SlideShare ist ein Scribd-Unternehmen logo
Biochemie

Inhaltsverzeichnis




                     -3-
Biochemie

Proteïne................................................................................................................................................................ 7
    Hierarchie der Zellkomponenten.................................................................................................................................. 7
    Allgemeiner Aufbau der Proteïne................................................................................................................................. 7
    Analyse der Raumstruktur von Proteïnen...................................................................................................................7
    Die 20 Aminosäuren...................................................................................................................................................... 8
    Struktur der Proteïne..................................................................................................................................................... 9
    Analyse von Proteïngemischen................................................................................................................................. 11
    Nachweis mit Ninhydrin.............................................................................................................................................. 15
    Bestimmung der Aminosäuresequenz......................................................................................................................15
    Zuordnung der Disulfidbrücken................................................................................................................................. 20
Enzyme / Coënzyme.......................................................................................................................................... 21
    Enzyme......................................................................................................................................................................... 21
    Coënzyme und prosthetische Gruppen.................................................................................................................... 27
    Hämoglobin / Myoglobin............................................................................................................................................. 32
Chemische Modifizierung von Proteïnen........................................................................................................ 35
    Zweck:.......................................................................................................................................................................... 35
    Unspezifische Reagenzien......................................................................................................................................... 36
    Gruppenspezifische Reagenzien............................................................................................................................... 36
    Reagenzien zur Änderung der Ladung...................................................................................................................... 37
    Hydrophobisierung von Enzymen.............................................................................................................................38
    Reversible Reagenzien............................................................................................................................................... 38
    Active-Site Labeling.................................................................................................................................................... 38
    Suizid-Substrate.......................................................................................................................................................... 38
    Photoaffinity-Label...................................................................................................................................................... 39
    Bifunktionelle Reagenziën.......................................................................................................................................... 39
    Semireversible Reagenzien........................................................................................................................................ 40
    Trägergebundene Enzyme.......................................................................................................................................... 40
Lipide.................................................................................................................................................................. 43
    Allgemeine Übersicht.................................................................................................................................................. 43
    Fette.............................................................................................................................................................................. 43
    Glycolipide................................................................................................................................................................... 43
    Phospholipide.............................................................................................................................................................. 44
    Isoprenoidlipide........................................................................................................................................................... 44
    Biomembranen............................................................................................................................................................ 45
Monosaccharide................................................................................................................................................ 47
    Nomenklatur................................................................................................................................................................. 47
    Zyklische Zucker......................................................................................................................................................... 48
    Nucleotide.................................................................................................................................................................... 48
Stoffwechsel....................................................................................................................................................... 49
    Unterscheidung der Lebewesen................................................................................................................................ 49
Kohlenstoff-Stoffwechsel................................................................................................................................. 51
    Glycogen...................................................................................................................................................................... 51
    Glycolyse...................................................................................................................................................................... 52
    Oxidative Decarboxylierung....................................................................................................................................... 56
    Hormonelle Steuerung................................................................................................................................................ 57
    Gluconeogenese.......................................................................................................................................................... 60
    Der Citratzyklus........................................................................................................................................................... 61
    Oxidative Phosphorylierung und Atmung................................................................................................................ 62
    Der Pentosephosphatweg.......................................................................................................................................... 65
Der Fettsäurestoffwechsel................................................................................................................................ 69
    Fettsäureabbau............................................................................................................................................................ 69
    Ketonkörper entstehen bei vorherrschendem Fettabbau.......................................................................................71
    Fettsäure-Synthese..................................................................................................................................................... 71
Aminosäureabbau und Harnstoffzyklus.......................................................................................................... 73
    Transaminierung......................................................................................................................................................... 73
    Oxidative Desaminierung........................................................................................................................................... 73
    Der Harnstoffzyklus..................................................................................................................................................... 74
Biosynthese von Makromolekülen................................................................................................................... 75
    Tetrahydrofolat als C1-Überträger............................................................................................................................. 75
    Zyklus der aktivierten Methylgruppe......................................................................................................................... 75
    Purin-Biosynthese....................................................................................................................................................... 76


                                                                                             -4-
Biochemie

    Pyrimidinbiosynthese................................................................................................................................................. 78
    Abbau der Purine......................................................................................................................................................... 78
    NAD-Biosynthese........................................................................................................................................................ 79
    Synthese von Sphingolipiden und Gangliosiden.....................................................................................................79
    Biosynthese von Phospholipiden.............................................................................................................................. 80
    Cholesterin-Synthese.................................................................................................................................................. 80
Photosynthese................................................................................................................................................... 83
    Lichtreaktion................................................................................................................................................................ 83
    Dunkelreaktion............................................................................................................................................................. 85
Anhang............................................................................................................................................................... 87
    Abbildungsverzeichnis............................................................................................................................................... 87
    Formelverzeichnis....................................................................................................................................................... 90
    Gleichungsverzeichnis............................................................................................................................................... 94
    Tabellenverzeichnis.................................................................................................................................................... 95




                                                                                          -5-
Biochemie


Proteïne
Hierarchie der Zellkomponenten
   •      Zelle

   •      Organellen                              z.B. Mitochondrien, Chloroplasten, Zellkern
   •      Supramolekulare Strukturen              Multiënzymkomplexe, Ribosomen, kontraktile Systeme
   •      Makromoleküle                           Nucleïnsäuren, Proteïne, Polysaccharide, Lipide
   •      Bildungsblöcke                          Nucleotide, Aminosäuren, Monosaccharide, Glycerol und Fettsäuren
   •      metabolische Zwischenprodukte           Pyruvat, Citrat, Malat
   •      Vorstufen aus de Umwelt                 CO2, N2, NH3, H2O

Allgemeiner Aufbau der Proteïne
   Proteïne sind Heteropolymere der Aminosäuren (d.h. aus verschiedenen Molekülen zusammengesetzt).
    Ein weiterer wichtiger Typ kovalenter Bindungen in Proteïnen sind die Disulfidbrücken zwischen Cysteïnhälften
(cross linkage). Die Bindungen können von Proteasen hydrolysiert werden.




                                           Abbildung 1 : Allgemeiner Aufbau der Proteïne


Nomenklatur:
   Außer beim Glycin ist das α-C-Atom asymmetrisch substituiert, es tritt daher optische Aktivität auf.
    Man unterscheidet 2 sterische Reihen, die L- und die D-Reihe, sowie zweierlei Konfigurationszuweisungen, die S- und
die R-Konfiguration. Nur L-Aminosäuren, die fast alle (Ausnahme L-Cysteïn) S-Konfiguration besitzen, sind Bausteine
der Proteïne.




                                         Formel 1 : Sterischer Unterschiede der Aminosäuren

   Der optische Drehungssinn ist unabhängig von der Zugehörigkeit zu einer sterischen Reihe.

Analyse der Raumstruktur von Proteïnen
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie: (NMR = Kernmagnetische Resonanz)
   Das Proteïn wird in ein magnetisches Feld gebracht und die unterschiedliche Resonanz der Atomkerne gemessen.
   Vorteil: Es ergibt sich ein 3D-Bild, welches sich aus der Summe von Einzelmolekülen in Lösung ergibt.

Röntgenstrukturanalyse eines Kristalls der Verbindung
   Bestrahlung des Moleküls mit Röntgenstrahlen, wobei die Strahlen bei unterschiedlicher Elektronendichteverteilung
unterschiedlich gebeugt werden. Durch die Mobilität ergeben sich allerdings Unschärfen im Kristall. Die Struktur des
Myoglobins (ähnlich dem Hämoglobin) wurde durch diese Methode aufgeklärt.
   Vorteil: Auflösungsgrenze = 0,15 nm (bzw. 0,2 - 0,35 nm) (beim LM: » 400 nm)
   Nachteil: eingeschränkte Dynamik




                                                                -7-
Biochemie


Die 20 Aminosäuren




                        Abbildung 2 : Konfiguration der Aminosäuren bei unterschiedlichen pH-Werten


Neutrale hydrophobe Aminosäuren




                                       Formel 2 : Neutrale hydrophobe Aminosäuren


Neutrale hydrophile Aminosäuren




                                        Formel 3 : Neutrale hydrophile Aminosäuren


Saure Aminosäuren




                                               Formel 4 :Saure Aminosäuren


Basische Aminosäuren




                                             Formel 5 : Basische Aminosäuren



                                                            -8-
Biochemie


Struktur der Proteïne
Primärstruktur
      Die Aminosäuresequenz in der Polypeptidkette.




                                                Formel 6 : Aminosäuresequenz in der Polypeptidkette


Sekundärstruktur
   Bei der α-Helixstruktur sind Wasserstoffbrücken intramolekular zwischen der NH- und der 4 AS1-Reste entfernten CO-
Gruppe ausgebildet.
      Dadurch entsteht die schraubenförmige Anordnung der Aminosäuren.




                                   Abbildung 3 : Schraubenförmige Anordnung der Aminosäuren (α-Helix-Struktur)

   Ganghöhe (pitch): Länge, die die α-Helix bei voller Drehung zunimmt. Eine Aminosäure bringt eine Drehung von 100°,
daher nach 3,6 AS eine volle Umdrehung.
   Bei der β-Faltblattstruktur kommt es zu einer zur Kettenrichtung senkrechten Ausbildung der H-Brücken (bei α-Helix:
parallel zur Helixachse) zwischen verschiedenen Polypeptidketten oder gefalteten Kettenteilen.
Seide
      -       reine Faltblattstruktur (fast nur Gly, Ser, Ala)
      -       an jeder 2. Position Gly
      -       Ketten parallel zur Faserachse
Kollagen
      -       häufigstes Proteïn in Wirbeltieren (Haut, Knochen, Knorpel)
      -       spezielle Helixstruktur
      -       mechanisch stark beanspruchbar
      -       denaturiertes Kollagen » Gelatine

Tertiärstruktur
      3D-Knäuelung der α-Helix und der Faltblattstruktur. Stabilisierung durch Disulfidbrücken:




                                 Abbildung 4 : Tertiärstruktur (3D-Knäuelung der α-Helix und der Faltblattstruktur)




1
    Aminosäuren

                                                                        -9-
Biochemie

Disulfidbrücken

   Besonders wichtig bei kleinen Polypeptiden (s. Anfinsen-Experiment), da Struktur stabilisierend (Insulin,
Chymotrypsin, Trypsin, α-Keratin (Haar))
Wasserstoffbrücken
   Elektrostatische Wechselwirkungen zwischen schwach acidem Donor und schwach basischem Akzeptor im Inneren des
Proteïns:
   a)       zwischen Peptidbindungen (α-Helix, β-Faltblatt)
   b)       zwischen Seitenketten der einzelnen AS
   und an der Oberfläche mit Wasser. Wechselwirkung mit Wasser ist energetisch günstiger.
Ionische Wechselwirkungen
   Relativ geringe Bedeutung für die Struktur, da meist an Enzymoberfläche
   →        hauptsächlich Wechselwirkungen mit dem Lösungsmittel
Hydrophobe Wechselwirkungen
   AS mit unpolaren Seitenketten: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro
   -        Versuch den Kontakt mit H2O zu vermeiden
   -        intramolekulare Gruppierung / Ausschluss von H2O
   -        hydrophobe AS innen, hydrophile außen (dadurch gute H2O-Löslichkeit)
Anfinsen-Experiment
   Untersuchung der Gründe für die Ausbildung einer Tertiärstruktur globulärer Proteïne.
   Ausgangsmaterial: RNAse: 124 AS, 4 S-S-Brücken
   Denaturierung in 8 M Harnstoff und Reduktionsmittel → Spaltung der Disulfidbrücken
   1.       Erst oxidiert und dann Harnstoff entfernt → falsche zufällige Renaturierung (keine Enzymaktivität)
   2.       Erst Entfernung des Harnstoffs (partielle Renaturierung) → richtige Faltung und richtige Disulfidbrücken
            (Enzymaktivität)
   Ergebnis: Die Aminosäuresequenz spezifiziert die Tertiärstruktur globulärer Proteïne.




                            Abbildung 5 : Die Aminosäuresequenz spezifiziert die Tertiärstruktur globulärer Proteïne

Domänen
   Proteïne bestehen oft aus mehreren Faltungseinheiten, die als Domänen bezeichnet werden.




                                                                     -10-
Biochemie




                                                   Abbildung 6 : Domänen bei Proteïnen


Quartärstruktur
   Anlagerung mehrerer Polypeptidketten (Untereinheiten) aneinander
   →      polymere Proteïne
   Bindungen wie bei der Tertiärstruktur.
   z. B. Virenhüllen, Hämoglobin, Multiënzymkomplexe




                              Abbildung 7 : Anlagerung mehrerer Polypeptidketten aneinander (Quartärstruktur)

Analyse von Proteïngemischen
   Probleme:
   -      Vorkommen oft in sehr kleinen Mengen (1 % vom Trockengewicht, Peptidhormone wie z. B. Insulin in noch
          kleineren Mengen)
   -      Stabilität: labil gegen pH (Bsp.: LDH dissoziiert bei pH < 6 → Denaturierung)
   -      Temperatur: kältelabil (z.B. F1-ATPase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase einiger Spezies),
          wärmelabil: die meisten Enzyme
   Um Substanzgemische aufzutrennen, kann man 5 Eigenschaften der Moleküle benutzen:
   1.     Molekülgröße
   2.     Elektrische Ladung
   3.     Absorptionsverhalten
   4.     Löslichkeit
   5.     Affinität

Chromatographie
   Physikalisch-chemisches Verfahren zur analytischen und präparativen Trennung gelöster oder gasförmiger
Verbindungen.
    Die chromatographische Trennung beruht darauf, dass eine mobile Phase über eine stationäre Phase wandert und dabei
die zu trennende Substanz mit unterschiedlicher Geschwindigkeit transportiert.


                                                                   -11-
Biochemie

   An der stationären Phase, dem Trägermaterial (z. B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Stärke, Zellulose, Silikonöl,
Ionenaustauschern) tritt eine unterschiedliche Verteilung der zu trennenden Substanzen mit der mobilen Phase (meist
organische Lösungsmittel) auf.
HPLC: (High Pressure Liquid Chromatography)
   Säulenchromatographie unter hohem Druck. Dadurch kann ein feineres Trennmaterial verwendet werden, bei dem die
Durchlaufzeit ohne Druck zu hoch wäre.

Molekülgröße
Zentrifugation (differentielle bzw. fraktionierte Zentrifugation)
   Voraussetzung: Molekulargewichtsunterschiede.
   Der Faktor S entspricht dabei der Sedimentationskonstante, ist also ein Maß für das Gewicht (ist aber auch abhängig
von der Form der Moleküle).

Ultrazentrifugation (Dichtezentrifugation)
   Sedimentierung der Proteïne durch extreme Zentrifugation (bis 300.000 g). Träger: Suchrosegradient

Dialyse
    Durch Osmose werden mit Hilfe einer semipermeablen Membran kleine Moleküle aus der Lösung entfernt. Zurück
bleiben nur die großen Moleküle (z.B. Proteïne).

Ultrafiltration
   Durch Druck oder Zentrifugationskraft werden kleine Moleküle und Wasser durch eine semipermeable Membran
gepresst.

Gelfiltration (Gelchromatographie)
   Das Substanzgemisch läuft über eine Säule aus stark hydratisiertem, polymeren Material wie z. B. Sephadex
(Polysaccharid-Derivat), BioGel (Polyacrylamid-Derivat) oder Agarose (Polysaccharid).
   Die Gelpartikel werden mit verschieden großen Poren hergestellt.
   Die Substanzen mit unterschiedlicher Größe dringen mit unterschiedlichem Maße in die Gelpartikel ein. Große
Substanzen laufen daher schneller durch die Säule als kleine Substanzen.




                                         Abbildung 8 : Gelfiltration (Gelchromatographie)


Elektrische Ladung

Ionenaustauschchromatographie (Ionenaustauscher)
   Das in der Säule befindliche Trägermaterial ist in der Lage, einen Teil der an austauschaktiven Gruppen gebundenen
Ionen gegen andere Ionen reversibel zu tauschen.
Trägermaterial
   ●        Sulfoniertes Polystyrol
   ●        Polyacrylamid
   ●        Zellulose
   ●        andere Zucker (Dextrane ≡ „Sephadex“)
Kationenaustauscher
   CM (Carboxymethyl / schwach sauer):                               R-CH2-COO-
   Sulfonyl:                                                         RSO3H + NaCl → RSO3Na + HCl

                                                              -12-
Biochemie

Anionenaustauscher
   DEAE (Diethylaminoethyl / schwach basisch):
                    R-CH2-CH2-NH-(CH2-CH3)2]+OH- + NaCl → R-CH2-CH2-NH-(CH2-CH3)2]+Cl- + NaOH
   Das im Austauscher verbleibende Substanzion kann durch Elution (Lösen) mit geeigneten Ionen, je nach
Dissoziationskonstante, abgelöst werden (z. B. durch pH-Gradiënten / Ionenstärkegradiënten).

Elektrophorese
  Bewegung elektrisch geladener Teilchen im elektrischen Feld. Die negativ geladenen Teilchen wandern dabei zur
Anode und die positiv geladenen zur Kathode. Die Wanderungsgeschwindigkeit hängt vom Verhältnis Masse/Ladung ab.
Hochspannungs-Trägermaterial
   1.      Papier
   2.      Kieselgelplatte
Niederspannungs-Trägermaterial
   1.      Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
   2.      Zelluloseacetat-Folien
Isoelektrische Fokussierung
   Durch den isoelektrischen Punkt (IEP) lassen sich Proteïngemische auftrennen (s.a. isoelektrische Fällung). In
Verbindung mit einer Elektrophorese wandern die Proteïne im elektrischen Feld. Dabei ist der pH-Gradiënt im Gel von
Bedeutung: Die Proteïne wandern bis zu der Stelle, wo der pH-Wert ihrem IEP entspricht. Da sie an diesem Punkt keine
Ladung mehr tragen, können sie nicht weiterwandern.

Absorptionsverhalten

Adsorptionschromatographie
    Die Trennung erfolgt über eine Säule, auf die die Substanzmenge gegeben wird. Der obere Teil der Säule adsorbiert nun
die Substanzmenge. Durch Zugabe von Lösungsmittel wird die Substanz wieder gelöst und fließt in der Säule ein kleines
Stück weiter, bis sie erneut adsorbiert wird. Dieser Vorgang wiederholt sich kontinuierlich, wodurch es durch die
unterschiedlichen Adsorptionsverhalten der verschiedenen Stoffe zu einer klaren Trennung der Substanzmenge kommt.
Durch die Zugabe entsprechender Mengen an Lösungsmittel können die einzelnen Fraktionen des Eluats in einem
Fraktionssammler entnommen werden.

Löslichkeit

Aussalzen
   z. B. Fällung (fraktioniert) mit Ammoniumsulfat (bis 3 M löslich in Wasser)
   ●       zunächst Anstieg der Löslichkeit des Proteïns bei Zugabe von Salz → Einsalz-Effekt
   ●       bei hoher Salzkonzentration → Aussalz-Effekt (Lösungsmittel reicht nicht mehr aus, Proteïne fallen
           nacheinander aus und werden abzentrifugiert)

Fällung
   Aceton-Fällung und Ethanol-Fällung; durch niedrige Diëlektrizitätskonstante wird die Solvatationskraft des Wassers
herabgesetzt, die Proteïne fallen aus.
   Aber: Fällung normalerweise bei niedrigen Temperaturen → Limitierung bei kältelabilen Proteïnen

Isoelektrische Fällung
   Am isoelektrischen Punkt (IEP) ist die Zahl der positiven Ladungen im Proteïn gleich der Zahl der negativen Ladungen.
Bei diesem pH-Wert ist die Löslichkeit des Proteïns minimal. Durch die Veränderung des pH-Wertes können Proteïne mit
unterschiedlicher Ladungsverteilung nacheinander abgetrennt werden.

Verteilungschromatographie
   Wie bei der Adsorptionschromatographie wird auch hier in einer Säule gearbeitet. Als Adsorptionsmittel dienen
Kieselgur, Zellulosepulver, Stärke oder Glaspulver, die mit Wasser befeuchtet werden.




                                                          -13-
Biochemie

   Das zu trennende Substanzgemisch wird gelöst und auf die Säule gegeben. Mit einem organischen Lösungsmittel wird
das Substanzgemisch langsam durch die Säule gespült. Eine Trennwirkung kommt dabei nicht durch die Adsorption der
Substanzen an dem Trägermaterial zustande, sondern durch das Eindringen der Stoffe in den Wasserfilm auf der
Oberfläche des Trägers. Dabei verteilen sich die Substanzen zu einem bestimmten Verhältnis in den beiden Phasen.
    Substanzen, die in organischen Lösungsmitteln leichter löslich sind als in Wasser, wandern schneller durch die Säule als
leicht wasserlösliche Substanzen.

Gaschromatographie
    Das Substanzgemisch wird verdampft und mit einem inerten Trägergas (Helium, Argon oder Stickstoff) durch ein
langes, dünnes Rohr geleitet. Die einzelnen Komponenten des Gasgemisches lösen sich mehr oder weniger gut in der
stationären Phase (Flüssigkeitsfilm auf der Innenseite des Rohrs) und können somit am Ende der Säule nach kürzerer oder
längerer Strömungszeit nachgewiesen werden.

Papierchromatographie
    Sie ist eine Verteilungschromatographie, die Trennwirkung beruht auf unterschiedlicher Löslichkeit der Substanzmenge
in dem Lösungsmittel.
   Das Lösungsmittel-Substanzgemisch steigt durch Kapillarkräfte auf. Während des Vorgangs kommt es zur Bildung
zweier Laufmittelphasen (eine hydrophile und eine hydrophobe Schicht). Durch die Wechselwirkung zwischen
hydrophilem Trägermaterial und hydrophilem Laufmittel wandert der hydrophobe Teil des Substanzgemisches schneller
und weiter hinauf.
   Als stationäre Phase dient dabei mit Wasser getränktes Filterpapier. Die Auftrennung (Entwicklung) erfolgt in einer gut
verschlossenen Chromatographieapparatur.

Dünnschichtchromatographie
    Als Trennschicht verwendet man oft Kieselgel, Kieselgur und Aluminiumoxid, das mit Wasser unter Zusatz von Gips
als dünnflüssige Suspension auf eine rechteckige Glas- oder Kunststoffplatte aufgetragen wird. Die Auftrennung
(Entwicklung) erfolgt in einer gut verschlossenen Chromatographieapparatur.
   Das Trennverfahren läuft wie bei der Papierchromatographie ab, jedoch sind die Zeitersparnis und eine empfindlichere
Auftrennung Vorteile der Dünnschichtchromatographie.
   Bei der 2D-Dünnschichtchromatographie wird nach Abschluss des ersten Laufes (a.) die Platte um 90° gedreht und ein
zweiter Lauf (b.) in einem anderen Fließmittel durchgeführt.




                                      Abbildung 9 : Eindimensionale DC (links) und 2D-DC (rechts)


Affinität

Affinitätschromatographie:
    Die Proteïne können gezielt aus einem Proteïngemisch isoliert werden. Das Prinzip basiert auf der Fähigkeit der
Proteïne, bestimmte Moleküle (Liganden) spezifisch zu binden. Dabei dient als Säulenmaterial z.B. das Polysaccharid
Agarose, an dessen Oberfläche die Liganden chemisch gebunden werden. Wird die Proteïnmischung nun auf die Säule
gegeben, so bleibt nur das dem Liganden entsprechende Proteïn hängen, der Rest fließt nach Zugabe von Pufferlösung
durch die Säule hindurch. Das gewünschte Proteïn kann dann durch Zugabe einer hohen Konzentration des Liganden in
löslicher Form von dem Trägermaterial eluiert werden. Dadurch besteht mit dieser Methode die Möglichkeit, bestimmte
Proteïne extrem hoch zu reinigen.




                                                                 -14-
Biochemie




                                        Abbildung 10 : Prinzip der Affinitätschromatographie

Gruppenspezifische Affinitätschromatographie
   z.B. AMP-Säulen zur Reinigung von NAD-abhängigen Proteïnen
Hochspezifische Affinitätschromatographie
   z.B. Reinigung von Antikörpern, Substratsäulen

Nachweis mit Ninhydrin




                                            Formel 7 : Aminosäurenachweis mit Ninhydrin

Bestimmung der Aminosäuresequenz
   Erste vollständige AS-Sequenz 1953 am Rinder-Insulin durch Frederick Sanger.
   Warum ist das Wissen über die AS-Sequenz wichtig?
   ●      Aufklärung der Kristallstruktur
   ●      Verständnis molekularer Mechanismen
   ●      Vergleich anderer Proteïne → Hinweise auf Funktion / evolutionäre Zusammenhänge

Versuchsplan
   1.     Bruttozusammensetzung der AS (Aminosäureanalyse)
   2.     Bestimmung der Endgruppen (Hinweis auf verschiedene Polypeptidketten)
   3.     Trennung in Einzelketten
   4.     Spaltung der Polypeptidketten in kleine Fragmente
   5.     Sequenzierung der kleinen Fragmente
   6.     Wiederholung von 4. unter Bildung anderer Fragmente → Überlappungsfragmente

                                                               -15-
Biochemie

   7.         Zuordnung der Disulfid-Gruppen innerhalb oder zwischen Untereinheiten

Aminosäureanalyse
   Zur Analyse wird eine Totalhydrolyse unter sauren und/oder basischen Bedingungen durchgeführt.

Sauer
   Erhitzen der Polypeptide in Gegenwart eines Überschusses an 6 N HCl bei 100 – 120 °C für 10 – 100 Stunden in einem
evakuierten, unter Vakuum zugeschmolzenen Röhrchen ist die normale Methode der Totalhydrolyse. Unter diesen
Bedingungen findet keine Razemisierung und keine O 2-Oxidation statt. Für die Freisetzung von Val, Leu, Ile sind lange
Zeiten erforderlich.
   Nachteil:
   -          teilweise Zerstörung von Ser, Thr, Tyr
   -          weitgehende Zerstörung von Trp
   -          aus den Amid-Gruppen von Asn und Gln entstehen Carboxylgruppen und Ammoniumionen, die in die Messung
              von Glu und Asp mit eingehen

Basisch
   Durch Kochen der Peptide in 2 – 4 M NaOH bei 100 °C für 4 – 8 h kann Trp getrennt bestimmt werden.
   Nachteil:
   -          Zerstörung von Cys, Ser, Thr, Arg
   -          andere AS werden teilweise desaminiert und racemisiert
   Vorteil:
   -          liefert die Trp-Werte

Endgruppenbestimmung
   Die Endgruppen geben Hinweise auf unterschiedliche Polypeptidketten. So besteht z.B. Insulin aus 2 AS-Ketten, die
über 2 Disulfidbrücken verbunden sind. Es ergeben sich also 2 Aminosäuren vom C-Terminus und 2 vom N-Terminus.

N-Terminus
Prinzipien:
   Sanger / Dansylierung




                                                  Abbildung 11 : Sanger / Dansylierung

   a)         AS-Kette
   b)         Markierung
   c)         Hydrolyse → einzelne AS
   Edman-Abbau
   a)         AS-Kette, Markierung, Hydrolyse → AS-Kette + 1 AS
   b)         Erneuter Ablauf




                                                       Abbildung 12 : Edman-Abbau


                                                                  -16-
Biochemie

Sanger-Reaktion (1945)




                                                 Formel 8 : Sanger-Reaktion

   Reaktion der freien α-Aminogruppe der Proteïne mit 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB) unter Bildung von gelben 2,4-
Dinitrophenyl-Derivaten.
    Durch die Hydrolyse der so entstandenen Peptide mit 6 N HCl werden alle Peptidbindungen gespalten. Es bleibt also
als einzige farbige Verbindung das 2,4-Dinitrophenyl-Derivat mit der N-terminalen Aminosäure übrig, welches abgetrennt
und durch chromatographischen Vergleich (2D-Dünnschichtchromatographie) mit bekannten 2,4-Dinitrophenyl-Derivaten
der einzelnen AS identifiziert werden kann.
   Problem: Nukleophile AS-Seitenketten können ebenfalls reagieren.
Dansylierung




                                                  Formel 9 : Dansylierung

   Statt dem DNFB wird Dansylchlorid (5-Dimethylamino-1-naphthalinsulfonylchlorid) als Markierungsreagenz
verwendet. Nach der Hydrolyse können die Dansyl-Derivate durch deren fluoreszierenden Charakter bestimmt werden.
Diese Methode ist 100 mal empfindlicher als die Methode von Sanger.
Edman-Abbau




                                                 Formel 10 : Edman-Abbau

   Großer Vorteil des Edman-Abbaus: Der Rest der AS-Kette bleibt nach der Abtrennung der terminalen AS intakt und
kann daher weiter untersucht werden. Somit kann das Proteïn Schritt für Schritt abgebaut werden. Das entstandene
Phenylthiohydantoin (PTH) wird über die Gas-Chromatographie (oder HPLC) getrennt und bestimmt.
   Dieser Vorteil wurde benutzt, um einen „Sequenator“ (Solid-Phase) zu bauen. Dieses Gerät führt die AS-Bestimmung
automatisch durch und bestimmt die entstehenden PTH-Derivate im Anschluss durch Chromatographie.




                                                           -17-
Biochemie

C-Terminus
Hydrazinolyse (Akabori-Reaktion)




                                            Formel 11 : Hydrazinolyse (Akabori-Reaktion)

    Alle Peptidbindungen werden durch Umwandlung der AS in Hydrazide gespalten. Es liegen daher nur noch
Aminosäure-Hydrazide vor. Einzige Ausnahme dazu ist die AS des C-terminalen Endes der ursprünglichen Proteïnkette.
Sie besitzt als einzige noch eine Carboxylgruppe und kann als freie Säure leicht chromatographisch identifiziert werden.
Reduktion
   der AS durch Lithiumborhydrid zum entsprechenden α-Aminoalkohol. Nach der Hydrolyse kann dieser Alkohol
chromatographisch identifiziert werden.
Abspaltung der C-terminalen AS
   durch Carboxypeptidase (eine Exopeptidase). Nachteil: das Enzym spaltet schnell die nächste AS ab.

Trennung in Einzelketten (falls erforderlich)
   a)       Entfaltung der AS-Kette durch Harnstoff → Aufhebung der Tertiär- und Quartärstruktur.
   b)       Spaltung der S-S-Bindungen durch
              -      Reduktion (z. B. NaBH4)
              -      Umsetzung mit Jodacetat: Bildung von stabilen Derivaten (Carboxymethylcysteïn)

                                R - SH + I - CH2 - COOH → R - S - CH2 - COOH + HI
                                                Formel 12 : Trennung mit Iodessigsäure


Spaltung in Fragmente (Partialhydrolyse)
   Zur späteren Identifizierung der Fragmente ist es wichtig, spezifische Spaltstellen zu erhalten.
   a)       Bromcyan-Spaltung
   Spaltung der Peptidbindungen an denen ein Methionin beteiligt ist.




                                                    Formel 13 : Bromcyan-Spaltung

   b)       Enzymatische Spaltung durch Proteasen (Hydrolyse der Peptidbindungen)
   Peptidasen (= Exopeptidasen) spalten AS vom Ende ab
   1.       Carboxypeptidase (C-Terminus)
   2.       Aminopeptidase (N-Terminus)

   Proteïnasen (= Endopeptidasen) spalten an spezifischer Spaltstelle innerhalb der AS-Kette
                                                   spaltet am C-terminalen Ende von
                             Trypsin               Lys, Arg
                             Chymotrypsin          Phe, Trp, Tyr
                             Pepsin                Phe, Trp, Tyr und verschiedene andere
                                             Tabelle 1 : Proteïnasen und ihre „Spaltstellen”




                                                                  -18-
Biochemie

   Thermolysin spaltet am N-terminalen Ende von Leu, Ile, Val Viele Proteasen werden als inaktive Vorstufen
(Zymogene, Proënzyme) sezerniert und dann proteolytisch aktiviert.
   Beispiele:
   ●          Bildung von Chymotrypsinogen als inaktive Vorstufe im Pankreas, Aktivierung zu Chymotrypsin im Dünndarm
              durch Spaltung einer Arg-Ile-Bindung mittels Trypsin.
   ●          Bildung von Trypsinogen als inaktive Vorstufe im Pankreas, Aktivierung zu Trypsin im Darm durch
              Enteropeptidase oder Trypsin selbst (autokatalytische Aktivierung).

Sequenzierung der Fragmente
   a)         chemisch:
        ●        Edman-Abbau
   b)         physikalisch:
        ●        FAB (fast atom bombardment)
            -        Variante der Massenspektroskopie, bis 25 AS
            -        bombardiert in Glycerol gelöste Peptide mit Ar- oder Xe-Atomen.
            -        Fragmentieren in verschieden große Teilstücke
            -        Vergleich zwischen Massen und Fragmenten → Sequenz
   Vorteil:
            -        mehrere Peptide (Gemisch, Verunreinigungen) möglich
            -        Untersuchung posttranslational veränderter Proteïne (z.B. blockierter N-Terminus)
            -        sehr hohe Empfindlichkeit
   Nachteil:
            -        hohe Gerätekosten
   c)         enzymatisch:
        ●        Exopeptidasen

Überlappungsfragmente
   Durch die Bildung weiterer, mit den bisherigen überlappender Fragmente kann auf die Sequenz des ganzen Proteïns
zurückgeschlossen werden. Um andere Fragmente zu erhalten, wird die Spezifität der entsprechenden Enzyme geändert.
   Dadurch kommt es zu einer anderen Spaltung und zu anderen Überlappungsfragmenten.
Spaltung am Beispiel von Trypsin
   a)         normale Spaltstellen:                Spaltung nach Lys und Arg
   b)         weniger Spaltstellen:                Blockierung von Lys → nur noch Spaltung bei Arg
        ●        Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid:




                                         Formel 14 : Spaltung von Tripsin mit Bernsteinsäureanhydrid

        ●        Reaktion mit Iodessigsäure:

                    Lys - ( CH2 ) 4 - NH2 + I - CH2 COOH → Lys - ( CH2 ) 4 - NH - CH2 − COOH + HI
                                               Formel 15 : Spaltung von Tripsin mit Iodessigsäure

   c)         mehr Spaltstellen:
        ●        Umwandlung von Cysteïn in Pseudolysin, dadurch Spaltung nach Cysteïn, Lys und Arg:




                                                                     -19-
Biochemie




                                          Formel 16 : Umwandlung von Cysteïn in Pseudolysin

Zuordnung der Disulfidbrücken
   1.       Carboxylierung der SH-Gruppen (mit Iodessigsäure)
   2.       Tryptische Verdauung ohne Reduktion der S-S-Brücken
   3.       Isolierung der vernetzten Peptide
   4.       Reduktion der S-S-Brücken (NaBH4 / pH 3)
   5.       Trennung der Oligopeptidketten in Gegenwart von Mercaptoethanol (Schutz der freien SH-Gruppen)
   6.       Sequenzierung der Einzelketten

        → Carboxymethylierte Cysteïne = frühere freie SH-Gruppen
        → freie SH-Gruppen = frühere S-S-Brücken




                                                                -20-
Biochemie


Enzyme / Coënzyme
Enzyme
Wirkungsweise von Enzymen
   Enzyme sind meist Proteïne (seltener Ribonucleïnsäuren).
   ●      Wirken als Katalysator
   ●      Verändern nicht die Lage des Gleichgewichts

   ●      Erhöhen die Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung durch Erniedrigung der Aktivierungsenergie ∆G
   ●      Ermöglichen milde Reaktionsbedingungen
   ●      Fähigkeit zur Regulation
   ●      Große Reaktionsspezifität




              Abbildung 13 : Erhöhen die Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung durch Erniedrigung der Aktivierungsenergie ∆G

   Die Bindung der Substrate erfolgt am aktiven Zentrum durch
   ●      ionische oder hydrophobe Wechselwirkungen
   ●      kovalente Zwischenstufen




                                            Abbildung 14 : Bindung der Substrate am aktiven Zentrum


Isoënzyme
   Enzyme gleicher Funktion, die sich aber in ihrer Struktur und infolgedessen in manchen Eigenschaften voneinander
unterscheiden.
Lactat-Dehydrogenase
   Tetramer aus 4 identischen Untereinheiten pro „Typ“.
   Der H-Typ dominiert im Herzmuskel, der M-Typ im Skelettmuskel und in der Leber. Diese Untereinheiten setzen sich
zu verschiedenen Tetrameren (multiplen Formen) zusammen:
                                                           H4, H3M, H2M2, HM3, M4
   Der H4-Typ besitzt eine höhere Affinität zu Pyruvat als der M 4-Typ. Deshalb wird der H 4-Typ durch hohe
Pyruvatkonzentrationen gehemmt (Substrathemmung).
   Diese homologen Enzyme sind durch Genduplikation entstanden:
         LDH-H4 (Mensch) — LDH-H4 (Schwein): höhere Homologie als: LDH-H4 (Mensch) — LDH-M4 (Mensch)

                                                                      -21-
Biochemie

Unterschiede bei Chymotrypsin und Trypsin
Substratbindungszentrum
   Chymotrypsin benötigt eine aromatische oder eine sperrige unpolare Seitenkette auf der Aminoseite der abzuspaltenden
Peptidkette.
    Die Nische (eine unpolare Tasche) ist dagegen bei Trypsin verändert (Aspartat statt Serin). Das Aspartat kann eine
starke elektrostatische Bindung mit einer positiv geladenen Lysin- oder Argininseitenkette des Substrats eingehen.




                                      Abbildung 15 : Unterschiede bei Chymotrypsin und Trypsin


Katalytische Triade von Trypsin
   Beispiel für kovalente Katalyse, Säure-Base-Katalyse, Deformation des Substrats.
   Beim Trypsin (und Chymotrypsin) bilden Histidin 57, Aspartat 102 und Serin 195 eine katalytische Triade, wodurch die
Reaktionsfähigkeit von Serin gesteigert wird.
   Wirkungsweise: Nach Zugabe eines Substrats wird ein Proton vom Serin 195 auf das Histidin 57 übertragen und der
Imidazolring durch Aspartat 102 stabilisiert.




                                           Abbildung 16 : Katalytische Triade von Trypsin


Einheiten der Enzymaktivität

Definition der Enzymaktivität:

                                                         1 μmol Substratumsatz
                                     1 Unit (U) =
                                                                  min
                                               Gleichung 1 : Absolute Enzymaktivität

                                         U / ml:                      Volumenaktivität
                                         U / mg Enzym:                spezifische Aktivität
SI-Einheiten:

                                                            1 mol Substratumsatz
                                     1 Katal (kat) =
                                                                      s
                                               Gleichung 2 : Absolute Enzymaktivität

                                         kat / kg:               spezifische Aktivität
                                                       1 U = 16,67 nkat


                                                               -22-
Biochemie

Regulation der Enzymaktivität

Aktivierung von Vorstufen
   Viele proteolytische Enzyme liegen in einer inaktiven Form vor. Man bezeichnet sie als Zymogene oder Proënzyme.
Die Aktivierung erfolgt durch die Hydrolyse einer oder mehrerer Peptidbindungen.
   In diese Gruppe fallen viele Verdauungs- und Blutgerinnungsenzyme.
   Beispiel: Zymogen des Trypsins = Trypsinogen

   N-terminales Hexapeptid wird abgespalten:           Spaltstelle = Lys - Ile
   →      Lys = natürliche Spaltstelle des Trypsins
   →      Die Protease Enteropeptidase braucht nur wenig aktives Trypsin herzustellen, dann:
   →      autokatalytische Aktivierung (Trypsin ist sein eigener Katalysator)

Allosterische Regulation (z. B. Feedback-Inhibition)
   Allosterie ist die Erscheinung, dass Makromoleküle (insbesondere Proteïne) ihre Konformation und Aktivität ändern,
wenn ein bestimmtes Molekül (ein Effektor - kann auch gleichzeitig Substrat oder Produkt sein) an das Makromolekül
gebunden wird. Die Bindung erfolgt an einer separaten Effektorbindungsstelle außerhalb des aktiven Zentrums (AZ), was
eine Konformationsänderung im AZ bewirkt und somit einen hemmenden (Effektor ist ein Inhibitor) oder aktivierenden
(Effektor ist Aktivator) Einfluss ausübt. Die allosterische Hemmung unterscheidet sich dabei von der kompetitiven
Hemmung, bei der der Inhibitor im AZ selbst bindet, durch ihre Kinetik.
   Bei der Feedback-Hemmung treten Endprodukte einer Reaktionskette als Inhibitoren früherer Reaktionsschritte auf, um
den Reaktionsweg abzuschalten.
   Beispiel: Regelung der ACTase bei der Pyrimidinbiosynthese, Hämoglobin etc.
Umsatzdiagramme (Substratproduktion über Zeit):




                                    Abbildung 17 : Umsatzdiagramme (Substratproduktion über Zeit)

Modelle zur Erklärung der Kooperativität bei oligomeren Proteïnen:
   a)     „Symmetriemodel“
   Alles-oder-Nichts-Umwandlung, kann aber nicht negative Kooperativität erklären!
   Voraussetzungen:
   -      Es gibt für jede Untereinheit 2 mögliche Konformationszustände (T bzw. R)
   -      Die Untereinheiten können immer nur in einer Form vorliegen, d.h. nur RR oder TT-Dimere, keine RT-
          Dimere! (T = „inaktiv“, R = „aktiv“)




                                                   Abbildung 18 : Symmetriemodel

   b)     „Sequenzmodel“
   Voraussetzungen:
   -      Es gibt für jede Untereinheit 2 mögliche Konformationszustände (T bzw. R)
   -      Diese Konformationsänderung kann die Substratbindungsaffinität der anderen Untereinheiten erhöhen oder
          erniedrigen




                                                    Abbildung 19 : Sequenzmodel


                                                                -23-
Biochemie

Kovalente Modifikation
   Die Aktivität wird durch eine Phosphorylierung oder Dephosphorylierung eines speziellen Serinrestes festgelegt.
Beispiel: Phosphorylase-Kinase

Assoziation - Dissoziation
    Es findet eine Regulation durch andere Proteïne statt. Manche Enzyme werden aktiv, wenn der Ca 2+-Spiegel in der Zelle
steigt. Das entsprechende Regulatorproteïn ist das Calmodulin; es bindet im Calcium-beladenen Zustand an die Proteïne
und aktiviert sie dadurch.
   Regulation in Form von Abbau (Proteolyse) durch spezielle Proteasen.
   Regulation durch „de novo“-Synthese.

Hemmkinetik
Kompetitive Hemmung
   Bei der kompetitiven Hemmung konkurriert ein Inhibitor mit dem Substrat um die Bindung an das aktive Zentrum.
   Dies verläuft nach dem Massenwirkungsgesetz, wodurch die Hemmung durch eine hohe Substratkonzentration
ausgeglichen werden kann.




                                              Abbildung 20 : Kompetitive Hemmung


Unkompetitive Hemmung
   Hier bindet der Inhibitor an den Enzym-Substrat-Komplex, nicht aber an das freie Enzym. Der ternäre Komplex ESI ist
nicht produktiv.




                                             Abbildung 21 : Unkompetitive Hemmung


Nicht-kompetitive Hemmung
   Die Bindung des Inhibitors erfolgt allosterisch, d.h. an einem anderen Zentrum (nicht dem aktiven Zentrum) des
Enzyms. Der Inhibitor verändert das aktive Zentrum, daher ergibt sich eine kleinere oder keine Aktivität. Der ternäre
Komplex ESI ist nicht produktiv.




                                            Abbildung 22 : Nicht-kompetitive Hemmung


                                                              -24-
Biochemie

Partiell nicht-kompetitive Hemmung
   Wie die nicht-kompetitive Hemmung, aber auch aus ESI Produktbildung möglich. Die Substrat- und allosterische
Bindungsstelle überlappen teilweise.




                                        Abbildung 23 : Partiell nichtkompetitive Hemmung


Das Michaelis-Menten Modell
   Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit als Funktion der Substratkonzentration




                                           Abbildung 24 : Das Michaelis-Menten Modell


Herleitung der Michaelis-Menten-Gleichung
                                                   k1          k3
                                        E + S ↔ ES ↔ E + P
                                                  k2           k4

                                        k = Geschwindigkeitskonstante
                                            Gleichung 3 : Michaelis-Menten-Gleichung

   Für die Anfangsgeschwindigkeit spielt k4 keine Rolle und wird vernachlässigt. Weitere Annahme:

                                            [ S] >> [E] ⇔ S total ≈ S frei
   Dann gilt:

                                    ES - Bildungsrate = k 1 [E] [ S]
                                     ES − Zerfallsrate = k 2 [ES] + k 3 [ES]
                                                  k 1 [E] [ S] = k 2 [ES] + k 3 [ES]
   Daraus folgert:

                                                          k 2 + k 3 [ E ][ S ]
                                                KM =               =
                                                              k1      [ ES ]
                                         Gleichung 4 : Definition der Michaelis-Konstanten




                                                               -25-
Biochemie

                                   [E]        =       [E ]
                                                        T            −              [ES]
                               freies Enzym       Gesamtenzym              Enzym−Substrat −Komplex


                               → [ES] =
                                                      [ S]  ∗ [E T ]
                                             [ S] + K M
                               ν 0 = k 3 [ES]
                               ν max = k 3 [E T ]

                               → ν 0 = k 3 [E T ] ∗
                                                         [ S]
                                                     [ S] + K M
                               ν 0 = ν max ∗
                                                  [ S]
                                              [ S] + K M
                                                   Gleichung 5 : Ableitung von v0

   Bei v0 = ½ vmax

                                     →
                                          1         ν
                                            ν max = max
                                                          [ S] → K = [ S ]
                                          2        [ S] + K M     M

                                              Gleichung 6 : Folgerung für v0 = ½ vmax


Bestimmung der Konstanten KM und vmax
Lineweaver / Burk

   Kehrwert der Michaelis-Menten-Gleichung: → lineare Darstellung möglich




                                         Abbildung 25 : Diagramm nach Lineweaver / Burk

Hanes

                                                             [ S]
                                                                  ν0
                                                               [ S]
Eadie / Hofstee

                                                               ν0
                                                             ν0
                                                                    [ S]
Kinetik bei allosterischen Enzymen
  Allosterische Enzyme halten sich nicht an das Michaelis-Menten-Modell und zeigen oft eine sigmoide (S-förmige)
Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration.




                                                               -26-
Biochemie




                                          Abbildung 26 : Kinetik bei allosterischen Enzymen


Zwei- (oder Mehr-)Substrat-Reaktionen
Single Displacement
   a)    random order
             +B
E + A ↔ EA ←→ EAB
                                         E+C+D
               +A
E + B ↔ EB ←→ EAB
   b)      compulsory order
                                                 +
                                      E + A ↔EA ← B →EAB →E + C + D
                                                 
                                      E + B ← →EB
                                            
Double Displacement
   Pingpong-Mechanismus (siehe Fettsäure-Synthese)

Coënzyme und prosthetische Gruppen
   Coënzyme sind Nicht-Eiweißverbindungen.
   Fast alle hier aufgeführten Substanzen enthalten ADP als Baustein! Die klassische Definition des Katalysators trifft auf
Coënzyme nicht zu, da sie aktiv verändert werden und erst in einem 2. (ebenfalls enzymatischen) Schritt wieder ihre
ursprüngliche Form erhalten.
    Die prosthetische Gruppe ist eine Nicht-Eiweißverbindung, die fest (kovalent oder ionisch) an das Enzym gebunden
ist. Sie kann eventuell nur ein einfaches Ion sein, was jedoch benötigt wird, um die volle Kapazität des Enzyms
herzustellen.

Wasserstoffübertragende Coënzyme
Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADP)
   Oxidierte Formen (NAD+ bzw. NADP+)




                                           Formel 17 : Oxidierte Form von NAD und NADP

   Wasserstoffaufnahme → reduzierte Formen (NADH bzw. NADPH)




                                          Formel 18 : Reduzierte Form von NAD und NADP




                                                                -27-
Biochemie

Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD)




                                                  Formel 19 : FAD-Gleichgewicht

   FAD kann auch durch Übertragung einzelner Elektronen über eine radikalische Zwischenstufe reduziert werden.

Flavinmononucleotid (FMN)
   -        Wasserstoffaufnahme wie bei FAD (FMN → FMNH2)
   -        prosthetische Gruppe bei der Elektronentransportkette




                                                 Formel 20 : Flavinmononucleotid

   Auch FMN kann (wie FAD) durch Übertragung einzelner Elektronen über eine radikalische Zwischenstufe reduziert
werden.

Ubichinon (Coënzym Q)
   -        2 Ein-Elektronen-Übergänge mit radikalischer Zwischenstufe
   -        Redoxsystem in der Atmungskette
   -        n = 6 – 10




                                                Formel 21 : Ubichinon-Redoxsystem


Plastochinon
   -        Redoxsystem in der Atmungskette
   -        Wasserstoffaufnahme wie bei Ubichinon
   -        n=9




                                                     Formel 22 : Plastochinon




                                                              -28-
Biochemie

Liponsäure
   -     Wasserstoff-Übertragung bei der oxidativen Decarboxylierung in Form von Liponamid (enzymgebunden):




                                                   Formel 23 : Liponsäure-System


Gruppenübertragende Coënzyme

Adenosintriphosphat (ATP)

   -     Energieträger biochemischer Reaktionen
   -     Liegt normalerweise in Metallkomplexen (Mg2+) vor
   -     Freisetzung von Energie durch Hydrolyse der Anhydrid-Bindungen




                                      Formel 24 : Adenosintriphosphat (ATP) und Mg-Komplex

Vergleich der Standardreaktionsenthalpien der Hydrolyse
                                                                        kJ / mol               kcal / mol
                 Phosphoenolpyruvat (PEP)                              -61,9                   -14,8
                 Carbamoylphosphat                                     -51,5                   -12,3
                 1,3-Bisphosphoglycerat                                -49,4                   -11,8
                 Acetylphosphat                                        -43,1                   -10,3
                 Creatinphosphat                                       -43,1                   -10,3
                 Pyrophosphat                                          -33,5                     -8,0
                 ATP → ADP, Pi                                         -30,5                     -7,3
                 Glucose-1-Phosphat                                    -20,9                     -5,0
                 Glucose-6-Phosphat                                    -13,8                     -3,3
                 Glucose-3-Phosphat                                     -9,2                     -2,2
                                 Tabelle 2 : Vergleich der Standardreaktionsenthalpien der Hydrolyse

   Durch seine Mittelstellung ist ATP als Phosphatgruppenüberträger geeignet. PEP kann wiederum eine
Phosphorylgruppe unter Bildung von ATP auf ADP übertragen.

Pyridoxalphosphat (PLP)
   -     Derivat des Pyridoxins (Vitamin B6)
   -     Die Aldehydgruppe dieses Coënzyms bildet eine Schiff'sche Base mit einer spezifischen Lysin-Seitenkette des
         Enzyms.
   -     Bei Phosphorylase fungiert PLP wahrscheinlich als Säure-Base-Katalysator (Protonenakzeptor und -donator).
         Hauptfunktion ist die Aktivierung der verschiedenen Bindungen am C α von Aminosäuren (z. B. bei
         Transaminierung).



                                                                -29-
Biochemie




                                                  Formel 25 : Pyridoxalphosphat (PLP)


Coënzyme für C1-Transfer
Tetrahydrofolat (THF)
   (siehe „Biosynthese von Makromolekülen“)




                                                   Formel 26 : Tetrahydrofolat (THF)


S-Adenosylmethionin
   (siehe „Biosynthese von Makromolekülen“)




                                                    Formel 27 : S-Adenosylmethionin


Biotin
   -        Beteiligung am Carboxyltransfer
   -        Isolierung als Vitamin H aus Leberextrakten
   -        Inaktivierung durch Bindung an Avidin (Proteïn des Eiklars)
   -        peptidartige Bindung an Lysinrest → prosthetische Gruppe




                                              Formel 28 : Biotin und Carboxy-Biotin-Enzym




                                                                 -30-
Biochemie

Coënzyme für C2-Transfer

Coënzym A




                                                 Formel 29 : Coënzym A

  Übertragung von Resten der Carbonsäuren
  bei Acetyl-CoA: R = CH3




                                            Formel 30 : Bildung von Acetyl-CoA


Thiamin-Pyrophosphat (TPP)
  Decarboxylierung von Pyruvat
  Enthält Vitamin B1 (Thiamin)




                                        Formel 31 : Thiamin-Pyrophosphat (TPP)


Coënzyme der Isomerasen und Lyasen

Cobalamin
  -      Radikalische Umlagerungen von Funktionellen Gruppen (-COO-, -NH3+)
  -      Methylgruppenübertragung




                                                  Formel 32 : Cobalamin




                                                          -31-
Biochemie


Hämoglobin / Myoglobin
Kooperativität
    Die Veränderung (Erhöhung/Erniedrigung) der Bindungsaffinitäten der Untereinheiten eines oligomeren Proteïns zu
kleinen Molekülen (wie hier zum Sauerstoffmolekül) durch die Bindung dieser Moleküle an benachbarte Untereinheiten
bezeichnet man als (positive / negative) Kooperativität.

Hämoglobin (Hb)
   Das Hämoglobin kommt in den Erythrocyten vor und übernimmt den Sauerstofftransport im Blut. Es besteht aus dem
Proteïn Globin und der prosthetischen Gruppe Häm. Das Häm ist der Eisenkomplex eines Porphyrins (des
Protoporphyrins IX).
   Das Fe(II) im Molekül wird durch die hydrophobe Umgebung gegen Oxidation geschützt.




                                                 Formel 33 : Hämoglobin (Hb)

Aufnahme von Sauerstoff durch das Häm
   Im Häm kann das Eisen unter Ausbildung einer sechsten (koordinativen) Bindung Sauerstoff reversibel binden. Das
Eisen verändert dabei nicht seine Ladungszahl, sondern Salzbrücken zwischen den Untereinheiten α1 und β1 brechen auf.
Dadurch können die nachfolgenden Sauerstoff-Moleküle leichter gebunden werden (positive Kooperativität). Es entsteht
Oxyhämoglobin. Jedes Hämoglobin kann daher 4 Sauerstoff-Moleküle aufnehmen.
   Im Desoxyhämoglobin liegt das Eisenatom etwa 0,04 nm außerhalb der Hämebene. Bei der Oxygenierung bewegt sich
das Eisenatom in die Hämebene hinein (d.h. das proximale His verschiebt sich), um mit dem Sauerstoff eine feste Bindung
einzugehen.




                                          Abbildung 27 : Oxygenierung von Hämoglobin

    Durch diese Verschiebung wird eine H-Brücke zwischen Asp-94 und His-146 aufgebrochen, und Protonen werden frei
(s. Bohr-Effekt).
Wirkung von Bisphosphoglycerat
   2,3-Bisphosphoglycerat (BPG) hat eine wichtige Rolle bei der Regulation der Sauerstoffaufnahme. Das
Desoxyhämoglobin kann ein Molekül BPG binden; die negativ geladenen Phosphatgruppen treten mit positiv geladenen
Gruppen von Histidin und Lysin in Wechselwirkung, wodurch die Raumstruktur so stark verändert wird, dass die
Sauerstoffaffinität stark sinkt.
   Bei der Sauerstoffbeladung wird das BPG wieder abgegeben. Befindet sich im Blut nur eine geringe Menge an BPG, so
enthält ein Teil des Desoxyhämoglobins kein BPG und bindet den Sauerstoff entsprechend fester. Daher kann der
Sauerstoff dann nicht in den zu versorgenden Geweben abgegeben werden und das Hämoglobin erfüllt seine
Transportfunktion nicht.
Abhängigkeit der Sättigung vom O2-Partialdruck
   Bei der Beladung des Hämoglobins wird der hohe Sauerstoffpartialdruck der Lunge ausgenutzt, um Sauerstoff zu
binden und in die Bereiche mit geringerem Sauerstoffpartialdruck zu transportieren.




                                                             -32-
Biochemie




                                   Abbildung 28 : Abhängigkeit der Sättigung vom O2-Partialdruck

Bohr-Effekt
   Der Bohr-Effekt ist die nach dem dänischen Physiologen benannte Sauerstoffaustreibung aus dem Oxyhämoglobin
durch Kohlendioxid, d.h. das Vorliegen einer höheren Konzentration an CO 2 und H+-Ionen in einem stoffwechselaktivem
Gewebe erleichtert die Freisetzung von O2.




                                                    Abbildung 29 : Bohr-Effekt

    Die Aufnahme von O2 in der Lunge, durch die Protonen freigesetzt werden, hat dabei die Austreibung von CO 2 zur
Folge. Auf molekularer Ebene kommt es beim Übergang von Oxy- zu Desoxyhämoglobin zu einer Verschiebung des Asp-
94 in die Nähe des His-146. Durch die Erhöhung der lokalen negativen Ladung wird der pK-Wert von His-146 erhöht, d.h.
die Wasserstoffaffinität nimmt zu: Es kommt leichter zur Aufnahme von H+.
Fötales Hämoglobin
   Der Fötus besitzt einen eigenen Hämoglobin-Typ, das Hämoglobin F (α2γ2) welches sich von dem der Erwachsenen
unterscheidet.
   Hämoglobin F bindet BPG schwächer und besitzt daher eine höhere Sauerstoffaffinität als Hämoglobin A. Daher kann
O2 vom mütterlichen Hämoglobin A auf das Hämoglobin F des Fötus übertragen werden.
Myoglobin (Mb)
  Das Myoglobin bindet ebenfalls den Sauerstoff durch das Häm. Es transportiert und speichert ihn jedoch in der
Muskelzelle und zeigt als Monomer keine Kooperativität.




                                                               -33-
Biochemie


Chemische Modifizierung von Proteïnen
Zweck:
  ●      Bestimmung katalytisch relevanter AS
  ●      Veränderung der Proteineigenschaften (durch Veränderung der Oberfläche)
         a)      Ladungsveränderung
         b)      hydrophobe Oberfläche
  ●      Quervernetzung mit bifunktionellen Gruppen
         a)      Abstandsmessungen im AZ (zwischen katalytisch relevanten AS)
         b)      Verknüpfung von Untereinheiten

               α:       zur Stabilisierung des Proteïns
               β:       Bestimmung der Geometrie des Aufbaus aus der Verteilung der Quervernetzungsprodukte
         c)      Lokalisierung relativ zu anderen Proteïnen(in der Membran, in Multienzymkomplexen, im Aufbau des
                 Ribosoms)

Welche AS-Seitenreste können reagieren?
  In allen Fällen werden elektrophile Reagenzien benötigt, (bei -COOH nur, wenn –COO-, sonst eventuell Nukleophile)




                                          Abbildung 30 : Reaktionsfähige AS-Seitenreste


Probleme:
  -      Kann überhaupt eine Seitenkette selektiv modifiziert werden? (z.B. bei LDH eine von 5 SH-Gruppen oder oft
         eine von mehr als 20 Lys-NH2-Gruppen)
  -      Sterische Zugänglichkeit:: Besondere Reaktivität durch spezifischen pK-Wert durch Nachbargruppen →
         kinetische Kontrolle (z.B. Lys-NH2 normal pK = 11; im AZ Teile mit pK = 8)

Wahl des Reagenz:
  -      Spezifität
  -      reversible Reaktion?
  -      milde Reaktionsbedingungen

Bestimmung des Einbaus:
  -      Farbige Reagenzien
  -      Radioaktive Markierung (3H, 14C, 35S...)

Bestimmung katalytisch relevanter AS:
  Korrelation der Aktivität mit dem Einbau:
  →      Probleme: Trotz 1:1-Relation kann es zu allosterischen Effekten kommen.
  →      Bsp.: Bei der Modifizierung der „essentiellen SH-Gruppe“ bei der LDH wird eine Seitenkette verschoben, an
         die ein „essentielles His“ geknüpft ist → Verlust der Aktivität!

Identifizierung der Art der modifizierten AS:
  z. B. durch die pH-Abhängigkeit (der pK-Wert von 6,5 deutet eventuell auf His)




                                                              -35-
Biochemie


Unspezifische Reagenzien
Iodessigsäure:




                                           Formel 34 : Umsetzung mit Iodessigsäure


Iodacetamid



                                           Formel 35 : Umsetzung mit Iodacetamid


Acet(yl)imidazol:
  (bei His, Cys Produkte instabil)




                                          Formel 36 : Umsetzung mit Acet(yl)imidazol

Gruppenspezifische Reagenzien
Lys-NH2
  Imidoester: (entsteht aus: R-CN + MeOH / HCl)




                                             Formel 37 : Umsetzung mit Lys-NH2


Tyr-OH
  Tetranitromethan:




                                             Formel 38 : Umsetzung mit Tyr-OH

  Alternativ: Umsetzung mit Diazoniumsalzen → Azofarbstoffe

Cys-SH
  Maleïnimide, z. B. N-Ethylmaleïnimid:




                                              Formel 39 : Umsetzung mit Cys-SH

  Umsetzung auch mit Lys bei pH = 6,5 - 7, Geschwindigkeit aber 1000mal langsamer.

                                                            -36-
Biochemie

Serin-OH
  Diisopropylfluorophosphat:
  Parathion (E 605) wirkt analog:




                                             Formel 40 : Umsetzung mit Serin-OH


Tryptophan
  Sulfenylchlorid (Koshland-Reagenz): Reaktion auch mit Cys-SH, das „reversibel“ geschützt werden muss.




                                            Formel 41 : Umsetzung mit Tryptophan


Arginin
  Butandion (Diacetyl):




                                              Formel 42 : Umsetzung mit Arginin


Aspartat, Glutamat:
  Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD)




                                        Formel 43 : Umsetzung mit Aspartat, Glutamat

Reagenzien zur Änderung der Ladung




                                      Abbildung 31 : Reagenzien zur Änderung der Ladung


                                                            -37-
Biochemie


Hydrophobisierung von Enzymen




                                        Abbildung 32 : Hydrophobisierung von Enzymen

Reversible Reagenzien
Histidin




                                        Abbildung 33 : Reversible Reagenzien (Histidin)


Cysteïn


   a)



   b)
   c)       Ellman’s Reagenz




                                                Formel 44 : Ellman's Reagenz

Active-Site Labeling




                                               Formel 45 : Active-Site Labeling

Suizid-Substrate
   Werden am aktiven Zentrum reaktiv.




                                                             -38-
Biochemie




                                                     Formel 46 : Suizid-Substrate

Photoaffinity-Label




                                                   Formel 47 : Photoaffinity-Label

Bifunktionelle Reagenziën
Kriterien für die Anwendung
  a)    Abstandsmessungen (im AZ) starr
        -      spezifisch für bestimmte Aminosäuren
        -      für Reste eventuell unterschiedlich spezifisch
  b)    Lokalisierung von „Nachbarn“; kovalente Verbindungen von Untereinheiten
        -      flexibel
        -      unspezifisch

Reagenz von Zahn




                          Formel 48 : Reagenz von Zahn, o,p- aktiviert für nucleophile Substitution des Fluor


Hugo Fasold




  Probleme:


                                                                 -39-
Biochemie

   -        viele Produkte
   -        Reaktion nur an Rest A oder nur an Rest B
   -        Quervernetzung zwischen A und B
   -        weitere Reste können entsprechend reagieren
   -        bei asymmetrische Reagenzien kann u.U. die eine oder die andere Seite mit Rest A reagieren
   Beispiel:




   Stufenweise Reaktion:
   Belichtung nach Entfernung des nicht umgesetzten Überschusses durch z.B. Dialyse oder Gelchromatographie.




   Aktivierung einfach durch pH > 8,5 nach Reaktion mit –SH und Dialyse




Semireversible Reagenzien




                                               Formel 49 : Semireversible Reagenzien

Trägergebundene Enzyme
Vorteile
   ●        Erhöhte Stabilität (z.B. Proteasen, Schutz vor Selbstverdauung)
   ●        Wiedergewinnung

Probleme
   ●        Zugänglichkeit des AZ
   ●        Kinetik: Diffusionsprobleme:
            Spezifische Aktivität kleiner als im löslichen Enzym, auch wenn Zugang zum AZ frei, denn nach Teilverdau
            des Trägers steigt die spezifische Aktivität bis zum Normalwert
   ●        Reaktion an der richtigen UE


                                                               -40-
Biochemie

Arten der Verknüpfung
  ●     kovalent
  ●     Adsorption
  ●     Einschlussverbindungen
  ●     Aggregation
  Kovalente Bindung an welche AS?
  -     Keine seltenen, da diese oft katalytisch relevant
  -     Schutz des AZ durch Komplexe (LDH: NAD+ / Oxalat)
  -     z.B. direkt an BrCN-aktivierte Agarose:
  -     (dargestellte Reaktion verläuft über Spacer + R-COOH, es geht auch mit Lys-NH 2)




  -     Bifunktionelle Reagenzien:

        Müssen erst mit Enzym reagieren und nur das "aktive", modifizierte     an Träger binden!




  -     Adsorption an:
            poröses Glas / Ti02 / Collagen
  -     Einschlussverbindungen:
            z.B. Copolymerisation (Acrylamid mit Bisacrylamid)
  -     Chemische Aggregation:
            z.B. durch bifunktionelle Reagenzien




                                                            -41-
Biochemie


Lipide
Allgemeine Übersicht




                                            Abbildung 34 : Lipide, allgemeiner Überblick

Fette
   Fette bestehen in der Regel aus Glycerin und 3 Fettsäuren, z.B. die unten abgebildeten.
    Für die Bezeichnung der Fettsäuren verwendet man eine Kurzschreibweise, bei der die Zahl der C-Atome und die Zahl
der Doppelbindungen angegeben werden.




                                                Formel 50 : Verschiedene Fettsäuren

Glycolipide
   Sie enthalten kein Phosphat, sondern stattdessen einen Mono- oder Oligosaccharidrest, der meist mit Sphingosin (oder
Glycerin) verknüpft ist und den hydrophilen Anteil bildet.

Glyceringlykolipide:
   1.2-Diacylglycerin und ein Mono- oder Oligosaccharid in 3-Stellung des Glycerins glycosidisch gebunden.

Sphingosinglykolipide:
   Als Sphingolipide enthalten sie als zentralen Baustein statt des 3-wertigen Alkohols Glycerin einen Aminodialkohol,
das Sphingosin, welches ein C18-Molekül mit einer trans-Doppelbindung ist.
    Durch Amidbildung mit einer Fettsäure kommt es zu Ceramiden, deren Glycoside die neutralen Glycosphingolipide
sind.




                                                 Formel 51 : Sphingosinglykolipide


                                                               -43-
Biochemie

   Einfachste Vertreter: Cerebroside. Bei den Cerebrosiden des Gehirns meist Galactose, bei Leber und Milz meist
Glucose.




                                                   Formel 52 : Ein Cerebrosid

Phospholipide
Glycerinphospholipide
   Phosphodiëster; die Phosphorsäure ist einerseits mit einem Sphingosin- oder Glycerinderivat (meist Diacylglycerin),
andererseits mit Cholin, Ethanolamin, Serin, Inosit oder Glycerin verestert.




                                            Formel 53 : Phosphatidylcholin (Lecithin)


Sphingosinphospholipide
  Sphingomyeline: In den Myelinscheiden vorkommende Sphingosinphospholipide, bei denen die endständige
Hydroxygruppe des Ceramids (s.o.) mit Phosphorylcholin verestert ist.




                                                  Formel 54 : Ein Sphingomyelin

Isoprenoidlipide
   Die Steroide und Terpene gehören zu dieser Stoffklasse und werden wegen ihrem ähnlichen Lösungsverhalten zu den
Lipiden gerechnet.

Steroide

Cholesterin
    Das Cholesterin leitet sich vom Cyclopentanoperhydrophenanthren ab, welches auch als Steran bezeichnet wird. Durch
die OH-Komponente liegt Cholesterin als Alkohol vor (engl.: Cholesterol). Cholesterin verleiht der Membran Starrheit und
schließt auftretende Löcher.




                                            Formel 55 : Sterangrundgerüst, Cholesterin


                                                              -44-
Biochemie

Terpene
   Zu dieser Stoffklasse gehören die Carotine und die Xanthophylle, die hier aber nicht weiter besprochen werden.

Biomembranen
Membranfunktion
   ●      Geben den Zellen Individualität durch Abtrennung der Umwelt
   ●      Bei Eukaryonten: Strukturierung von Zellorganellen durch interne Membranen
                  Eukaryonten: Einzellige oder mehrzellige Organismen, die einen vom Cytoplasma durch eine Membran
                  abgegrenzten Zellkern besitzen.
                  Prokaryonten: Kein Zellkern.

   ●      Kompartimentierung bestimmter Prozesse
   ●      Extrem spezifische Permeabilitätsbarrieren
   ●      Bewirken geordnete räumliche Anordnung bestimmter Enzyme zueinander (Reaktionsketten möglich)
   ●      Enthalten Pumpen (molekulare), Rezeptoren (Hormone) zur Steuerung interner Prozesse

Bau der Membranen
   ●      Keine kovalenten oder festen Strukturen, sondern eine „Flüssigkeitsschicht“, die durch Wechselwirkungen mit
          dem Lösungsmittel entsteht.
   ●      Bestehen aus: Lipiden (v.a. Phospholipide, Glycolipide und Cholesterin) und Proteïnen




                                                  Abbildung 35 : Membranen

   Die Flächen können Vesikel (kugelförmige Doppelschichten) bilden.
   Die Doppelschicht liegt nicht starr vor, sondern befindet sich ständig im Fluss, wobei die Proteïne ihre Positionen
verändern können. Laterale Diffusion einfach, hochmobile Schicht. Transversale Diffusion (flip-flop) energetisch
ungünstig.




                                                            -45-
Biochemie


Monosaccharide
Nomenklatur




                                         Abbildung 36 : Nomenklatur der Monosaccharide

  Aldose mit n C-Atomen: 2n-2 stereoisomere Formen
  Pentosen: n = 5 → 23 = 8 Isomere (4 L-Formen und 4 D-Formen)
  Hexosen: n = 6 → 24 = 16 Isomere

Fischer-Projektion
  -        D-Zucker haben an ihrem carbonylfernsten Asymmetriezentrum die gleiche absolute Konfiguration wie D-
           Glycerinaldehyd
  -        L-Zucker sind Spiegelbilder der D-Zucker

Glycerinaldehyd




                                        Formel 56 : Konfigurationen des Glycerinaldehyds


Epimere:
  Zucker, die sich in der Konfiguration nur an einem C-Atom unterscheiden (z.B. Glucose / Mannose).

Acetale und Ketale
  Acetale entstehen bei der Reaktion von Aldehydgruppen mit Alkoholen:




                                        Formel 57 : Reaktionsweg: Aldehyd zum Vollacetal

  Ketale entstehen bei der Reaktion von Ketogruppen mit Alkoholen.




                                       Formel 58 : Reaktionsweg: Ketogruppe zum Vollketal


                                                             -47-
Biochemie

Saccharose




                                                 Formel 59 : Saccharose

Zyklische Zucker
5-Ring-Zucker




                                                Formel 60 : 5-Ring-Zucker


6-Ring-Zucker




                                                Formel 61 : 6-Ring-Zucker

Nucleotide
  Nucleoside: Zucker und eine Base
  Nucleotide:   Zucker, Base und ein oder mehr Phosphatreste

Purinbasen




                                                 Formel 62 : Purinbasen


Pyrimidinbasen




                                               Formel 63 : Pyrimidinbasen


                                                          -48-
Biochemie


Stoffwechsel
    Die grundlegenden Stoffwechselwege sind in den meisten Organismen identisch!

Aufklärung durch
    ●          Fütterungsversuche mit durch Isotopen markierten Substanzen
    ●          Verwendung von Stoffwechselinhibitoren (Hemmstoffen)
    ●          Verwendung von auxotrophen Mutanten (benötigen bestimmten Nährstoff für ihr Wachstum)

Mutanten durch
    ●          mutagene Substanzen
    ●          Strahlung, z.B. Röntgenstrahlung
    ●          molekularbiologische Methoden
   Ein Beispiel für die Wirkung von Mutanten ist die Arginin-Biosynthese im Harnstoff-Zyklus mit folgenden
Enzymdefekten:




                                                          Abbildung 37 : Mutanten bei der Arginin-Biosynthese

Mutante 1 wächst auf: Ornithin oder Citrullin oder Arginin; Mutante 2 wächst auf: Citrullin oder Arginin; Mutante 3 wächst auf: Arginin
     Cross-feeding: Mutante 2 reichert Ornithin an und wächst mit Filtrat von Mutante 3 (da in diesem Citrullin angereichert
ist), aber nicht umgekehrt

Metabolismus
    Stoffwechsel: Bedeutung i.a. Anabolismus und Katabolismus

Anabolismus
    Aufbau von Körpersubstanzen

Katabolismus
    Abbau von Körpersubstanzen und Nahrungsbestandteilen

Speicherung der Energie
    As ATP / hochreduzierte Verbindungen (z.B. Glucose) reduzierte Elektronenüberträger (NADH, FADH2, NADPH)

Verwendung der Energie
    Für Biosynthesen (Anabolismus) / Muskelarbeit (ATP) / Transportprozesse

Unterscheidung der Lebewesen
    1.         Nach der Kohlenstoffquelle:                           autotroph: „sich selbst ernährend“; C-Quelle ist CO2
                                                                     heterotroph: C-Quelle sind andere Zellen bzw. deren Bestandteile
    2.         Nach der Energiequelle:                               phototroph: Licht
                                                                     chemotroph: Redoxprozesse
    3.         Nach den Elektronendonatoren:                         lithotroph: anorganische Verbindungen: (H2S, NH3, S, Co, Fe2+, H2O)
                                                                     organotroph: organische Verbindungen
         Organismen                         C-Quelle                            E-Quelle                     e—-Donatoren                        Beispiel
photolithotroph                                  CO2                              Licht                      anorg. Verb.                 Bakteriën
photoorganotroph                        org. Verb./CO2                            Licht                        org. Verb.                 Purpurbakteriën
chemolithotroph                                  CO2                       Redoxprozesse                     anorg. Verb.                 Archaëbakteriën
chemoorganotroph                           org. Verb.                      Redoxprozesse                       org. Verb.                 alle höheren Tiere



                                                                                    -49-
Biochemie

Tabelle 3 : Unterscheidung der Lebewesen




                 -50-
Biochemie


Kohlenstoff-Stoffwechsel
Glycogen
   Glycogen ist eine leicht mobilisierbare Speicherform der Glucose. Es ist ein großes, verzweigtes Polymer aus
Glucoseeinheiten in α-1,4-glykosidischer Bindung.




                                          Formel 64 : α-1,4- und α-1,6-glycosidische Bindung

   Die Synthese und der Abbau von Glycogen sind aus mehreren Gründen von Bedeutung:
   ●       Regulation des Blutzuckerspiegels
   ●       Glucosereservoir für anstrengende Muskelaktivität
   ●       Synthese und Abbau laufen auf unterschiedlichen Reaktionswegen, dies verdeutlicht ein wichtiges Prinzip der
           Biochemie
   ●       Generelle Bedeutung der Regulationsmechanismen auf hormoneller Ebene
   ●       Reversible Phosphorylierung der Enzyme

Abbau des Glycogens durch Glycogen-Phosphorylase
   Phosphorolyse bedeutet die Spaltung einer Bindung durch Einbau von Orthophosphat (im Gegensatz zur Hydrolyse,
einer Spaltung durch Wasser).




                                    Formel 65 : Abbau des Glycogens durch Glycogen-Phosphorylase

    Für den Ablauf der Spaltung ist als Coënzym das Pvridoxal-5-phosphat (PLP), ein Derivat des Pyridoxins (Vitamin B6)
erforderlich. Die Aldehydgruppe dieses Coënzyms bildet eine Schiff'sche Base mit einer spezifischen Lysin-Seitenkette des
Enzyms.
   PLP spaltet mit seiner Phosphatgruppe zunächst die glycosidische Bindung und wird durch anorganisches Phosphat
wieder freigesetzt (doppelte Inversion am C1).

Abbau des Glycogens durch Phosphorylase
    Phosphorylase kann die Kette nur solange abbauen, bis sie einen endständigen Glucoserest erreicht, der nur 4 Einheiten
bis zu einer Verzweigung entfernt ist.




                                       Abbildung 38 : Abbau des Glycogens durch Phosphorylase


Übertragung durch eine Transferase
   Die Transferase überträgt einen Block von 3 Glucoseeinheiten von einem äußeren Zweig auf einen anderen.



                                          Abbildung 39 : Übertragung durch eine Transferase


Abbau durch ein debranching enzyme (= Aufhebung der Verzweigung)
   Das dritte Abbauenzym, die α-1,6-Glucosidase (unter dem Namen debranching enzyme bekannt), hydrolysiert die
Bindung des einzelstehenden Glucosemoleküls, es entsteht ein Molekül Glucose.


                                         Abbildung 40 : Abbau durch ein debranching enzyme


                                                                -51-
Biochemie

  Somit liegt das Glycogen wieder in einer linearen Form vor und kann weiter von der Phosphorylase abgebaut werden.

Synthese von Glycogen
  Die Synthese hat als erste Vorstufe die UDP-Glucose.

                         Glucose - 1- Phosphat + UTP → UDP - Glucose + PPi
                         Glycogen( n) + UDP - Glucose → Glycogen( n + 1) + UDP
                                             Gleichung 7 : Synthese von Glycogen


UDP-Glucose




                                                  Formel 66 : UDP-Glucose

  Die Verzweigungen (α-1,6-Bindungen) werden durch ein branching enzyme gebildet.

Glycolyse
Ablauf der Glycolyse




                                              Formel 67 : Ablauf der Glycolyse


                                                            -52-
Biochemie

   Die Glycolyse ist eine Folge von Reaktionen in denen im Cytosol (Cytoplasma) Glucose in Pyruvat umgewandelt wird
und gleichzeitig ATP entsteht. In aeroben Organismen geht sie dem Citratzyklus und der Atmungskette voraus. Unter
anaëroben Bedingungen tritt das Pyruvat in die Mitochondriën über und wird hier vollständig zu CO 2 und H2O oxidiert. Bei
ungenügendem Sauerstoffangebot, etwa in einem Muskel, wird das Pyruvat in Lactat überführt. Bei einigen anaeroben wird
das Pyruvat in Ethanol umgewandelt. Die Bildung von Lactat oder Ethanol aus Glucose sind Beispiele für Gärungen.

Netto-Stoffbilanz der Glycolyse

                 Glucose + 2ADP + 2Pi + 2NAD+ → 2Pyruvat + 2ATP + 2NADH/H+ + 2H2 O
                                                       Gleichung 8 : Netto-Stoffbilanz der Glycolyse


Bildung von Fructose-1,6-bisphosphat aus Glucose
    Die Umwandlung besteht aus 3 Reaktionen: einer Phosphorylierung, einer Isomerisierung und einer
2. Phosphorylierung. Der Sinn dieser Reaktionen ist die Überführung der Glucose in eine reaktionsfähige Form, welche
sich in 2 C3-Einheiten spalten lässt.




                                      Formel 68 : Bildung von Fructose-1,6-bisphosphat aus Glucose (Gesamtreaktion)




                                               Formel 69 : Phosphorylierung der Glucose durch Hexokinase




    Formel 70 : Isomerisierung von Glucose-6-phosphat zu Fructose-6-phosphat durch Glucosephosphat-Isomerase (Umwandlung einer Aldose in eine Ketose)




                                   Formel 71 : Phosphorylierung zu Fructose-l,6-bisphosphat durch Phosphofructokinase


Bildung von Glycerinaldehyd-3-phosphat




       Formel 72 : Spaltung von Fructose-1,6-bisphosphat in Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) durch Aldolase




                                                          Formel 73 : Mechanismus der Aldolase


                                                                           -53-
Biochemie

   Aldolase führt die umgekehrte Reaktion einer Aldolkondensation (z.B. Aldehyd + Keton) durch. Die Reaktion läuft nur
mit GAP weiter, dass DHAP wird durch Triosephosphatisomerase in GAP überführt.

1. energiegewinnender Schritt
   Phosphorylierung und Oxidation des GAP (keine ATP-Bildung!)




            Formel 74 : Umwandlung von Glycerinaldehyd-3-phosphat in 1,3-Bisphosphoglycerat durch Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase




                                        Formel 75 : Mechanismus der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase


2. energiegewinnender Schritt
   Dies ist die erste ATP-bildende Reaktion, katalysiert durch Phosphoglycerat-Kinase.




                                                       Formel 76 . Erste ATP-bildende Reaktion




                                            Formel 77 : Bildung von Pyruvat und eines zweiten Moleküls ATP


Regulation der Glycolyse




                                                        Abbildung 41 : Regulation der Glycolyse

  Glycolyse und Gluconeogenese sind so koordiniert, dass beide Vorgänge nicht gemeinsam anlaufen. Bei dieser
Kontrolle spielt ein Signalmolekül, das Fructose-2,6-bisphosphat eine wichtige Rolle.

                                                                         -54-
Biochemie

Regulation der Glycolyse / Gluconeogenese durch F-2,6-BP
   F-2,6-BP aktiviert die 6-Phosphofructo-1-Kinase der Leber, indem sie deren Affinität zu Fructose-6-Phosphat steigert
und die Hemmwirkung von ATP herabsetzt. Dies hat die Synthese von F-1.6-BP durch die Phosphorylierung von Fructose-
6-phosphat zur Folge. Gleichzeitig wird Fructose-1,6-bisphosphatase durch F-2,6-BP gehemmt.

Regulation der Konzentration von F-2,6-BP
    F-2,6-BP wird durch Phosphorylierung (durch 6-Phosphofructo-2-Kinase) synthetisiert und kann von der Fructose-2,6-
bisphosphatase zu Fructose-6-phosphat hydrolysiert werden. Beide Enzyme befinden sich auf einer einzigen Peptidkette,
die man auch als Tandem-Enzym bezeichnet.

Regulation des Tandem-Enzyms
   Die Aktivitäten von 6-Phosphofructo-2-Kinase und Fructose-2,6-bisphosphatase werden durch die Phosphorylierung
eines Serinrestes kontrolliert.
   Bei Glucosemangel löst ein Konzentrationsanstieg des Hormons Glucagon eine Reaktionskaskade aus, die zur
Phosphorylierung dieses bifunktionellen Enzyms führt (Fructose-6-phosphat → Gluconeogenese). Ist dagegen Glucose im
Überschuss vorhanden, verliert das Enzym seine Phosphorylgruppe, wodurch der F-2,6-BP-Spiegel ansteigt (→
Glycolyse).

           unphosphoryliert:            aktiviert Kinase, hemmt Bisphosphatase          → Aufbau von F-2,6-BP
           phosphoryliert               aktiviert Bisphosphatase, hemmt Kinase          → Abbau von F-2,6-BP




                                          Abbildung 42 : Regulation des Tandem-Enzyms


Weiterverarbeitung des Pyruvats

Aërobiër
Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex
   ●       Acetyl-CoA
   ●       Citronensäure-Zyklus → oxidative Phosphorylierung
   ●       CO2 + H2O




                                         Abbildung 43 : Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex


Höhere Organismen und Bakterien bei O2-Mangel (anaërob)
Homolaktische Fermentation → Lactat (Muskel)

                               Glucose + 2ADP + 2Pi → 2Lactat + 2ATP + 2H2 O




                                               Formel 78 : Anaërobe Lactatbildung


                                                             -55-
Biochemie

Hefe und Mikroorganismen (anaërob)
Alkoholische Gärung zum Ethanol

                        Glucose + 2ADP + 2Pi + 2FT → 2Ethanol + 2CO 2 + 2H2 O
   1        Decarboxylierung durch Pyruvat-Decarboxylase
   2        Reduktion durch Alkohol-Dehydrogenase mit NADH




                                                      Formel 79 : Alkoholische Gärung

Oxidative Decarboxylierung
   Die Funktion dieses Reaktionsweges ist die Bildung von Acetyl-CoA aus Pyruvat in den Mitochondriën, welches
anschließend im Citratzyklus vollständig zu CO2 oxidiert wird.
   Die Reaktion wird durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex katalysiert. Es handelt sich dabei um einen sehr
großen Multienzymkomplex aus 3 eng zusammenwirkenden Enzymen (Vorteil des Multienzymkomplexes: Höhere
Geschwindigkeit, kaum Nebenreaktionen).
              Komponente                      Abk.           Ketten              Coënzyme                         Reaktion
                                                                                                    Oxidative Decarboxylierung von
Pyruvat-Dehydrogenase                           E1              24                  TPP
                                                                                                    Pyruvat
                                                                                                    Transfer der Acetylgruppe auf
Dihydrolipoyl-Transacetylase                    E2              24              Liponamid
                                                                                                    CoA
                                                                                                    Regenerierung der oxidierten
Dihydrolipoyl-Dehydrogenase                     E3              12             FAD + NAD+
                                                                                                    Form des Liponamids
                                      Tabelle 4 : Komponenten des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes


Decarboxylierung des Pyruvats nach Bindung an das TPP

                                  Pyruvat + TPP → Hydroxyethyl - TPP + CO 2
                           Gleichung 9 : Decarboxylierung des Pyruvats nach Bindung an das TPP (Gesamtreaktion)




                                                      Formel 80 : Ionisierung des TPP

   Durch die Ionisierung des TPP kommt es zur Bildung eines Carbanions, das nucleophil mit Pyruvat reagiert.




                                  Formel 81 : Bildung eines Carbanions, das nucleophil mit Pyruvat reagiert




                                                                     -56-
Biochemie

Oxidation der Hydroxyethylgruppe und Übertragung auf Liponamid




                              Formel 82 : Oxidation der Hydroxyethylgruppe und Übertragung auf Liponamid


Übertragung der Acetylgruppe auf Coënzym A




                                        Formel 83 : Übertragung der Acetylgruppe auf Coënzym A


Regenerierung der oxidierten Form des Liponamids




                                     Formel 84 : Regenerierung der oxidierten Form des Liponamids


Regulation des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes
Produkthemmung
   Die Produkte der Pyruvatoxidation, Acetyl-CoA und NADH, hemmen den Enzymkomplex. Acetyl-CoA hemmt die
Transacetylase-Komponente, NADH die Dihydrolipoyl-Dehydrogenase.

Feedback-Regulation durch Nucleotide (Rückkopplungshemmung):
   Die Aktivität des Enzymkomplexes wird durch die Energieladung kontrolliert. AMP aktiviert den Komplex, GTP
hemmt ihn, d.h. der Komplex wird gehemmt, wenn unmittelbar verfügbare Energie vorhanden ist.

Regulation durch reversible Phosphorylierung:
    Der Komplex wird enzymatisch inaktiv, wenn ein spezifischer Serinrest durch eine Kinase phosphoryliert wird. Dabei
hemmt AMP und Pyruvat die Kinase. Die Phosphorylierung kann durch eine Phosphatase rückgängig gemacht werden. Es
liegt also ein reversibler Regulationsmechanismus vor.

Hormonelle Steuerung
   Der Glycogenstoffwechsel wird von bestimmten Hormonen stark beeinflusst.

Insulin
    Ein Polypeptidhormon, welches die Fähigkeit der Leber steigert, Glycogen zu synthetisieren. Insulin wird in den B-
Zellen der Langerhansschen Inseln im Pankreas gebildet und ins Blut abgegeben. Ein hoher Insulinspiegel im Blut
signalisiert Sättigung, ein geringer einen Hungerzustand.

Adrenalin (Epinephrin)
   Entgegengesetzte Wirkung von Insulin, bewirkt also den Abbau von Glycogen in der Muskulatur. Freisetzung aus dem
Nebennierenmark.

Glucagon
   Stimulierung des Glycogenabbaus in der Leber. Wird von den α-Zellen des Pankreas abgegeben, wenn der Blutzucker
niedrig ist. Durch den Abbau des Glycogens wird der Blutzuckerspiegel wieder angehoben.

                                                                 -57-
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie
Biochemie

Weitere ähnliche Inhalte

Andere mochten auch

Canaima
CanaimaCanaima
Canaima
Jorge Llosa
 
ARTE EN PINTURA INTERIOR
ARTE EN PINTURA INTERIORARTE EN PINTURA INTERIOR
ARTE EN PINTURA INTERIOR
Jorge Llosa
 
Agua Coca Cola
Agua Coca ColaAgua Coca Cola
Agua Coca Cola
gloria isabel rodriguez
 
Capitulo 4
Capitulo 4Capitulo 4
Capitulo 4
guest6554ec
 
Filosofía del Grafiti
Filosofía del GrafitiFilosofía del Grafiti
Filosofía del Grafiti
cazcarate
 
Lecturas comprensivas-2009-1-cat
Lecturas comprensivas-2009-1-catLecturas comprensivas-2009-1-cat
Lecturas comprensivas-2009-1-catsilvia
 
Roma
RomaRoma
FOTO CONCEPTOS
FOTO CONCEPTOSFOTO CONCEPTOS
FOTO CONCEPTOS
Jorge Llosa
 
Brochure tecnologias ceropapel
Brochure tecnologias ceropapelBrochure tecnologias ceropapel
Brochure tecnologias ceropapel
CEROPAPEL
 
Ley autoridad profesorado
Ley autoridad profesoradoLey autoridad profesorado
Ley autoridad profesorado
Cra manchuela
 
Horario2014 1 geologia
Horario2014 1 geologiaHorario2014 1 geologia
Horario2014 1 geologia
Jorge Paredes
 
4º actividades matematicas
4º actividades matematicas4º actividades matematicas
4º actividades matematicas
José M. Blázquez
 
Portfolio 2015 (Smaller)
Portfolio 2015 (Smaller)Portfolio 2015 (Smaller)
Portfolio 2015 (Smaller)
Maksym Gerasimov
 

Andere mochten auch (14)

Canaima
CanaimaCanaima
Canaima
 
ARTE EN PINTURA INTERIOR
ARTE EN PINTURA INTERIORARTE EN PINTURA INTERIOR
ARTE EN PINTURA INTERIOR
 
Agua Coca Cola
Agua Coca ColaAgua Coca Cola
Agua Coca Cola
 
Capitulo 4
Capitulo 4Capitulo 4
Capitulo 4
 
Filosofía del Grafiti
Filosofía del GrafitiFilosofía del Grafiti
Filosofía del Grafiti
 
Lecturas comprensivas-2009-1-cat
Lecturas comprensivas-2009-1-catLecturas comprensivas-2009-1-cat
Lecturas comprensivas-2009-1-cat
 
Roma
RomaRoma
Roma
 
FOTO CONCEPTOS
FOTO CONCEPTOSFOTO CONCEPTOS
FOTO CONCEPTOS
 
Brochure tecnologias ceropapel
Brochure tecnologias ceropapelBrochure tecnologias ceropapel
Brochure tecnologias ceropapel
 
Ley autoridad profesorado
Ley autoridad profesoradoLey autoridad profesorado
Ley autoridad profesorado
 
Horario2014 1 geologia
Horario2014 1 geologiaHorario2014 1 geologia
Horario2014 1 geologia
 
4º actividades matematicas
4º actividades matematicas4º actividades matematicas
4º actividades matematicas
 
Binder1
Binder1Binder1
Binder1
 
Portfolio 2015 (Smaller)
Portfolio 2015 (Smaller)Portfolio 2015 (Smaller)
Portfolio 2015 (Smaller)
 

Mehr von Frank Bölter

Stereochemie organischer Verbindungen
Stereochemie organischer VerbindungenStereochemie organischer Verbindungen
Stereochemie organischer VerbindungenFrank Bölter
 
Physikalische Chemie
Physikalische ChemiePhysikalische Chemie
Physikalische ChemieFrank Bölter
 
Kernresonanzspektroskopie
KernresonanzspektroskopieKernresonanzspektroskopie
KernresonanzspektroskopieFrank Bölter
 
Infrarot- und Ramanspektroskopie
Infrarot- und RamanspektroskopieInfrarot- und Ramanspektroskopie
Infrarot- und RamanspektroskopieFrank Bölter
 

Mehr von Frank Bölter (10)

Zellchemie
ZellchemieZellchemie
Zellchemie
 
Zellbiologie
ZellbiologieZellbiologie
Zellbiologie
 
Stereochemie organischer Verbindungen
Stereochemie organischer VerbindungenStereochemie organischer Verbindungen
Stereochemie organischer Verbindungen
 
Physikalische Chemie
Physikalische ChemiePhysikalische Chemie
Physikalische Chemie
 
Organische Chemie
Organische  ChemieOrganische  Chemie
Organische Chemie
 
Mikrobiologie
MikrobiologieMikrobiologie
Mikrobiologie
 
Bioanalytik
BioanalytikBioanalytik
Bioanalytik
 
Abbe-Refraktometer
Abbe-RefraktometerAbbe-Refraktometer
Abbe-Refraktometer
 
Kernresonanzspektroskopie
KernresonanzspektroskopieKernresonanzspektroskopie
Kernresonanzspektroskopie
 
Infrarot- und Ramanspektroskopie
Infrarot- und RamanspektroskopieInfrarot- und Ramanspektroskopie
Infrarot- und Ramanspektroskopie
 

Biochemie

  • 1.
  • 3. Biochemie Proteïne................................................................................................................................................................ 7 Hierarchie der Zellkomponenten.................................................................................................................................. 7 Allgemeiner Aufbau der Proteïne................................................................................................................................. 7 Analyse der Raumstruktur von Proteïnen...................................................................................................................7 Die 20 Aminosäuren...................................................................................................................................................... 8 Struktur der Proteïne..................................................................................................................................................... 9 Analyse von Proteïngemischen................................................................................................................................. 11 Nachweis mit Ninhydrin.............................................................................................................................................. 15 Bestimmung der Aminosäuresequenz......................................................................................................................15 Zuordnung der Disulfidbrücken................................................................................................................................. 20 Enzyme / Coënzyme.......................................................................................................................................... 21 Enzyme......................................................................................................................................................................... 21 Coënzyme und prosthetische Gruppen.................................................................................................................... 27 Hämoglobin / Myoglobin............................................................................................................................................. 32 Chemische Modifizierung von Proteïnen........................................................................................................ 35 Zweck:.......................................................................................................................................................................... 35 Unspezifische Reagenzien......................................................................................................................................... 36 Gruppenspezifische Reagenzien............................................................................................................................... 36 Reagenzien zur Änderung der Ladung...................................................................................................................... 37 Hydrophobisierung von Enzymen.............................................................................................................................38 Reversible Reagenzien............................................................................................................................................... 38 Active-Site Labeling.................................................................................................................................................... 38 Suizid-Substrate.......................................................................................................................................................... 38 Photoaffinity-Label...................................................................................................................................................... 39 Bifunktionelle Reagenziën.......................................................................................................................................... 39 Semireversible Reagenzien........................................................................................................................................ 40 Trägergebundene Enzyme.......................................................................................................................................... 40 Lipide.................................................................................................................................................................. 43 Allgemeine Übersicht.................................................................................................................................................. 43 Fette.............................................................................................................................................................................. 43 Glycolipide................................................................................................................................................................... 43 Phospholipide.............................................................................................................................................................. 44 Isoprenoidlipide........................................................................................................................................................... 44 Biomembranen............................................................................................................................................................ 45 Monosaccharide................................................................................................................................................ 47 Nomenklatur................................................................................................................................................................. 47 Zyklische Zucker......................................................................................................................................................... 48 Nucleotide.................................................................................................................................................................... 48 Stoffwechsel....................................................................................................................................................... 49 Unterscheidung der Lebewesen................................................................................................................................ 49 Kohlenstoff-Stoffwechsel................................................................................................................................. 51 Glycogen...................................................................................................................................................................... 51 Glycolyse...................................................................................................................................................................... 52 Oxidative Decarboxylierung....................................................................................................................................... 56 Hormonelle Steuerung................................................................................................................................................ 57 Gluconeogenese.......................................................................................................................................................... 60 Der Citratzyklus........................................................................................................................................................... 61 Oxidative Phosphorylierung und Atmung................................................................................................................ 62 Der Pentosephosphatweg.......................................................................................................................................... 65 Der Fettsäurestoffwechsel................................................................................................................................ 69 Fettsäureabbau............................................................................................................................................................ 69 Ketonkörper entstehen bei vorherrschendem Fettabbau.......................................................................................71 Fettsäure-Synthese..................................................................................................................................................... 71 Aminosäureabbau und Harnstoffzyklus.......................................................................................................... 73 Transaminierung......................................................................................................................................................... 73 Oxidative Desaminierung........................................................................................................................................... 73 Der Harnstoffzyklus..................................................................................................................................................... 74 Biosynthese von Makromolekülen................................................................................................................... 75 Tetrahydrofolat als C1-Überträger............................................................................................................................. 75 Zyklus der aktivierten Methylgruppe......................................................................................................................... 75 Purin-Biosynthese....................................................................................................................................................... 76 -4-
  • 4. Biochemie Pyrimidinbiosynthese................................................................................................................................................. 78 Abbau der Purine......................................................................................................................................................... 78 NAD-Biosynthese........................................................................................................................................................ 79 Synthese von Sphingolipiden und Gangliosiden.....................................................................................................79 Biosynthese von Phospholipiden.............................................................................................................................. 80 Cholesterin-Synthese.................................................................................................................................................. 80 Photosynthese................................................................................................................................................... 83 Lichtreaktion................................................................................................................................................................ 83 Dunkelreaktion............................................................................................................................................................. 85 Anhang............................................................................................................................................................... 87 Abbildungsverzeichnis............................................................................................................................................... 87 Formelverzeichnis....................................................................................................................................................... 90 Gleichungsverzeichnis............................................................................................................................................... 94 Tabellenverzeichnis.................................................................................................................................................... 95 -5-
  • 5. Biochemie Proteïne Hierarchie der Zellkomponenten • Zelle • Organellen z.B. Mitochondrien, Chloroplasten, Zellkern • Supramolekulare Strukturen Multiënzymkomplexe, Ribosomen, kontraktile Systeme • Makromoleküle Nucleïnsäuren, Proteïne, Polysaccharide, Lipide • Bildungsblöcke Nucleotide, Aminosäuren, Monosaccharide, Glycerol und Fettsäuren • metabolische Zwischenprodukte Pyruvat, Citrat, Malat • Vorstufen aus de Umwelt CO2, N2, NH3, H2O Allgemeiner Aufbau der Proteïne Proteïne sind Heteropolymere der Aminosäuren (d.h. aus verschiedenen Molekülen zusammengesetzt). Ein weiterer wichtiger Typ kovalenter Bindungen in Proteïnen sind die Disulfidbrücken zwischen Cysteïnhälften (cross linkage). Die Bindungen können von Proteasen hydrolysiert werden. Abbildung 1 : Allgemeiner Aufbau der Proteïne Nomenklatur: Außer beim Glycin ist das α-C-Atom asymmetrisch substituiert, es tritt daher optische Aktivität auf. Man unterscheidet 2 sterische Reihen, die L- und die D-Reihe, sowie zweierlei Konfigurationszuweisungen, die S- und die R-Konfiguration. Nur L-Aminosäuren, die fast alle (Ausnahme L-Cysteïn) S-Konfiguration besitzen, sind Bausteine der Proteïne. Formel 1 : Sterischer Unterschiede der Aminosäuren Der optische Drehungssinn ist unabhängig von der Zugehörigkeit zu einer sterischen Reihe. Analyse der Raumstruktur von Proteïnen Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie: (NMR = Kernmagnetische Resonanz) Das Proteïn wird in ein magnetisches Feld gebracht und die unterschiedliche Resonanz der Atomkerne gemessen. Vorteil: Es ergibt sich ein 3D-Bild, welches sich aus der Summe von Einzelmolekülen in Lösung ergibt. Röntgenstrukturanalyse eines Kristalls der Verbindung Bestrahlung des Moleküls mit Röntgenstrahlen, wobei die Strahlen bei unterschiedlicher Elektronendichteverteilung unterschiedlich gebeugt werden. Durch die Mobilität ergeben sich allerdings Unschärfen im Kristall. Die Struktur des Myoglobins (ähnlich dem Hämoglobin) wurde durch diese Methode aufgeklärt. Vorteil: Auflösungsgrenze = 0,15 nm (bzw. 0,2 - 0,35 nm) (beim LM: » 400 nm) Nachteil: eingeschränkte Dynamik -7-
  • 6. Biochemie Die 20 Aminosäuren Abbildung 2 : Konfiguration der Aminosäuren bei unterschiedlichen pH-Werten Neutrale hydrophobe Aminosäuren Formel 2 : Neutrale hydrophobe Aminosäuren Neutrale hydrophile Aminosäuren Formel 3 : Neutrale hydrophile Aminosäuren Saure Aminosäuren Formel 4 :Saure Aminosäuren Basische Aminosäuren Formel 5 : Basische Aminosäuren -8-
  • 7. Biochemie Struktur der Proteïne Primärstruktur Die Aminosäuresequenz in der Polypeptidkette. Formel 6 : Aminosäuresequenz in der Polypeptidkette Sekundärstruktur Bei der α-Helixstruktur sind Wasserstoffbrücken intramolekular zwischen der NH- und der 4 AS1-Reste entfernten CO- Gruppe ausgebildet. Dadurch entsteht die schraubenförmige Anordnung der Aminosäuren. Abbildung 3 : Schraubenförmige Anordnung der Aminosäuren (α-Helix-Struktur) Ganghöhe (pitch): Länge, die die α-Helix bei voller Drehung zunimmt. Eine Aminosäure bringt eine Drehung von 100°, daher nach 3,6 AS eine volle Umdrehung. Bei der β-Faltblattstruktur kommt es zu einer zur Kettenrichtung senkrechten Ausbildung der H-Brücken (bei α-Helix: parallel zur Helixachse) zwischen verschiedenen Polypeptidketten oder gefalteten Kettenteilen. Seide - reine Faltblattstruktur (fast nur Gly, Ser, Ala) - an jeder 2. Position Gly - Ketten parallel zur Faserachse Kollagen - häufigstes Proteïn in Wirbeltieren (Haut, Knochen, Knorpel) - spezielle Helixstruktur - mechanisch stark beanspruchbar - denaturiertes Kollagen » Gelatine Tertiärstruktur 3D-Knäuelung der α-Helix und der Faltblattstruktur. Stabilisierung durch Disulfidbrücken: Abbildung 4 : Tertiärstruktur (3D-Knäuelung der α-Helix und der Faltblattstruktur) 1 Aminosäuren -9-
  • 8. Biochemie Disulfidbrücken Besonders wichtig bei kleinen Polypeptiden (s. Anfinsen-Experiment), da Struktur stabilisierend (Insulin, Chymotrypsin, Trypsin, α-Keratin (Haar)) Wasserstoffbrücken Elektrostatische Wechselwirkungen zwischen schwach acidem Donor und schwach basischem Akzeptor im Inneren des Proteïns: a) zwischen Peptidbindungen (α-Helix, β-Faltblatt) b) zwischen Seitenketten der einzelnen AS und an der Oberfläche mit Wasser. Wechselwirkung mit Wasser ist energetisch günstiger. Ionische Wechselwirkungen Relativ geringe Bedeutung für die Struktur, da meist an Enzymoberfläche → hauptsächlich Wechselwirkungen mit dem Lösungsmittel Hydrophobe Wechselwirkungen AS mit unpolaren Seitenketten: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro - Versuch den Kontakt mit H2O zu vermeiden - intramolekulare Gruppierung / Ausschluss von H2O - hydrophobe AS innen, hydrophile außen (dadurch gute H2O-Löslichkeit) Anfinsen-Experiment Untersuchung der Gründe für die Ausbildung einer Tertiärstruktur globulärer Proteïne. Ausgangsmaterial: RNAse: 124 AS, 4 S-S-Brücken Denaturierung in 8 M Harnstoff und Reduktionsmittel → Spaltung der Disulfidbrücken 1. Erst oxidiert und dann Harnstoff entfernt → falsche zufällige Renaturierung (keine Enzymaktivität) 2. Erst Entfernung des Harnstoffs (partielle Renaturierung) → richtige Faltung und richtige Disulfidbrücken (Enzymaktivität) Ergebnis: Die Aminosäuresequenz spezifiziert die Tertiärstruktur globulärer Proteïne. Abbildung 5 : Die Aminosäuresequenz spezifiziert die Tertiärstruktur globulärer Proteïne Domänen Proteïne bestehen oft aus mehreren Faltungseinheiten, die als Domänen bezeichnet werden. -10-
  • 9. Biochemie Abbildung 6 : Domänen bei Proteïnen Quartärstruktur Anlagerung mehrerer Polypeptidketten (Untereinheiten) aneinander → polymere Proteïne Bindungen wie bei der Tertiärstruktur. z. B. Virenhüllen, Hämoglobin, Multiënzymkomplexe Abbildung 7 : Anlagerung mehrerer Polypeptidketten aneinander (Quartärstruktur) Analyse von Proteïngemischen Probleme: - Vorkommen oft in sehr kleinen Mengen (1 % vom Trockengewicht, Peptidhormone wie z. B. Insulin in noch kleineren Mengen) - Stabilität: labil gegen pH (Bsp.: LDH dissoziiert bei pH < 6 → Denaturierung) - Temperatur: kältelabil (z.B. F1-ATPase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase einiger Spezies), wärmelabil: die meisten Enzyme Um Substanzgemische aufzutrennen, kann man 5 Eigenschaften der Moleküle benutzen: 1. Molekülgröße 2. Elektrische Ladung 3. Absorptionsverhalten 4. Löslichkeit 5. Affinität Chromatographie Physikalisch-chemisches Verfahren zur analytischen und präparativen Trennung gelöster oder gasförmiger Verbindungen. Die chromatographische Trennung beruht darauf, dass eine mobile Phase über eine stationäre Phase wandert und dabei die zu trennende Substanz mit unterschiedlicher Geschwindigkeit transportiert. -11-
  • 10. Biochemie An der stationären Phase, dem Trägermaterial (z. B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Stärke, Zellulose, Silikonöl, Ionenaustauschern) tritt eine unterschiedliche Verteilung der zu trennenden Substanzen mit der mobilen Phase (meist organische Lösungsmittel) auf. HPLC: (High Pressure Liquid Chromatography) Säulenchromatographie unter hohem Druck. Dadurch kann ein feineres Trennmaterial verwendet werden, bei dem die Durchlaufzeit ohne Druck zu hoch wäre. Molekülgröße Zentrifugation (differentielle bzw. fraktionierte Zentrifugation) Voraussetzung: Molekulargewichtsunterschiede. Der Faktor S entspricht dabei der Sedimentationskonstante, ist also ein Maß für das Gewicht (ist aber auch abhängig von der Form der Moleküle). Ultrazentrifugation (Dichtezentrifugation) Sedimentierung der Proteïne durch extreme Zentrifugation (bis 300.000 g). Träger: Suchrosegradient Dialyse Durch Osmose werden mit Hilfe einer semipermeablen Membran kleine Moleküle aus der Lösung entfernt. Zurück bleiben nur die großen Moleküle (z.B. Proteïne). Ultrafiltration Durch Druck oder Zentrifugationskraft werden kleine Moleküle und Wasser durch eine semipermeable Membran gepresst. Gelfiltration (Gelchromatographie) Das Substanzgemisch läuft über eine Säule aus stark hydratisiertem, polymeren Material wie z. B. Sephadex (Polysaccharid-Derivat), BioGel (Polyacrylamid-Derivat) oder Agarose (Polysaccharid). Die Gelpartikel werden mit verschieden großen Poren hergestellt. Die Substanzen mit unterschiedlicher Größe dringen mit unterschiedlichem Maße in die Gelpartikel ein. Große Substanzen laufen daher schneller durch die Säule als kleine Substanzen. Abbildung 8 : Gelfiltration (Gelchromatographie) Elektrische Ladung Ionenaustauschchromatographie (Ionenaustauscher) Das in der Säule befindliche Trägermaterial ist in der Lage, einen Teil der an austauschaktiven Gruppen gebundenen Ionen gegen andere Ionen reversibel zu tauschen. Trägermaterial ● Sulfoniertes Polystyrol ● Polyacrylamid ● Zellulose ● andere Zucker (Dextrane ≡ „Sephadex“) Kationenaustauscher CM (Carboxymethyl / schwach sauer): R-CH2-COO- Sulfonyl: RSO3H + NaCl → RSO3Na + HCl -12-
  • 11. Biochemie Anionenaustauscher DEAE (Diethylaminoethyl / schwach basisch): R-CH2-CH2-NH-(CH2-CH3)2]+OH- + NaCl → R-CH2-CH2-NH-(CH2-CH3)2]+Cl- + NaOH Das im Austauscher verbleibende Substanzion kann durch Elution (Lösen) mit geeigneten Ionen, je nach Dissoziationskonstante, abgelöst werden (z. B. durch pH-Gradiënten / Ionenstärkegradiënten). Elektrophorese Bewegung elektrisch geladener Teilchen im elektrischen Feld. Die negativ geladenen Teilchen wandern dabei zur Anode und die positiv geladenen zur Kathode. Die Wanderungsgeschwindigkeit hängt vom Verhältnis Masse/Ladung ab. Hochspannungs-Trägermaterial 1. Papier 2. Kieselgelplatte Niederspannungs-Trägermaterial 1. Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) 2. Zelluloseacetat-Folien Isoelektrische Fokussierung Durch den isoelektrischen Punkt (IEP) lassen sich Proteïngemische auftrennen (s.a. isoelektrische Fällung). In Verbindung mit einer Elektrophorese wandern die Proteïne im elektrischen Feld. Dabei ist der pH-Gradiënt im Gel von Bedeutung: Die Proteïne wandern bis zu der Stelle, wo der pH-Wert ihrem IEP entspricht. Da sie an diesem Punkt keine Ladung mehr tragen, können sie nicht weiterwandern. Absorptionsverhalten Adsorptionschromatographie Die Trennung erfolgt über eine Säule, auf die die Substanzmenge gegeben wird. Der obere Teil der Säule adsorbiert nun die Substanzmenge. Durch Zugabe von Lösungsmittel wird die Substanz wieder gelöst und fließt in der Säule ein kleines Stück weiter, bis sie erneut adsorbiert wird. Dieser Vorgang wiederholt sich kontinuierlich, wodurch es durch die unterschiedlichen Adsorptionsverhalten der verschiedenen Stoffe zu einer klaren Trennung der Substanzmenge kommt. Durch die Zugabe entsprechender Mengen an Lösungsmittel können die einzelnen Fraktionen des Eluats in einem Fraktionssammler entnommen werden. Löslichkeit Aussalzen z. B. Fällung (fraktioniert) mit Ammoniumsulfat (bis 3 M löslich in Wasser) ● zunächst Anstieg der Löslichkeit des Proteïns bei Zugabe von Salz → Einsalz-Effekt ● bei hoher Salzkonzentration → Aussalz-Effekt (Lösungsmittel reicht nicht mehr aus, Proteïne fallen nacheinander aus und werden abzentrifugiert) Fällung Aceton-Fällung und Ethanol-Fällung; durch niedrige Diëlektrizitätskonstante wird die Solvatationskraft des Wassers herabgesetzt, die Proteïne fallen aus. Aber: Fällung normalerweise bei niedrigen Temperaturen → Limitierung bei kältelabilen Proteïnen Isoelektrische Fällung Am isoelektrischen Punkt (IEP) ist die Zahl der positiven Ladungen im Proteïn gleich der Zahl der negativen Ladungen. Bei diesem pH-Wert ist die Löslichkeit des Proteïns minimal. Durch die Veränderung des pH-Wertes können Proteïne mit unterschiedlicher Ladungsverteilung nacheinander abgetrennt werden. Verteilungschromatographie Wie bei der Adsorptionschromatographie wird auch hier in einer Säule gearbeitet. Als Adsorptionsmittel dienen Kieselgur, Zellulosepulver, Stärke oder Glaspulver, die mit Wasser befeuchtet werden. -13-
  • 12. Biochemie Das zu trennende Substanzgemisch wird gelöst und auf die Säule gegeben. Mit einem organischen Lösungsmittel wird das Substanzgemisch langsam durch die Säule gespült. Eine Trennwirkung kommt dabei nicht durch die Adsorption der Substanzen an dem Trägermaterial zustande, sondern durch das Eindringen der Stoffe in den Wasserfilm auf der Oberfläche des Trägers. Dabei verteilen sich die Substanzen zu einem bestimmten Verhältnis in den beiden Phasen. Substanzen, die in organischen Lösungsmitteln leichter löslich sind als in Wasser, wandern schneller durch die Säule als leicht wasserlösliche Substanzen. Gaschromatographie Das Substanzgemisch wird verdampft und mit einem inerten Trägergas (Helium, Argon oder Stickstoff) durch ein langes, dünnes Rohr geleitet. Die einzelnen Komponenten des Gasgemisches lösen sich mehr oder weniger gut in der stationären Phase (Flüssigkeitsfilm auf der Innenseite des Rohrs) und können somit am Ende der Säule nach kürzerer oder längerer Strömungszeit nachgewiesen werden. Papierchromatographie Sie ist eine Verteilungschromatographie, die Trennwirkung beruht auf unterschiedlicher Löslichkeit der Substanzmenge in dem Lösungsmittel. Das Lösungsmittel-Substanzgemisch steigt durch Kapillarkräfte auf. Während des Vorgangs kommt es zur Bildung zweier Laufmittelphasen (eine hydrophile und eine hydrophobe Schicht). Durch die Wechselwirkung zwischen hydrophilem Trägermaterial und hydrophilem Laufmittel wandert der hydrophobe Teil des Substanzgemisches schneller und weiter hinauf. Als stationäre Phase dient dabei mit Wasser getränktes Filterpapier. Die Auftrennung (Entwicklung) erfolgt in einer gut verschlossenen Chromatographieapparatur. Dünnschichtchromatographie Als Trennschicht verwendet man oft Kieselgel, Kieselgur und Aluminiumoxid, das mit Wasser unter Zusatz von Gips als dünnflüssige Suspension auf eine rechteckige Glas- oder Kunststoffplatte aufgetragen wird. Die Auftrennung (Entwicklung) erfolgt in einer gut verschlossenen Chromatographieapparatur. Das Trennverfahren läuft wie bei der Papierchromatographie ab, jedoch sind die Zeitersparnis und eine empfindlichere Auftrennung Vorteile der Dünnschichtchromatographie. Bei der 2D-Dünnschichtchromatographie wird nach Abschluss des ersten Laufes (a.) die Platte um 90° gedreht und ein zweiter Lauf (b.) in einem anderen Fließmittel durchgeführt. Abbildung 9 : Eindimensionale DC (links) und 2D-DC (rechts) Affinität Affinitätschromatographie: Die Proteïne können gezielt aus einem Proteïngemisch isoliert werden. Das Prinzip basiert auf der Fähigkeit der Proteïne, bestimmte Moleküle (Liganden) spezifisch zu binden. Dabei dient als Säulenmaterial z.B. das Polysaccharid Agarose, an dessen Oberfläche die Liganden chemisch gebunden werden. Wird die Proteïnmischung nun auf die Säule gegeben, so bleibt nur das dem Liganden entsprechende Proteïn hängen, der Rest fließt nach Zugabe von Pufferlösung durch die Säule hindurch. Das gewünschte Proteïn kann dann durch Zugabe einer hohen Konzentration des Liganden in löslicher Form von dem Trägermaterial eluiert werden. Dadurch besteht mit dieser Methode die Möglichkeit, bestimmte Proteïne extrem hoch zu reinigen. -14-
  • 13. Biochemie Abbildung 10 : Prinzip der Affinitätschromatographie Gruppenspezifische Affinitätschromatographie z.B. AMP-Säulen zur Reinigung von NAD-abhängigen Proteïnen Hochspezifische Affinitätschromatographie z.B. Reinigung von Antikörpern, Substratsäulen Nachweis mit Ninhydrin Formel 7 : Aminosäurenachweis mit Ninhydrin Bestimmung der Aminosäuresequenz Erste vollständige AS-Sequenz 1953 am Rinder-Insulin durch Frederick Sanger. Warum ist das Wissen über die AS-Sequenz wichtig? ● Aufklärung der Kristallstruktur ● Verständnis molekularer Mechanismen ● Vergleich anderer Proteïne → Hinweise auf Funktion / evolutionäre Zusammenhänge Versuchsplan 1. Bruttozusammensetzung der AS (Aminosäureanalyse) 2. Bestimmung der Endgruppen (Hinweis auf verschiedene Polypeptidketten) 3. Trennung in Einzelketten 4. Spaltung der Polypeptidketten in kleine Fragmente 5. Sequenzierung der kleinen Fragmente 6. Wiederholung von 4. unter Bildung anderer Fragmente → Überlappungsfragmente -15-
  • 14. Biochemie 7. Zuordnung der Disulfid-Gruppen innerhalb oder zwischen Untereinheiten Aminosäureanalyse Zur Analyse wird eine Totalhydrolyse unter sauren und/oder basischen Bedingungen durchgeführt. Sauer Erhitzen der Polypeptide in Gegenwart eines Überschusses an 6 N HCl bei 100 – 120 °C für 10 – 100 Stunden in einem evakuierten, unter Vakuum zugeschmolzenen Röhrchen ist die normale Methode der Totalhydrolyse. Unter diesen Bedingungen findet keine Razemisierung und keine O 2-Oxidation statt. Für die Freisetzung von Val, Leu, Ile sind lange Zeiten erforderlich. Nachteil: - teilweise Zerstörung von Ser, Thr, Tyr - weitgehende Zerstörung von Trp - aus den Amid-Gruppen von Asn und Gln entstehen Carboxylgruppen und Ammoniumionen, die in die Messung von Glu und Asp mit eingehen Basisch Durch Kochen der Peptide in 2 – 4 M NaOH bei 100 °C für 4 – 8 h kann Trp getrennt bestimmt werden. Nachteil: - Zerstörung von Cys, Ser, Thr, Arg - andere AS werden teilweise desaminiert und racemisiert Vorteil: - liefert die Trp-Werte Endgruppenbestimmung Die Endgruppen geben Hinweise auf unterschiedliche Polypeptidketten. So besteht z.B. Insulin aus 2 AS-Ketten, die über 2 Disulfidbrücken verbunden sind. Es ergeben sich also 2 Aminosäuren vom C-Terminus und 2 vom N-Terminus. N-Terminus Prinzipien: Sanger / Dansylierung Abbildung 11 : Sanger / Dansylierung a) AS-Kette b) Markierung c) Hydrolyse → einzelne AS Edman-Abbau a) AS-Kette, Markierung, Hydrolyse → AS-Kette + 1 AS b) Erneuter Ablauf Abbildung 12 : Edman-Abbau -16-
  • 15. Biochemie Sanger-Reaktion (1945) Formel 8 : Sanger-Reaktion Reaktion der freien α-Aminogruppe der Proteïne mit 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB) unter Bildung von gelben 2,4- Dinitrophenyl-Derivaten. Durch die Hydrolyse der so entstandenen Peptide mit 6 N HCl werden alle Peptidbindungen gespalten. Es bleibt also als einzige farbige Verbindung das 2,4-Dinitrophenyl-Derivat mit der N-terminalen Aminosäure übrig, welches abgetrennt und durch chromatographischen Vergleich (2D-Dünnschichtchromatographie) mit bekannten 2,4-Dinitrophenyl-Derivaten der einzelnen AS identifiziert werden kann. Problem: Nukleophile AS-Seitenketten können ebenfalls reagieren. Dansylierung Formel 9 : Dansylierung Statt dem DNFB wird Dansylchlorid (5-Dimethylamino-1-naphthalinsulfonylchlorid) als Markierungsreagenz verwendet. Nach der Hydrolyse können die Dansyl-Derivate durch deren fluoreszierenden Charakter bestimmt werden. Diese Methode ist 100 mal empfindlicher als die Methode von Sanger. Edman-Abbau Formel 10 : Edman-Abbau Großer Vorteil des Edman-Abbaus: Der Rest der AS-Kette bleibt nach der Abtrennung der terminalen AS intakt und kann daher weiter untersucht werden. Somit kann das Proteïn Schritt für Schritt abgebaut werden. Das entstandene Phenylthiohydantoin (PTH) wird über die Gas-Chromatographie (oder HPLC) getrennt und bestimmt. Dieser Vorteil wurde benutzt, um einen „Sequenator“ (Solid-Phase) zu bauen. Dieses Gerät führt die AS-Bestimmung automatisch durch und bestimmt die entstehenden PTH-Derivate im Anschluss durch Chromatographie. -17-
  • 16. Biochemie C-Terminus Hydrazinolyse (Akabori-Reaktion) Formel 11 : Hydrazinolyse (Akabori-Reaktion) Alle Peptidbindungen werden durch Umwandlung der AS in Hydrazide gespalten. Es liegen daher nur noch Aminosäure-Hydrazide vor. Einzige Ausnahme dazu ist die AS des C-terminalen Endes der ursprünglichen Proteïnkette. Sie besitzt als einzige noch eine Carboxylgruppe und kann als freie Säure leicht chromatographisch identifiziert werden. Reduktion der AS durch Lithiumborhydrid zum entsprechenden α-Aminoalkohol. Nach der Hydrolyse kann dieser Alkohol chromatographisch identifiziert werden. Abspaltung der C-terminalen AS durch Carboxypeptidase (eine Exopeptidase). Nachteil: das Enzym spaltet schnell die nächste AS ab. Trennung in Einzelketten (falls erforderlich) a) Entfaltung der AS-Kette durch Harnstoff → Aufhebung der Tertiär- und Quartärstruktur. b) Spaltung der S-S-Bindungen durch - Reduktion (z. B. NaBH4) - Umsetzung mit Jodacetat: Bildung von stabilen Derivaten (Carboxymethylcysteïn) R - SH + I - CH2 - COOH → R - S - CH2 - COOH + HI Formel 12 : Trennung mit Iodessigsäure Spaltung in Fragmente (Partialhydrolyse) Zur späteren Identifizierung der Fragmente ist es wichtig, spezifische Spaltstellen zu erhalten. a) Bromcyan-Spaltung Spaltung der Peptidbindungen an denen ein Methionin beteiligt ist. Formel 13 : Bromcyan-Spaltung b) Enzymatische Spaltung durch Proteasen (Hydrolyse der Peptidbindungen) Peptidasen (= Exopeptidasen) spalten AS vom Ende ab 1. Carboxypeptidase (C-Terminus) 2. Aminopeptidase (N-Terminus) Proteïnasen (= Endopeptidasen) spalten an spezifischer Spaltstelle innerhalb der AS-Kette spaltet am C-terminalen Ende von Trypsin Lys, Arg Chymotrypsin Phe, Trp, Tyr Pepsin Phe, Trp, Tyr und verschiedene andere Tabelle 1 : Proteïnasen und ihre „Spaltstellen” -18-
  • 17. Biochemie Thermolysin spaltet am N-terminalen Ende von Leu, Ile, Val Viele Proteasen werden als inaktive Vorstufen (Zymogene, Proënzyme) sezerniert und dann proteolytisch aktiviert. Beispiele: ● Bildung von Chymotrypsinogen als inaktive Vorstufe im Pankreas, Aktivierung zu Chymotrypsin im Dünndarm durch Spaltung einer Arg-Ile-Bindung mittels Trypsin. ● Bildung von Trypsinogen als inaktive Vorstufe im Pankreas, Aktivierung zu Trypsin im Darm durch Enteropeptidase oder Trypsin selbst (autokatalytische Aktivierung). Sequenzierung der Fragmente a) chemisch: ● Edman-Abbau b) physikalisch: ● FAB (fast atom bombardment) - Variante der Massenspektroskopie, bis 25 AS - bombardiert in Glycerol gelöste Peptide mit Ar- oder Xe-Atomen. - Fragmentieren in verschieden große Teilstücke - Vergleich zwischen Massen und Fragmenten → Sequenz Vorteil: - mehrere Peptide (Gemisch, Verunreinigungen) möglich - Untersuchung posttranslational veränderter Proteïne (z.B. blockierter N-Terminus) - sehr hohe Empfindlichkeit Nachteil: - hohe Gerätekosten c) enzymatisch: ● Exopeptidasen Überlappungsfragmente Durch die Bildung weiterer, mit den bisherigen überlappender Fragmente kann auf die Sequenz des ganzen Proteïns zurückgeschlossen werden. Um andere Fragmente zu erhalten, wird die Spezifität der entsprechenden Enzyme geändert. Dadurch kommt es zu einer anderen Spaltung und zu anderen Überlappungsfragmenten. Spaltung am Beispiel von Trypsin a) normale Spaltstellen: Spaltung nach Lys und Arg b) weniger Spaltstellen: Blockierung von Lys → nur noch Spaltung bei Arg ● Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid: Formel 14 : Spaltung von Tripsin mit Bernsteinsäureanhydrid ● Reaktion mit Iodessigsäure: Lys - ( CH2 ) 4 - NH2 + I - CH2 COOH → Lys - ( CH2 ) 4 - NH - CH2 − COOH + HI Formel 15 : Spaltung von Tripsin mit Iodessigsäure c) mehr Spaltstellen: ● Umwandlung von Cysteïn in Pseudolysin, dadurch Spaltung nach Cysteïn, Lys und Arg: -19-
  • 18. Biochemie Formel 16 : Umwandlung von Cysteïn in Pseudolysin Zuordnung der Disulfidbrücken 1. Carboxylierung der SH-Gruppen (mit Iodessigsäure) 2. Tryptische Verdauung ohne Reduktion der S-S-Brücken 3. Isolierung der vernetzten Peptide 4. Reduktion der S-S-Brücken (NaBH4 / pH 3) 5. Trennung der Oligopeptidketten in Gegenwart von Mercaptoethanol (Schutz der freien SH-Gruppen) 6. Sequenzierung der Einzelketten → Carboxymethylierte Cysteïne = frühere freie SH-Gruppen → freie SH-Gruppen = frühere S-S-Brücken -20-
  • 19. Biochemie Enzyme / Coënzyme Enzyme Wirkungsweise von Enzymen Enzyme sind meist Proteïne (seltener Ribonucleïnsäuren). ● Wirken als Katalysator ● Verändern nicht die Lage des Gleichgewichts ● Erhöhen die Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung durch Erniedrigung der Aktivierungsenergie ∆G ● Ermöglichen milde Reaktionsbedingungen ● Fähigkeit zur Regulation ● Große Reaktionsspezifität Abbildung 13 : Erhöhen die Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung durch Erniedrigung der Aktivierungsenergie ∆G Die Bindung der Substrate erfolgt am aktiven Zentrum durch ● ionische oder hydrophobe Wechselwirkungen ● kovalente Zwischenstufen Abbildung 14 : Bindung der Substrate am aktiven Zentrum Isoënzyme Enzyme gleicher Funktion, die sich aber in ihrer Struktur und infolgedessen in manchen Eigenschaften voneinander unterscheiden. Lactat-Dehydrogenase Tetramer aus 4 identischen Untereinheiten pro „Typ“. Der H-Typ dominiert im Herzmuskel, der M-Typ im Skelettmuskel und in der Leber. Diese Untereinheiten setzen sich zu verschiedenen Tetrameren (multiplen Formen) zusammen: H4, H3M, H2M2, HM3, M4 Der H4-Typ besitzt eine höhere Affinität zu Pyruvat als der M 4-Typ. Deshalb wird der H 4-Typ durch hohe Pyruvatkonzentrationen gehemmt (Substrathemmung). Diese homologen Enzyme sind durch Genduplikation entstanden: LDH-H4 (Mensch) — LDH-H4 (Schwein): höhere Homologie als: LDH-H4 (Mensch) — LDH-M4 (Mensch) -21-
  • 20. Biochemie Unterschiede bei Chymotrypsin und Trypsin Substratbindungszentrum Chymotrypsin benötigt eine aromatische oder eine sperrige unpolare Seitenkette auf der Aminoseite der abzuspaltenden Peptidkette. Die Nische (eine unpolare Tasche) ist dagegen bei Trypsin verändert (Aspartat statt Serin). Das Aspartat kann eine starke elektrostatische Bindung mit einer positiv geladenen Lysin- oder Argininseitenkette des Substrats eingehen. Abbildung 15 : Unterschiede bei Chymotrypsin und Trypsin Katalytische Triade von Trypsin Beispiel für kovalente Katalyse, Säure-Base-Katalyse, Deformation des Substrats. Beim Trypsin (und Chymotrypsin) bilden Histidin 57, Aspartat 102 und Serin 195 eine katalytische Triade, wodurch die Reaktionsfähigkeit von Serin gesteigert wird. Wirkungsweise: Nach Zugabe eines Substrats wird ein Proton vom Serin 195 auf das Histidin 57 übertragen und der Imidazolring durch Aspartat 102 stabilisiert. Abbildung 16 : Katalytische Triade von Trypsin Einheiten der Enzymaktivität Definition der Enzymaktivität: 1 μmol Substratumsatz 1 Unit (U) = min Gleichung 1 : Absolute Enzymaktivität U / ml: Volumenaktivität U / mg Enzym: spezifische Aktivität SI-Einheiten: 1 mol Substratumsatz 1 Katal (kat) = s Gleichung 2 : Absolute Enzymaktivität kat / kg: spezifische Aktivität 1 U = 16,67 nkat -22-
  • 21. Biochemie Regulation der Enzymaktivität Aktivierung von Vorstufen Viele proteolytische Enzyme liegen in einer inaktiven Form vor. Man bezeichnet sie als Zymogene oder Proënzyme. Die Aktivierung erfolgt durch die Hydrolyse einer oder mehrerer Peptidbindungen. In diese Gruppe fallen viele Verdauungs- und Blutgerinnungsenzyme. Beispiel: Zymogen des Trypsins = Trypsinogen N-terminales Hexapeptid wird abgespalten: Spaltstelle = Lys - Ile → Lys = natürliche Spaltstelle des Trypsins → Die Protease Enteropeptidase braucht nur wenig aktives Trypsin herzustellen, dann: → autokatalytische Aktivierung (Trypsin ist sein eigener Katalysator) Allosterische Regulation (z. B. Feedback-Inhibition) Allosterie ist die Erscheinung, dass Makromoleküle (insbesondere Proteïne) ihre Konformation und Aktivität ändern, wenn ein bestimmtes Molekül (ein Effektor - kann auch gleichzeitig Substrat oder Produkt sein) an das Makromolekül gebunden wird. Die Bindung erfolgt an einer separaten Effektorbindungsstelle außerhalb des aktiven Zentrums (AZ), was eine Konformationsänderung im AZ bewirkt und somit einen hemmenden (Effektor ist ein Inhibitor) oder aktivierenden (Effektor ist Aktivator) Einfluss ausübt. Die allosterische Hemmung unterscheidet sich dabei von der kompetitiven Hemmung, bei der der Inhibitor im AZ selbst bindet, durch ihre Kinetik. Bei der Feedback-Hemmung treten Endprodukte einer Reaktionskette als Inhibitoren früherer Reaktionsschritte auf, um den Reaktionsweg abzuschalten. Beispiel: Regelung der ACTase bei der Pyrimidinbiosynthese, Hämoglobin etc. Umsatzdiagramme (Substratproduktion über Zeit): Abbildung 17 : Umsatzdiagramme (Substratproduktion über Zeit) Modelle zur Erklärung der Kooperativität bei oligomeren Proteïnen: a) „Symmetriemodel“ Alles-oder-Nichts-Umwandlung, kann aber nicht negative Kooperativität erklären! Voraussetzungen: - Es gibt für jede Untereinheit 2 mögliche Konformationszustände (T bzw. R) - Die Untereinheiten können immer nur in einer Form vorliegen, d.h. nur RR oder TT-Dimere, keine RT- Dimere! (T = „inaktiv“, R = „aktiv“) Abbildung 18 : Symmetriemodel b) „Sequenzmodel“ Voraussetzungen: - Es gibt für jede Untereinheit 2 mögliche Konformationszustände (T bzw. R) - Diese Konformationsänderung kann die Substratbindungsaffinität der anderen Untereinheiten erhöhen oder erniedrigen Abbildung 19 : Sequenzmodel -23-
  • 22. Biochemie Kovalente Modifikation Die Aktivität wird durch eine Phosphorylierung oder Dephosphorylierung eines speziellen Serinrestes festgelegt. Beispiel: Phosphorylase-Kinase Assoziation - Dissoziation Es findet eine Regulation durch andere Proteïne statt. Manche Enzyme werden aktiv, wenn der Ca 2+-Spiegel in der Zelle steigt. Das entsprechende Regulatorproteïn ist das Calmodulin; es bindet im Calcium-beladenen Zustand an die Proteïne und aktiviert sie dadurch. Regulation in Form von Abbau (Proteolyse) durch spezielle Proteasen. Regulation durch „de novo“-Synthese. Hemmkinetik Kompetitive Hemmung Bei der kompetitiven Hemmung konkurriert ein Inhibitor mit dem Substrat um die Bindung an das aktive Zentrum. Dies verläuft nach dem Massenwirkungsgesetz, wodurch die Hemmung durch eine hohe Substratkonzentration ausgeglichen werden kann. Abbildung 20 : Kompetitive Hemmung Unkompetitive Hemmung Hier bindet der Inhibitor an den Enzym-Substrat-Komplex, nicht aber an das freie Enzym. Der ternäre Komplex ESI ist nicht produktiv. Abbildung 21 : Unkompetitive Hemmung Nicht-kompetitive Hemmung Die Bindung des Inhibitors erfolgt allosterisch, d.h. an einem anderen Zentrum (nicht dem aktiven Zentrum) des Enzyms. Der Inhibitor verändert das aktive Zentrum, daher ergibt sich eine kleinere oder keine Aktivität. Der ternäre Komplex ESI ist nicht produktiv. Abbildung 22 : Nicht-kompetitive Hemmung -24-
  • 23. Biochemie Partiell nicht-kompetitive Hemmung Wie die nicht-kompetitive Hemmung, aber auch aus ESI Produktbildung möglich. Die Substrat- und allosterische Bindungsstelle überlappen teilweise. Abbildung 23 : Partiell nichtkompetitive Hemmung Das Michaelis-Menten Modell Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit als Funktion der Substratkonzentration Abbildung 24 : Das Michaelis-Menten Modell Herleitung der Michaelis-Menten-Gleichung k1 k3 E + S ↔ ES ↔ E + P k2 k4 k = Geschwindigkeitskonstante Gleichung 3 : Michaelis-Menten-Gleichung Für die Anfangsgeschwindigkeit spielt k4 keine Rolle und wird vernachlässigt. Weitere Annahme: [ S] >> [E] ⇔ S total ≈ S frei Dann gilt: ES - Bildungsrate = k 1 [E] [ S] ES − Zerfallsrate = k 2 [ES] + k 3 [ES] k 1 [E] [ S] = k 2 [ES] + k 3 [ES] Daraus folgert: k 2 + k 3 [ E ][ S ] KM = = k1 [ ES ] Gleichung 4 : Definition der Michaelis-Konstanten -25-
  • 24. Biochemie [E] = [E ] T − [ES] freies Enzym Gesamtenzym Enzym−Substrat −Komplex → [ES] = [ S] ∗ [E T ] [ S] + K M ν 0 = k 3 [ES] ν max = k 3 [E T ] → ν 0 = k 3 [E T ] ∗ [ S] [ S] + K M ν 0 = ν max ∗ [ S] [ S] + K M Gleichung 5 : Ableitung von v0 Bei v0 = ½ vmax → 1 ν ν max = max [ S] → K = [ S ] 2 [ S] + K M M Gleichung 6 : Folgerung für v0 = ½ vmax Bestimmung der Konstanten KM und vmax Lineweaver / Burk Kehrwert der Michaelis-Menten-Gleichung: → lineare Darstellung möglich Abbildung 25 : Diagramm nach Lineweaver / Burk Hanes [ S] ν0 [ S] Eadie / Hofstee ν0 ν0 [ S] Kinetik bei allosterischen Enzymen Allosterische Enzyme halten sich nicht an das Michaelis-Menten-Modell und zeigen oft eine sigmoide (S-förmige) Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration. -26-
  • 25. Biochemie Abbildung 26 : Kinetik bei allosterischen Enzymen Zwei- (oder Mehr-)Substrat-Reaktionen Single Displacement a) random order +B E + A ↔ EA ←→ EAB E+C+D +A E + B ↔ EB ←→ EAB b) compulsory order + E + A ↔EA ← B →EAB →E + C + D  E + B ← →EB  Double Displacement Pingpong-Mechanismus (siehe Fettsäure-Synthese) Coënzyme und prosthetische Gruppen Coënzyme sind Nicht-Eiweißverbindungen. Fast alle hier aufgeführten Substanzen enthalten ADP als Baustein! Die klassische Definition des Katalysators trifft auf Coënzyme nicht zu, da sie aktiv verändert werden und erst in einem 2. (ebenfalls enzymatischen) Schritt wieder ihre ursprüngliche Form erhalten. Die prosthetische Gruppe ist eine Nicht-Eiweißverbindung, die fest (kovalent oder ionisch) an das Enzym gebunden ist. Sie kann eventuell nur ein einfaches Ion sein, was jedoch benötigt wird, um die volle Kapazität des Enzyms herzustellen. Wasserstoffübertragende Coënzyme Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADP) Oxidierte Formen (NAD+ bzw. NADP+) Formel 17 : Oxidierte Form von NAD und NADP Wasserstoffaufnahme → reduzierte Formen (NADH bzw. NADPH) Formel 18 : Reduzierte Form von NAD und NADP -27-
  • 26. Biochemie Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD) Formel 19 : FAD-Gleichgewicht FAD kann auch durch Übertragung einzelner Elektronen über eine radikalische Zwischenstufe reduziert werden. Flavinmononucleotid (FMN) - Wasserstoffaufnahme wie bei FAD (FMN → FMNH2) - prosthetische Gruppe bei der Elektronentransportkette Formel 20 : Flavinmononucleotid Auch FMN kann (wie FAD) durch Übertragung einzelner Elektronen über eine radikalische Zwischenstufe reduziert werden. Ubichinon (Coënzym Q) - 2 Ein-Elektronen-Übergänge mit radikalischer Zwischenstufe - Redoxsystem in der Atmungskette - n = 6 – 10 Formel 21 : Ubichinon-Redoxsystem Plastochinon - Redoxsystem in der Atmungskette - Wasserstoffaufnahme wie bei Ubichinon - n=9 Formel 22 : Plastochinon -28-
  • 27. Biochemie Liponsäure - Wasserstoff-Übertragung bei der oxidativen Decarboxylierung in Form von Liponamid (enzymgebunden): Formel 23 : Liponsäure-System Gruppenübertragende Coënzyme Adenosintriphosphat (ATP) - Energieträger biochemischer Reaktionen - Liegt normalerweise in Metallkomplexen (Mg2+) vor - Freisetzung von Energie durch Hydrolyse der Anhydrid-Bindungen Formel 24 : Adenosintriphosphat (ATP) und Mg-Komplex Vergleich der Standardreaktionsenthalpien der Hydrolyse kJ / mol kcal / mol Phosphoenolpyruvat (PEP) -61,9 -14,8 Carbamoylphosphat -51,5 -12,3 1,3-Bisphosphoglycerat -49,4 -11,8 Acetylphosphat -43,1 -10,3 Creatinphosphat -43,1 -10,3 Pyrophosphat -33,5 -8,0 ATP → ADP, Pi -30,5 -7,3 Glucose-1-Phosphat -20,9 -5,0 Glucose-6-Phosphat -13,8 -3,3 Glucose-3-Phosphat -9,2 -2,2 Tabelle 2 : Vergleich der Standardreaktionsenthalpien der Hydrolyse Durch seine Mittelstellung ist ATP als Phosphatgruppenüberträger geeignet. PEP kann wiederum eine Phosphorylgruppe unter Bildung von ATP auf ADP übertragen. Pyridoxalphosphat (PLP) - Derivat des Pyridoxins (Vitamin B6) - Die Aldehydgruppe dieses Coënzyms bildet eine Schiff'sche Base mit einer spezifischen Lysin-Seitenkette des Enzyms. - Bei Phosphorylase fungiert PLP wahrscheinlich als Säure-Base-Katalysator (Protonenakzeptor und -donator). Hauptfunktion ist die Aktivierung der verschiedenen Bindungen am C α von Aminosäuren (z. B. bei Transaminierung). -29-
  • 28. Biochemie Formel 25 : Pyridoxalphosphat (PLP) Coënzyme für C1-Transfer Tetrahydrofolat (THF) (siehe „Biosynthese von Makromolekülen“) Formel 26 : Tetrahydrofolat (THF) S-Adenosylmethionin (siehe „Biosynthese von Makromolekülen“) Formel 27 : S-Adenosylmethionin Biotin - Beteiligung am Carboxyltransfer - Isolierung als Vitamin H aus Leberextrakten - Inaktivierung durch Bindung an Avidin (Proteïn des Eiklars) - peptidartige Bindung an Lysinrest → prosthetische Gruppe Formel 28 : Biotin und Carboxy-Biotin-Enzym -30-
  • 29. Biochemie Coënzyme für C2-Transfer Coënzym A Formel 29 : Coënzym A Übertragung von Resten der Carbonsäuren bei Acetyl-CoA: R = CH3 Formel 30 : Bildung von Acetyl-CoA Thiamin-Pyrophosphat (TPP) Decarboxylierung von Pyruvat Enthält Vitamin B1 (Thiamin) Formel 31 : Thiamin-Pyrophosphat (TPP) Coënzyme der Isomerasen und Lyasen Cobalamin - Radikalische Umlagerungen von Funktionellen Gruppen (-COO-, -NH3+) - Methylgruppenübertragung Formel 32 : Cobalamin -31-
  • 30. Biochemie Hämoglobin / Myoglobin Kooperativität Die Veränderung (Erhöhung/Erniedrigung) der Bindungsaffinitäten der Untereinheiten eines oligomeren Proteïns zu kleinen Molekülen (wie hier zum Sauerstoffmolekül) durch die Bindung dieser Moleküle an benachbarte Untereinheiten bezeichnet man als (positive / negative) Kooperativität. Hämoglobin (Hb) Das Hämoglobin kommt in den Erythrocyten vor und übernimmt den Sauerstofftransport im Blut. Es besteht aus dem Proteïn Globin und der prosthetischen Gruppe Häm. Das Häm ist der Eisenkomplex eines Porphyrins (des Protoporphyrins IX). Das Fe(II) im Molekül wird durch die hydrophobe Umgebung gegen Oxidation geschützt. Formel 33 : Hämoglobin (Hb) Aufnahme von Sauerstoff durch das Häm Im Häm kann das Eisen unter Ausbildung einer sechsten (koordinativen) Bindung Sauerstoff reversibel binden. Das Eisen verändert dabei nicht seine Ladungszahl, sondern Salzbrücken zwischen den Untereinheiten α1 und β1 brechen auf. Dadurch können die nachfolgenden Sauerstoff-Moleküle leichter gebunden werden (positive Kooperativität). Es entsteht Oxyhämoglobin. Jedes Hämoglobin kann daher 4 Sauerstoff-Moleküle aufnehmen. Im Desoxyhämoglobin liegt das Eisenatom etwa 0,04 nm außerhalb der Hämebene. Bei der Oxygenierung bewegt sich das Eisenatom in die Hämebene hinein (d.h. das proximale His verschiebt sich), um mit dem Sauerstoff eine feste Bindung einzugehen. Abbildung 27 : Oxygenierung von Hämoglobin Durch diese Verschiebung wird eine H-Brücke zwischen Asp-94 und His-146 aufgebrochen, und Protonen werden frei (s. Bohr-Effekt). Wirkung von Bisphosphoglycerat 2,3-Bisphosphoglycerat (BPG) hat eine wichtige Rolle bei der Regulation der Sauerstoffaufnahme. Das Desoxyhämoglobin kann ein Molekül BPG binden; die negativ geladenen Phosphatgruppen treten mit positiv geladenen Gruppen von Histidin und Lysin in Wechselwirkung, wodurch die Raumstruktur so stark verändert wird, dass die Sauerstoffaffinität stark sinkt. Bei der Sauerstoffbeladung wird das BPG wieder abgegeben. Befindet sich im Blut nur eine geringe Menge an BPG, so enthält ein Teil des Desoxyhämoglobins kein BPG und bindet den Sauerstoff entsprechend fester. Daher kann der Sauerstoff dann nicht in den zu versorgenden Geweben abgegeben werden und das Hämoglobin erfüllt seine Transportfunktion nicht. Abhängigkeit der Sättigung vom O2-Partialdruck Bei der Beladung des Hämoglobins wird der hohe Sauerstoffpartialdruck der Lunge ausgenutzt, um Sauerstoff zu binden und in die Bereiche mit geringerem Sauerstoffpartialdruck zu transportieren. -32-
  • 31. Biochemie Abbildung 28 : Abhängigkeit der Sättigung vom O2-Partialdruck Bohr-Effekt Der Bohr-Effekt ist die nach dem dänischen Physiologen benannte Sauerstoffaustreibung aus dem Oxyhämoglobin durch Kohlendioxid, d.h. das Vorliegen einer höheren Konzentration an CO 2 und H+-Ionen in einem stoffwechselaktivem Gewebe erleichtert die Freisetzung von O2. Abbildung 29 : Bohr-Effekt Die Aufnahme von O2 in der Lunge, durch die Protonen freigesetzt werden, hat dabei die Austreibung von CO 2 zur Folge. Auf molekularer Ebene kommt es beim Übergang von Oxy- zu Desoxyhämoglobin zu einer Verschiebung des Asp- 94 in die Nähe des His-146. Durch die Erhöhung der lokalen negativen Ladung wird der pK-Wert von His-146 erhöht, d.h. die Wasserstoffaffinität nimmt zu: Es kommt leichter zur Aufnahme von H+. Fötales Hämoglobin Der Fötus besitzt einen eigenen Hämoglobin-Typ, das Hämoglobin F (α2γ2) welches sich von dem der Erwachsenen unterscheidet. Hämoglobin F bindet BPG schwächer und besitzt daher eine höhere Sauerstoffaffinität als Hämoglobin A. Daher kann O2 vom mütterlichen Hämoglobin A auf das Hämoglobin F des Fötus übertragen werden. Myoglobin (Mb) Das Myoglobin bindet ebenfalls den Sauerstoff durch das Häm. Es transportiert und speichert ihn jedoch in der Muskelzelle und zeigt als Monomer keine Kooperativität. -33-
  • 32. Biochemie Chemische Modifizierung von Proteïnen Zweck: ● Bestimmung katalytisch relevanter AS ● Veränderung der Proteineigenschaften (durch Veränderung der Oberfläche) a) Ladungsveränderung b) hydrophobe Oberfläche ● Quervernetzung mit bifunktionellen Gruppen a) Abstandsmessungen im AZ (zwischen katalytisch relevanten AS) b) Verknüpfung von Untereinheiten α: zur Stabilisierung des Proteïns β: Bestimmung der Geometrie des Aufbaus aus der Verteilung der Quervernetzungsprodukte c) Lokalisierung relativ zu anderen Proteïnen(in der Membran, in Multienzymkomplexen, im Aufbau des Ribosoms) Welche AS-Seitenreste können reagieren? In allen Fällen werden elektrophile Reagenzien benötigt, (bei -COOH nur, wenn –COO-, sonst eventuell Nukleophile) Abbildung 30 : Reaktionsfähige AS-Seitenreste Probleme: - Kann überhaupt eine Seitenkette selektiv modifiziert werden? (z.B. bei LDH eine von 5 SH-Gruppen oder oft eine von mehr als 20 Lys-NH2-Gruppen) - Sterische Zugänglichkeit:: Besondere Reaktivität durch spezifischen pK-Wert durch Nachbargruppen → kinetische Kontrolle (z.B. Lys-NH2 normal pK = 11; im AZ Teile mit pK = 8) Wahl des Reagenz: - Spezifität - reversible Reaktion? - milde Reaktionsbedingungen Bestimmung des Einbaus: - Farbige Reagenzien - Radioaktive Markierung (3H, 14C, 35S...) Bestimmung katalytisch relevanter AS: Korrelation der Aktivität mit dem Einbau: → Probleme: Trotz 1:1-Relation kann es zu allosterischen Effekten kommen. → Bsp.: Bei der Modifizierung der „essentiellen SH-Gruppe“ bei der LDH wird eine Seitenkette verschoben, an die ein „essentielles His“ geknüpft ist → Verlust der Aktivität! Identifizierung der Art der modifizierten AS: z. B. durch die pH-Abhängigkeit (der pK-Wert von 6,5 deutet eventuell auf His) -35-
  • 33. Biochemie Unspezifische Reagenzien Iodessigsäure: Formel 34 : Umsetzung mit Iodessigsäure Iodacetamid Formel 35 : Umsetzung mit Iodacetamid Acet(yl)imidazol: (bei His, Cys Produkte instabil) Formel 36 : Umsetzung mit Acet(yl)imidazol Gruppenspezifische Reagenzien Lys-NH2 Imidoester: (entsteht aus: R-CN + MeOH / HCl) Formel 37 : Umsetzung mit Lys-NH2 Tyr-OH Tetranitromethan: Formel 38 : Umsetzung mit Tyr-OH Alternativ: Umsetzung mit Diazoniumsalzen → Azofarbstoffe Cys-SH Maleïnimide, z. B. N-Ethylmaleïnimid: Formel 39 : Umsetzung mit Cys-SH Umsetzung auch mit Lys bei pH = 6,5 - 7, Geschwindigkeit aber 1000mal langsamer. -36-
  • 34. Biochemie Serin-OH Diisopropylfluorophosphat: Parathion (E 605) wirkt analog: Formel 40 : Umsetzung mit Serin-OH Tryptophan Sulfenylchlorid (Koshland-Reagenz): Reaktion auch mit Cys-SH, das „reversibel“ geschützt werden muss. Formel 41 : Umsetzung mit Tryptophan Arginin Butandion (Diacetyl): Formel 42 : Umsetzung mit Arginin Aspartat, Glutamat: Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD) Formel 43 : Umsetzung mit Aspartat, Glutamat Reagenzien zur Änderung der Ladung Abbildung 31 : Reagenzien zur Änderung der Ladung -37-
  • 35. Biochemie Hydrophobisierung von Enzymen Abbildung 32 : Hydrophobisierung von Enzymen Reversible Reagenzien Histidin Abbildung 33 : Reversible Reagenzien (Histidin) Cysteïn a) b) c) Ellman’s Reagenz Formel 44 : Ellman's Reagenz Active-Site Labeling Formel 45 : Active-Site Labeling Suizid-Substrate Werden am aktiven Zentrum reaktiv. -38-
  • 36. Biochemie Formel 46 : Suizid-Substrate Photoaffinity-Label Formel 47 : Photoaffinity-Label Bifunktionelle Reagenziën Kriterien für die Anwendung a) Abstandsmessungen (im AZ) starr - spezifisch für bestimmte Aminosäuren - für Reste eventuell unterschiedlich spezifisch b) Lokalisierung von „Nachbarn“; kovalente Verbindungen von Untereinheiten - flexibel - unspezifisch Reagenz von Zahn Formel 48 : Reagenz von Zahn, o,p- aktiviert für nucleophile Substitution des Fluor Hugo Fasold Probleme: -39-
  • 37. Biochemie - viele Produkte - Reaktion nur an Rest A oder nur an Rest B - Quervernetzung zwischen A und B - weitere Reste können entsprechend reagieren - bei asymmetrische Reagenzien kann u.U. die eine oder die andere Seite mit Rest A reagieren Beispiel: Stufenweise Reaktion: Belichtung nach Entfernung des nicht umgesetzten Überschusses durch z.B. Dialyse oder Gelchromatographie. Aktivierung einfach durch pH > 8,5 nach Reaktion mit –SH und Dialyse Semireversible Reagenzien Formel 49 : Semireversible Reagenzien Trägergebundene Enzyme Vorteile ● Erhöhte Stabilität (z.B. Proteasen, Schutz vor Selbstverdauung) ● Wiedergewinnung Probleme ● Zugänglichkeit des AZ ● Kinetik: Diffusionsprobleme: Spezifische Aktivität kleiner als im löslichen Enzym, auch wenn Zugang zum AZ frei, denn nach Teilverdau des Trägers steigt die spezifische Aktivität bis zum Normalwert ● Reaktion an der richtigen UE -40-
  • 38. Biochemie Arten der Verknüpfung ● kovalent ● Adsorption ● Einschlussverbindungen ● Aggregation Kovalente Bindung an welche AS? - Keine seltenen, da diese oft katalytisch relevant - Schutz des AZ durch Komplexe (LDH: NAD+ / Oxalat) - z.B. direkt an BrCN-aktivierte Agarose: - (dargestellte Reaktion verläuft über Spacer + R-COOH, es geht auch mit Lys-NH 2) - Bifunktionelle Reagenzien: Müssen erst mit Enzym reagieren und nur das "aktive", modifizierte an Träger binden! - Adsorption an: poröses Glas / Ti02 / Collagen - Einschlussverbindungen: z.B. Copolymerisation (Acrylamid mit Bisacrylamid) - Chemische Aggregation: z.B. durch bifunktionelle Reagenzien -41-
  • 39. Biochemie Lipide Allgemeine Übersicht Abbildung 34 : Lipide, allgemeiner Überblick Fette Fette bestehen in der Regel aus Glycerin und 3 Fettsäuren, z.B. die unten abgebildeten. Für die Bezeichnung der Fettsäuren verwendet man eine Kurzschreibweise, bei der die Zahl der C-Atome und die Zahl der Doppelbindungen angegeben werden. Formel 50 : Verschiedene Fettsäuren Glycolipide Sie enthalten kein Phosphat, sondern stattdessen einen Mono- oder Oligosaccharidrest, der meist mit Sphingosin (oder Glycerin) verknüpft ist und den hydrophilen Anteil bildet. Glyceringlykolipide: 1.2-Diacylglycerin und ein Mono- oder Oligosaccharid in 3-Stellung des Glycerins glycosidisch gebunden. Sphingosinglykolipide: Als Sphingolipide enthalten sie als zentralen Baustein statt des 3-wertigen Alkohols Glycerin einen Aminodialkohol, das Sphingosin, welches ein C18-Molekül mit einer trans-Doppelbindung ist. Durch Amidbildung mit einer Fettsäure kommt es zu Ceramiden, deren Glycoside die neutralen Glycosphingolipide sind. Formel 51 : Sphingosinglykolipide -43-
  • 40. Biochemie Einfachste Vertreter: Cerebroside. Bei den Cerebrosiden des Gehirns meist Galactose, bei Leber und Milz meist Glucose. Formel 52 : Ein Cerebrosid Phospholipide Glycerinphospholipide Phosphodiëster; die Phosphorsäure ist einerseits mit einem Sphingosin- oder Glycerinderivat (meist Diacylglycerin), andererseits mit Cholin, Ethanolamin, Serin, Inosit oder Glycerin verestert. Formel 53 : Phosphatidylcholin (Lecithin) Sphingosinphospholipide Sphingomyeline: In den Myelinscheiden vorkommende Sphingosinphospholipide, bei denen die endständige Hydroxygruppe des Ceramids (s.o.) mit Phosphorylcholin verestert ist. Formel 54 : Ein Sphingomyelin Isoprenoidlipide Die Steroide und Terpene gehören zu dieser Stoffklasse und werden wegen ihrem ähnlichen Lösungsverhalten zu den Lipiden gerechnet. Steroide Cholesterin Das Cholesterin leitet sich vom Cyclopentanoperhydrophenanthren ab, welches auch als Steran bezeichnet wird. Durch die OH-Komponente liegt Cholesterin als Alkohol vor (engl.: Cholesterol). Cholesterin verleiht der Membran Starrheit und schließt auftretende Löcher. Formel 55 : Sterangrundgerüst, Cholesterin -44-
  • 41. Biochemie Terpene Zu dieser Stoffklasse gehören die Carotine und die Xanthophylle, die hier aber nicht weiter besprochen werden. Biomembranen Membranfunktion ● Geben den Zellen Individualität durch Abtrennung der Umwelt ● Bei Eukaryonten: Strukturierung von Zellorganellen durch interne Membranen Eukaryonten: Einzellige oder mehrzellige Organismen, die einen vom Cytoplasma durch eine Membran abgegrenzten Zellkern besitzen. Prokaryonten: Kein Zellkern. ● Kompartimentierung bestimmter Prozesse ● Extrem spezifische Permeabilitätsbarrieren ● Bewirken geordnete räumliche Anordnung bestimmter Enzyme zueinander (Reaktionsketten möglich) ● Enthalten Pumpen (molekulare), Rezeptoren (Hormone) zur Steuerung interner Prozesse Bau der Membranen ● Keine kovalenten oder festen Strukturen, sondern eine „Flüssigkeitsschicht“, die durch Wechselwirkungen mit dem Lösungsmittel entsteht. ● Bestehen aus: Lipiden (v.a. Phospholipide, Glycolipide und Cholesterin) und Proteïnen Abbildung 35 : Membranen Die Flächen können Vesikel (kugelförmige Doppelschichten) bilden. Die Doppelschicht liegt nicht starr vor, sondern befindet sich ständig im Fluss, wobei die Proteïne ihre Positionen verändern können. Laterale Diffusion einfach, hochmobile Schicht. Transversale Diffusion (flip-flop) energetisch ungünstig. -45-
  • 42. Biochemie Monosaccharide Nomenklatur Abbildung 36 : Nomenklatur der Monosaccharide Aldose mit n C-Atomen: 2n-2 stereoisomere Formen Pentosen: n = 5 → 23 = 8 Isomere (4 L-Formen und 4 D-Formen) Hexosen: n = 6 → 24 = 16 Isomere Fischer-Projektion - D-Zucker haben an ihrem carbonylfernsten Asymmetriezentrum die gleiche absolute Konfiguration wie D- Glycerinaldehyd - L-Zucker sind Spiegelbilder der D-Zucker Glycerinaldehyd Formel 56 : Konfigurationen des Glycerinaldehyds Epimere: Zucker, die sich in der Konfiguration nur an einem C-Atom unterscheiden (z.B. Glucose / Mannose). Acetale und Ketale Acetale entstehen bei der Reaktion von Aldehydgruppen mit Alkoholen: Formel 57 : Reaktionsweg: Aldehyd zum Vollacetal Ketale entstehen bei der Reaktion von Ketogruppen mit Alkoholen. Formel 58 : Reaktionsweg: Ketogruppe zum Vollketal -47-
  • 43. Biochemie Saccharose Formel 59 : Saccharose Zyklische Zucker 5-Ring-Zucker Formel 60 : 5-Ring-Zucker 6-Ring-Zucker Formel 61 : 6-Ring-Zucker Nucleotide Nucleoside: Zucker und eine Base Nucleotide: Zucker, Base und ein oder mehr Phosphatreste Purinbasen Formel 62 : Purinbasen Pyrimidinbasen Formel 63 : Pyrimidinbasen -48-
  • 44. Biochemie Stoffwechsel Die grundlegenden Stoffwechselwege sind in den meisten Organismen identisch! Aufklärung durch ● Fütterungsversuche mit durch Isotopen markierten Substanzen ● Verwendung von Stoffwechselinhibitoren (Hemmstoffen) ● Verwendung von auxotrophen Mutanten (benötigen bestimmten Nährstoff für ihr Wachstum) Mutanten durch ● mutagene Substanzen ● Strahlung, z.B. Röntgenstrahlung ● molekularbiologische Methoden Ein Beispiel für die Wirkung von Mutanten ist die Arginin-Biosynthese im Harnstoff-Zyklus mit folgenden Enzymdefekten: Abbildung 37 : Mutanten bei der Arginin-Biosynthese Mutante 1 wächst auf: Ornithin oder Citrullin oder Arginin; Mutante 2 wächst auf: Citrullin oder Arginin; Mutante 3 wächst auf: Arginin Cross-feeding: Mutante 2 reichert Ornithin an und wächst mit Filtrat von Mutante 3 (da in diesem Citrullin angereichert ist), aber nicht umgekehrt Metabolismus Stoffwechsel: Bedeutung i.a. Anabolismus und Katabolismus Anabolismus Aufbau von Körpersubstanzen Katabolismus Abbau von Körpersubstanzen und Nahrungsbestandteilen Speicherung der Energie As ATP / hochreduzierte Verbindungen (z.B. Glucose) reduzierte Elektronenüberträger (NADH, FADH2, NADPH) Verwendung der Energie Für Biosynthesen (Anabolismus) / Muskelarbeit (ATP) / Transportprozesse Unterscheidung der Lebewesen 1. Nach der Kohlenstoffquelle: autotroph: „sich selbst ernährend“; C-Quelle ist CO2 heterotroph: C-Quelle sind andere Zellen bzw. deren Bestandteile 2. Nach der Energiequelle: phototroph: Licht chemotroph: Redoxprozesse 3. Nach den Elektronendonatoren: lithotroph: anorganische Verbindungen: (H2S, NH3, S, Co, Fe2+, H2O) organotroph: organische Verbindungen Organismen C-Quelle E-Quelle e—-Donatoren Beispiel photolithotroph CO2 Licht anorg. Verb. Bakteriën photoorganotroph org. Verb./CO2 Licht org. Verb. Purpurbakteriën chemolithotroph CO2 Redoxprozesse anorg. Verb. Archaëbakteriën chemoorganotroph org. Verb. Redoxprozesse org. Verb. alle höheren Tiere -49-
  • 45. Biochemie Tabelle 3 : Unterscheidung der Lebewesen -50-
  • 46. Biochemie Kohlenstoff-Stoffwechsel Glycogen Glycogen ist eine leicht mobilisierbare Speicherform der Glucose. Es ist ein großes, verzweigtes Polymer aus Glucoseeinheiten in α-1,4-glykosidischer Bindung. Formel 64 : α-1,4- und α-1,6-glycosidische Bindung Die Synthese und der Abbau von Glycogen sind aus mehreren Gründen von Bedeutung: ● Regulation des Blutzuckerspiegels ● Glucosereservoir für anstrengende Muskelaktivität ● Synthese und Abbau laufen auf unterschiedlichen Reaktionswegen, dies verdeutlicht ein wichtiges Prinzip der Biochemie ● Generelle Bedeutung der Regulationsmechanismen auf hormoneller Ebene ● Reversible Phosphorylierung der Enzyme Abbau des Glycogens durch Glycogen-Phosphorylase Phosphorolyse bedeutet die Spaltung einer Bindung durch Einbau von Orthophosphat (im Gegensatz zur Hydrolyse, einer Spaltung durch Wasser). Formel 65 : Abbau des Glycogens durch Glycogen-Phosphorylase Für den Ablauf der Spaltung ist als Coënzym das Pvridoxal-5-phosphat (PLP), ein Derivat des Pyridoxins (Vitamin B6) erforderlich. Die Aldehydgruppe dieses Coënzyms bildet eine Schiff'sche Base mit einer spezifischen Lysin-Seitenkette des Enzyms. PLP spaltet mit seiner Phosphatgruppe zunächst die glycosidische Bindung und wird durch anorganisches Phosphat wieder freigesetzt (doppelte Inversion am C1). Abbau des Glycogens durch Phosphorylase Phosphorylase kann die Kette nur solange abbauen, bis sie einen endständigen Glucoserest erreicht, der nur 4 Einheiten bis zu einer Verzweigung entfernt ist. Abbildung 38 : Abbau des Glycogens durch Phosphorylase Übertragung durch eine Transferase Die Transferase überträgt einen Block von 3 Glucoseeinheiten von einem äußeren Zweig auf einen anderen. Abbildung 39 : Übertragung durch eine Transferase Abbau durch ein debranching enzyme (= Aufhebung der Verzweigung) Das dritte Abbauenzym, die α-1,6-Glucosidase (unter dem Namen debranching enzyme bekannt), hydrolysiert die Bindung des einzelstehenden Glucosemoleküls, es entsteht ein Molekül Glucose. Abbildung 40 : Abbau durch ein debranching enzyme -51-
  • 47. Biochemie Somit liegt das Glycogen wieder in einer linearen Form vor und kann weiter von der Phosphorylase abgebaut werden. Synthese von Glycogen Die Synthese hat als erste Vorstufe die UDP-Glucose. Glucose - 1- Phosphat + UTP → UDP - Glucose + PPi Glycogen( n) + UDP - Glucose → Glycogen( n + 1) + UDP Gleichung 7 : Synthese von Glycogen UDP-Glucose Formel 66 : UDP-Glucose Die Verzweigungen (α-1,6-Bindungen) werden durch ein branching enzyme gebildet. Glycolyse Ablauf der Glycolyse Formel 67 : Ablauf der Glycolyse -52-
  • 48. Biochemie Die Glycolyse ist eine Folge von Reaktionen in denen im Cytosol (Cytoplasma) Glucose in Pyruvat umgewandelt wird und gleichzeitig ATP entsteht. In aeroben Organismen geht sie dem Citratzyklus und der Atmungskette voraus. Unter anaëroben Bedingungen tritt das Pyruvat in die Mitochondriën über und wird hier vollständig zu CO 2 und H2O oxidiert. Bei ungenügendem Sauerstoffangebot, etwa in einem Muskel, wird das Pyruvat in Lactat überführt. Bei einigen anaeroben wird das Pyruvat in Ethanol umgewandelt. Die Bildung von Lactat oder Ethanol aus Glucose sind Beispiele für Gärungen. Netto-Stoffbilanz der Glycolyse Glucose + 2ADP + 2Pi + 2NAD+ → 2Pyruvat + 2ATP + 2NADH/H+ + 2H2 O Gleichung 8 : Netto-Stoffbilanz der Glycolyse Bildung von Fructose-1,6-bisphosphat aus Glucose Die Umwandlung besteht aus 3 Reaktionen: einer Phosphorylierung, einer Isomerisierung und einer 2. Phosphorylierung. Der Sinn dieser Reaktionen ist die Überführung der Glucose in eine reaktionsfähige Form, welche sich in 2 C3-Einheiten spalten lässt. Formel 68 : Bildung von Fructose-1,6-bisphosphat aus Glucose (Gesamtreaktion) Formel 69 : Phosphorylierung der Glucose durch Hexokinase Formel 70 : Isomerisierung von Glucose-6-phosphat zu Fructose-6-phosphat durch Glucosephosphat-Isomerase (Umwandlung einer Aldose in eine Ketose) Formel 71 : Phosphorylierung zu Fructose-l,6-bisphosphat durch Phosphofructokinase Bildung von Glycerinaldehyd-3-phosphat Formel 72 : Spaltung von Fructose-1,6-bisphosphat in Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) durch Aldolase Formel 73 : Mechanismus der Aldolase -53-
  • 49. Biochemie Aldolase führt die umgekehrte Reaktion einer Aldolkondensation (z.B. Aldehyd + Keton) durch. Die Reaktion läuft nur mit GAP weiter, dass DHAP wird durch Triosephosphatisomerase in GAP überführt. 1. energiegewinnender Schritt Phosphorylierung und Oxidation des GAP (keine ATP-Bildung!) Formel 74 : Umwandlung von Glycerinaldehyd-3-phosphat in 1,3-Bisphosphoglycerat durch Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase Formel 75 : Mechanismus der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase 2. energiegewinnender Schritt Dies ist die erste ATP-bildende Reaktion, katalysiert durch Phosphoglycerat-Kinase. Formel 76 . Erste ATP-bildende Reaktion Formel 77 : Bildung von Pyruvat und eines zweiten Moleküls ATP Regulation der Glycolyse Abbildung 41 : Regulation der Glycolyse Glycolyse und Gluconeogenese sind so koordiniert, dass beide Vorgänge nicht gemeinsam anlaufen. Bei dieser Kontrolle spielt ein Signalmolekül, das Fructose-2,6-bisphosphat eine wichtige Rolle. -54-
  • 50. Biochemie Regulation der Glycolyse / Gluconeogenese durch F-2,6-BP F-2,6-BP aktiviert die 6-Phosphofructo-1-Kinase der Leber, indem sie deren Affinität zu Fructose-6-Phosphat steigert und die Hemmwirkung von ATP herabsetzt. Dies hat die Synthese von F-1.6-BP durch die Phosphorylierung von Fructose- 6-phosphat zur Folge. Gleichzeitig wird Fructose-1,6-bisphosphatase durch F-2,6-BP gehemmt. Regulation der Konzentration von F-2,6-BP F-2,6-BP wird durch Phosphorylierung (durch 6-Phosphofructo-2-Kinase) synthetisiert und kann von der Fructose-2,6- bisphosphatase zu Fructose-6-phosphat hydrolysiert werden. Beide Enzyme befinden sich auf einer einzigen Peptidkette, die man auch als Tandem-Enzym bezeichnet. Regulation des Tandem-Enzyms Die Aktivitäten von 6-Phosphofructo-2-Kinase und Fructose-2,6-bisphosphatase werden durch die Phosphorylierung eines Serinrestes kontrolliert. Bei Glucosemangel löst ein Konzentrationsanstieg des Hormons Glucagon eine Reaktionskaskade aus, die zur Phosphorylierung dieses bifunktionellen Enzyms führt (Fructose-6-phosphat → Gluconeogenese). Ist dagegen Glucose im Überschuss vorhanden, verliert das Enzym seine Phosphorylgruppe, wodurch der F-2,6-BP-Spiegel ansteigt (→ Glycolyse). unphosphoryliert: aktiviert Kinase, hemmt Bisphosphatase → Aufbau von F-2,6-BP phosphoryliert aktiviert Bisphosphatase, hemmt Kinase → Abbau von F-2,6-BP Abbildung 42 : Regulation des Tandem-Enzyms Weiterverarbeitung des Pyruvats Aërobiër Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex ● Acetyl-CoA ● Citronensäure-Zyklus → oxidative Phosphorylierung ● CO2 + H2O Abbildung 43 : Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex Höhere Organismen und Bakterien bei O2-Mangel (anaërob) Homolaktische Fermentation → Lactat (Muskel) Glucose + 2ADP + 2Pi → 2Lactat + 2ATP + 2H2 O Formel 78 : Anaërobe Lactatbildung -55-
  • 51. Biochemie Hefe und Mikroorganismen (anaërob) Alkoholische Gärung zum Ethanol Glucose + 2ADP + 2Pi + 2FT → 2Ethanol + 2CO 2 + 2H2 O 1 Decarboxylierung durch Pyruvat-Decarboxylase 2 Reduktion durch Alkohol-Dehydrogenase mit NADH Formel 79 : Alkoholische Gärung Oxidative Decarboxylierung Die Funktion dieses Reaktionsweges ist die Bildung von Acetyl-CoA aus Pyruvat in den Mitochondriën, welches anschließend im Citratzyklus vollständig zu CO2 oxidiert wird. Die Reaktion wird durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex katalysiert. Es handelt sich dabei um einen sehr großen Multienzymkomplex aus 3 eng zusammenwirkenden Enzymen (Vorteil des Multienzymkomplexes: Höhere Geschwindigkeit, kaum Nebenreaktionen). Komponente Abk. Ketten Coënzyme Reaktion Oxidative Decarboxylierung von Pyruvat-Dehydrogenase E1 24 TPP Pyruvat Transfer der Acetylgruppe auf Dihydrolipoyl-Transacetylase E2 24 Liponamid CoA Regenerierung der oxidierten Dihydrolipoyl-Dehydrogenase E3 12 FAD + NAD+ Form des Liponamids Tabelle 4 : Komponenten des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes Decarboxylierung des Pyruvats nach Bindung an das TPP Pyruvat + TPP → Hydroxyethyl - TPP + CO 2 Gleichung 9 : Decarboxylierung des Pyruvats nach Bindung an das TPP (Gesamtreaktion) Formel 80 : Ionisierung des TPP Durch die Ionisierung des TPP kommt es zur Bildung eines Carbanions, das nucleophil mit Pyruvat reagiert. Formel 81 : Bildung eines Carbanions, das nucleophil mit Pyruvat reagiert -56-
  • 52. Biochemie Oxidation der Hydroxyethylgruppe und Übertragung auf Liponamid Formel 82 : Oxidation der Hydroxyethylgruppe und Übertragung auf Liponamid Übertragung der Acetylgruppe auf Coënzym A Formel 83 : Übertragung der Acetylgruppe auf Coënzym A Regenerierung der oxidierten Form des Liponamids Formel 84 : Regenerierung der oxidierten Form des Liponamids Regulation des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes Produkthemmung Die Produkte der Pyruvatoxidation, Acetyl-CoA und NADH, hemmen den Enzymkomplex. Acetyl-CoA hemmt die Transacetylase-Komponente, NADH die Dihydrolipoyl-Dehydrogenase. Feedback-Regulation durch Nucleotide (Rückkopplungshemmung): Die Aktivität des Enzymkomplexes wird durch die Energieladung kontrolliert. AMP aktiviert den Komplex, GTP hemmt ihn, d.h. der Komplex wird gehemmt, wenn unmittelbar verfügbare Energie vorhanden ist. Regulation durch reversible Phosphorylierung: Der Komplex wird enzymatisch inaktiv, wenn ein spezifischer Serinrest durch eine Kinase phosphoryliert wird. Dabei hemmt AMP und Pyruvat die Kinase. Die Phosphorylierung kann durch eine Phosphatase rückgängig gemacht werden. Es liegt also ein reversibler Regulationsmechanismus vor. Hormonelle Steuerung Der Glycogenstoffwechsel wird von bestimmten Hormonen stark beeinflusst. Insulin Ein Polypeptidhormon, welches die Fähigkeit der Leber steigert, Glycogen zu synthetisieren. Insulin wird in den B- Zellen der Langerhansschen Inseln im Pankreas gebildet und ins Blut abgegeben. Ein hoher Insulinspiegel im Blut signalisiert Sättigung, ein geringer einen Hungerzustand. Adrenalin (Epinephrin) Entgegengesetzte Wirkung von Insulin, bewirkt also den Abbau von Glycogen in der Muskulatur. Freisetzung aus dem Nebennierenmark. Glucagon Stimulierung des Glycogenabbaus in der Leber. Wird von den α-Zellen des Pankreas abgegeben, wenn der Blutzucker niedrig ist. Durch den Abbau des Glycogens wird der Blutzuckerspiegel wieder angehoben. -57-