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1 von 91
1
METRAS Impulstag
Der
Eurachem Guide Accreditation for
Microbiological Laboratories
in der Praxis
Heidemarie Schindl & Barbara Vanek
22.11.2016
2
Eurachem
• Europ. Netzwerk von Organisationen
• Ziel: System für internationale Rückverfolgbarkeit von
Messungen
• Förderung guter Qualitätspraxis
• Diskussionsforum gemeinsamer Probleme
(analytische Chemie und Qualitätsfragen)
• Guide bietet Information und ist Leitfaden für Erfüllung
ISO 17025-Erfordernisse
• 2nd Edition 2013, Herausgeber Eurachem in
Zusammenarbeit mit EA (European cooperation for
Accreditation)
• https://eurachem.org/index.php/publications/guides/microbio
3
4
Produkt-Matrix
• Arzneimittel
• Lebensmittel
• Trinkwasser
• Futtermittel
• medizinische Diagnostik
• Umweltmikrobiologie
• ….
5
Arzneimittel
• je nachdem ob steriles/
nicht steriles Produkt:
• Sterilität
• Keimzahl (CFU)
• Fremdkeim
• Identität (zB API Test)
• Ausreichende
Konservierung
• Antibiotika (Hemmhöfe)
• Endotoxin (Limulus)
• Monographieentwicklung
Arzneibuch
• ÖAB, Pharm. Eur.
• Etablierung
Referenzmaterialien (zB.
CRS, BSP)
• betrifft legalen/ illegalen
Markt
6
Beispiel-Monographieentwicklung
Aqua Menthae (Pfefferminzwasser)
• 3 Hersteller
• 3 Chargen / Hersteller
•Testprinzip:
• Ph. Eur. 5.1.4
• Ph. Eur. 2.6.12
• Ph. Eur. 2.6.13
7
Folium Malvae
(Käsepappeltee)
•Testprinzip:
• Ph.Eur. 2.6.31
• Ph.Eur. 5.1.8.
Beispiel-Tee-
Keimzahlbestimmung
8
Wasser, Umwelt
• Trinkwasser
• Badewasser
• Abwasser
• Kühlturmwasser
• Abklatsche
• Luftkeimzahl
• ….
9
Personal
ISO 17025 Kap.5.2, Eurachem LF Kap.
3
10
Kompetenz
Leiter
Laborant
Angelernter
Hilfskraft
Praktikant
Boten
Sekretariat
17025: Mitarbeiter, die bestimmte Einrichtungen bedienen, Prüfungen
und/oder Kalibrierungen durchführen, Ergebnisse werten und
Prüfberichte unterschreiben, müssen kompetent sein.
11
Kompetenz =
Qualifikation
(Ausbildung, Schulung)
+
Erfahrung
+
Persönlichkeit
12
Qualifikation
• Prüfpersonal und beaufsichtigendes Personal:
• Ausbildung in Mikrobiologie o. Ä.
und/oder
• umfassende einschlägige Erfahrung in Bezug auf den
Akkreditierungs-Scope
13
Tätigkeitsbeschreibungen (17025),
Arbeitsplatzbeschreibungen, Stellenbeschreibung…
•Anforderungen und Verantwortungen für leitendes
Personal, technisches und unterstützende
Fachpersonal festlegen:
- Ziele bzgl. Qualifikation, Ausbildungen, Schulungen
- Verantwortlichkeiten, Befugnisse
- stellenbezogen, personenbezogen
•autorisiertes Personal für Abgabe von „Meinungen
und Interpretationen“ (15189 Pflicht, 17025 als
Anmerkung)
14
selbstständiges Arbeiten / Arbeiten
unter Aufsicht
• Freigabekriterien festlegen
• umfassende praktische Erfahrung vor Freigabe
• Beaufsichtigendes Personal:
• Qualifikation festlegen
• Datum der Befugniserteilung dokumentieren
15
Prüfmatrix          
SO
P
Titel qualitätsrelev.
Geräte
Mit der
Durch-
führung
beauftragt
Prüf-
leitung
Basis-
norm
Requali
-fizierg-
intervall
123 Bestimmung der Faktor
XIII-Aktivität in
Fibrinklebern und
Konzentraten (chromogene
Methode)
Mikrotiterplatten-
Photometer
MA 1,
MA 2,
MA 3,
…
PL 1 akkreditiert
durch Ph.
Eur. 0903
1 Jahr
456 Bestimmung der aktivierten
Partiellen Thrombo-
plastinzeit in SD-Plasma
Gerinnungsautoma
t
… PL 2 akkreditiert
durch Ph.
Eur. 1646
1 Jahr
789 Bestimmung der
Proteinzusammensetzung
von Immunglobulinen
mittels
Zonenelektrophorese
….   … akkreditiert
durch Ph.
Eur. 2.2.31
1 Jahr
16
Kompetenzmatrix I: Anlegen II: Auswerten
Datum der Freigabe eintragen
Prüfverfahren: graue Schattierung: akkreditierte
Verfahren
A-AL-Nr.
Titel
MA 1 MA 2 MA 3 MA 4
I. II. I. II. I. II. I. II.
A-AL0702
Inaktivierungsprüfung –
Überprüfung von Sterilisatoren
mittels Bioindikatoren OENORM EN
13060
A-AL1000 Luftkeimzahluntersuchungen
A-AL1100 Abklatschtests
A-AL1900
Membranfiltration zum Nachweis
von Legionella spp., ÖNORM ISO
11731-2
A-AL 2201
Wasserbeschaffenheit Quantitative
Best. der k. Mikroorganismen ISO
6222:19999
A-AL 2202
Wasserbeschaffenheit Nachweis
und Zählung E.coli und Coliforme
ISO 9308-1
17
Personalschulungen
• Adäquate Schulungen das gesamte Personal die Durchführung
der Analysen und Handhabung der Ausrüstung betreffend.
• Ermittlung des Schulungsbedarfs
• Schulungsplan
• Einschulung und Beaufsichtigung neuer Mitarbeiter
• Theorie
• mikrobiologische Analysentechniken
• Proben aufnehmen/anlegen/auswerten
• Aus/Fort/Weiterbildungen
• interne/externe Schulungen
18
Wirksamkeitsprüfungen
• Test/Prüfung
• Gespräch
• Kurzvortrag
• Beobachtung
• Ringversuch
19
Aufrechterhaltung der Kompetenz
• laufend überwachen und aufzeichnen:
• intern und externe QS
• ggf. Nachschulungen
• Aufrechterhaltung der Kompetenz bei selten
durchgeführte Analysen:
• regelm. Verifikation
• Intervall dafür festlegen
• Dokumentation
20
21
Eurachem Guide Kap.4
„Environment“
• Räumlichkeiten
• Umgebungskont
rolle
• Hygiene
22
• Genereller Aufbau
• Zugangskontrolle
• Kreuzkontamination
• designierte Bereiche
• Probenempfang/ -lager
• Probevorbereitung/ -untersuchung
• Referenzorganismen
• Handhabung potentiell Pathogener
• Lagerung Kulturmedien und Reagenzien
• Medienzubereitung und Equipment
• Sterilität, Dekontamination
• Reinigung Glasware
• Lagerung gefährlicher Chemikalien
Räumlichkeiten
23
• Waschküche kann, nach erfolgter Dekontamination,
mit anderen Laborbereichen geteilt werden
• Laborausrüstung in Routine nicht zwischen
Bereichen wechseln
• Molekularbiologielabor:
• zugeordnet (Pipetten, Spitze, Zentrifugen,
Probenröhrchen, Arbeitskleidung,
Heizblöcke etc. in jedem Bereich vorhanden)
DNA Kreuzkontamination!
• Platz
Räumlichkeiten
24
• ausreichende Belüftung
• geeignete Raumtemperatur
• regelmäßige Überprüfung der Klimaanlagenfilter
• keine natürliche Belüftung bei Reinräumen
und Pathogenen
• Kontaminationsvermeidung
• falls Labor in Produktionsbetrieb:
• Auftreten von potentieller Kontamination
vermeiden
Räumlichkeiten
25
• Herstellung von PCR Primern und Probes (=Sonden)
• Segregationskonzept zur Vermeidung
DNA Kreuzkontamination
• Amplifikation in eigenen Bereich
mit Überdruck
• Unterdruck für Räumlichkeiten mit
„high-risk“ Organismen
Räumlichkeiten
26
• Programm muss vorhanden sein
• air sampling plates
• surface swaps
• Definition von Akzeptanzkriterien
• Verfahren bei Überschreiten der Limits
• mittels Datenanalyse Erkennen von
Trends möglich
• Bei NAT:
• Negativkontrolle um etwaige DNA
Kontamination anzuzeigen
Umgebungskontrolle
27
• Programm: Resultate aus Umgebungsmonitoring,
potentielle Kreuzkontamination fließen ein
• Vorgehensweise bei Verschütten
• Vermeiden von Staubansammlung
• keine Pflanzen, keine persönlichen Gegenstände
• minimale Papierunterlagen
im Labor
• Mantelwechsel
• Händewaschen
• Handschuhwechsel
Hygiene
28
Validierung von
Analysenverfahren
ISO 17025 Kap.5.4.5, Eurachem LF Kap. 5
Richtigkeit
Wiederfindung
Messunsicherheit
r = 2,8 x s
Verifizierung
Validierung
29
ISO 17025:
• 5.4.5 Validierung von Verfahren
• 5.4.5.1 Die Validierung ist die Bestätigung durch
Untersuchung und Bereitstellung eines Nachweises,
dass die besonderen Anforderungen für einen speziellen
beabsichtigten Gebrauch erfüllt werden.
30
Validierung
• Soll belegen, dass Prüfverfahren für seine bestimmte
Aufgabe eignet.
• Soll die Leistungsgrenzen des Prüfverfahrens
charakterisieren.
• Soll belegen, dass die Methode im Labor beherrscht
wird.
• Ist Teil der Qualitätssicherung!
31
Besonderheiten in der Mikrobiologie
• Lebende Systeme
• Wechselbeziehungen innerhalb des Nachweissystems
• Flüssige Nachweissysteme: mögliche Kontaminationen mit
Fremdkeimen
• Kolonie-Nachweissysteme: Zielkolonien durch das Wachstum
von Nichtzielorganismen oder durch Verunreinigungen
überwachsen bzw. verdeckt.
32
Mikrobiologische Analysenschritte
• Probenahme
• Transport/Lagerung
• Probenvorbereitung
• Voranreicherung/Anreicherung
• Isolation/Auszählung
• Bestätigung
• Auswertung
Analytik
Präanalytik
33
Normative Grundlagen
• ÖNORM ENV ISO 13843:2001 Wasserbeschaffenheit – Richtlinie zur
Validierung mikrobiologischer Verfahren (ISO/TR 13843:2000)
• SAS 328.dw:2013 Leitfaden zur Validierung mikrobiologischer
Prüfverfahren und zur Abschätzung der Messunsicherheit im Bereich
Lebensmittel- und Umweltmikrobiologie
• ÖNORM EN ISO 16140: 2003 Mikrobiologie von Lebens- und Futtermitteln
– Arbeitsvorschrift für die Validierung alternativer Verfahren
• ….
34
Auswahl von Analysenverfahren
• Internationale Normen
• Nationale Normen
• Wissenschaftliche Publikationen
• Leitfäden etc. von anerkannten Organisationen
• nicht normative Verfahren
• selbst entwickelte Verfahren
 Welche Verfahren sind zu validieren?
35
Nährkartonscheiben - validieren?
36
• Das Laboratorium muss bestätigen, dass es Verfahren nach
normativen Dokumenten richtig anwenden kann, bevor es diese für
Prüfungen und Kalibrierungen einführt.
= Validierung in vermindertem Umfang, „Verifizierung“
• Verfahren die nicht in normativen Dokumenten festgelegt sind
• selbst entwickelte Verfahren
• Verfahren nach normativen Dokumenten, die außerhalb ihres
vorgesehenen Anwendungsbereiches angewendet werden
• Änderungen und Erweiterungen in Verfahren nach normativen
Dokumenten
= Vollvalidierung
37
Validierungsumfang
• Die Validierung muss in dem Umfang durchgeführt
werden, der zur Erfüllung der Erfordernisse der
beabsichtigten Anwendung oder des betreffenden
Anwendungsgebiets notwendig ist.
• Methode: quantitativ, semi-quantiativ, qualitativ
• Matrix: Anzahl und Art
• Validierung kann Verfahren für Probenahme,
Handhabung und Transport umfassen.
38
Umfang vollständige Validierung
Qualitative Methode Quantitative Methode
Matrix Effekt X X
Spezifität X X
Sensitivität X X
Rel.
Richtigkeit
X X
Wiederholbark
eit
X X
Reproduzierba
rkeit
X X
Nachweisgrenz
e
X
Bestimmungsgr
enze
X
Falsch-Positiv-
Rate
X X
Falsch- X X
39
Validierung sollen reale
Testbedingungen widerspiegeln:
• Natürlich kontaminierte Proben
• Künstlich kontaminierte Proben (Spiken): bekannte
Keimzahlhöhe
• Kombination
• Matrixeffekt
• Wasser: Trinkwasser, Oberflächenwasser, Badewasser
• horizontales Lebensmittelverfahren: mind. 4 Matrices prüfen
(SAS)
• Umweltproben
40
Kommerzielle Test Kits
• Validierungsdaten des Herstellers verfügbar halten
41
Voraussetzungen für die Durchführung
der Validierung
• Einsatz von gewarteten und kalibrierten Geräten und
Messeinrichtungen
• zertifizierte Bezugsnormalen, Referenzstämme
• geschulte Mitarbeiter
• Arbeitsanleitung für die zu validierende Methode
• Validierungsplan oder Beschreibung des Versuchsablaufs
• Die Rückverfolgbarkeit der verwendeten Einrichtungen und
Medien zu Validierungsdaten muss gegeben sein!
42
Methoden zur Validierung
• Referenzmaterialien: zertifizierte Referenzstämme oder
Standards
• Alternativmethode: Vergleich mit Ergebnissen, die mit anderen
Verfahren erzielt wurden
• Laborvergleiche: Ringversuche, Vergleichsprüfungen
 statistische Absicherung
• systematische Beurteilung der Faktoren, die das Ergebnis
beeinflussen:
• zB Probnahme, Probentransport,…
43
Dokumentationsanforderungen
• 17025, 5.4.5.2: Das Laboratorium muss die erhaltenen
Ergebnisse und das für die Validierung verwendete
Verfahren aufzeichnen und festlegen, ob das Verfahren
für den beabsichtigten Gebrauch geeignet ist (Aussage
zu ihrer Gültigkeit).
• 15189: Autorisiertes Personal für Bewertung!
44
• Vergleichsversuch wurde durchgeführt, Fazit:
„Ergebnisse sind nicht vergleichbar“.
• Begleitflora!
• Dreifaktorielle Varianzanalyse (insges. 60 Analysen):
• Probenahme/Probenteilung (1 Gesamtprobe in 5 Teilproben
für 5 Labors)
• Hitze/Säurebehandlung
• 2x 0,5ml Direktansatz und Filtration mit 2 verschiedene
Membranfiltern
45
Haupteinflussfaktoren:
1: Säure- oder Hitzebehandlung
2: Direktansatz oder MF
46
Messunsicherheit
ISO 17025 Kap.5.4.6, Eurachem LF Kap. 6
47
Messunsicherheit
• Die Messunsicherheit grenzt den Wertebereich ein,
innerhalb dessen der wahre Wert der Messgröße mit
einer bestimmten anzugebenden Wahrscheinlichkeit
liegt.
• Mikrobiologische Verfahren sind nicht robust, eine
statistisch gültige Schätzung der Messunsicherheit ist
daher nicht möglich.
• Die Messunsicherheit für mikrobiologische Verfahren
muss nur auf Kundenwunsch auf dem Prüfbericht
angegeben werde.
• Alle Unsicherheitsfaktoren müssen dem Labor bekannt
sein!
48
Messunsicherheit
• Einzelnen Komponenten der Unsicherheit identifizieren,
• zeigen, dass sie unter Kontrolle sind (standardisierte
Vorgänge) und
• ihren Beitrag zur Streuung der Prüfergebnisse
bestimmen.
49
Komponenten der Unsicherheit
Einflüsse, die leicht zu bestimmen und zu messen sind:
• Pipettieren
• Wiegen
• Verdünnen
• Inkubationseffekte
 Wiederfindungsversuche,….
50
Komponenten der Unsicherheit
Einflüsse, die nicht messbar sind:
• Probenstabilität
• Probenvorbereitung
• Verteilung der Keime in der Probe
• Matrix
• Beiträge nicht unbedingt in Messunsicherheit mit
einbeziehen, da kein Faktor der Methodik.
• Beiträge müssen aber bekannt und unter Kontrolle sein!
 Standardisierung (Probengröße, Homogenisierung,..)
51
Quantitative – qualitative Methoden
• Abschätzung der MU idR nur für quantitative Methoden
möglich.
• Vorgehen bei qualitativen Methoden oder
Identifizierungen:
• Qualität von Reagenzien und Medien - QS
• Ergebnisinterpretation durch Laboranten - Zählversuche
• Nachweisgrenze in Abhängigkeit des Inokulums
• Falsch-Positiv-, Falsch-Negativ-Rate
52
Abschätzung der
Messunsicherheit von
quantitativen Verfahren
• gestützt auf Daten aus Wiederhol- und Vergleichspräzision oder
Ringversuchen
• Erfahrungswert für Guss-, Spatel- und Tropftechnik:
Messunsicherheit zwischen 10 und 50% durchaus üblich.
• SAS: Aus Erfahrung von Vergleichsprüfungen lässt sich die
Messunsicherheit von mikrobiologischen Verfahren mit
+ 0,5 log10 KBE/g oder ml abschätzen.
• Wiederholpräzision r:
• qualitative Verfahren: r = x / n
• quantitative Verfahren: r = 2,8 x s
• Faktor 2,8: beruht auf Normalverteilung (Vertrauensintervall von 95%).
53
-50% ca. 50 KBE
+50%
54
Eurachem Guide Kap.7 „Ausrüstung
– Wartung, Kalibrierung,
Überwachung“
55
Eurachem Guide Kap.7 „Ausrüstung
– Wartung, Kalibrierung,
Überwachung“
• Wartung:
• Verwendungshäufigkeit
gibt Intervall vor
• eigenen Autoklaven für
Dekontamination (ideal!)
• Sterilisieren von
Materialen
• Filtrationsapparatur
• Glasware/ Einweg
• Petrischalen (Glas/ Plastik)
• Wasserbäder
• Brutschränke
• Laminar Flows und
Sicherheitsbänke
• Autoklaven
• Kühlgeräte
• Pipetten, Dispenser
• Thermometer, Stoppuhren,
Waagen, pH-Meter,
Kolonienzähler
56
„Ausrüstung – Wartung, Kalibrierung,
Überwachung“
• Kalibrierung:
• Programm muss
vorhanden sein für
Equipment mit direktem
Einfluss auf Testresultat
• Beispiel Appendix C und D
• falls Temperatur
ergebnisrelevant
• Messgeräte von hinreichender
Qualität gemäß Messunsicherheit,
• Rückführbarkeit auf
Temperaturstandards
• Brutschrank, Wasserbäder, Ofen,
T-kontrollierte Räume:
• T-Stabilität und T-Verteilung, t bis
zur Equilibrierung
• Initial bestimmt und später
periodisch überprüft, nach
Reparaturen
• tägliche Dokumentation der T bei
laufendem Betrieb
57
• Autoklaven
• spezifizierte Zeit
• Temperaturtoleranzen
• Monitoring von T mittels
Thermoelement und
Recorder
 T- Chart oder Verwendung
Bioindicator f. Sterilisation/
Dekontaminationsschritt
• Indikatorstreifen
• Waagen:
• regelmäßige Kalibrierung
• Volumen:
• Dispenser, Pipetten, initiale
Verifikation  regelmäßiger
Check
• Glasware mit
Toleranzzertifikat müssen
nicht verifiziert werden!
• Überprüfung Genauigkeit des
entnommenen/ Soll-Volumens
sowie Ermittlung Präzision
durch wiederholte Entnahmen
• Einweg: Lieferant adäquates
QMS, ansonsten Check jedes
Batches auf Eignung
„Ausrüstung – Wartung, Kalibrierung,
Überwachung“
58
• Thermocycler
• Verifikation von T, t
• weitere:
• LF-, Sauerstoff-, pH-Meter:
regelmäßige Verifikation
oder immer vor Gebrauch
• Hygrometer, falls
ergebnisrelevant
• Zentrifugen, falls
Zentrifugalkraft
ergebnisrelevant
„Ausrüstung – Wartung, Kalibrierung,
Überwachung“
59
• Appendix C:
Guidance on Calibration
and Calibration Checks
• Appendix D:
Guidance on Equipment
Validation and
Verification of
Performance
„Ausrüstung – Wartung, Kalibrierung,
Überwachung“
• Appendix E:
Guidance on
Maintainance of
Equipment
60
Reagenzien und
Kulturmedien
ISO 17025 Kap.4.6 und 5.5, Eurachem
LF Kap. 8
61
Eingangskontrolle
• Für alle qualitätsrelevanten Reagenzien und Medien
• Unversehrtheit der Verpackung, Transportbedingungen,...
• jede Charge vor Verwendung auf Eignung überprüfen
• rückführbare Positiv- und Negativkontrollen (ATCC, …)
• ISO 11133
62
selbst hergestellte Medien
• Quantitative Leistungsprüfungen jeder Charge
• Wiederfindung der Zielorganismen
• gut und schlecht wachsende
• Hemmung der Nicht-Zielorganismen
• pH-Wert
• Farbe
• Sterilität
• Haltbarkeitsdauer selbst hergestellter Medien unter
definierten Bedingungen festlegen
• sachgemäße Lagerung der Trockenmedien
63
Fertigmedien
• Quantitative Leistungsprüfungen
• Umfang abhängig von Komplexität des Mediums
oder
• QM-System des Herstellers:
• Qualitätszertifikat
• Produktspezifikationen
• dann keine umfangreiche Prüfung erforderlich
64
aus Vortrag Qualitätskontrolle von mikrobiologischen
Nährmedien; Barbara Gerten, Fa. Merck
• Fertigmedien, denen Supplemente zugesetzt
werden
• mindestens eine qualitative Prüfung empfohlen
• aus handelsüblichen Trockenmedien hergestellte
Medien
• bei Isolierungs- und Zählmedien sollte mindestens
eine halbquantitative Prüfung durchgeführt werden
• bei Prüfmedien zur Charakterisierung kann eine
qualitative Prüfung ausreichend sein
• quantitative Prüfungen geben eine größere
Sicherheit hinsichtlich der Qualität der Medien
65
Kennzeichnung
• Identität
• Konzentration
• Lagerbedingungen
• Öffnungsdatum
• Herstellungsdatum
• Ablaufdatum bzw. Lagerdauer
• Chargen-Kennzeichnung
• Freigabe der Chargen
• Verantwortliche Personen müssen in Aufzeichnungen
ersichtlich sein.
66
67
Eurachem Guide Kap.9
„ Referenzmaterialien,
Referenzstämme“
68
Eurachem Guide Kap.9
„ Referenzmaterialien,
Referenzstämme“
• Appendix A:
• Referenzmaterialien dienen
der Rückverfolgbarkeit und
werden verwendet:
• Aussage zur Genauigkeit von
Testresultaten
• Gerätekalibrierung
• Methodenvalidierung
• Performance der Methoden
• ermöglichen Vergleichbarkeit
von Methoden
• Überprüfung Qualität
Kulturmedien
• Performance von Testkits
• Referenzkulturen
• rückverfolgbare Stämme von
nationalen/ internationalen
dafür anerkannten Stellen
• Alternative: kommerzielle
Derivate, müssen auf
„anerkannte“ rückführbar
sein.
• Referenzstämme  durch
einmalige Subkultivierung:
Referenz Stammlösung
(eingefroren bzw.
lyophilisiert)  primäre
Subkultur: Referenz
Arbeitslösung (Routine)
• bereits aufgetaute
Stammlösungen dürfen nicht
mehr eingefroren werden
69
Eurachem Guide Kap.9
„ Referenzmaterialien,
Referenzstämme“
• Arbeitskulturen dürfen nicht subkultiviert
werden, außer durch ein SOP gefordert,
oder das Labor kann belegen, dass keine
Eigenschaft sich verändert hat
• kommerzielle Derivate von
Referenzstämmen werden nur als
Arbeitskulturen verwendet
70
Probenahme
ISO 17025 Kap.5.7, Eurachem LF Kap.
10
71
ISO 17025:
• Probenahmeplan o/u Verfahren zur Probenahme
• am Ort der Probenahme verfügbar
• Abweichungen, Ergänzungen oder Ausschlüsse von dem
schriftlich niedergelegten Probenahmeverfahren
dokumentieren
• Verfahren zum Aufzeichnen der wesentlichen Angaben
und Tätigkeiten hinsichtlich der Probenahme
• Umgebungsbedingungen
• Zeitpunkt
• besondere Vorkommnisse
72
Probenahme – überbrachte Proben
• abgesichert durch Qualitäts-Sicherungsmaßnahmen
• Monitoring der Probenehmer
• Ringversuche für Probenahmen
• Akkreditierung der Probenahmeverfahren
• Probenahmenormen, zB ÖNORM EN ISO 19458, ÖNORM M
5874, ÖNORM B 5019, MiQs
• Wenn nicht akkreditiert, Hinweis im Bericht, dass
Probenahme außerhalb der Akkreditierung.
73
Sonstiges
• Probenahme nur durch geschultes und freigegebenes
Personal
• Verantwortungen festlegen
• geeignete, sterile Probenahmeutensilien
74
Handhabung von Prüf- und
Kalibriergegenständen
ISO 17025 Kap.5.8, Eurachem LF Kap.
11
75
Probeneingang
• Verfahren zu:
• Transport, Eingang, Handhabung, Schutz, Lagerung,
Aufbewahrung und/oder Beseitigung der Proben
• Botendienste schulen
• System zur Identifizierung der Probe
• Machbarkeitsprüfung
• Aufzeichnungen über:
• Datum und ggf. Zeitpunkt des Probeneingangs
• Zustand der Probe und ggf. Temperatur
• ggf. Informationen zu Probengewinnung (Zeitpunkt,…)
• Vorgehen bei Ungewöhnlichkeiten oder Abweichungen 
Rücksprache mit Kunden
76
Probenlagerung
• Lagerbedingungen festlegen und aufzeichnen
• Temperatur
• Transport- und Lagerdauer
• bis Testbeginn – keine ungerechtfertigte Verzögerung
• Rückstellmuster - zumindest bis Berichterstellung
• Kreuzkontaminationen vermeiden
• Probenvorbereitung und Probenteilung ist Teil des
Prüfverfahrens
77
ÖNORM EN ISO 19458 Wasserbeschaffenheit -
Probenahme für mikrobiologische Untersuchungen
78
ÖNORM B 5019 Legionellen
ISO 15189 – medizinische Laboratorien:
• Anforderungen an die Gewinnung, Lagerung und den
Probentransport für die jeweiligen Materialien in den
entsprechenden MIQ (Mikrobiologisch-infektiologischer
Qualitätsstandard).
• Probentransport diagnostischer Proben in Österreich: multilaterale
Vereinbarung M143
79
Entsorgung
ISO 17025 Kap.5.8, Eurachem LF Kap.
12
80
Entsorgung
ISO 17025 Kap.5.8, Eurachem LF Kap.
12
• Korrekte Entsorgung –gem. nationalen/internationalen
Vorgaben
• Vermeidung der Kontamination der Testumgebung und
Umwelt
• Autoklavieren
• getrennt für Abfall und Nährmedien, Glaswaren etc.
• ggf. zu entsorgende Proben
• befugter Entsorger
• schwarze Kübel, gelbe Kübel, orange Säcke für Spitalsmüll,…
81
Eurachem Guide Kap.13
„Qualitätssicherung“
82
Eurachem Guide Kap.13
„Qualitätssicherung“
• Interne Qualitätskontrolle (QK)
• Konsistenz der Testresultate (day-to-day) und deren
Konformität mit bestehenden Kriterien soll demonstriert
werden
• gespikte Proben
• Referenzmaterialien
• Wiederholungsmessungen
• Verwendung Interne Kontrollen zur Testperformance
• Externe QK
• Proficiency testing schemes (PTS) => Matrix! 
Laborvergleichstests
• Häufigkeit der Teilnahme an PTS soll Scope entsprechen
• EA-4/18-guidance
• ISO 17043 akkreditierte PTS
83
Berichte
ISO 17025 Kap.5.10, Eurachem LF Kap.
14
Prüfbericht
Inspektionsbericht
§73-GutachtenAkkreditierungszeichen
Akkreditierungslogo
84
Ergebnisangabe - quantitative Methoden
• Anzahl KBE / Volumen oder Gewicht
• Bei <10 KBE/Platte nimmt Präzision des Ergebnisses
signifikant ab. Im Bericht reflektiert.
• „0“ KBE angeben als
• nicht nachweisbar / Volumen oder Masse
• kleiner Nachweisgrenze
• Null in definierter Einheit
85
Ergebnisangabe - qualitative Methoden
• nachgewiesen / nicht nachgewiesen
• „kleiner als bestimmte Anzahl an Keimen in definierter
Einheit“, wo sinnvoll und nach Kundenrücksprache
86
Ergebnis  Meinung und Interpretation
87
Angabe der Messunsicherheit
• Falls die MU angegeben wird, müssen dem Kunden alle
limitierenden Komponenten bekannt gegeben werden
• insbesondere, ob Verteilung der Keime in der Probe mit
berücksichtigt wurde.
88
ÖNORM 6222 Wasserbeschaffenheit
-Gesamtkeimzahl
89
ÖNORM EN ISO 11731-2 Legionellen
90
Inhalt Prüfberichte gem. ISO 17025
relevante Angaben - Mikrobiologie:
• Angabe des angewendeten Verfahrens (Zusammenhang
zu Akkreditierungsumfang)
• Beschreibung des Zustands der Probe
• Eingangsdatum und Prüfdatum
• ggf. Probenahmedatum und Hinweise auf Probenahme
• §73-Gutachten ist nicht akkreditiert
91
Danke für Ihre
Aufmerksamkeit!
www.metras.at
office@metras.at
0676 3952 640

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Akkreditierung von mikrobiologischen Laboratorien

  • 1. 1 METRAS Impulstag Der Eurachem Guide Accreditation for Microbiological Laboratories in der Praxis Heidemarie Schindl & Barbara Vanek 22.11.2016
  • 2. 2 Eurachem • Europ. Netzwerk von Organisationen • Ziel: System für internationale Rückverfolgbarkeit von Messungen • Förderung guter Qualitätspraxis • Diskussionsforum gemeinsamer Probleme (analytische Chemie und Qualitätsfragen) • Guide bietet Information und ist Leitfaden für Erfüllung ISO 17025-Erfordernisse • 2nd Edition 2013, Herausgeber Eurachem in Zusammenarbeit mit EA (European cooperation for Accreditation) • https://eurachem.org/index.php/publications/guides/microbio
  • 3. 3
  • 4. 4 Produkt-Matrix • Arzneimittel • Lebensmittel • Trinkwasser • Futtermittel • medizinische Diagnostik • Umweltmikrobiologie • ….
  • 5. 5 Arzneimittel • je nachdem ob steriles/ nicht steriles Produkt: • Sterilität • Keimzahl (CFU) • Fremdkeim • Identität (zB API Test) • Ausreichende Konservierung • Antibiotika (Hemmhöfe) • Endotoxin (Limulus) • Monographieentwicklung Arzneibuch • ÖAB, Pharm. Eur. • Etablierung Referenzmaterialien (zB. CRS, BSP) • betrifft legalen/ illegalen Markt
  • 6. 6 Beispiel-Monographieentwicklung Aqua Menthae (Pfefferminzwasser) • 3 Hersteller • 3 Chargen / Hersteller •Testprinzip: • Ph. Eur. 5.1.4 • Ph. Eur. 2.6.12 • Ph. Eur. 2.6.13
  • 7. 7 Folium Malvae (Käsepappeltee) •Testprinzip: • Ph.Eur. 2.6.31 • Ph.Eur. 5.1.8. Beispiel-Tee- Keimzahlbestimmung
  • 8. 8 Wasser, Umwelt • Trinkwasser • Badewasser • Abwasser • Kühlturmwasser • Abklatsche • Luftkeimzahl • ….
  • 9. 9 Personal ISO 17025 Kap.5.2, Eurachem LF Kap. 3
  • 10. 10 Kompetenz Leiter Laborant Angelernter Hilfskraft Praktikant Boten Sekretariat 17025: Mitarbeiter, die bestimmte Einrichtungen bedienen, Prüfungen und/oder Kalibrierungen durchführen, Ergebnisse werten und Prüfberichte unterschreiben, müssen kompetent sein.
  • 12. 12 Qualifikation • Prüfpersonal und beaufsichtigendes Personal: • Ausbildung in Mikrobiologie o. Ä. und/oder • umfassende einschlägige Erfahrung in Bezug auf den Akkreditierungs-Scope
  • 13. 13 Tätigkeitsbeschreibungen (17025), Arbeitsplatzbeschreibungen, Stellenbeschreibung… •Anforderungen und Verantwortungen für leitendes Personal, technisches und unterstützende Fachpersonal festlegen: - Ziele bzgl. Qualifikation, Ausbildungen, Schulungen - Verantwortlichkeiten, Befugnisse - stellenbezogen, personenbezogen •autorisiertes Personal für Abgabe von „Meinungen und Interpretationen“ (15189 Pflicht, 17025 als Anmerkung)
  • 14. 14 selbstständiges Arbeiten / Arbeiten unter Aufsicht • Freigabekriterien festlegen • umfassende praktische Erfahrung vor Freigabe • Beaufsichtigendes Personal: • Qualifikation festlegen • Datum der Befugniserteilung dokumentieren
  • 15. 15 Prüfmatrix           SO P Titel qualitätsrelev. Geräte Mit der Durch- führung beauftragt Prüf- leitung Basis- norm Requali -fizierg- intervall 123 Bestimmung der Faktor XIII-Aktivität in Fibrinklebern und Konzentraten (chromogene Methode) Mikrotiterplatten- Photometer MA 1, MA 2, MA 3, … PL 1 akkreditiert durch Ph. Eur. 0903 1 Jahr 456 Bestimmung der aktivierten Partiellen Thrombo- plastinzeit in SD-Plasma Gerinnungsautoma t … PL 2 akkreditiert durch Ph. Eur. 1646 1 Jahr 789 Bestimmung der Proteinzusammensetzung von Immunglobulinen mittels Zonenelektrophorese ….   … akkreditiert durch Ph. Eur. 2.2.31 1 Jahr
  • 16. 16 Kompetenzmatrix I: Anlegen II: Auswerten Datum der Freigabe eintragen Prüfverfahren: graue Schattierung: akkreditierte Verfahren A-AL-Nr. Titel MA 1 MA 2 MA 3 MA 4 I. II. I. II. I. II. I. II. A-AL0702 Inaktivierungsprüfung – Überprüfung von Sterilisatoren mittels Bioindikatoren OENORM EN 13060 A-AL1000 Luftkeimzahluntersuchungen A-AL1100 Abklatschtests A-AL1900 Membranfiltration zum Nachweis von Legionella spp., ÖNORM ISO 11731-2 A-AL 2201 Wasserbeschaffenheit Quantitative Best. der k. Mikroorganismen ISO 6222:19999 A-AL 2202 Wasserbeschaffenheit Nachweis und Zählung E.coli und Coliforme ISO 9308-1
  • 17. 17 Personalschulungen • Adäquate Schulungen das gesamte Personal die Durchführung der Analysen und Handhabung der Ausrüstung betreffend. • Ermittlung des Schulungsbedarfs • Schulungsplan • Einschulung und Beaufsichtigung neuer Mitarbeiter • Theorie • mikrobiologische Analysentechniken • Proben aufnehmen/anlegen/auswerten • Aus/Fort/Weiterbildungen • interne/externe Schulungen
  • 18. 18 Wirksamkeitsprüfungen • Test/Prüfung • Gespräch • Kurzvortrag • Beobachtung • Ringversuch
  • 19. 19 Aufrechterhaltung der Kompetenz • laufend überwachen und aufzeichnen: • intern und externe QS • ggf. Nachschulungen • Aufrechterhaltung der Kompetenz bei selten durchgeführte Analysen: • regelm. Verifikation • Intervall dafür festlegen • Dokumentation
  • 20. 20
  • 21. 21 Eurachem Guide Kap.4 „Environment“ • Räumlichkeiten • Umgebungskont rolle • Hygiene
  • 22. 22 • Genereller Aufbau • Zugangskontrolle • Kreuzkontamination • designierte Bereiche • Probenempfang/ -lager • Probevorbereitung/ -untersuchung • Referenzorganismen • Handhabung potentiell Pathogener • Lagerung Kulturmedien und Reagenzien • Medienzubereitung und Equipment • Sterilität, Dekontamination • Reinigung Glasware • Lagerung gefährlicher Chemikalien Räumlichkeiten
  • 23. 23 • Waschküche kann, nach erfolgter Dekontamination, mit anderen Laborbereichen geteilt werden • Laborausrüstung in Routine nicht zwischen Bereichen wechseln • Molekularbiologielabor: • zugeordnet (Pipetten, Spitze, Zentrifugen, Probenröhrchen, Arbeitskleidung, Heizblöcke etc. in jedem Bereich vorhanden) DNA Kreuzkontamination! • Platz Räumlichkeiten
  • 24. 24 • ausreichende Belüftung • geeignete Raumtemperatur • regelmäßige Überprüfung der Klimaanlagenfilter • keine natürliche Belüftung bei Reinräumen und Pathogenen • Kontaminationsvermeidung • falls Labor in Produktionsbetrieb: • Auftreten von potentieller Kontamination vermeiden Räumlichkeiten
  • 25. 25 • Herstellung von PCR Primern und Probes (=Sonden) • Segregationskonzept zur Vermeidung DNA Kreuzkontamination • Amplifikation in eigenen Bereich mit Überdruck • Unterdruck für Räumlichkeiten mit „high-risk“ Organismen Räumlichkeiten
  • 26. 26 • Programm muss vorhanden sein • air sampling plates • surface swaps • Definition von Akzeptanzkriterien • Verfahren bei Überschreiten der Limits • mittels Datenanalyse Erkennen von Trends möglich • Bei NAT: • Negativkontrolle um etwaige DNA Kontamination anzuzeigen Umgebungskontrolle
  • 27. 27 • Programm: Resultate aus Umgebungsmonitoring, potentielle Kreuzkontamination fließen ein • Vorgehensweise bei Verschütten • Vermeiden von Staubansammlung • keine Pflanzen, keine persönlichen Gegenstände • minimale Papierunterlagen im Labor • Mantelwechsel • Händewaschen • Handschuhwechsel Hygiene
  • 28. 28 Validierung von Analysenverfahren ISO 17025 Kap.5.4.5, Eurachem LF Kap. 5 Richtigkeit Wiederfindung Messunsicherheit r = 2,8 x s Verifizierung Validierung
  • 29. 29 ISO 17025: • 5.4.5 Validierung von Verfahren • 5.4.5.1 Die Validierung ist die Bestätigung durch Untersuchung und Bereitstellung eines Nachweises, dass die besonderen Anforderungen für einen speziellen beabsichtigten Gebrauch erfüllt werden.
  • 30. 30 Validierung • Soll belegen, dass Prüfverfahren für seine bestimmte Aufgabe eignet. • Soll die Leistungsgrenzen des Prüfverfahrens charakterisieren. • Soll belegen, dass die Methode im Labor beherrscht wird. • Ist Teil der Qualitätssicherung!
  • 31. 31 Besonderheiten in der Mikrobiologie • Lebende Systeme • Wechselbeziehungen innerhalb des Nachweissystems • Flüssige Nachweissysteme: mögliche Kontaminationen mit Fremdkeimen • Kolonie-Nachweissysteme: Zielkolonien durch das Wachstum von Nichtzielorganismen oder durch Verunreinigungen überwachsen bzw. verdeckt.
  • 32. 32 Mikrobiologische Analysenschritte • Probenahme • Transport/Lagerung • Probenvorbereitung • Voranreicherung/Anreicherung • Isolation/Auszählung • Bestätigung • Auswertung Analytik Präanalytik
  • 33. 33 Normative Grundlagen • ÖNORM ENV ISO 13843:2001 Wasserbeschaffenheit – Richtlinie zur Validierung mikrobiologischer Verfahren (ISO/TR 13843:2000) • SAS 328.dw:2013 Leitfaden zur Validierung mikrobiologischer Prüfverfahren und zur Abschätzung der Messunsicherheit im Bereich Lebensmittel- und Umweltmikrobiologie • ÖNORM EN ISO 16140: 2003 Mikrobiologie von Lebens- und Futtermitteln – Arbeitsvorschrift für die Validierung alternativer Verfahren • ….
  • 34. 34 Auswahl von Analysenverfahren • Internationale Normen • Nationale Normen • Wissenschaftliche Publikationen • Leitfäden etc. von anerkannten Organisationen • nicht normative Verfahren • selbst entwickelte Verfahren  Welche Verfahren sind zu validieren?
  • 36. 36 • Das Laboratorium muss bestätigen, dass es Verfahren nach normativen Dokumenten richtig anwenden kann, bevor es diese für Prüfungen und Kalibrierungen einführt. = Validierung in vermindertem Umfang, „Verifizierung“ • Verfahren die nicht in normativen Dokumenten festgelegt sind • selbst entwickelte Verfahren • Verfahren nach normativen Dokumenten, die außerhalb ihres vorgesehenen Anwendungsbereiches angewendet werden • Änderungen und Erweiterungen in Verfahren nach normativen Dokumenten = Vollvalidierung
  • 37. 37 Validierungsumfang • Die Validierung muss in dem Umfang durchgeführt werden, der zur Erfüllung der Erfordernisse der beabsichtigten Anwendung oder des betreffenden Anwendungsgebiets notwendig ist. • Methode: quantitativ, semi-quantiativ, qualitativ • Matrix: Anzahl und Art • Validierung kann Verfahren für Probenahme, Handhabung und Transport umfassen.
  • 38. 38 Umfang vollständige Validierung Qualitative Methode Quantitative Methode Matrix Effekt X X Spezifität X X Sensitivität X X Rel. Richtigkeit X X Wiederholbark eit X X Reproduzierba rkeit X X Nachweisgrenz e X Bestimmungsgr enze X Falsch-Positiv- Rate X X Falsch- X X
  • 39. 39 Validierung sollen reale Testbedingungen widerspiegeln: • Natürlich kontaminierte Proben • Künstlich kontaminierte Proben (Spiken): bekannte Keimzahlhöhe • Kombination • Matrixeffekt • Wasser: Trinkwasser, Oberflächenwasser, Badewasser • horizontales Lebensmittelverfahren: mind. 4 Matrices prüfen (SAS) • Umweltproben
  • 40. 40 Kommerzielle Test Kits • Validierungsdaten des Herstellers verfügbar halten
  • 41. 41 Voraussetzungen für die Durchführung der Validierung • Einsatz von gewarteten und kalibrierten Geräten und Messeinrichtungen • zertifizierte Bezugsnormalen, Referenzstämme • geschulte Mitarbeiter • Arbeitsanleitung für die zu validierende Methode • Validierungsplan oder Beschreibung des Versuchsablaufs • Die Rückverfolgbarkeit der verwendeten Einrichtungen und Medien zu Validierungsdaten muss gegeben sein!
  • 42. 42 Methoden zur Validierung • Referenzmaterialien: zertifizierte Referenzstämme oder Standards • Alternativmethode: Vergleich mit Ergebnissen, die mit anderen Verfahren erzielt wurden • Laborvergleiche: Ringversuche, Vergleichsprüfungen  statistische Absicherung • systematische Beurteilung der Faktoren, die das Ergebnis beeinflussen: • zB Probnahme, Probentransport,…
  • 43. 43 Dokumentationsanforderungen • 17025, 5.4.5.2: Das Laboratorium muss die erhaltenen Ergebnisse und das für die Validierung verwendete Verfahren aufzeichnen und festlegen, ob das Verfahren für den beabsichtigten Gebrauch geeignet ist (Aussage zu ihrer Gültigkeit). • 15189: Autorisiertes Personal für Bewertung!
  • 44. 44 • Vergleichsversuch wurde durchgeführt, Fazit: „Ergebnisse sind nicht vergleichbar“. • Begleitflora! • Dreifaktorielle Varianzanalyse (insges. 60 Analysen): • Probenahme/Probenteilung (1 Gesamtprobe in 5 Teilproben für 5 Labors) • Hitze/Säurebehandlung • 2x 0,5ml Direktansatz und Filtration mit 2 verschiedene Membranfiltern
  • 45. 45 Haupteinflussfaktoren: 1: Säure- oder Hitzebehandlung 2: Direktansatz oder MF
  • 47. 47 Messunsicherheit • Die Messunsicherheit grenzt den Wertebereich ein, innerhalb dessen der wahre Wert der Messgröße mit einer bestimmten anzugebenden Wahrscheinlichkeit liegt. • Mikrobiologische Verfahren sind nicht robust, eine statistisch gültige Schätzung der Messunsicherheit ist daher nicht möglich. • Die Messunsicherheit für mikrobiologische Verfahren muss nur auf Kundenwunsch auf dem Prüfbericht angegeben werde. • Alle Unsicherheitsfaktoren müssen dem Labor bekannt sein!
  • 48. 48 Messunsicherheit • Einzelnen Komponenten der Unsicherheit identifizieren, • zeigen, dass sie unter Kontrolle sind (standardisierte Vorgänge) und • ihren Beitrag zur Streuung der Prüfergebnisse bestimmen.
  • 49. 49 Komponenten der Unsicherheit Einflüsse, die leicht zu bestimmen und zu messen sind: • Pipettieren • Wiegen • Verdünnen • Inkubationseffekte  Wiederfindungsversuche,….
  • 50. 50 Komponenten der Unsicherheit Einflüsse, die nicht messbar sind: • Probenstabilität • Probenvorbereitung • Verteilung der Keime in der Probe • Matrix • Beiträge nicht unbedingt in Messunsicherheit mit einbeziehen, da kein Faktor der Methodik. • Beiträge müssen aber bekannt und unter Kontrolle sein!  Standardisierung (Probengröße, Homogenisierung,..)
  • 51. 51 Quantitative – qualitative Methoden • Abschätzung der MU idR nur für quantitative Methoden möglich. • Vorgehen bei qualitativen Methoden oder Identifizierungen: • Qualität von Reagenzien und Medien - QS • Ergebnisinterpretation durch Laboranten - Zählversuche • Nachweisgrenze in Abhängigkeit des Inokulums • Falsch-Positiv-, Falsch-Negativ-Rate
  • 52. 52 Abschätzung der Messunsicherheit von quantitativen Verfahren • gestützt auf Daten aus Wiederhol- und Vergleichspräzision oder Ringversuchen • Erfahrungswert für Guss-, Spatel- und Tropftechnik: Messunsicherheit zwischen 10 und 50% durchaus üblich. • SAS: Aus Erfahrung von Vergleichsprüfungen lässt sich die Messunsicherheit von mikrobiologischen Verfahren mit + 0,5 log10 KBE/g oder ml abschätzen. • Wiederholpräzision r: • qualitative Verfahren: r = x / n • quantitative Verfahren: r = 2,8 x s • Faktor 2,8: beruht auf Normalverteilung (Vertrauensintervall von 95%).
  • 53. 53 -50% ca. 50 KBE +50%
  • 54. 54 Eurachem Guide Kap.7 „Ausrüstung – Wartung, Kalibrierung, Überwachung“
  • 55. 55 Eurachem Guide Kap.7 „Ausrüstung – Wartung, Kalibrierung, Überwachung“ • Wartung: • Verwendungshäufigkeit gibt Intervall vor • eigenen Autoklaven für Dekontamination (ideal!) • Sterilisieren von Materialen • Filtrationsapparatur • Glasware/ Einweg • Petrischalen (Glas/ Plastik) • Wasserbäder • Brutschränke • Laminar Flows und Sicherheitsbänke • Autoklaven • Kühlgeräte • Pipetten, Dispenser • Thermometer, Stoppuhren, Waagen, pH-Meter, Kolonienzähler
  • 56. 56 „Ausrüstung – Wartung, Kalibrierung, Überwachung“ • Kalibrierung: • Programm muss vorhanden sein für Equipment mit direktem Einfluss auf Testresultat • Beispiel Appendix C und D • falls Temperatur ergebnisrelevant • Messgeräte von hinreichender Qualität gemäß Messunsicherheit, • Rückführbarkeit auf Temperaturstandards • Brutschrank, Wasserbäder, Ofen, T-kontrollierte Räume: • T-Stabilität und T-Verteilung, t bis zur Equilibrierung • Initial bestimmt und später periodisch überprüft, nach Reparaturen • tägliche Dokumentation der T bei laufendem Betrieb
  • 57. 57 • Autoklaven • spezifizierte Zeit • Temperaturtoleranzen • Monitoring von T mittels Thermoelement und Recorder  T- Chart oder Verwendung Bioindicator f. Sterilisation/ Dekontaminationsschritt • Indikatorstreifen • Waagen: • regelmäßige Kalibrierung • Volumen: • Dispenser, Pipetten, initiale Verifikation  regelmäßiger Check • Glasware mit Toleranzzertifikat müssen nicht verifiziert werden! • Überprüfung Genauigkeit des entnommenen/ Soll-Volumens sowie Ermittlung Präzision durch wiederholte Entnahmen • Einweg: Lieferant adäquates QMS, ansonsten Check jedes Batches auf Eignung „Ausrüstung – Wartung, Kalibrierung, Überwachung“
  • 58. 58 • Thermocycler • Verifikation von T, t • weitere: • LF-, Sauerstoff-, pH-Meter: regelmäßige Verifikation oder immer vor Gebrauch • Hygrometer, falls ergebnisrelevant • Zentrifugen, falls Zentrifugalkraft ergebnisrelevant „Ausrüstung – Wartung, Kalibrierung, Überwachung“
  • 59. 59 • Appendix C: Guidance on Calibration and Calibration Checks • Appendix D: Guidance on Equipment Validation and Verification of Performance „Ausrüstung – Wartung, Kalibrierung, Überwachung“ • Appendix E: Guidance on Maintainance of Equipment
  • 60. 60 Reagenzien und Kulturmedien ISO 17025 Kap.4.6 und 5.5, Eurachem LF Kap. 8
  • 61. 61 Eingangskontrolle • Für alle qualitätsrelevanten Reagenzien und Medien • Unversehrtheit der Verpackung, Transportbedingungen,... • jede Charge vor Verwendung auf Eignung überprüfen • rückführbare Positiv- und Negativkontrollen (ATCC, …) • ISO 11133
  • 62. 62 selbst hergestellte Medien • Quantitative Leistungsprüfungen jeder Charge • Wiederfindung der Zielorganismen • gut und schlecht wachsende • Hemmung der Nicht-Zielorganismen • pH-Wert • Farbe • Sterilität • Haltbarkeitsdauer selbst hergestellter Medien unter definierten Bedingungen festlegen • sachgemäße Lagerung der Trockenmedien
  • 63. 63 Fertigmedien • Quantitative Leistungsprüfungen • Umfang abhängig von Komplexität des Mediums oder • QM-System des Herstellers: • Qualitätszertifikat • Produktspezifikationen • dann keine umfangreiche Prüfung erforderlich
  • 64. 64 aus Vortrag Qualitätskontrolle von mikrobiologischen Nährmedien; Barbara Gerten, Fa. Merck • Fertigmedien, denen Supplemente zugesetzt werden • mindestens eine qualitative Prüfung empfohlen • aus handelsüblichen Trockenmedien hergestellte Medien • bei Isolierungs- und Zählmedien sollte mindestens eine halbquantitative Prüfung durchgeführt werden • bei Prüfmedien zur Charakterisierung kann eine qualitative Prüfung ausreichend sein • quantitative Prüfungen geben eine größere Sicherheit hinsichtlich der Qualität der Medien
  • 65. 65 Kennzeichnung • Identität • Konzentration • Lagerbedingungen • Öffnungsdatum • Herstellungsdatum • Ablaufdatum bzw. Lagerdauer • Chargen-Kennzeichnung • Freigabe der Chargen • Verantwortliche Personen müssen in Aufzeichnungen ersichtlich sein.
  • 66. 66
  • 67. 67 Eurachem Guide Kap.9 „ Referenzmaterialien, Referenzstämme“
  • 68. 68 Eurachem Guide Kap.9 „ Referenzmaterialien, Referenzstämme“ • Appendix A: • Referenzmaterialien dienen der Rückverfolgbarkeit und werden verwendet: • Aussage zur Genauigkeit von Testresultaten • Gerätekalibrierung • Methodenvalidierung • Performance der Methoden • ermöglichen Vergleichbarkeit von Methoden • Überprüfung Qualität Kulturmedien • Performance von Testkits • Referenzkulturen • rückverfolgbare Stämme von nationalen/ internationalen dafür anerkannten Stellen • Alternative: kommerzielle Derivate, müssen auf „anerkannte“ rückführbar sein. • Referenzstämme  durch einmalige Subkultivierung: Referenz Stammlösung (eingefroren bzw. lyophilisiert)  primäre Subkultur: Referenz Arbeitslösung (Routine) • bereits aufgetaute Stammlösungen dürfen nicht mehr eingefroren werden
  • 69. 69 Eurachem Guide Kap.9 „ Referenzmaterialien, Referenzstämme“ • Arbeitskulturen dürfen nicht subkultiviert werden, außer durch ein SOP gefordert, oder das Labor kann belegen, dass keine Eigenschaft sich verändert hat • kommerzielle Derivate von Referenzstämmen werden nur als Arbeitskulturen verwendet
  • 70. 70 Probenahme ISO 17025 Kap.5.7, Eurachem LF Kap. 10
  • 71. 71 ISO 17025: • Probenahmeplan o/u Verfahren zur Probenahme • am Ort der Probenahme verfügbar • Abweichungen, Ergänzungen oder Ausschlüsse von dem schriftlich niedergelegten Probenahmeverfahren dokumentieren • Verfahren zum Aufzeichnen der wesentlichen Angaben und Tätigkeiten hinsichtlich der Probenahme • Umgebungsbedingungen • Zeitpunkt • besondere Vorkommnisse
  • 72. 72 Probenahme – überbrachte Proben • abgesichert durch Qualitäts-Sicherungsmaßnahmen • Monitoring der Probenehmer • Ringversuche für Probenahmen • Akkreditierung der Probenahmeverfahren • Probenahmenormen, zB ÖNORM EN ISO 19458, ÖNORM M 5874, ÖNORM B 5019, MiQs • Wenn nicht akkreditiert, Hinweis im Bericht, dass Probenahme außerhalb der Akkreditierung.
  • 73. 73 Sonstiges • Probenahme nur durch geschultes und freigegebenes Personal • Verantwortungen festlegen • geeignete, sterile Probenahmeutensilien
  • 74. 74 Handhabung von Prüf- und Kalibriergegenständen ISO 17025 Kap.5.8, Eurachem LF Kap. 11
  • 75. 75 Probeneingang • Verfahren zu: • Transport, Eingang, Handhabung, Schutz, Lagerung, Aufbewahrung und/oder Beseitigung der Proben • Botendienste schulen • System zur Identifizierung der Probe • Machbarkeitsprüfung • Aufzeichnungen über: • Datum und ggf. Zeitpunkt des Probeneingangs • Zustand der Probe und ggf. Temperatur • ggf. Informationen zu Probengewinnung (Zeitpunkt,…) • Vorgehen bei Ungewöhnlichkeiten oder Abweichungen  Rücksprache mit Kunden
  • 76. 76 Probenlagerung • Lagerbedingungen festlegen und aufzeichnen • Temperatur • Transport- und Lagerdauer • bis Testbeginn – keine ungerechtfertigte Verzögerung • Rückstellmuster - zumindest bis Berichterstellung • Kreuzkontaminationen vermeiden • Probenvorbereitung und Probenteilung ist Teil des Prüfverfahrens
  • 77. 77 ÖNORM EN ISO 19458 Wasserbeschaffenheit - Probenahme für mikrobiologische Untersuchungen
  • 78. 78 ÖNORM B 5019 Legionellen ISO 15189 – medizinische Laboratorien: • Anforderungen an die Gewinnung, Lagerung und den Probentransport für die jeweiligen Materialien in den entsprechenden MIQ (Mikrobiologisch-infektiologischer Qualitätsstandard). • Probentransport diagnostischer Proben in Österreich: multilaterale Vereinbarung M143
  • 79. 79 Entsorgung ISO 17025 Kap.5.8, Eurachem LF Kap. 12
  • 80. 80 Entsorgung ISO 17025 Kap.5.8, Eurachem LF Kap. 12 • Korrekte Entsorgung –gem. nationalen/internationalen Vorgaben • Vermeidung der Kontamination der Testumgebung und Umwelt • Autoklavieren • getrennt für Abfall und Nährmedien, Glaswaren etc. • ggf. zu entsorgende Proben • befugter Entsorger • schwarze Kübel, gelbe Kübel, orange Säcke für Spitalsmüll,…
  • 82. 82 Eurachem Guide Kap.13 „Qualitätssicherung“ • Interne Qualitätskontrolle (QK) • Konsistenz der Testresultate (day-to-day) und deren Konformität mit bestehenden Kriterien soll demonstriert werden • gespikte Proben • Referenzmaterialien • Wiederholungsmessungen • Verwendung Interne Kontrollen zur Testperformance • Externe QK • Proficiency testing schemes (PTS) => Matrix!  Laborvergleichstests • Häufigkeit der Teilnahme an PTS soll Scope entsprechen • EA-4/18-guidance • ISO 17043 akkreditierte PTS
  • 83. 83 Berichte ISO 17025 Kap.5.10, Eurachem LF Kap. 14 Prüfbericht Inspektionsbericht §73-GutachtenAkkreditierungszeichen Akkreditierungslogo
  • 84. 84 Ergebnisangabe - quantitative Methoden • Anzahl KBE / Volumen oder Gewicht • Bei <10 KBE/Platte nimmt Präzision des Ergebnisses signifikant ab. Im Bericht reflektiert. • „0“ KBE angeben als • nicht nachweisbar / Volumen oder Masse • kleiner Nachweisgrenze • Null in definierter Einheit
  • 85. 85 Ergebnisangabe - qualitative Methoden • nachgewiesen / nicht nachgewiesen • „kleiner als bestimmte Anzahl an Keimen in definierter Einheit“, wo sinnvoll und nach Kundenrücksprache
  • 86. 86 Ergebnis  Meinung und Interpretation
  • 87. 87 Angabe der Messunsicherheit • Falls die MU angegeben wird, müssen dem Kunden alle limitierenden Komponenten bekannt gegeben werden • insbesondere, ob Verteilung der Keime in der Probe mit berücksichtigt wurde.
  • 89. 89 ÖNORM EN ISO 11731-2 Legionellen
  • 90. 90 Inhalt Prüfberichte gem. ISO 17025 relevante Angaben - Mikrobiologie: • Angabe des angewendeten Verfahrens (Zusammenhang zu Akkreditierungsumfang) • Beschreibung des Zustands der Probe • Eingangsdatum und Prüfdatum • ggf. Probenahmedatum und Hinweise auf Probenahme • §73-Gutachten ist nicht akkreditiert

Hinweis der Redaktion

  1. Vorstellen wir, Vorstellrunde Teilnehmer, wenn nicht zuviele.
  2. Ph. Eur. 2.6.12 Mikrobiologische Prüfung nicht steriler Produkte: Zählung der gesamten vermehrungsfähigen Keime Ph. Eur. 2.6.13Mikrobiologische Prüfung nicht steriler Produkte: Nachweis spezifizierter Mikroorganismen Ph. Eur. 2.7.2Mikrobiologische Wertbestimmung von Antibiotika
  3. Bestimmung der Keimzahl (5.1.4, 2.6.12) Testung auf Eignung und Hemmung (2.6.12, 2.6.13) Spezifische Organismen E. Coli (5.1.4, 2.6.13)
  4. Tätigkeitsbeschreibung auch für QM, iA,…
  5. 17025 und EC-LF keine großen Unterschiede bzgl. Personal
  6. ISO 17025, 5.3 von der Behörde abgenommen Arbeitsstätten-/Betriebsbewilligung Sicherheitsstufe Hygieneprogramm/-beauftragter Dekontaminationsregeln Reinigungsprotokolle Desinfektions/ Reinigungsmittelliste persönliche Schutzausrüstung (Brille, Arbeitskleidung, Handschuhe) Verhaltensregeln Luftwechselrate? Differenzdruck? # OCABR Guideline Testing facility und ancillary facility requirements Zugangskontrolle nur für authorized personnell
  7. Heißluftschrank Wasser Destillationsapparatur Mikroskope Scanner Schublehre
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  10. Puffer mit Expiration Date markieren sowie T-gerecht lagern Indikatorstreifen gibt lediglich Aussage darüber dass eine Beladung autoklaviert wurde, aber nicht ob dasAutoklavieren zur vollen Länge passiert ist
  11. Referenzmaterialien: Standards, die keinen festgelegten Wert haben aber dennoch Resultate generieren oder als Indikator für die Validität der Prüfung gelten werden als Referenzmaterialien bezeichnet. Referenzstandards: Primäre Referenzstandards: sind Referenzstandards denen ein Wert z.B. im Rahmen eines Ringversuchs zugewiesen wurde. Primäre Referenzstandards stehen „an der Spitze“ und haben per definitionem „richtige“ Werte für die keine Messunsicherheit angegeben wird. Weiters werden Referenzspektren des EDQM sowie BRP (biologische Referenzpräparate) des EDQM als Primärstandards betrachtet. Sekundäre Referenzstandards: sind demgegenüber Referenzstandards denen ein Wert über Ablesung, d.h. Vergleich oder Kalibration (s.u.) an einem Primärstandard zugewiesen wurde. Der zugewiesene Wert eines Sekundärstandards ist somit rückführbar auf den des Primärstandards. Sekundärstandards werden dann eingesetzt wenn Primärstandards nur begrenzt zur Verfügung stehen oder über längere Zeiträume verfügbar sein sollen. In der Routineanalytik werden sie auch als Haus- oder Arbeitsstandards bezeichnet. Üblicherweise wird zum festgelegten Wert auch die entsprechende Messunsicherheit angegeben. Referenzstämme (Bakterien, Viren, Pilze, ...) für die Identifikation von Mikroorganisamen unterliegen ebenfalls dieser SVA (im Gegensatz zu Stämmen die ausschließlich für Relativbestimmungen eingesetzt werden); sowie der SVA_L18 „Stämme“.
  12. Referenzmaterialien: Standards, die keinen festgelegten Wert haben aber dennoch Resultate generieren oder als Indikator für die Validität der Prüfung gelten werden als Referenzmaterialien bezeichnet. Referenzstandards: Primäre Referenzstandards: sind Referenzstandards denen ein Wert z.B. im Rahmen eines Ringversuchs zugewiesen wurde. Primäre Referenzstandards stehen „an der Spitze“ und haben per definitionem „richtige“ Werte für die keine Messunsicherheit angegeben wird. Weiters werden Referenzspektren des EDQM sowie BRP (biologische Referenzpräparate) des EDQM als Primärstandards betrachtet. Sekundäre Referenzstandards: sind demgegenüber Referenzstandards denen ein Wert über Ablesung, d.h. Vergleich oder Kalibration (s.u.) an einem Primärstandard zugewiesen wurde. Der zugewiesene Wert eines Sekundärstandards ist somit rückführbar auf den des Primärstandards. Sekundärstandards werden dann eingesetzt wenn Primärstandards nur begrenzt zur Verfügung stehen oder über längere Zeiträume verfügbar sein sollen. In der Routineanalytik werden sie auch als Haus- oder Arbeitsstandards bezeichnet. Üblicherweise wird zum festgelegten Wert auch die entsprechende Messunsicherheit angegeben. Referenzstämme (Bakterien, Viren, Pilze, ...) für die Identifikation von Mikroorganisamen unterliegen ebenfalls dieser SVA (im Gegensatz zu Stämmen die ausschließlich für Relativbestimmungen eingesetzt werden); sowie der SVA_L18 „Stämme“.
  13. Für Einkanal-Pipetten mit variablem Volumen unter 20µl ist die akzeptable zufällige Messabweichung größer als in ISO 8655-2 festgelegt. Diese Pipetten dürfen für quantitative Bestimmungen nicht eingesetzt werden.
  14. EA-4/18-guidance on the level and frequency of proficiency testing participation, Case Study 2 – Microbiology Testing Laboratory ISO/IEC 17043:2010 Conformity assessment -- General requirements for proficiency testing
  15. EA-4/18-guidance on the level and frequency of proficiency testing participation, Case Study 2 – Microbiology Testing Laboratory ISO/IEC 17043:2010 Conformity assessment -- General requirements for proficiency testing