Verfahren des Western-Blot. Allgemeines zum Western-Blot.Herkunft des Westernblots. Definition des Western-Blot.Wirkprinzip des Western-Blot.Verfahren des Proteintransfers.Die erweiterte Methode des Western-Blots.Die Bedeutung der Proteinbanden.Die Methode der Proteindetektion.Aufsplittung einzelner Proteinbanden und Untersuchung mit Antigenen oder konjugierten Antikörpern. Ferwendung konjugierter Antikörper mit Floureszenzreaktion.Immunoblot v.s. Elisa.Anwendungen des Western-Blot.Geräte zur Durchführung des Estern-Blot.Gelelektrophorese.Transfer von Proteinen horizontale Drehung in Startphase.vertikale Gegenphase mit konjugierten Antikörpern.Z.B. SSD-Polyacrlamid-Elektrophorese.Beispiele für die Anwendung des Western-Blod.Prinzip des Western-Blod bei multiplen verschiedensten Antikörpern als detailiertes Gesamtbild.

2. 1) Definition : Der Western Blot ist ein molekularbiologisches
Verfahren zum Nachweis von Proteinen durch �bertragung
(Blotting) auf eine Tr�germembran. Durch verschiedene
anschlie�ende Reaktionen k�nnen dann bestimmte
Proteine nachgewiesen werden.
2) Allgemeines zu Herkunft und Name.
1975 wurde das erste Blotverfahren zum Nachweis von
DNA - Fragmenten von Edwin Southern und dem Namen
Southern Blot eingef�hrt. Daran angelehnt wurden der
Nachweis von RNA als Northern Blot und der Nachweis
von Proteinen als Western Blot bezeichnnet.
.

3. Die

4. Gelelektrophorese:

6. Vor dem eigentlichen Western Blot muss das Proteingemisch
aufgetrennt werden. Ein Beispiel w�re hier die SDS-PAGE, bei dem
die Proteine im elektrischen Feld entsprechend ihrer Gr��e
unterschiedlich weit auf einem Polyacrylamid-Gel wandern. Nachdem
die Proteine nun 'sortiert' sind werden sie mit Hilfe eines weiteren
elektrischen Feldes, welches senkrecht zu dem Gel steht, auf eine
PVDF- oder Nitrocellulose-Membran �bertragen.
Schematischer Aufbau eines Western Blot: Schlitten (a), Schw�mme
(b), d�nne- (c) u. dicke- (d) Wattman-Papiere, PVDF-Membran (e),
Polyacrylamid Gel (f)

7. Die Proteinbanden sind nun fest auf der Membran gebunden und
k�nnen nun mit verschiedenen Methoden nachgewiesen werden.
Am h�ufigsten werden hier Antik�rper verwendet, die an ein
bestimmtes Protein binden. Damit ein Ergebnis zustande kommt,
m�ssen vorher die freien Bindungsstellen auf der Membran mit
Proteinen, die nicht von Antik�rpern erkannt werden k�nnen,
blockiert werden. Dazu behandelt man die Membran z.B. mit
Bovinem Serumalbumin oder einer Milchpulver-L�sung.
Anschlie�end werden zwei verschiedene Antik�rper auf die
Membran gegeben. Die Prim�rantik�rper binden zun�chst an das
gesuchte Protein. Nach dem Entfernen unspezifisch bindender
Antik�rper durch Waschen wird die Membran mit einem
Sekund�rantik�rper behandelt. Der Sekund�rantik�rper bindet an
den Prim�rantik�rper und ist z.B. an ein Enzym gekoppelt, welches
eine Farbreaktion katalysiert. Nach dem Auftragen der Antik�rper
wird die Membran mehrfach gewaschen, um alle �bersch�ssigen
Antik�rper zu entfernen. Die katalysierte Farbreaktion kann nun
durch Zugabe eines entsprechenden Substrats gestartet werden. In
den Banden, in denen das gesuchte Protein sitzt, kann die
gew�nschte Farbreaktion beobachtet werden. Alternativ kann der
Sekund�rantik�rper auch Radioaktiv markiert sein, was einen
Nachweis auf Photopapier erlaubt. Eine weitere M�glichkeit ist,
Meerrettich-Peroxidase gekoppelte Sekund�rantik�rper zu
verwenden, die einen Nachweis des Proteins durch
Chemolumineszenz erlauben.

14. Gelektrophorese

17. Vielen Dank f�r Ihr
Bildungsinteresse.
Quellen: Wikipedia,DocCheck,Google,
Lehrb�cher Immunologie
w.geiler,Internist