Selektive Kulturverfahren und molekularer Nachweis von Clostridium botulinum in Honig und Fischerzeugnissen

1. 1
Selektive Kulturverfahren
und molekularer Nachweis
von Clostridium botulinum
in Honig und Fischerzeugnissen
Matthias Mailänder
matthias.mailaender@studium.uni-hamburg.de
Diplomvortrag

2. 2
Clostridium botulinum
Elektronenmikroskopie,
Dennis KunkelLichtmikroskopie,
Sporenfärbung mit Kristallviolett,
U.S. Center for Desease Control
Ermengem, E. Ueber einen neuen anaëroben Bacillus und seine Beziehungen zum Botulismus.
Medical Microbiology and Immunology, 26, 1–56, 1897.

3. 3
Phänotyp
Collins, East. Phylogeny and taxonomy of the food-borne pathogen Clostridium botulinum and
its neurotoxins. Journal of Applied Microbiology, 84, 5–17, 1998.
Gruppe: I II III IV
Toxintyp: A, B, F B, E, F C, D G
Proteolyse: Ja Nein Nein Ja
Lipase: Ja Ja Ja Nein
Wachstumsoptimum: 35–40°C 18–25°C 40°C 37°C

4. 4
Phylogenie
Dessimoz, C., et.al OMA, A Comprehensive, Automated Project for the Identification of Orthologs from
Complete Genome Data. Lecture Notes in Computer Science, 61–72, 2005.
Gruppe IIGruppe II
Gruppe IGruppe I

5. 5
Botulinumtoxin
Segelke, B., et.al: B. Crystal structure of Clostridium botulinum neurotoxin protease in a product-bound state:
Evidence for noncanonical zinc protease activity. PNAS, 101, 6888–6893, 2004.
PDB 3BON,
ProteinShader

6. 6
Wirkort
Wikimedia Commons: Diagramm einer ganzen Nervenzelle, Mariana Ruiz Villarreal, 2007, gemeinfrei
Neuron

7. 7
Wirkort
Wikimedia Commons: Diagramm einer ganzen Nervenzelle, Mariana Ruiz Villarreal, 2007, gemeinfrei
Neuron

8. 8
Wirkort
Wikimedia Commons: Diagramm einer ganzen Nervenzelle, Mariana Ruiz Villarreal, 2007, gemeinfrei
Neuron
Neuron

9. 9
Wirkmechanismus
Simpson, L. L. Identification of the Major Steps in Botulinum Toxin Action. Annual Review of
Pharmacology and Toxicology, 44, 167–193, 2004.

10. 10
Botulinumtoxin
Ricin
2,3,7,8-Tetrachlordibenzodioxin
Nicotin
Kaliumcyanid
LD50 (mg/70 kg)
Toxizität beim Menschen
Forth, Henschler, Rummel: Pharmakologie und Toxikologie (6. Auflage), B.I.W.-Verlag, Mannheim 1992, S. 749
10-6
10-4
10-2
110²

11. 11
Fallzahlen Deutschland
Hélène Therre. Botulism in the European Union. Eurosurveillance, 4, 1–16, 1999.
Robert-Koch-Institut. Infektionsepidemiologisches Jahrbuch. Berlin 2012.
1988
1989
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
39
15 15
23
4
17
13
11 12
9
19
9
12
9
6
24
6
9
12
15
4
9
Jahr
Fälle

12. 12
Therapie
Bildquelle: Informationsdienst Wissenschaft, http://idw-online.de/de/image?id=53068, freie Verwendung
Schmutzhard, E. Leitlinien für Diagnostik und Therapie in der Neurologie. Thieme, Stuttgart 2008, 4. Auflage.

13. 13
Risikolebensmittel
Bundesinstitut für Risikobewertung: Hinweise für Verbraucher zum Botulismus durch Lebensmittel, Berlin, 2005

14. 14
Säuglingsbotulismus
Robert-Koch-Institut. Säuglingsbotulismus: Fallbericht und Übersicht. Epidemiologisches Bulletin, 37, 1998.

15. 15
Wundbotulismus
Postmes, T et al., Honey for wounds, ulcers, and skin graft preservation.
Lancet. Vol. 341, no. 8847, pp. 256-257. 1993.

16. 16
Maustest nach § 64 LFGB
ISO. Nachweis von Clostridium botulinum und Botulinum-Toxin in Fleisch und Fleischerzeugnissen L-06.00-26. In: Amtliche
Sammlung von Untersuchungsverfahren nach Paragraph 64 LFGB Untersuchung von Lebensmitteln. Beuth-Verlag, Berlin 1988
positiver Nachweis

17. 17 ISO. Nachweis von Clostridium botulinum und Botulinum-Toxin in Fleisch und Fleischerzeugnissen L-06.00-26. In: Amtliche
Sammlung von Untersuchungsverfahren nach Paragraph 64 LFGB Untersuchung von Lebensmitteln. Beuth-Verlag, Berlin 1988
10-1 10-2 10-3
Quantifizierung

18. 18 ISO. Nachweis von Clostridium botulinum und Botulinum-Toxin in Fleisch und Fleischerzeugnissen L-06.00-26. In: Amtliche
Sammlung von Untersuchungsverfahren nach Paragraph 64 LFGB Untersuchung von Lebensmitteln. Beuth-Verlag, Berlin 1988
Anti-A Anti-B
Anti-FAnti-E
Toxintypisierung

19. 19
Multiplex-PCR
Lindström, M. et.al. Multiplex PCR Assay for Detection and Identification of Clostridium botulinum Types A, B, E, and
F in Food and Fecal Material. Applied and Environmental Microbiology, 67, 5694–5699, 2001.
F
B
E
A
A
F
E
B

20. 20
Selektivmedien
AEY-Agar,
ohne Hemmstoffe
ISO-Methode, § 64 LFGB
AEY-Agar mit
2 mg/L Nalidixinsäure und
10 mg/L Polymyxin-B-Sulfat
Dezfulian, M., Dowell, V. R. Cultural and physiological characteristics and antimicrobial susceptibility of Clostridium
botulinum isolates from foodborne and infant botulism cases. Journal of Clinical Microbiology, 11, 604–609, 1980.

21. 21
Vorgehensweise
BLAST
Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.
J. Bacteriol., 173, 697–703, 1991.

22. 22
Phylogramm
Saitou, N., Nei, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees.
Molecular Biology and Evolution, 4, 406–425, 1987.

23. 23
Zusammenfassung
● Validierung und Optimierung der
Multiplex-PCR nach Lindström et al.
Untersuchungsgut Proben positiv Toxintyp Herkunft
Honig 60 1 E Argentinien
Fisch 30 1 E Travemünde
● Neue Antibiotika-Kombinationen für
Anreicherungsbouillon und Eigelb-Agar
● 16S rDNS-Sequenzierung der Isolate

24. AUSBLICK >AUSBLICK >
IN DIE ZUKUNFTIN DIE ZUKUNFT
Mehta, J., Van, B., et. al The Use of Phages and Aptamers as Alternatives to Antibodies in Medical and Food Diagnostics. In: Biomedical Engineering, Trends, Research and Technologies, 2011.
Scarlatos, A., et. al Methods for Detecting Botulinum Toxin with Applicability to Screening Foods Against Biological Terrorist Attacks. Journal of Food Science, 70, 121–130, 2005.
Satterfield, B. A, et. al. A quadruplex real-time PCR assay for rapid detection and differentiation of the Clostridium botulinum toxin genes A, B, E and F. Journalof Medical Microbiology, 59, 55 –64, 2010.