Das Nationale Listerien-Referenzlabor ist innerhalb der AGES an das "Zentrum für lebensmittelbedingte Infektionskrankheiten" / Institut für medizinische Mikrobiologie und Hygiene in Graz übersiedelt. Zum Auftakt am neuen Standort veranstaltete die AGES dieses Fachgespräch, bei dem verschiedene Aspekte in Zusammenhang mit dem potentiellen Auftreten von Listerien aktuell beleuchtet wurden. Erstmals wurden zudem die neuen Richtlinien des Europäischen Referenzlabors (EU-RL) für Listeria monocytogenes zur Harmonisierung der Probennahme vorgestellt. Dokumentation der Fachtagung mit Präsentationen: http://www.ages.at/ages/ages-akademie/stakeholderveranstaltungen/graz-listerien-referenzlabor/

1. Listerien in Lebensmitteln in Österreich
Dr. Ariane Pietzka
Leiterin Nationales Referenzlabor für Listerien
Zentrum für lebensmittelbedingte Infektionskrankheiten / Institut für medizinische
Mikrobiologie und Hygiene
Listerien-Referenzlabor: Akademischer Luxus oder Public Health Erfordernis?
Graz, 19.Oktober 2012
www.ages.at Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit GmbH

2. Was sind Listerien?
• Stäbchenförmige Bakterien
• Größe: 0.4 x 1-1.5 µm
• Grampositiv
• nicht-sporenbildend Listeria monocytogenes
• fakultativ anaerob
• Benannt nach britischem Chirurgen
Joseph Lister (1827 –1912)
Joseph Lister
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3. Was sind Listerien?
• Bekannte Species:
- L. fleischmannii
- L. grayi
o L. murrayi
- L. innocua
- L. ivanovii
o L. ivanovii subspec. ivanovii
o L. ivanovii subspec. londoniensis
- L. monocytogenes - pathogen für Mensch und Tier
o 13 Serotypen (1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, [4ab], 4c, 4d,
4e, 7)
3a, 3b, 3c, 4a, 4c ,4d, 4e, 7  sehr selten in LM, selten Listeriose
verursachend
- L. marthii
- L. rocourtiae
- L. seeligeri
- L. welshimeri
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4. Besonderheiten / Eigenschaften
von Listerien?
• Verursachen Listeriose
• Risikogruppen:
- Immunsupprimierte (Vorerkrankungen)
- Schwangere
- Ältere
• Aufnahme v.a. durch verzehrfertige Produkte – kein Erhitzen vor dem
Essen
- z.B.:
- Geräucherter Fisch, Meeresfrüchte
- Salat (bereits gewaschen / geschnitten)
- Käse
- Rohwurstprodukte
- Speiseeis
• Möglichkeiten der Kontamination des Lebensmittels:
- Rohmaterial
- Gesamter Herstellungsprozess (Reifung, Schlachtung,
Schneidemaschinen, Gerätschaften,…)
- Verpackung des Produkts
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5. Besonderheiten / Eigenschaften
von Listerien?
• Sehr anspruchslos
- Sauerstoffanspruch: aerob bis mikroaerophil, Vermehrung unter
Vakuum und modifizierter Atmosphäre möglich
- Vermehrung auch bei Kühlschranktemperatur
- Fähigkeit zur Biofilmbildung auf rostfreien Stahloberflächen, Böden,
Kühlräumen,…
• Vorkommen: ubiquitär (Boden, Pflanzen, Kompost, Silage,
Abwässer, Kot von Haus- und Nutztieren,…)
• Befall führt nicht zum Verderb von Lebensmitteln
- Aussehen und Geruch des Lebensmittels bleibt unverändert
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6. Lebensmittelsicherheit
• Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 über mikrobiologische Kriterien
für Lebensmittel
- gültig für Listeria monocytogenes
Lebensmittelkategorie Grenzwerte Stufe, für die das Kriterium gilt
Verzehrfertige Lebensmittel für Säuglinge oder In 25 g nicht In Verkehr gebrachte Erzeugnisse
für med. Zwecke nachweisbar während der Haltbarkeitsdauer
(n=10)
Andere verzehrfertige Lebensmittel (nicht für In 25 g nicht Bevor das Lebensmittel die unmittelbare
Säuglinge und für med. Zwecke), die die nachweisbar Kontrolle des Lebensmittelunternehmers
Vermehrung von L. monocytogenes (n=5) (Hersteller) verlassen hat
begünstigen können
100 KBE/g In Verkehr gebrachte Erzeugnisse
(n=5) während der Haltbarkeitsdauer
Andere verzehrfertige Lebensmittel (nicht für 100 KBE/g In Verkehr gebrachte Erzeugnisse
Säuglinge und für med. Zwecke), die die (n=5) während der Haltbarkeitsdauer
Vermehrung von L. monocytogenes nicht
begünstigen können
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7. LMSVG Lebensmittelsicherheits-
und Verbraucherschutzgesetz
• LMSVG §38 Abs.6 Pflichten der Unternehmer
- Im Rahmen der Eigenkontrolle betreffend das Vorliegen
von Zoonosen und Zoonoseerregern…,… die Isolate dem
gemäß §75 zuständigen Referenzlabor zu übermitteln
oder deren unverzügliche Übermittlung durch das
untersuchende Labor zu veranlassen.
• LMSVG §74 Pflichten des Labors
- Labors die im Rahmen von §38 Abs.1 Z6 das Vorliegen von
Zoonosen und Zoonosenerregern untersuchen, haben
Isolate unverzüglich, längstens jedoch binnen zwei
Tagen, dem gemäß §75 zuständigen Referenzlabor
anonymisiert und unter Hinweis auf die
Produktgruppe zu übermitteln
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8. LMSVG Lebensmittelsicherheits-
und Verbraucherschutzgesetz
• LMSVG §75 Aufgabe des Nationalen Referenzlabors
- Koordination der Tätigkeiten der Agentur, der
Untersuchungsanstalten der Länder sowie der gemäß §73
autorisierten Personen
- Durchführung von Laborvergleichstests
- Weiterleitung von Informationen des
Gemeinschaftsreferenzlabors (EU-RL) an das BMG, die
Agentur, die Untersuchungsanstalten sowie an die gemäß
§73 autorisierten Personen
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9. Einsendeformular für Listeria
monocytogenes Isolate
http://www.ages.at/ages/ueber-uns/oeffentliche-
gesundheit/referenzzentralen/rl-listerien/
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10. Listerien in Lebensmitteln
• Betroffene Lebensmittel:
- Rohes Fleisch, Rohwurst,
Rohmilch, Käse, (Räucher)-Fisch,
Fleisch- und Geflügelerzeugnisse,
Frischgemüse, Ready-to-eat
Salate,…
• Österreich 2012: 239 Isolate Sonstige LM
(Zeitraum Juli-September) OLB
~9% Fleisch, Wurst
~ 47 %
- 112 Fleisch/Wurst Isolate ~9%
- 45 Fisch, Meeresfrüchte, Salat, Gemüse
Umfeldproben Fisch-Schlachtung ~1%
- 35 Frischkäse, Milch, Schnittkäse,
Käseschmierwasser Käse
- 3 Salat, Gemüse (RTE, ~ 15 %
Fertigprodukte)
- 22 Oberflächen (OLB),
Wischproben
- 22 sonstige (Lebensmittel, nicht
genau definiert) Fisch, Meeresfrüchte
~ 19 %
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11. Ablauf am NRL
Als L. monocytogenes identifizierte Isolate:
- Serotypisierung (Multiplex-PCR)
o Unterscheidung in 4 Serogruppen
- inlB -Typisierung
(High-Resolution Melting (HRM), Sequenzierung) Wachstum von L. mono auf
o Weitere Unterscheidung der PCR-Serogruppen Rapid L´Mono Agar
- Goldstandard:
Pulsed-Field-Gel-Elektrophorese (PFGE)
o Weitere Unterscheidung der inlB – Sequenztypen
• Pflege der Daten in einer Datenbank (Bionumerics,
Applied Maths)
• Versand von Prüfberichten an einsendende Labors
• Stammsammlung
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12. Typisierung I
• Serotypisierung mit PCR (Doumith et. al. 2004)
- 4 Serogruppen L. monocytogenes (lanes 1-10)
o 1/2a, 3a
o 1/2b, 3b, 7
o 1/2c, 3c
o 4b, 4d, 4e L. innocua
- Listeria species (lanes 11-16) L. welshimeri
L. ivanovii
L. seeligeri
1/2a 1/2b 1/2c 4b 3a 3b 3c 4d 4e 7 4a 4c
L. monocytogenes
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13. Serotypisierung (PCR)
Verteilung der PCR-Serogruppen innerhalb verschiedener Produktgruppen:
Fleisch, Wurst Fisch, Meeresfrüchte
5% 3%
7%
23% 20% 1/2a, 3a
1/2a, 3a
1/2c, 3c
1/2c, 3c
4b, 4d, 4e
4b, 4d, 4e
1/2b, 3b, 7
1/2b, 3b, 7
2%
69% 71%
Käse
18%
1/2a, 3a
1/2b, 3b, 7
82%
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14. Typisierung II:inlB-Sequenztypen
High-Resolution Melting (HRM)
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15. High-Resolution Melting
• inlB: Genabschnitt mit Serotyp-spezifischen Unterschieden in der
DNA-Sequenz
• Unterschiede in der DNA-Sequenz führen zu verschiedenen
Schmelzkurven beim High-Resolution-Melting
Virulenzgen: inlB (Internalin B)
Forward Primer
inlB-F
339
343 351 359
500 bp PCR-Produkt
Codons mit 367 371 373 380
Punktmutationen
(SNP´s) 386 387 390 393 396 397 398 400
401 403 410 411 417
421 422 426 427 435 439
441 445 446 455 457 459
466 470 inlB-R
Reverse Primer
www.ages.at inlB Sequenz (Accession Nr.: NC 012488) L. monocytogenes 4b

16. High-Resolution Melting
Amplification (PCR) High Resolution Melting
Amplification Curves Melting Curves
Normalization
Normalized Melting Curves
Temperature-
Shift
Normalized and Temp-Shifted Difference Plot Normalized and Shifted Melting Curves
Difference Plot
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17. High-Resolution Melting
Difference Plot:
18 verschiedenen inlB–Sequenztypen (ST) von 192 L. monocytogenes Isolaten
Fünf phylogenetische Gruppen (PG)
Serotypen: 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4d, 4e, und 7
Basislinie: inlB ST-2
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18. High-Resolution Melting
Verteilung der inlB-Sequenztypen bei Fleisch/Wurst-Isolaten:
inlB ‐Sequenztypen bei Isolaten aus Fleisch/Wurst
inlB‐ST 19
1/2b, 3b, 7 1%
3% inlB‐ST 21
6%
4b, 4d, 4e inlB‐ST 16
5% 4% inlB‐ST 7
14%
inlB‐ST 15
1/2a, 3a 19%
69%
1/2c, 3c
22%
inlB‐ST 13
1%
inlB‐ST 8
inlB‐ST 12
17%
2% inlB‐ST 9
6%
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19. Typisierung III: Pulsed-Field-Gel-
Elektrophorese
• Genetischer Fingerprint
• Schnitt des gesamten Genoms mit 2
Restriktionsenzymen
- AscI
- ApaI
• Vergleich der Muster mit eigener Datenbank
(Bionumerics, Applied Maths)
- Abgleich mit Humanisolaten
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20. Pulsed-Field Gelelektrophorese
Unterscheidung der inlB-Sequenztypen bei Fleisch/Wurst-Isolaten:
3 PFGE-Muster
inlB‐ST 19
1/2b, 3b, 7 1%
inlB‐ST 21 9 PFGE-Muster
3%
inlB‐ST 16 6%
4b, 4d, 4e 4%
4 PFGE-Muster inlB‐ST 7
5%
14%
inlB‐ST 15
1/2a, 3a 19%
69%
1/2c, 3c
22% inlB‐ST 13
1%
inlB‐ST 12 inlB‐ST 8
2% inlB‐ST 9 17%
6%
1 PFGE-Muster
3 PFGE-Muster
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21. Akademischer Luxus oder Public
Health Erfordernis?
• „Multinationaler Listerioseausbruch“ 2009/2010
Foto: AGES
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22. Listerioseausbruch 2009/2010
verursacht durch „Quargel“
Produktrückruf: 23. Januar 2010
66 L. monocytogenes Isolate aus Quargel untersucht:
- Klon 1: 2 Isolate
- Klon 2: 64 Isolate
Ende November 2009:
Wechsel der Schutzkultur
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23. Listerioseausbruch 2009/2010
verursacht durch „Quargel“
PFGE_AscI PFGE_ApaI
Patientenisolat Serotyp 1/2a
Klon I Isolat aus Quargel inlB-ST 15
14 Patientenisolate
-12 aus Österreich (davon 3 †)
- 2 aus Deutschland (davon 2 †)
PFGE_AscI PFGE_ApaI
Patientenisolat Serotyp 1/2a
Klon II Isolat aus Quargel inlB-ST 9
20 Patientenisolate
-13 aus Österreich (davon 2 †)
- 6 aus Deutschland (davon 1 †)
- 1 aus der Tschechischen Republik
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24. Listerioseausbruch 2009/2010
verursacht durch „Quargel“
• Dezember 2009: Kassabons der Patienten werden gesammelt
- Hinweis auf Quargelkauf bei 3 von 7 Patienten
- Regelmäßiger Quargelkonsum bei 8 von 9 befragten Patienten
- Fall-Kontroll-Studie ergab eindeutigen Zusammenhang
• Molekulare Subtypisierung bestätigt epidemiologische
Untersuchungen – liefert Nachweis für Quargel als Verursacher
des multinationalen Listerioseausbruchs
• Zusammenhang Klon I/ Klon II identifiziert
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25. Akademischer Luxus oder Public
Health Erfordernis?
• Aufgaben des NRL´s:
• Abklärung epidemiologischer Fragen auf nationaler /
internationaler Ebene - Datenweitergabe
- Seit Januar 2012: Pro Quartal – Abgleich der Typisierungen von
Patientenisolaten mit Lebensmittelisolaten
o Regelmäßige Überwachung gewährleistet
o Schnellere Reaktion im Fall eines Ausbruchs
• Gewährleistung eines raschen Datenaustauschs mit
Nachbarländern
• Internationaler Methodenabgleich mit EU-RL
• Führen einer Stammsammlung
• Nationale Referenzlabor für Listeria monocytogenes
 Public Health Erfordernis
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26. Danke!
Core Unit Molekularbiologie Wien
Werner Ruppitsch
Anna Stöger
Lebensmittelmikrobiologie Graz
Sigrid Fleck
Kathrin Hauser
Silke Konrath
Andrea Kormann-Klement
Claudia Schlagenhaufen
Hildegard Stangl
Referenzlabor Graz
Manuela Fest
Christian Kornschober
Anna Lennkh
Birgit Moik
Iris Strutz
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