Zellchemie    Inhaltsverzeichnis:1. Nukleinsäuren – Struktur, Organisation und Replikation...................................
Zellchemie4. Zielsteuerung von Proteïnen.....................................................................................
Zellchemie         7.1.12. Wiederverwertung von Ketonkörpern.................................................................
Zellchemie    11.3. Oncogenese...............................................................................................
Zellchemie1. Nukleinsäuren – Struktur, Organisation und Replikation1.1.1. Nukleinsäuren sind die Träger der Erbanlagen    ...
Zellchemie1.2. Struktur der DNA1.2.1. DNA ist eine Doppelhelix bestehend aus zwei antiparallel angeordneten Ketten   Die S...
Zellchemie    Durch die Geometrie der gepaarten Basen bildet sich, bei der Wicklung der beiden Stränge zu einer Doppelheli...
Zellchemie1.3.1. Histone    Die hauptsächlichen Proteïnkomponenten des Chromatins bilden die Histone. Histone sind basisch...
Zellchemie                                      Abbildung 4 : Höhere Organisationsformen des Chromatins1.3.3. Höhere Organ...
Zellchemie    Die 30 nm Faser (Fiber) wird in der Zelle noch kompakter verpackt. Wie die 30 nm Faser zu Strukturen höherer...
Zellchemie1.4. DNA-Biosynthese – Replikation   Bevor sich eine Zelle teilen kann, muss sie eine neue Kopie ihrer DNA anfer...
Zellchemie1.4.2. Die Replikation beginnt mit der Entwindung der beiden DNA-Stränge am     Replikationsursprung (Ori) durch...
Zellchemie                                                    Abbildung 7 : Vergrößerte Sicht einer Replikationsgabel (Pra...
Zellchemie           Abbildung 9 : Modell der koordinierten DNA-Synthese des Leit- und Folgestranges an der Replikationsga...
Zellchemie1.4.7. Der Gleitring verleiht der DNA-Polymerase eine hohe Prozessivität und      katalytische Kapazität    Der ...
Zellchemie                                     Abbildung 10 : Desaminierung von Cytosin durch salpetrige Säure und deren S...
Zellchemie                                             Abbildung 12 : Basen Excisions Reparatur1.5.5. Entfernung von fehlg...
Zellchemie   Bei genetisch bedingten Defiziënzen in diesem System (z.B. Defekte in den Genen brc1 und brc2) entsteht häufi...
Zellchemie2. Genexpression und Genregulation2.1.1. DNA ist die „Speicherform“ der genetischen Information, RNA die „Arbeit...
Zellchemie    Reaktionen, die zur Synthese von Nukleïnsäuren (und Proteïnen) führen, unterscheiden sich grundlegend von de...
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  1. 1. Zellchemie Inhaltsverzeichnis:1. Nukleinsäuren – Struktur, Organisation und Replikation............................................................................7 1.1.1. Nukleinsäuren sind die Träger der Erbanlagen.............................................................................................................................7 1.2. Struktur der DNA.................................................................................................................................................... 8 1.2.1. DNA ist eine Doppelhelix bestehend aus zwei antiparallel angeordneten Ketten.........................................................................8 1.2.2. Die Replikation der DNA ist semikonservativ.................................................................................................................................9 1.2.3. Der genetische Code......................................................................................................................................................................9 1.3. Organisation der DNA............................................................................................................................................ 9 1.3.1. Histone.........................................................................................................................................................................................10 1.3.2. Chromatin ist aus Nukleosomen aufgebaut.................................................................................................................................10 1.3.3. Höhere Organisationsformen des Chromatins.............................................................................................................................11 1.3.4. Nukleosomen sind dynamische Grundbausteine des Chromatins..............................................................................................12 1.3.5. Chromatin-Remodellierungs-Maschinen machen die in Nukleosomen verpackte DNA zugänglich und können Histon- Oktamere relativ zur DNA-Sequenz verschieben..................................................................................................................................12 1.3.6. Histon-Acetyltransferasen sind an der Aktivierung von Promotoren beteiligt, Histon-Deacetylasen an ihrer Reprimierung......12 1.3.7. Histon-Deacetylasen....................................................................................................................................................................12 1.4. DNA-Biosynthese – Replikation.......................................................................................................................... 13 1.4.1. Die DNA-Polymerase ist gleichzeitig eine 3´→ 5´ Exonuclease..................................................................................................13 1.4.2. Die Replikation beginnt mit der Entwindung der beiden DNA-Stränge am Replikationsursprung (Ori) durch Helikasen...........14 1.4.3. Die Synthese neuer DNA setzt sich an Replikationsgabeln fort..................................................................................................14 1.4.4. Ein Tochterstrang der DNA wird kontinuierlich synthetisiert, der andere entsteht diskontinuierlich als eine Folge kurzer Fragmente..............................................................................................................................................................................................14 1.4.5. Zur Verknüpfung der Okazaki-Fragmente am Folgestrang werden 3 zusätzliche Enzymaktivitäten benötigt............................15 1.4.6. Topoisomerasen...........................................................................................................................................................................15 1.4.7. Der Gleitring verleiht der DNA-Polymerase eine hohe Prozessivität und katalytische Kapazität...............................................17 1.5. DNA-Reparatur...................................................................................................................................................... 17 1.5.1. Die postreplikative Korrektur der DNA hält Mutationsraten niedrig und verhindert Krebs..........................................................17 1.5.2. Enzymatische Reparatur von DNA-Schäden...............................................................................................................................17 1.5.3. Nucleotide Excision Reparatur bei E. coli....................................................................................................................................18 1.5.4. Die Entfernung von Uracil aus DNA erfolgt durch das BER-System...........................................................................................18 1.5.5. Entfernung von fehlgepaarten Nukleotiden erfolgt durch das „mismatch repair system“............................................................19 1.5.6. Doppelstrangbrüche werden durch das Rekombinative Reparatursystem korrigiert..................................................................192. Genexpression und Genregulation.............................................................................................................. 21 2.1.1. DNA ist die „Speicherform“ der genetischen Information, RNA die „Arbeitsform“.......................................................................21 2.1.2. RNA-Synthese (Transkription).....................................................................................................................................................21 2.1.3. Initiation der Transkription eines eukaryontischen Gens beginnt am Promotor und benötigt allgemeine Transkriptionsfaktoren ................................................................................................................................................................................................................22 2.1.4. Struktur eukaryontischer Promotoren..........................................................................................................................................23 2.1.5. Elongation der RNA-Synthese.....................................................................................................................................................23 2.2. RNA-Prozessierung.............................................................................................................................................. 23 2.2.1. RNAs werden meistens als Vorläufermoleküle synthetisiert und durchlaufen einen Reifungsprozess (Prozessieren)..............23 2.2.2. Beim Prozessieren werden auch lange Nucleotidsequenzen aus dem Inneren von RNA-Molekülen entfernt..........................24 2.2.3. Beim Editieren wird die RNA-Sequenz matrizenunabhängig verändert......................................................................................24 2.3. Kontrolle der Genexpression (Genregulation)..................................................................................................24 2.3.1. Gene werden von Transkriptionsfaktoren reguliert......................................................................................................................25 2.3.2. Eukaryotische Transkriptionsfaktoren kontrollieren die Genregulation oft aus großer Entfernung.............................................25 2.3.3. Eukaryotische Gene werden in der Regel von mehreren Transkriptionsfaktoren reguliert.........................................................25 2.3.4. Genetisch bedingter Ausfall eines einzigen Transkriptionsfaktors kann zu schweren klinischen Symptomen führen...............26 2.3.5. Rezeptoren der Steroid- und Schilddrüsenhormone sind Transkriptionsfaktoren.......................................................................26 2.3.6. Wirkungsmechanismus des Cortisols..........................................................................................................................................26 2.3.7. Cortisolwirkungen auf den Intermediärstoffwechsel....................................................................................................................27 2.3.8. Fettsäuren werden in Ketonkörper umgewandelt........................................................................................................................27 2.3.9. Cortisol wirkt entzündungshemmend...........................................................................................................................................27 2.3.10. Cortisol hemmt auch sehr effektiv immunologische Vorgänge..................................................................................................27 2.3.11. Cortisol wirkt immunsuppressiv, indem es die Proliferation aktivierter T- und B-Zellen hemmt................................................273. Proteïn-Biosynthese, -Modifikation und –Abbau........................................................................................29 3.1. Proteïn-Biosynthese............................................................................................................................................. 29 3.1.1. Die Entschlüsselung des genetischen Codes..............................................................................................................................29 3.1.2. Transfer-RNAs wirken als Adaptoren, die Nucleotidsequenzen in Proteïnsequenzen übersetzen............................................29 3.1.3. Posttranskriptionelle Modifikation von tRNA-Molekülen..............................................................................................................30 3.1.4. Spezifische Enzyme koppeln jede Aminosäure an ihr zugehöriges tRNA-Molekül.....................................................................30 3.1.5. Der genetische Code ist degeneriert............................................................................................................................................31 3.1.6. Die Einzelschritte der Proteinsynthese werden am Ribosom katalysiert.....................................................................................31 3.1.7. Der Initiationsvorgang legt das Leseraster für die Proteïnsynthese fest.....................................................................................31 3.1.8. Die Kettenverlängerung (Elongation) besteht aus 3 Schritten.....................................................................................................33 3.1.9. Polysomen....................................................................................................................................................................................33 3.1.10. Eine Proteïnkette wird vom Ribosom abgelöst, wenn eines von 3 verschiedenen Stopp-Codons erreicht wird......................34 3.1.11. Regulation der Translation.........................................................................................................................................................34 3.2. Modifizierung von Proteïnen............................................................................................................................... 35 3.2.1. Posttranslationelle Faltung und Modifizierung von Proteïnen......................................................................................................35 3.2.2. Modifizierung von Aminosäuren...................................................................................................................................................36 3.3. Abbau von Proteïnen........................................................................................................................................... 36 3.3.1. Durch sorgfältig kontrollierten Proteïnabbau wird die Mengenregulierung jedes Proteïns unterstützt.......................................36 3.3.2. Intrazelluläre Proteolyse als Regelmechanismus........................................................................................................................36 3.3.3. Ubiquitinkontrollierte Proteolyse...................................................................................................................................................37 3.3.4. Proteasomen spielen eine wichtige Rolle bei der Präsentation kurzer antigener Peptide durch MHC-I-Molekülen...................37 -3-
  2. 2. Zellchemie4. Zielsteuerung von Proteïnen........................................................................................................................ 39 4.1. Es gibt zwei wichtige Transportwege: eines aus dem Cytosol, das andere aus dem ER.............................39 4.1.1. Zellen sortieren Proteïne während oder nach der Translation....................................................................................................39 4.2. Transport von Proteïnen aus dem Cytosol........................................................................................................40 4.2.1. Signalsequenzen dirigieren Proteïne zu Mitochondriën..............................................................................................................40 4.2.2. TOM-Proteïne vermitteln den Proteïntransport über die mitochondriale Außenmembran, Tim-Proteïne durch die Innenmembran.......................................................................................................................................................................................40 4.2.3. Nukleäre Proteïne tragen Kernlokalisationssequenzen...............................................................................................................40 4.2.4. Die meisten Proteïne passieren die Kernporen in einem Komplex mit Transportproteïnen der Importin-ß-Familie...................41 4.2.5. Der Kernimport entscheidet über den Zutritt von Transkriptionsfaktoren und anderen Regulatorproteïnen zur DNA................41 4.2.6. Eine kurze Signalsequenz dirigiert den Import von Proteïnen in Peroxisomen...........................................................................41 4.3. Transport von Proteïnen in das ER und von dort aus weiter...........................................................................41 4.3.1. Proteïne werden co-translational in das endoplasmatische Retikulum importiert.......................................................................41 4.3.2. Sekretorische Proteïne.................................................................................................................................................................42 4.3.3. Signal-Anker-Sequenzen und Stopp-Transfer-Sequenzen regulieren den Proteïneinbau in Membranen.................................42 4.3.4. Proteïne können auch über Lipidanker mit der Membran verbunden sein..................................................................................43 4.3.5. Zielsteuerung lysosomaler Proteïne.............................................................................................................................................43 4.4. Vesikulärer Transport, Exo- und Endocytose....................................................................................................44 4.4.1. Vesikeltransport und Fusion mit der Zielmembran......................................................................................................................465. Überblick über den Stoffwechsel, Enzyme, Coënzyme..............................................................................47 5.1. ATP ist Energielieferant bei endergonen Reaktionen.......................................................................................47 5.1.1. ATP liefert Energie durch Gruppenübertragungen, nicht durch einfache Hydrolyse...................................................................48 5.2. Rolle von Enzymen bei biologischen Prozessen..............................................................................................48 5.2.1. Kinetische Größen zur Kennzeichnung eines Enzyms................................................................................................................48 5.3. Enzymkinetik: Experimentelle Bestimmung der Affinität eines Enzyms zum Substrat (KM) und seiner katalytischen Kapazität (Vmax).................................................................................................................................. 49 5.4. Enzymhemmung................................................................................................................................................... 50 5.4.1. Nicht-kompetitive Hemmung........................................................................................................................................................51 5.5. Abweichungen von der Michaelis-Menten-Kinetik: Kooperativität und Allosterie........................................52 5.5.1. Schrittmacher-Enzyme.................................................................................................................................................................52 5.5.2. Einige wichtige Beispiele..............................................................................................................................................................53 5.6. Coënzyme.............................................................................................................................................................. 546. Regulation des Glucose- und Glycogen-Stoffwechsels durch Metabolite und Hormone.......................55 6.1. Bedeutung der Glucose im Stoffwechsel...........................................................................................................55 6.1.1. Die Glycolyse................................................................................................................................................................................55 6.1.2. Die einzelnen Schritte und Energieausbeute der Glycolyse........................................................................................................56 6.1.3. Die Regulation der Glycolyse.......................................................................................................................................................56 6.1.4. Der Pentosephosphatweg............................................................................................................................................................57 6.1.5. Der irreversible oxidative Teil des Pentosephosphatweges........................................................................................................58 6.1.6. Stoffwechselwege, die in die Glycolyse münden.........................................................................................................................59 6.1.7. Fructose und Sorbit......................................................................................................................................................................59 6.1.8. Glycogenstoffwechsel und hormonelle Regulation......................................................................................................................60 6.1.9. Biosynthese des Glycogens.........................................................................................................................................................60 6.1.10. Glycogenabbau..........................................................................................................................................................................61 6.1.11. Der Blutglucosespiegel wird über den Glycogenstoffwechsel der Leber reguliert....................................................................61 6.1.12. Rolle von Hormonen und des zyklischen AMP bei der koordinierten Regulation des Glycogen Auf- und Abbaus zum Ausgleich von Schwankungen der Blutglucose.....................................................................................................................................62 6.1.13. Mechanismus der Glucagonwirkung auf den Glycogenstoffwechsel: so genannte G-Proteïne koppeln Hormonrezeptoren mit der Adenylyl-Cyklase..............................................................................................................................................................................63 6.1.14. Ausschaltung des Hormonsignals..............................................................................................................................................63 6.1.15. Cholera.......................................................................................................................................................................................63 6.1.16. Proteïnkinase-A aktiviert in der Leberzelle katabole Prozesse und inaktiviert anabole............................................................64 6.1.17. Die Rolle der Reaktionskaskade besteht in einer Verstärkung des Hormonsignals um mehrere Zehnerpotenzen.................64 6.1.18. Insulin ist ein Hormon, das den Blutglucosespiegel senkt.........................................................................................................64 6.1.19. Insulinbiosynthese und Mechanismus der Insulinsekretion.......................................................................................................65 6.1.20. Insulin-Wirkungsmechanismus..................................................................................................................................................65 6.1.21. Vom Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS) gehen schnelle und langsame Signale aus...................................................................66 6.1.22. Schnelle Insulinwirkungen in der Leber.....................................................................................................................................66 6.1.23. Langsame Insulinwirkungen in der Leber..................................................................................................................................66 6.1.24. Die Gluconeogenese..................................................................................................................................................................67 6.1.25. Insulin aktiviert in der Leber die Glycolyse und hemmt die Gluconeogenese...........................................................................69 6.1.26. Insulinwirkungen in Muskel- und Fettgewebe............................................................................................................................69 6.1.27. Molekularer Mechanismus der insulinabhängigen Glucoseaufnahme in Muskel und Fettgewebe...........................................70 6.1.28. Diabetes mellitus (Altersdiabetes): eine Volkskrankheit............................................................................................................707. Lipidstoffwechsel.......................................................................................................................................... 71 7.1.1. Neutralfette als Energiedepot.......................................................................................................................................................71 7.1.2. Biosynthese der Fettsäuren.........................................................................................................................................................71 7.1.3. Die Reaktionen des Fettsäuresynthase-Komplexes....................................................................................................................72 7.1.4. Die Verlängerung der Fettsäurekette über 16 bzw. 18 C-Atome hinaus.....................................................................................72 7.1.5. Einführung von Doppelbindungen in Fettsäuren..........................................................................................................................73 7.1.6. Synthese von Fetten aus den Fettsäuren....................................................................................................................................73 7.1.7. Fett- und Fettsäure-Abbau...........................................................................................................................................................74 7.1.8. Ein Teil des Fettsäure-Abbaus erfolgt in der menschlichen Zelle in Peroxisomen.....................................................................75 7.1.9. Abbau ungesättigter Fettsäuren...................................................................................................................................................75 7.1.10. Ketonkörper-Metabolismus........................................................................................................................................................75 7.1.11. Biosynthese der Ketonkörper.....................................................................................................................................................76 -4-
  3. 3. Zellchemie 7.1.12. Wiederverwertung von Ketonkörpern........................................................................................................................................76 7.1.13. Cholesterinbiosynthese..............................................................................................................................................................778. Energiegewinnung der Zelle......................................................................................................................... 79 8.1.1. Übersicht......................................................................................................................................................................................79 8.1.2. Der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex........................................................................................................................................79 8.1.3. Regulation der Pyruvat-Dehydrogenase......................................................................................................................................80 8.1.4. Der Citratzyklus............................................................................................................................................................................80 8.1.5. Die Atmungskette.........................................................................................................................................................................81 8.1.6. ATP-Synthese..............................................................................................................................................................................81 8.1.7. Kontrolle der Zellatmung..............................................................................................................................................................82 8.1.8. ATP-Ausbeute bei der Oxidation verschiedener Substrate (P/O-Quotient)................................................................................82 8.1.9. Der Transport von Redoxäquivalenten (NADH) durch die Membran der Mitochondrien erfolgt auf indirektem Wege über den Malat-Aspartat-„Shuttle“ oder über den α-Glycerophosphat-„Shuttle“...................................................................................................839. Aminosäure- und Proteïnmetabolismus, Harnstoffzyklus.........................................................................85 9.1.1. Proteïnmetabolismus....................................................................................................................................................................85 9.1.2. Aminosäure-Metabolismus 1. Weg des Stickstoffs, Harnstoffzyklus...........................................................................................85 9.1.3. Bedeutung von Pyridoxalphosphat als Coënzym im Aminosäure-Stoffwechsel.........................................................................85 9.1.4. Glutamat-Dehydrogenase............................................................................................................................................................86 9.1.5. Der Harnstoffzyklus......................................................................................................................................................................86 9.1.6. Aminosäure-Metabolismus 2. Umwandlungen des Kohlenstoffgerüsts......................................................................................87 9.1.7. Die C3-Familie..............................................................................................................................................................................87 9.1.8. Die C4-Familie..............................................................................................................................................................................88 9.1.9. Die C5-Familie..............................................................................................................................................................................88 9.1.10. Funktion von Glutamin in der Niere............................................................................................................................................88 9.1.11. Die Isoleucin, Methionin, Valin-Gruppe......................................................................................................................................88 9.1.12. Coënzym B12.............................................................................................................................................................................89 9.1.13. Übertragung von Ein-Kohlenstoff-Einheiten (C1-Metabolismus)...............................................................................................89 9.1.14. Biosynthese von Aminosäuren...................................................................................................................................................9010. Struktur und Stoffwechsel der Nucleotide................................................................................................91 10.1.1. Übersicht....................................................................................................................................................................................91 10.1.2. Nomenklatur und Chemie der Nucleotide..................................................................................................................................91 10.1.3. Metabolismus der Purinnucleotide und Wiederverwertung der Purinbasen..............................................................................92 10.1.4. Purin-Biosynthese......................................................................................................................................................................92 10.1.5. Aktivierung des Ribose-5-phosphats.........................................................................................................................................92 10.1.6. Schritte der Purin-Biosynthese...................................................................................................................................................93 10.1.7. Regulation der Purin-Biosynthese..............................................................................................................................................94 10.1.8. Kinasen wandeln Nucleoside in Nucleotide um und diese in höher phosphorylierte Formen...................................................95 10.1.9. Die Enzyme der Purinwiederverwertung (Salvage Pathway) ermöglichen die Verknüpfung der Purinbasen mit der aktivierten Ribose (PRPP) in einem Schritt.............................................................................................................................................................95 10.1.10. Genetisch defekte HGPRT führt zu Hyperurikämie, in schweren Fällen zu mentaler Retardation und Selbstverstümmelung ................................................................................................................................................................................................................96 10.1.11. Biosynthese der 2-Desoxyribonukleotide................................................................................................................................97 10.1.12. Desoxythymidilat entsteht durch Methylierung von Desoxyuridilat und benötigt Methylen-Tetrahydrofolsäure als C1-Donor ................................................................................................................................................................................................................97 10.1.13. Hemmstoffe der Dihydrofolatreduktase werden bei der Bekämpfung bakterieller Infekte und bei der Chemotherapie eingesetzt...............................................................................................................................................................................................97 10.1.14. Abbau der Purinbasen zu Harnsäure.......................................................................................................................................98 10.1.15. Harnsäure hat eine geringe Löslichkeit....................................................................................................................................98 10.1.16. Bringt ein hoher Harnsäurespiegel irgend einen Vorteil für den Menschen?..........................................................................98 10.1.17. Störungen des Purinstoffwechsels können zu einem überhöhten Harnsäurespiegel führen und akute Gichtanfälle auslösen ................................................................................................................................................................................................................99 10.1.18. Defekte in 2 verschiedenen Enzymen des Purinabbaus, der Adenosin-Desaminase (ADA) und der Purinnucleosid- Phosphorylase (PNP), führen zu Immunschwäche...............................................................................................................................99 10.1.19. Pyrimidinbiosynthese...............................................................................................................................................................99 10.1.20. Regulation der Pyrimidinbiosynthese.....................................................................................................................................100 10.1.21. Wachstumsfaktoren regulieren die allosterischen Eigenschaften des multifunktionellen Proteïns CAD..............................100 10.1.22. Carbamoylphosphat-Synthetase I dient der Harnstoffsynthese, Carbamoylphosphat-Synthetase II dem Aufbau des Pyrimidinringes.....................................................................................................................................................................................101 10.1.23. Die Bildung von Cytidin-Nucleotiden erfolgt durch Aminierung von UTP..............................................................................101 10.1.24. Patienten unter Ammoniak-Stress, etwa bei hereditären Defekten des Harnstoffzyklus, scheiden erhöht Orotsäure im Harn aus (Orotazidurie).................................................................................................................................................................................101 10.1.25. Abbau der Pyrimidinnucleotide zu Endprodukten..................................................................................................................102 10.1.26. Hereditäre Orotazidurie resultiert aus einem Defekt in der Biosynthese der Pyrimidinnucleotide........................................10211. Zellwachstum, Zellteilung und Onkogenese........................................................................................... 103 11.1. Zellvermehrung................................................................................................................................................. 103 11.1.1. Wachstumsfaktoren und Cytokine regulieren Wachstum und Vermehrung eukaryontischer Zellen......................................103 11.1.2. Manche Wachstumsfaktor-Rezeptoren (Cytokin-Rezeptoren) besitzen keine eigene Tyrosinkinase-Aktivität, sie rekrutieren sie.........................................................................................................................................................................................................104 11.2. Zellzyklus.......................................................................................................................................................... 104 11.2.1. Die Grundlage des Zellzyklus-Kontrollsystems bilden zyklisch aktivierte Proteïnkinasen......................................................105 11.2.2. Bei der Regulation der cyclinabhängige Proteïnkinasen wird Cyclin zuerst angereichert, später proteolytisch abgebaut.....106 11.2.3. Verschiedene Cyclin-CDK-Komplexe lösen den Übergang von einer in die nächste Phasen des Zellzyklus aus.................107 11.2.4. Das Retinoblastomproteïn (pRB) ist Regulator des G1/S Übergangs.....................................................................................107 11.2.5. An 3 wichtigen Restriktionspunkten wird kontrolliert, ob alle Bedingungen für den Übergang in die nächste Phase erfüllt sind. ..............................................................................................................................................................................................................108 -5-
  4. 4. Zellchemie 11.3. Oncogenese...................................................................................................................................................... 109 11.3.1. Die Entstehung von Tumoren geht auf Mutationen in Genen zurück, die das Zellwachstum und Zellteilung kontrollieren...109 11.3.2. Dominante Funktionsgewinn-Mutationen (gain of function mutations) in Protooncogenen sind die eine Ursache für Krebs 109 11.3.3. Rezessive Funktionsverlust-Mutationen (loss of function mutations) sind die andere Ursache für die Krebsentstehung......109 11.3.4. Tumorentstehung ist ein mehrstufiger Prozess.......................................................................................................................110 11.4. Eine enzymatische Kaskade löst den programmierten Zelltod aus............................................................110 11.4.1. Caspasen spalten spezifische Funktionsproteïne der Zelle....................................................................................................11212. DNA-Technologie....................................................................................................................................... 113 12.1.1. In vitro Synthese von DNA.......................................................................................................................................................113 12.1.2. Die Polymerase-Kettenreaktion vervielfältigt ausgewählte DNA-Sequenzen.........................................................................113 12.1.3. Bestimmung der DNA-Sequenz...............................................................................................................................................113 12.1.4. Analyse einzelner Gene im Gemisch des gesamten Genoms................................................................................................114 12.1.5. Wie wird eine Genanalyse angefertigt?...................................................................................................................................114 12.1.6. Restriktionsnukleasen..............................................................................................................................................................115 12.1.7. Hybridisierung..........................................................................................................................................................................115 12.1.8. „Blot"- Hybridisierung...............................................................................................................................................................116 12.1.9. In situ Hybridisierung................................................................................................................................................................116 12.1.10. Herstellung von cDNA aus mRNA und Konstruktion von cDNA-Genbanken........................................................................117 12.1.11. Die Technik der DNA-Klonierung...........................................................................................................................................118 12.1.12. Genomische Genbanken.......................................................................................................................................................118 12.1.13. Herstellung radioaktiver Sonden............................................................................................................................................118 12.1.14. Mit Hilfe klonierter DNA können große Mengen von selten vorkommenden Proteïnen produziert werden..........................11913. Anhang....................................................................................................................................................... 121 13.1. Abbildungsverzeichnis.................................................................................................................................... 121 13.2. Formelverzeichnis............................................................................................................................................ 126 13.3. Tabellenverzeichnis......................................................................................................................................... 127 -6-
  5. 5. Zellchemie1. Nukleinsäuren – Struktur, Organisation und Replikation1.1.1. Nukleinsäuren sind die Träger der Erbanlagen Die Desoxyribonukleïnsäure, abgekürzt DNA (engl. deoxyribonucleic acid) ist Träger der genetischen Information vonProkaryonten (wie E. coli) bis hin zum Menschen. Bei einigen Viren kann auch RNA als Träger der genetischenInformation dienen (z.B. bei Retroviren wie HIV). Die DNA muss dabei 2 wichtige Kriterien erfüllen. Sie muss in der Lagesein 1. die genetische Information von Generation zu Generation präzise weiterzugeben und 2. sämtliche wichtigen biologischen Informationen in verschlüsselter Form in sich zu beherbergen. Bei der Teilung einer Zelle wird die in ihr enthaltene DNA vollständig dupliziert und die beiden identischen Kopiengleichmäßig auf Tochterzellen verteilt: Dieser Vorgang wird Replikation genannt. Neu gebildete Zellen aktivieren je nachihrer Bestimmung definierte DNA-Abschnitte und schreiben ihre Information in Ribonucleïnsäuren oder RNA (engl.ribonucleic acid) um: Wir bezeichnen diesen Vorgang als Transkription (Umschreibung). DNA-Abschnitte, die Informationen zur Herstellung eines RNA-Transkripts besitzen, bezeichnet man als Gene; derGroßteil der Gene codiert für Proteïne. Zur Biosynthese von Proteïnen muss die Zelle die in RNA gespeichertenInformationen in Proteïne übersetzen: Dieser Prozess heißt Translation (Übersetzung). Der Fluss der genetischenInformation führt also von DNA über RNA zum Proteïn. Proteïne sind es, die letztlich nahezu alle Lebensfunktionen wieStoffwechsel, Bewegung, Wahrnehmung, Gefühlszustände und mehr bewirken. Dieser fundamentale genetische Prozess: DNA → RNA → Proteïn → (alles weitere) wurde als Zentrales Dogma der Molekularbiologie bezeichnet. Die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur der DNA (Doppelhelix) durch Watson und Crick trugen viel zumVerständnis bei, wie die funktionellen Kriterien der Erbsubstanz erfüllt werden können. Abbildung 1 : DNA-Doppelhelix -7-
  6. 6. Zellchemie1.2. Struktur der DNA1.2.1. DNA ist eine Doppelhelix bestehend aus zwei antiparallel angeordneten Ketten Die Struktur eines DNA-Moleküls ist nicht kompliziert: die DNA besteht aus einer langen unverzweigten Kette vonDesoxyribonukleotiden; dabei können mehrere Hundert Millionen dieser Bausteine zu einem einzigen Polynucleotidaneinander gereiht sein, das dann zum Chromosom verpackt wird (Organisation). Die DNA ist aus 2 Strängen zusammengesetzt, die sich in Form einer rechtshändigen Helix (s. Abb. 1) umeinanderwickeln (Doppelhelix). Jede der beiden Stränge ist aus Nukleotiden aufgebaut. Die 3´-Hydroxylgruppe desvorangegangenen Nucleotids ist mit der 5´-OH-Gruppe des nächsten Nucleotids über eine Phosphatbrücke kovalentverbunden (Formel 1). Somit ist DNA eine lineare Kette von Desoxyribose und Phosphat (Zucker-Phosphat-Rückgrat), andie über das C1-Atom des Zuckers Purin- oder Pyrimidinbasen angeheftet sind. 2 solcher DNA-Stränge sind so angeordnet,dass die Basen innen liegen und das Zucker-Phosphat-Rückgrat außen ist (s. Abb. 1). Das 5-Ende trägt häufig einPhosphat, während das 3´-Ende eine freie OH-Gruppe enthält. Formel 1 : Kovalente Bindung der Nukleotide über PhosphatbrückeDNA-Einzelstrang: Die DNA besteht aus einem Zucker-Phosphat-Rückgrat und Basen. Das C1-Atom der Desoxyribose trägt jeweils eine Base (Adenin, Thymin, Guanin undCytosin). DNA-Stränge haben eine Polarität; übereinkunftsgemäß wird die Sequenz von 5‘ → 3‘ gelesen, im vorliegenden Fall also:A-T-G-A-C (und nicht C-A-G-T-A). Die Basen bilden untereinander Wasserstoffbrücken aus, die die beiden Stränge zusammenhalten (s. Formel 2).Wasserstoffbrücken sind um ein vielfaches schwächer als kovalente Bindungen. Einzelne Wasserstoffbrücken sind beiRaumtemperatur instabil. Die große Zahl an Wasserstoffbrücken machen in einer DNA letztlich die Stabilität aus. Formel 2 : Basenpaare vom Watson-Crick-TypKomplementäre Basen werden durch Wasserstoffbrücken zusammengehalten. Die Wasserstoffbrücken sind nicht kovalenter Natur und lassen sich durch Temperatureinwirkung„aufschmelzen“. Es ist die große Anzahl der Wasserstoffbrücken in der DNA, die diesem Molekül so hohe Stabilität verleiht. Beachte, dass die Winkel der N-glycosidischenBindung (zwischen Desoxyribose und Base) zueinander geringer als 180° ist. Entsprechend bilden sich in der Doppelhelix zwei ungleiche Furchen. -8-
  7. 7. Zellchemie Durch die Geometrie der gepaarten Basen bildet sich, bei der Wicklung der beiden Stränge zu einer Doppelhelix, einekleine und eine große Furche (s. Abb. 1). Es gäbe zwei gleich große Furchen, wenn die Ribosylphosphate der Basenpaarein einem Winkel von 180° zueinander stünden. Über diese beiden Furchen treten Proteïne mit der DNA inWechselwirkung. Funktionelle Aminosäuren dieser Proteïne, wie z.B. Transkriptionsfaktoren, bilden Wasserstoffbrückenmit den Basenpaaren der DNA aus. Die parallele Ausrichtung von benachbarten Basenpaaren begünstigt die Entstehung von hydrophobenWechselwirkungen zwischen ihnen. Idealerweise sind die gepaarten Basen in einer Ebene, d.h. coplanar angeordnet: DieBasen sind gestapelt. In nativer DNA zeigen Basenpaare jedoch oft eine leichte propellerartige Verdrillung, um ihreschichtweise Anordnung zu optimieren. Ähnlich wie die Proteïnhelix kann auch eine DNA-Helix verschiedeneKonformationen und Drehsinne einnehmen. Die in der Natur vorherrschende Form der DNA ist die rechtsgängige B-Helix.1.2.2. Die Replikation der DNA ist semikonservativ Wenden wir uns jetzt der Frage zu, wie die gespeicherte Information über Generationen ohne größere Änderungenweitergegeben werden kann. Vor jeder Teilung muss eine Zelle eine exakte Kopie ihres Genoms anfertigen, um diegenetische Information vollständig an die Tochtergeneration weiterzugeben. Wie kann der riesige DNA-Datenspeicher mitgrößtmöglicher Präzision kopiert werden? Die Struktur des DNA-Doppelstrangs bietet eine plausible Lösung diesesProblems. Da ein Strang mit seiner Nucleotidsequenz ein exaktes „Spiegelbild“ seines Gegenstrangs mit komplementärerNucleotidsequenz ist, tragen beide Moleküle prinzipiell die gleiche genetische Information. Werden die beiden Stränge derDoppelhelix getrennt, so kann nun jeder der beiden Einzelstränge als Vorlage (Matrize) für die Synthese eineskomplementären Gegenstrangs dienen (s. Abb. 2). Bei diesem Kopiervorgang entstehen zwei identische Replikate, die jeeinen Eltern- und einen Tochter-Strang besitzen: Diese Art der Replikation wird als semi-konservativ bezeichnet. Abbildung 2 : Semikonservative Replikation der DNADie beiden parentalen DNA-Stränge dienen als Matrizen für die Synthese von komplementären Filialsträngen.1.2.3. Der genetische Code Eine weitere sehr wichtige Erkenntnis aus der Mitte des 20. Jahrhunderts war, dass genetische Information vor allemaus Bauplänen für Proteïne besteht („ein Gen, ein Proteïn-Hypothese“). Man hat nach der Aufklärung der Struktur derDNA sehr schnell Vorstellungen entwickelt, wie die Information für die Proteïnsynthese in der DNA verschlüsselt seinkönnte. Mehrere Basen zusammen müssen ein „Code“ für den Einbau einer Aminosäure ergeben. Da Proteïne aus 20verschiedenen Aminosäuren aufgebaut sind, reichen Codons mit 2 Basen nicht aus, denn sie könnten nur für 42 = 16Aminosäuren codieren. Man nahm also Codons mit 3 Basen an, die in der Lage wären für bis zu 43 = 64 Aminosäuren zucodieren.1.3. Organisation der DNA Verpackung zellulärer DNA zu Chromatin. Das diploide Genom des Menschen enthält etwa 6 * 109 Basenpaare anDNA mit einer Gesamtlänge von 1,8 m. Die DNA ist auf 22 Autosomen und 2 Geschlechtschromosomen auf geteilt. DieDNA befindet sich im Zellkern, der einen Durchmesser von etwa 6 µm hat. Die DNA muss demnach so verpackt werden,dass 1,8 m in einer Kugel vom Durchmesser von 6 µm Platz finden, d.h. um einen Faktor von etwa 300.000 „verdichtet“werden. Die DNA eukaryontischer Zellen liegt nicht „nackt“ vor, sie ist mit diversen Proteïnen, hauptsächlich mit den basischenHistonen assoziiert. Der Komplex aus DNA und Proteïn wird, aufgrund seiner spezifischen Färbbarkeit, Chromatingenannt. Chromatin unterliegt verschiedenen Organisationsformen: in Zellkernen, die sich in der Interphase befinden,erscheint es lichtmikroskopisch als eine amorphe Masse, ohne sichtbare Zeichen einer strukturellen Organisation, die aberin Wirklichkeit besteht. Kurz vor Eintritt der Zelle in die Mitose beginnt sich das Chromatin zu mikroskopischerkennbaren, kompakten Faserstrukturen zu organisieren, die man Chromosomen nennt. -9-
  8. 8. Zellchemie1.3.1. Histone Die hauptsächlichen Proteïnkomponenten des Chromatins bilden die Histone. Histone sind basische Proteïne, die manin allen Eukaryonten findet. Sie gehören zu den am besten konservierten Proteïnen. Zwischen den Aminosäuresequenzendes Histons H4 aus Rind und Erbse bestehen nur 2 unwesentliche Unterschiede. Die Aminosäuresequenz von H4 hat sichdemnach seit mehr als einer Milliarde Jahren, seit der Divergenz von Pflanzen und Tieren, fast nicht verändert.Offensichtlich lastet ein starker Selektionsdruck auf diesen Proteïnen, weil vermutlich auch kleinere Änderungen dazuführen, dass fundamentale Funktionen der Histone bei der Organisation der DNA zu den verschiedenen Formen vonChromatin und Chromosomen beeinträchtigt wären.1.3.2. Chromatin ist aus Nukleosomen aufgebaut Histone und DNA lagern sich zu Nukleosomen zusammen, den Grundbausteinen der Chromatinstruktur. Je 2 Moleküleder 4 Kernhistone lagern sich zu einem Komplex zusammen - auch Histon-Oktamer genannt - um den sich 146 Basenpaareder DNA-Kette, unter Bildung eines Nukleosomen-Kerns (engl.: nucleosome core particle), wickeln (s. Abb. 3).2 Nukleosomenkerne sind durch eine Verbindungs-DNA (Linker-DNA) miteinander verbunden. Im Gegensatz zu denkonstanten 146 Basenpaaren im Kern ist die Länge der DNA im Verbindungsstück (Linker) ziemlich variabel; sie schwanktzwischen 20 und 100 bp1. Das eigentliche Nukleosom besteht aus dem Nukleosomen-Kern und einem Anteil an der Linker-DNA. Abbildung 3 : Kleinste Einheiten des Chromatins (Nukleosomen)Je 2 Moleküle der 4 Kernhistone lagern sich zu einem Komplex zusammen - auch Histon-Oktamer genannt – um den sich 146 Basenpaare der DNA-Kette, unter Bildung einesNukleosomen-Kerns, winden. Das eigentliche Nukleosom besteht aus dem Nukleosomen-Kern und einem Anteil an der Linker-DNA. Höhere Eukaryonten besitzen ein weiteres Histon, Histon H1. Einfache Eukaryonten, wie die Hefe, haben kein H1.Histon H1 ist sowohl mit der Linker-DNA (deswegen auch „Linker-Histon" genannt) als auch mit dem Nukleosomen-Kern assoziiert. Es ist an der Stelle lokalisiert, an der die DNA in den Nukleosomen-Kern eintritt und ihn nach2 Windungen wieder verlässt. Hier klammert H1 die DNA an den Nukleusomenkern und trägt zu einer weiterenStabilisierung des Nukleosoms bei. Histon H1 ist wahrscheinlich zur Ausbildung höherer Organisationsformen desChromatins (s. Abb. 4) nötig.1 Basenpaaren - 10 -
  9. 9. Zellchemie Abbildung 4 : Höhere Organisationsformen des Chromatins1.3.3. Höhere Organisationsformen des Chromatins Isoliertes Chromatin aus einer Zelle in der Interphase ist im Lichtmikroskop unsichtbar, zeigt aber imElektronenmikroskop eine an Perlenketten erinnernde, aus Nukleosomen-Kernen und Verbindungs-DNA bestehendeFilamentstruktur mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 11 nm (s. Abb. 4b). Diese Filamentstruktur sieht man imElektronenmikroskop unter unphysiologischen Bedingungen, nämlich bei sehr niedriger Ionenstärke. Unterphysiologischen Bedingungen geht die Filamentstruktur spontan in eine kompaktere Fiberstruktur (s. Abb. 4c) über. Wiediese zustande kommt, ist nicht klar. Nach einer von 2 gängigen Vorstellungen sind die Nukleosomen selbst um eine Achsegewunden und bilden eine Spirale, der man den Namen „Solenoid" verlieh. Eine Windung des Solenoids (solenoid, engl.:Spule, Magnetspule) besteht im Durchschnitt aus 6 Nukleosomen. Sie hat einen Durchmesser von 30 nm. Die Ausbildungdieser kompakteren Chromatinstruktur erfordert die Anwesenheit des Histons H 1. Eine neuere Vorstellung ist, dassNukleosomen zickzack-artig gefaltet werden und dadurch die 30 nm Fiberstruktur ausbilden. Auch für dieses Modell ist dieAnwesenheit von H1 nötig. Der überwiegende Teil des Chromatins liegt in Form der kompakteren, 30 nm Struktur vor, diein Zellkernen in der Interphase, besonders aber in Metaphasechromosomen, weiter zu Strukturen höherer Ordnung gefaltetist. 2 – 3 % des Chromatins jedoch scheinen in locker verpackter Form, als 11 nm Filament, vorzuliegen. Man vermutet,dass Chromatin während der Transkription diese Form annimmt. Unter physiologischen Salzkonzentrationen könnte dieselocker verpackte Form durch Modifizierung der Histone (z.B. Acetylierung) entstehen. Das Aufwickeln der DNA umHiston-Oktamere unter Bildung von Nukleosomen, stellt die erste Stufe der Verpackung von DNA zu Chromatin dar, dieOrganisation des 11 nm Filaments in die 30 nm Fiber, die zweite. Bis zu dieser Stufe wurde die DNA zweimal um denFaktor 7, also insgesamt etwa 50 fach komprimiert (7 * 7 = 49). - 11 -
  10. 10. Zellchemie Die 30 nm Faser (Fiber) wird in der Zelle noch kompakter verpackt. Wie die 30 nm Faser zu Strukturen höhererOrdnung gefaltet wird, ist im Detail noch offen. Es gibt Hinweise dafür, dass die 30 nm Faser in Schleifen organisiert ist,die von einer zentralen Achse ausgehen (s. Abb. 4d). In der Interphase könnte dies bereits die höchste Stufe derVerpackung der DNA sein. Lichtmikroskopisch sind diese Strukturen noch nicht sichtbar, denn die Schleifen bestehen auseinem nur 30 nm dicken „Faden“ in einer lockeren Formation. Erst eine dichtere Packung der Schleifen selbst würde zumikroskopisch sichtbaren Strukturen führen. Ein Modell für die nächst höhere Ebene der Organisation, die mit dem Eintrittin die Mitose erfolgt, schlägt vor, dass die Stämme der Schleifen spiralenförmig aufgewickelt werden. Dadurch entstehteine zentrale Achse, aus der die Schleifen radial nach außen - etwa wie die Schaufeln einer Turbine – projizieren. DiesesModell wird deshalb als „radial loop model“ bezeichnet (s. Abb. 4e). Das „radial loop model“ ist aber nur eines vonmehreren möglichen Modellen. Eine dichte Anordnung der Schleifen würde im Lichtmikroskop als ein langer Faden mitunregelmäßiger Oberfläche erscheinen, etwa wie Lampenbürstenchromosomen bei Amphibien. Diese hätte eine geschätzteDicke von 700 nm und wäre damit bereits mikroskopisch erkennbar. Der postulierte Faden könnte sich durch weitereFaltung oder Spiralisierung zu Metaphase-Chromosomen formieren (s. Abb. 4f).1.3.4. Nukleosomen sind dynamische Grundbausteine des Chromatins In den vorigen Abschnitten wurde diskutiert, wie DNA so kompakt gefaltet werden kann, dass sie im Zellkern Platzfindet. Wir müssen uns jetzt die Frage stellen, wie sich diese Verpackung auf die diversen Funktionen der DNA, auf dieReplikation, DNA-Reparatur und Transkription auswirkt. Es muss Mechanismen geben, die eine lokale Auflockerung derChromatinstruktur ermöglichen - etwa innerhalb einer Schleife von Lampenbürstenchromosomen - und Zugang zubestimmten DNA-Abschnitten wie beispielsweise dem Promotor, gewährleisten.1.3.5. Chromatin-Remodellierungs-Maschinen machen die in Nukleosomen verpackte DNA zugänglich und können Histon-Oktamere relativ zur DNA-Sequenz verschieben Vor einigen Jahren wurden Chromatin-Remodellierungs-Komplexe entdeckt, deren vermutliche Funktion darin besteht,in Nukleosomen verpackte DNA zugänglich zu machen. Diese Komplexe bestehen aus mehreren Proteïnen und sind in derLage, Wechselwirkungen zwischen DNA und dem Histon-Oktamer-Komplex vorübergehend aufzulösen. Die dafür nötigeEnergie stammt aus der Hydrolyse von ATP 2. Im Übergangszustand, wo DNA-Proteïn-Kontakte gelöst sind, kann dasHiston-Oktamer relativ zur DNA-Sequenz verschoben werden. Eine Vorstellung zur Funktion dieser Maschinen ist, dasssie beispielsweise Erkennungssequenzen für Transkriptionsfaktoren oder für die RNA-Polymerase freilegen, so dass diesean die DNA binden und ihre Funktion ausüben können. Es ist heute experimentell gesichert, dass Chromatin-Remodellierungs-Maschinen an der Aktivierung einiger Promotoren, und damit an der Regulation der Genexpressionbeteiligt sind.1.3.6. Histon-Acetyltransferasen sind an der Aktivierung von Promotoren beteiligt, Histon-Deacetylasen an ihrer Reprimierung Aus Säugerzellen wurden mehrere Histon-Acetyltransferasen (Histon-Acetylasen) isoliert, die eine Acetylgruppe vonCoënzym-A (CoA) auf Lysinreste von Histonen übertragen. Alle diese Acetylasen können in vitro freie Histone anspezifischen Positionen acetylieren, einige auch Histone, die in Nukleosomen eingebaut sind. Manche Enzyme sindspezifisch für ein bestimmtes Lysin im basischen N-terminalen Arm (z.B. Lysin 5 oder 12 in Histon H4 oder Lysin 14 inHiston H3). Jede Acetylierung eines Lysins führt zur Neutralisierung einer positiven Ladung des Histons. Welchen Einfluss die Acetylierung und Ladungsveränderung von Histonen auf die Chromatinstruktur ausübt, ist nichtgeklärt. Denkbar ist, dass elektrostatische Wechselwirkungen zwischen DNA und dem modifizierten Histon aufgehobenwerden. Möglich ist aber auch eine Lockerung von Wechselwirkungen zwischen Histonen untereinander oder zwischendem modifizierten Histon und anderen Proteïnen. Nukleosomen in transkriptionell aktiven Chromatinbereichen sind häufighyperacetyliert. Ein hoher Grad an Acetylierung von Histonen erhöht die Löslichkeit des Chromatins und erniedrigt seineTendenz zur Aggregation. Die Bindung von Histon H1 an das Nukleosom scheint auch gelockert zu werden, was daraufschließen lässt, dass diese Modifizierung zur Auflösung lokaler kompakter Chromatinstrukturen beiträgt und dieAusbildung lockerer, für Komponenten der Transkriptionsmaschinerie besser zugängliche Formen fördert.1.3.7. Histon-Deacetylasen Eine interessante neue Entdeckung ist, dass Histon-Acetyltransferasen mit so genannten Cofaktoren der Transkriptionassoziiert, oder sogar integraler Bestandteil dieser Faktoren sind. Gleichermaßen interessant ist, dass Histon-Deacetylasen,Enzyme, die Acetylreste von Histonen entfernen, mit sogenannten Corepressoren der Transkription assoziiert sind. DieseBefunde implizieren, dass diese Enzyme einerseits an der Transkriptionskontrolle beteiligt sind (Acetylasen an derAktivierung, Deacetylasen an der Reprimierung) und andererseits, dass sie diese Funktion über eine Veränderung derChromatinstruktur ausüben2 Adenosintriphosphat - 12 -
  11. 11. Zellchemie1.4. DNA-Biosynthese – Replikation Bevor sich eine Zelle teilen kann, muss sie eine neue Kopie ihrer DNA anfertigen, sich replizieren. Bei der DNA-Replikation werden aus dem ursprünglichen DNA-Molekül 2 komplette DNA-Doppelhelices synthetisiert, wobei die neueDoppelhelix in seiner Nucleotidsequenz mit dem elterlichen identisch ist. Da jeder DNA-Strang einer Doppelhelix eineNucleotidsequenz enthält, die zur Nucleotidsequenz des Partnerstranges genau komplementär ist, kann jeder Strang alsMatrize (Vorlage) für die Synthese des neuen Stranges dienen. Die DNA-Synthese wird von DNA-abhängigen, bei Virenauch von RNA-abhängigen, DNA-Polymerasen katalysiert. Die DNA-Polymerasen fördern die schrittweise Addition vonDesoxyribonucleotid-Einheiten an das 3´-Ende der wachsenden DNA-Kette (s. Abb. 1-07) nach der Gleichung: ( DNA ) n −Reste + dNTP → ( DNA ) n +1 Reste + PP Formel 3 : DNA-Kettenverlängerung (allgemeine Formel) Zum Einbau der Nucleotide in die DNA müssen diese aktiviert sein. Die aktivierte Form der Nucleotide sind dieNucleosid-Triphosphate (NTP’s). Bei der Kettenverlängerung durch die DNA-Polymerase erfolgt die Bildung einerPhosphodiesterbindung durch einen hydrophilen Angriff der 3-OH-Gruppe des letzten Nucleotids der Kette am 5-Triphosphat des eintretenden Nucleotids (s. Formel 4). Dabei wird Pyrophosphat freigesetzt. Pyrophosphat wird vonPyrophosphatasen in 2 Phosphate gespalten und damit dem Gleichgewicht der Reaktion entzogen. Die DNA-Synthesewird also von der Energie, die bei der Hydrolyse der Säureanhydridbindungen der Desoxyribonucleosid-Triphosphatenfreigesetzt wird, angetrieben. Alle DNA-Polymerasen katalysieren das Wachstum der DNA-Kette in 5´ → 3´-Richtung. Formel 4 : DNA-Biosynthese (Replikation)Der „rechte“ Matrizenstrang dient als Vorlage (Matrize) für die Bildung des neu synthetisierten Strangs. Die Vorstufen bei der DNA-Synthese sind die Desoxyribonucleosid-Triphosphate. Die 3‘-OH-Gruppe des vorangegangenen Nucleotids greift an der gezeichnete (*) Stelle die Triphosphatgruppe des eintretenden Nucleotids an, wobeiPyrophosphat freigesetzt und eine neue Nucleotidbindung geknüpft wird. Die DNA-Synthese erfolgt von 5‘ nach 3‘.1.4.1. Die DNA-Polymerase ist gleichzeitig eine 3´→ 5´ Exonuclease Mit dieser Aktivität korrigiert sie ihre eigenen Fehler. Die Replikation ist so genau, dass nur ungefähr nach Einbau1 Million Nucleotidpaare ein Irrtum entsteht (Fehlerhäufigkeit = 1:106). Die Zahl der gemachten Fehler ist somit wesentlichgeringer, als man aus theoretischen Überlegungen erwarten müsste. Die Basenpaare A-T und G-C sind die stabilstenPaarungen, es können sich aber auch andere, wie G-T oder A-C, natürlich mit deutlich geringerer Stabilität, ausbilden.Solche inkorrekte Basenpaarungen entstehen wegen der geringen Stabilität zwar viel seltener als die korrekten, aber häufiggenug um eine Zelle durch Anhäufung von Fehlern zu töten, wenn sie nicht korrigiert würden. Die Anhäufung von Fehlernwird dadurch vermieden, dass die DNA-Polymerase ihre Fehler selbst korrigieren kann (Qualitätskontrolle der DNA-Polymerase). Sie hat neben der Polymerase-Aktivität eine korrekturlesende Aktivität. Bevor die Polymerase einNucleotid an die wachsende Kette anhängt überprüft sie, ob das vorhergehende Nucleotid korrekt mit der Matrize gepaartist. Wenn es so ist, hängt sie das nächste Nucleotid an, wenn nicht, spaltet sie das fehlgepaarte Nucleotid am 3´-Ende derwachsenden Kette wieder ab. Damit ist die Polymerase gleichzeitig eine 3´ → 5´ Exonuclease (Exonuclease: spaltet vomEnde her). Die DNA-Polymerase prüft somit das Ergebnis jedes von ihr katalysierten Polymerisationsschrittes, bevor siemit dem nächsten fortfährt. - 13 -
  12. 12. Zellchemie1.4.2. Die Replikation beginnt mit der Entwindung der beiden DNA-Stränge am Replikationsursprung (Ori) durch Helikasen Der Replikationsursprung enthält A- und T-reiche DNA-Abschnitte sowie Sequenzen, die Initiationsproteïne binden.Nach Eintritt der Zelle in die S-Phase werden Proteïne mit Helikase-Aktivität rekrutiert, die unter ATP-Hydrolyse die A-und T-reiche DNA lokal auf winden, indem sie die Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären Basen lockern.Danach bindet eine Gruppe von Proteïnen, die als komplexe „Replikationsmaschinen“ die Replikation durchführen. DieseMaschinen enthalten neben der DNA-Polymerase eine größere Zahl anderer Proteïne mit diversen Funktionen (Helikasen,Primase, etc.). Abbildung 5 : Die Replikation beginnt an besonderen Stellen der DNADie Replikation beginnt an besonderen Stellen der DNA mit einer besonderen Nucleotidsequenz, die man Ori (origin of replication) nennt. Am Ori binden DNA-Helikasen,welche den DNA-Doppelstrang aufwickeln (kleine Blase in der obigen Abbildung). Vom Ori aus läuft die Replikation bidirektional unter Bildung einer Replikationsblase.1.4.3. Die Synthese neuer DNA setzt sich an Replikationsgabeln fort DNA, die gerade repliziert wird, lässt sich durch Elektronenmikroskopie und Radioautographie sichtbar machen (s.Abb. 5). Obwohl die Auflösung der Technik nicht sehr hoch ist, so ist es dennoch sicher, dass lange Strecken nicht alseinzelsträngige Abschnitte vorhanden sind. Somit schließen diese Bilder einen Replikationsmechanismus aus, bei dem sichder DNA-Doppelstrang erst vollständig entwindet, bevor die Synthese neuer DNA beginnt. Die Synthese neuer DNA istvielmehr eng mit der schrittweisen Entwindung der elterlichen DNA verknüpft. Der stets fortschreitende Punkt, an dem dieDNA entwunden und gleichzeitig neu synthetisiert wird (Pfeile in Abb. 5), wird als Replikationsgabel bezeichnet. DasWachstum der DNA-Stränge erfolgt gleichsinnig mit der Fortbewegung der Replikationsgabel. Eine vergrößerte Sicht derEreignisse an der Replikationsgabel zeigt Abb. 6. Der unten liegende neu synthetisierte DNA-Strang würde, da dieelterlichen DNA-Stränge antiparallel angeordnet sind, in 5´ → 3´-Richtung wachsen, während der obere Strang in 3´ → 5´-Richtung wachsen müsste. Nukleinsäurestränge wachsen jedoch ausschließlich in einer Richtung, nämlich von 5´ → 3´.Wie hat die Natur dieses Problem gelöst? Abbildung 6 : Vergrößerte Sicht einer Replikationsgabel (Theorie)Das Wachstum der neu synthetisierten DNA-Stränge folgt der Bewegungsrichtung der Replikationsgabel. Danach müsste einer der Stränge in 5‘ → 3‘-Richtung (untererStrang), der andere in 3‘ → 5‘-Richtung (oberer Strang) wachsen. In Wirklichkeit wachsen aber beide Stränge in 5‘ → 3‘-Richtung.1.4.4. Ein Tochterstrang der DNA wird kontinuierlich synthetisiert, der andere entsteht diskontinuierlich als eine Folge kurzer Fragmente Alle Nucleïnsäurestränge werden in 5´ → 3´-Richtung synthetisiert. Am einen elterlichen Strang wird der als Leitstrangbezeichnete Tochterstrang (in Abb. 7 unten) kontinuierlich in 5´ → 3´-Richtung gebildet, also in der Wachstumsrichtungder Replikationsgabel. Am anderen elterlichen Strang (oben) werden dagegen in 5´ → 3´-Richtung einzelne DNA-Abschnitte (nach ihrem Entdecker Okazaki-Fragmente genannt) diskontinuierlich synthetisiert. Die Bildung der Okazaki-Fragmente erfolgt also entgegengesetzt zur Wanderungsrichtung der Replikationsgabel. Die DNA-Polymerase muss dabeiimmer wieder „Sprünge“ machen. Nach einer Synthese-Phase von der Replikationsgabel weg, erfolgt ein Sprung zurückzur Replikationsgabel. Der diskontinuierlich synthetisierte Tochterstrang wird als Folgestrang bezeichnet. Dieunterbrochenen DNA-Fragmente werden anschließend mit Hilfe der DNA-Ligase zu einem kontinuierlichen DNA-Strangmiteinander verknüpft. - 14 -
  13. 13. Zellchemie Abbildung 7 : Vergrößerte Sicht einer Replikationsgabel (Praxis)An der Replikationsgabel wird der Leitstrang kontinuierlich in Richtung 5‘ → 3‘ synthetisiert. Der Folgestrang wird diskontinuierlich gebildet, zunächst in Form von Okazaki-Fragmenten, die später zusammengefügt werden. Auch der Folgestrang wird in 5‘ → 3‘ synthetisiert.1.4.5. Zur Verknüpfung der Okazaki-Fragmente am Folgestrang werden 3 zusätzliche Enzymaktivitäten benötigt Das erste Enzym entfernt den RNA-Primer. Hierbei handelt es sich um die 5´ → 3´-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase (nicht zu verwechseln mit der 3´ → 5´ korrekturlesenden Aktivität). Die Nuclease entfernt sukzessiveRibonucleotid um Ribonucleotid des RNA-Primers am 5´-Ende des Okazaki-Fragments. Eine DNA-Polymerase, welche inder Zelle als Reparaturenzym fungiert, füllt gleichzeitig die entstandene Lücke mit Desoxyribonukleotiden auf. Schließlich„verschweißt“ die DNA-Ligase 2 Okazaki-Fragmente miteinander, so dass letztlich auch der Folgestrang zu einerkontinuierlichen DNA-Doppelhelix wird. Diese Schritte sind in Abb. 8 dargestellt. Abbildung 8 : Diskontinuierliche Synthese des Folgestranges Die DNA-Polymerasen können von sich aus die Replikation nicht initiieren; sie können nur eine bereits bestehendeKette verlängern. D.h., sie brauchen einen „Primer“. Solche Primer bestehen in Eukaryontenzellen aus kurzen RNA-Stücken, die von der „Primase“ gebildet werden. Später werden die RNA-Primer abgebaut und die Lücken wieder zumDoppelstrang aufgefüllt.1.4.6. Topoisomerasen Bei der Replikation und der Transkription entsteht überspiralige DNA. Zur Entfernung solcher „Supercoils“ dienenTopoisomerasen. Die Topoisomerase I katalysiert die Entspannung der superspiralisierten DNA, indem sie vorübergehendEinzelstrangbrüche in die Kette einfügt. Topoisomerase II, bei Bakterien auch DNA-Gyrase genannt, führt unter ATP-Verbrauch negative Superhelices in die DNA ein. Topoisomerase II führt Doppelstrangbrüche in die Kette ein. Die bakterielle DNA-Gyrase ist Angriffspunkt verschiedener Antibiotika. Nalidixinsäure, die zur Bekämpfung vonHarnwegsinfekten eingesetzt wird, beeinträchtigt die Spaltung und Wiederverknüpfung der DNA bei der Spiralisierung.Novobiocin blockiert die Bindung von ATP an die Gyrase. Die Replikation beider DNA-Stränge erfolgt in der Zelle koordiniert durch eine aus über zehn Untereinheitenbestehenden DNA-Replikationsmaschine. In den vorigen Abschnitten wurden die einzelnen enzymatischen Schritte, die beider DNA-Replikation ablaufen, einzeln erörtert, als würden sie tatsächlich durch voneinander unabhängigen Enzymenkatalysiert. In Wirklichkeit erfolgt die Replikation in einem Multiënzymkomplex, in dem alle Teilschritte - die Bildung undEntfernung der RNA-Primer bis hin zur Leitstrang- und Folgestrangsynthese, miteinander koordiniert sind. - 15 -
  14. 14. Zellchemie Abbildung 9 : Modell der koordinierten DNA-Synthese des Leit- und Folgestranges an der Replikationsgabel (Beispiel Holoenzym III von E. coli)Eine Helikase wandert entlang der DNA und schmilzt die Doppelhelix in der Replikationsgabel auf. An die geschmolzene DNA lagern sich einzelstrangbindende Proteïne an,welche die DNA geschmolzen halten und schützen. Eines der beiden Polymerasen (links) verlängert den Leitstrang am 3‘-Ende. Die Leitstrang-Polymerase (links) und derGleitring verbleiben auf der DNA und die Synthese des Leitstranges erfolgt kontinuierlich. Eine zweite Polymerase (rechts) synthetisiert den Folgestrang diskontinuierlich unterBildung eines Okazaki-Fragments. Die zwei Polymerasen sind über die τ-Untereinheiten miteinander verbunden. Während der gleichsinnigen Bewegung derReplikationskomplexes mit der Replikationsgabel bildet sich am Folgestrang eine Schleife. Stößt die Polymerase an das vorher synthetisierte Okazaki-Fragment an (Primer 1),hält die Replikation an, die Klammer (Gleitring) löst sich, die Folgestrang-Polymerase dissoziiert von der DNA (bleibt aber mit dem Komplex über die τ-Untereinheitgebunden). Die Polymerase bindet sich an den nächsten Primer (Primer 3) und fängt an, nach erneuter Bindung des Gleitrings an das Enzym, das nächste Okazaki-Fragment zusynthetisieren. Der Zyklus wiederholt sich, sobald das neue Okazaki-Fragment an den vorher synthetisierten stößt. Die bakterielle Replikationsmaschine, die auch Polymerase III-Holoenzym genannt wird, ist ein dimerer Komplex ausmindestens 10 verschiedenen Untereinheiten (s. Abb. 9). Ein Teilkomplex baut sich auf dem Leitstrang, ein anderer aufdem Folgestrang auf. Beide Teilkomplexe sind durch eine bestimmte Untereinheit (Untereinheit-τ) eng miteinander zueinem Gesamtkomplex verbunden. Beide Hälften enthalten die Polymerase III wie auch die meisten anderenUntereinheiten, und es wird vermutet, dass die eine Hälfte den Leitstrang, die andere den Folgestrang synthetisiert. Folglichist der Gesamtkomplex ein asymmetrisches Dimer, denn die Folgestrangsynthese enthält Teilreaktionen, die bei derLeitstrangsynthese nicht benötigt werden; entsprechend enthält ein Teilkomplex Untereinheiten, die im anderen nichtgebraucht werden. Die Helikase, die sozusagen am Bug des Holoënzyms die beiden Stränge der DNA entwindet, wird imGesamtkomplex nur in einem Exemplar benötigt. Auch die Primase ist nur einmal vertreten; im Replikationsursprung wirdsie zwar zur Initiation beider DNA-Stränge benötigt, später aber nur noch am Folgestrang. Die Abb. 9 stellt ein anschauliches Modell der koordinierten Synthese des Leit- und Folgestranges am gleichen Ort undzur gleichen Zeit dar, wobei die Synthese des Leitstranges gleichsinnig mit der Bewegungsrichtung der Replikationsgabel,die des Folgestranges entgegengesetzt zu ihr erfolgt. Die Synthese des Folgestranges, welches in diesem Modell eineSchleife bildet, kann so lange fortgesetzt werden, bis die Polymerase an das bereits vorher synthetisierte Okazaki-Fragmentstößt. Dann wird die Synthese unterbrochen und die Polymerase, die den Folgestrang synthetisiert, dissoziiert von der DNAab. Sie kann sich anschließend an die DNA wieder anlagern und beim nächsten Primer (Primer 3) mit der Synthesefortfahren. Bei diesen „Sprüngen“ übernimmt die ß-Untereinheit des Holoënzyms, der auch als Gleitring bezeichnet wird,eine wichtige Funktion. - 16 -
  15. 15. Zellchemie1.4.7. Der Gleitring verleiht der DNA-Polymerase eine hohe Prozessivität und katalytische Kapazität Der bakterielle Gleitring besteht aus zwei, der Gleitring des Menschen aus 3 identischen Untereinheiten, die sich, wieein Ring, um die DNA legen und gleichzeitig mit der Polymerase III eine feste Bindung eingehen. Durch diese Bindungwird die Polymerase mit der Matrize eng verbunden; sie wird zu einem prozessiven Enzym. Eine hohe Prozessivität weisteine Polymerase auf, wenn sie sehr viele katalytische Schritte hintereinander durchführt, bevor sie sich von der Matrizelöst. Die isolierte Polymerase III (beim Menschen die Polymerase α) arbeitet dagegen distributiv, d.h. sie fällt von derMatrize nach weniger als 20 katalytischen Schritten ab, und muss sich neu binden, bevor sie weitere Nucleotide an denwachsenden Strang anknüpfen kann. Die hohe Prozessivität wird also vom Gleitring vermittelt. Der Gleitring, der mit der Polymerase des Folgestranges verbunden ist, öffnet sich, wenn die Polymerase an das bereitssynthetisierte Okazaki-Fragment anstößt. Die Polymerase wird distributiv, fällt von der Matrize, bindet sich an andererStelle und beginnt mit der Synthese des nächsten Okazaki-Fragments. Der andere Gleitring, der mit der Polymerase desLeitstranges verbunden ist, öffnet sich praktisch nie; der Leitstrang wird kontinuierlich verlängert. Die DNA-Polymerase III im Holoënzym hat eine hohe katalytische Kapazität (V max): sie ist in der Lage, die Kette um1000 Nucleotide in der Sekunde zu verlängern. Die isolierte Polymerase III, ohne Beteiligung der anderen Proteïn-Untereinheiten, ist auch aktiv, schafft aber nur etwa 20 – 40 Nucleotide in derselben Zeit. Zur hohen Geschwindigkeit derPolymerase trägt die Prozessivität entscheidend bei. Der Gleitring ist also auch für die hohe Synthesegeschwindigkeit imHoloënzym mitverantwortlich.1.5. DNA-Reparatur1.5.1. Die postreplikative Korrektur der DNA hält Mutationsraten niedrig und verhindert Krebs Durch Einwirkung verschiedener Strahlen wie UV-Licht, Röntgenstrahlung, oder radioaktive Strahlung sowie durchEinwirkung einer Vielzahl chemischer Agenziën, unterliegt die DNA ständiger unerwünschter Veränderungen. Durch UV-Licht entstehen in erster Linie Pyrimidin-Dimere, besonders Thymidin-Dimere (s. Abb. 10). Solche veränderte DNA kannnicht mehr korrekt transkribiert und repliziert werden. Eine Desaminierung von Cytosin erzeugt Uracil (s. Abb. 11), damitkann es zu einer Fehlpaarung mit Adenin kommen und zu einer bleibenden Mutation führen. Röntgenstrahlung kann zuStrangbrüchen führen. Aber auch die DNA-Polymerase kann, trotz ihrer korrekturlesenden Funktion, falsche Basenpaare,so genannte „mismatch“, Fehlpaarungen, in die DNA einführen. Entsprechend zeigen viele Substanzen mit mutagenenEigenschaften auch eine karzinogene Wirkung. Formel 5 : Thymidin-DimerUnter UV-Licht kann es zu kovalenten Bindungen zwischen benachbarten Thymin-Basen desselben DNA-Stranges kommen. Thymin-Dimere könne durch Excisionsreparaturentfernt werden.1.5.2. Enzymatische Reparatur von DNA-Schäden Die Natur hat mehrere Mechanismen entwickelt, um solche Schäden, wie sie im vorigen Kapitel aufgeführt wurden,wieder zu reparieren. Die durch Sonnenbestrahlung entstandene dimerisierte Thymidine können durch DNA-Reparaturenzyme erkannt und wieder aus dem Strang entfernt werden. 4 verschiedene Reparatursysteme sind heute relativgut untersucht, die eines der oben genannten Schäden erkennt und repariert. Thymidin-Dimere werden vom NER-Systembehoben. NER steht für nucleotide excision repair. Durch Desaminierung von Cytosin entstandenes Uracil in der DNAwird vom „base excision repair“-System (BER) korrigiert. Durch die DNA-Polymerase eingeführte Fehlpaarungen werdenvom „mismatch repair system“ behoben. Doppelstrangbrüche durch das „Rekombinative Reparatursystem“. - 17 -
  16. 16. Zellchemie Abbildung 10 : Desaminierung von Cytosin durch salpetrige Säure und deren Salze (Nitrite)Aus Cytosin entsteht Uracil. Dieses wird in der menschlichen Zelle als falsch erkannt, da normalerweise kein Uracil in der DNA vorkommt. Die Uracyl-Glykosylase kann dieseBase entfernen und das BER-System den Strang reparieren1.5.3. Nucleotide Excision Reparatur bei E. coli Die Reparatur beginnt, wenn sich 2 Moleküle des Proteïns A (korrekt: UVrA = UV-repair A) zu einem Dimerzusammenfinden, an welches sich das Proteïn UVrB unter Hetero-Trimerbildung anlagert (s. Abb. 12). Dieser Komplex hatDNA-Bindungseigenschaften und bindet an doppelsträngige DNA. Der Komplex hat auch Helikase-Aktivität und wandertunter ATP-Hydrolyse an dem DNA-Strang entlang um nach Schäden Ausschau zu halten. Wenn der Komplex auf einelädierte Stelle trifft (z.B. Strukturveränderung durch die Bildung von Thymidindimeren), dann dissozïieren die A-Proteïneab und das Protein B rekrutiert das Proteïn UVrC. Dieser neue Komplex hat Endonuclease-Aktivität und führt2 Einzelstrang-Brüche genau 8 Basen vor und 5 Basen nach der lädierten Stelle ein. Die konzertierte Wirkung des ProteinsUVrD (auch eine Helikase) und der DNA-Polymerase bewirken die Entfernung des herausgeschnittenen DNA-Fragmentsund zusammen mit der Ligase die Reparatur. Abbildung 11 : Nukleotid Excisions Reparatur des Bakteriums E. coliMit Hilfe dieses Reparatursystems können Thymidin-Dimere aus der DNA entfernt werden. Das menschliche System funktioniert im Prinzip genauso wie das bakterielle.Erbliche Defekte in diesem Reparatursystem führen beim Menschen zu Xeroderma pigmentosum, Cockayne´s Syndrom und Hauttumoren. Das eukaryontische System unterscheidet sich vom bakteriellen System im Wesentlichen dadurch, dass es komplizierterist. Statt der 4 Proteïne A - D beim Bakterium, sind mindestens 9 Proteïne beim Menschen beteiligt. Schäden in diesemReparatursystem führen beim Menschen zu schweren Krankheitsbildern wie Xeroderma pigmentosum, Cockayne´sSyndrom und Hauttumoren.1.5.4. Die Entfernung von Uracil aus DNA erfolgt durch das BER-System Nach der hydrolytischen Entfernung des Uracils durch die Uracil-DNA-Glycosylase, einem Enzym, das dieglycosidische Bindung zwischen Zucker und Base spaltet, verbleibt ein Desoxyriboserest ohne Base, eine so genannteApurinsäure bzw. Apyrimidinsäure in der DNA. Diese DNA wird durch die AP-Endonuklease gespalten. Der Zucker-Phosphatrest wird durch die DNA-Phosphodiësterase entfernt. Anschließend wird die Lücke durch die DNA-Polymeraseund Ligase, wie beim NER-System, geschlossen. - 18 -
  17. 17. Zellchemie Abbildung 12 : Basen Excisions Reparatur1.5.5. Entfernung von fehlgepaarten Nukleotiden erfolgt durch das „mismatch repair system“ Trotz der 3´ → 5´-Exonucleaseaktivität der DNA-Polymerase kann es zu Fehlpaarungen kommen. Das Problem bei derBehebung eines Schadens durch Fehlpaarung ist, dass das Reparatursystem erkennen muss, welcher Strang der elterliche ist(und damit der richtige) bzw. welcher Strang der neu synthetisierte, und damit der fehlerhafte Strang ist. Erinnern wir uns daran, dass die menschliche DNA an Cytosinresten methyliert sein kann, meistens, wenn nach einemCytosin ein Guanin folgt. Solche CpG-Sequenzen werden häufig zu 5-Methyl-CpG modifiziert. Da die Methylierung erstnach der Replikation der DNA stattfindet, gibt es eine kurze Zeitspanne, innerhalb deren die neu synthetisierte DNA nochunmethyliert ist. Das „mismatch repair system“, das besonders gut bei Bakterien erforscht ist, beim Menschen jedoch nochnicht in allen Details aufgeklärt werden konnte, erkennt einerseits die fehlgepaarte Stelle in der DNA mit Hilfe des MutS-Proteïns, so wie welcher der beiden Stränge der elterliche ist, wahrscheinlich an der Methylierung der Cytosine mit Hilfedes MutH-Proteïns. Die Reparatur erfolgt, wie bei den meisten anderen Systemen durch Ausschneiden (Excision) desfehlerhaften Oligonucleotids, Neusynthese und Ligierung an der Bruchstelle. Bei genetisch bedingten Defiziënzen im mismatch-repair-system besteht eine erhöhte Anfälligkeit für HNPCC (engl.für hereditary non polyposis colon carcinoma), also einem erblichen nicht polypösen Kolonkarzinom.1.5.6. Doppelstrangbrüche werden durch das Rekombinative Reparatursystem korrigiert Durch ionisierende Strahlen oder bestimmte Chemotherapeutika können DNA-Doppelstrangbrüche entstehen. Da indiesem Fall der Fehler in beiden Strängen gleichzeitig auftritt, muss sich das Reparatursystem am anderen Schwester-Chromatid orientieren. Die Reparatur erfolgt durch homologe Rekombination. - 19 -
  18. 18. Zellchemie Bei genetisch bedingten Defiziënzen in diesem System (z.B. Defekte in den Genen brc1 und brc2) entsteht häufigBrustkrebs. - 20 -
  19. 19. Zellchemie2. Genexpression und Genregulation2.1.1. DNA ist die „Speicherform“ der genetischen Information, RNA die „Arbeitsform“ Die DNA nimmt nicht direkt an der Proteïnsynthese teil. Von spezifischen Teilen der DNA (einzelne Gene) werdendurch einen Prozess, der als Transkription bezeichnet wird, „Arbeitskopien“ der DNA hergestellt. Von jedem Genwerden, je nach Bedarf, mehr oder weniger RNA-Kopien hergestellt. Etwa 90 % der zellulären Nukleinsäure ist RNA, nur etwa 10 % ist DNA. Die RNA lässt sich in 3 große Gruppeneinteilen: 1. ribosomale RNA (rRNA), die in Ribosomen eingebaut wird und als struktureller Bestandteil von Ribosomen wichtige Funktionen ausübt 2. Messenger-RNA (mRNA), die die Größe und Sequenz eines Proteïns bestimmt 3. Transfer-RNA (tRNA), die bei der Übersetzung der Nucleïnsäuresequenz in eine Proteïnsequenz eine Schlüsselrolle spielt Die Transkription wird von (DNA-abhängigen) RNA-Polymerasen katalysiert. RNA-Polymerasen werden gewöhnlichaus mehreren Polypeptidketten gebildet und haben eine Molmasse von 500.000 oder mehr. Menschliche Zellen enthalten3 verschiedene RNA-Polymerasen. RNA-Polymerase I synthetisiert die großen ribosomalen RNAs. RNA-Polymerase IIist für die mRNA zuständig, während RNA-Polymerase III eine Vielfalt kurzer RNAs, wie z.B. die tRNAs, synthetisiert.Polymerase II wird stark, Polymerase III schwächer und Polymerase I kaum von dem Pilzgift α-Amanitin gehemmt.2.1.2. RNA-Synthese (Transkription) Die RNA-Synthese, auch Transkription genannt, beginnt, wenn ein RNA-Polymerase-Molekül an eine Promotor-Sequenz bindet. Damit sind wir bei einem Thema von ganz allgemeinem Interesse: den spezifischen Wechselwirkungenzwischen zwei ganz unterschiedlichen Makromolekülen, nämlich Proteïnen und Nukleïnsäuren. Genau wie die Enzyme, diesich in der Evolution so entwickelt haben, dass sie unterschiedliche Substrate binden und verschiedenartige Reaktionenkatalysieren, so haben manche Proteïne sich auch so angepasst, dass sie ganz bestimmte Nucleotidsequenzen in einemNucleïnsäurestrang erkennen und binden. Die Stelle auf der DNA, an die ein Molekül der RNA-Polymerase bindet,bezeichnet man als Promotor. Die RNA-Polymerasen der Zellen erkennen Promotoren aber nicht allein, sondern sind aufdie Mitwirkung zusätzlicher Faktoren angewiesen, die man als allgemeine Transkriptionsfaktoren bezeichnet. DerPromotor stellt nicht nur eine Bindungsstelle für die Polymerase dar, sondern enthält auch die Information darüber, welcherder beiden DNA-Stränge transkribiert wird und an welcher Stelle die Transkription beginnt. Abbildung 13 : Kettenverlängerung (Elongation) bei der TranskriptionDie Kettenverlängerung erfolgt durch einen Angriff der 3‘ -OH-Gruppe im endständigen Nukleotid des wachsenden Stranges auf das 5‘-Phosphat des neu hinzugekommenenNucleosidtriphosphats. Das dabei freigesetzte Pyrophosphat wird anschließend gespalten, so dass die Reaktion in Richtung der Polymerisierung vorangetrieben wird. DieNucleotidsequenz des Matrizenstranges bestimmt die Nucleotidsequenz der neu synthetisierten RNA. Die Polymerase wandert an der DNA-Matrize in 3´ → 5´-Richtung entlang (s. Abb. 14). Wo die Polymeraseentlangläuft, wird die DNA vorübergehend auseinander gewunden und ein komplementärer RNA-Strang synthetisiert, dervon seinem 5 -Ende aus in 3 -Richtung wächst. Dabei werden die Ribonucleosidtriphosphate (NTPs) zuNucleosidmonophosphaten hydrolysiert und in die RNA eingebaut. Die von der RNA-Polymerase katalysierte Reaktionlautet: RNA n + NTP → RNA n +1 + PPi Formel 6 : Allgemeine Formel der RNA-Polymerase katalysierten Reaktion - 21 -
  20. 20. Zellchemie Reaktionen, die zur Synthese von Nukleïnsäuren (und Proteïnen) führen, unterscheiden sich grundlegend von denen desIntermediärstoffwechsels. Manche Reaktionen, die zur Bildung von Zuckern, Lipiden, Aminosäuren und anderen kleinenMolekülen führen, befinden sich unter Umständen so nahe am Gleichgewicht, dass man eine nennenswerte Rückreaktionmessen kann; Nukleïnsäure- und Proteïnsynthesereaktionen dagegen müssen unter Bedingungen ablaufen, die so gut wiekeine Rückreaktion zulassen. Bei der Transkription wird diese Anforderung durch eine 2. Reaktion erfüllt. Sie lautet: PPi → 2Pi Formel 7 : Spaltung des Pyrophosphates und wird von einem anderen Enzym katalysiert, einer Pyrophosphatase. In diesem Fall wird das in der ersten Reaktionentstandene Pyrophosphat (PPj) zu 2 Molekülen anorganischem Phosphat (Pi) hydrolysiert. Dabei wird so viel freieEnthalpie frei, dass der Einbau der Nucleotide praktisch nicht mehr umzukehren ist. Abbildung 14 : Initiation eines eukoryotischen Gens durch die RNA-Polymerase II(A) Der allgemeine Transkriptions-Initiationsfaktor TFIID bindet an die TATA-Box im Promotor, worauf sich auch TFIIB binden kann (B).(B) (C) Der Rest der allgemeinen Transkriptionsfaktoren sowie die RNA-Polymerase lagern sich an den Komplex an.(C) (D) TFIIH phosphoreliert unter Verbrauch von ATP die RNA-Polymerase II, die dadurch ihre Konformation ändert, vom Komplex freigesetzt wird und (E) die Transkription beginnen kann.2.1.3. Initiation der Transkription eines eukaryontischen Gens beginnt am Promotor und benötigt allgemeine Transkriptionsfaktoren Es wurde vor vielen Jahren beobachtet, dass das Zusammenbringen eines Gens und von gereinigter RNA-Polymerase IInicht zu einer Transkription des Gens führt. Die RNA-Polymerase für sich alleine kann die Transkription in vitro nichtinitiieren. Dazu braucht sie allgemeine Transkriptionsfaktoren. Die allgemeinen Transkriptionsfaktoren positionieren dieRNA-Polymerase am Promotor an die richtige Stelle, helfen bei der Trennung der beiden DNA-Stränge, so dass dieTranskription starten kann und helfen nach Transkriptionsbeginn die RNA-Polymerase aus dem Komplex im Promotorfreizusetzen, damit der begonnene Transkriptionsprozess fortgesetzt werden kann. Die Abb. 15 zeigt die Rolle einigerallgemeinen Transkriptionsfaktoren bei der Initiation der Transkription. - 22 -

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