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Entwicklung eines
Real-Time-PCR-Systems
für den spezifischen Nachweis von
Enterobacteriaceae
in Lebensmitteln
vorgelegt von
Diplom-Biologin
Barbara A. E. Heinze
Von der Fakultät III – Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktorin der Naturwissenschaften
– Dr. rer. nat. –
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dipl.-Ing. Dr. D. Knorr
Berichter: Prof. Dipl.-Ing. Dr. U. Stahl
Berichterin: Dipl.-Ing. Dr. K. Berghof-Jäger
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 10.09.2007
Berlin 2007
D 83
DANKSAGUNG
Mein Dank gilt an erster Stelle meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Ulf Stahl für die
wissenschaftliche Betreuung und Unterstützung beim Erstellen dieser Arbeit.
Frau Dr. Kornelia Berghof-Jäger, Geschätsführerin der BIOTECON Diagnostics
GmbH, danke ich für die Möglichkeit, die vorliegende Arbeit anzufertigen sowie für
die ständige Hilfestellung und zielorientierte Diskussionsbereitschaft.
Herrn Dr. Cordt Grönewald danke ich für die Betreuung dieser Arbeit, wertvolle
Anregungen, Ratschläge und Gespräche und für die kritische Durchsicht des
Manuskripts.
Frau Astrid Schneider gilt mein herzlicher Dank für die hilfreichen fachlichen
Diskussionen und auch die weniger fachlichen Gespräche sowie für das kritische
Lesen des Manuskripts.
Frau Astrid Seemann danke ich für ihre fachliche Unterstützung und Diskussion zu
allen Fragen der Mikrobiologie.
Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der BIOTECON Diagnostics GmbH bin ich
sehr dankbar für ihre Hilfsbereitschaft, die gute Zusammenarbeit und freundliche
Arbeitsatmosphäre.
Ganz besonders bedanke ich mich bei Herrn Dirk Eimer für seine intensive
Auseinandersetzung mit mir und meiner Arbeit, das Korrekturlesen, seine
unermütliche Diskussionsbereitschaft und seine starken Nerven.
Ich bedanke mich ganz herzlich für die Motivierung und Stärkung bei meiner Familie
Christiane, Erika und Joachim Heinze.
Frau Sonja Körber bin ich sehr dankbar für ihre entscheidende Unterstützung.
Inhalt
I
INHALT
Seite
Inhalt I
Verzeichnis der Abbildungen IV
Verzeichnis der Tabellen V
Verzeichnis der Abkürzungen und Zeichen VI
I EINLEITUNG
1 THEORETISCHER TEIL
ENTEROBACTERIACEAE IN LEBENSMITTELN 1
1.1 Lebensmittel als Überträger von Infektionskrankheiten 1
1.2 Enterobacteriaceae als Ursachen für Lebensmittelinfektionen 5
1.2.1 Häufigster Vertreter lebensmittelassoziierter Enterobacteriaceae:
Salmonella 8
1.2.1.1 Enteritis-Salmonellose 9
1.3 Enterobacteriaceae als Markerorganismen 14
2 PRAKTISCHER TEIL
DETEKTION BAKTERIELLER KONTAMINATIONEN IN
LEBENSMITTELN
16
2.1 Mikrobiologischer Nachweis von Enterobacteriaceen 16
2.2 Molekularbiologischer Bakterien-Nachweis mittels PCR 18
2.2.1 Aspekte der PCR 21
2.3 Zielsetzung der Arbeit 24
II MATERIAL UND METHODEN
1 MATERIAL 26
1.1 Bakterienstämme 26
1.2 Nährmedien 28
1.3 Reagenzien 29
1.4 Enzyme 31
1.5 Reaktionskits 32
1.6 Primer und Sonden 32
1.7 Lebensmittelproben 35
1.8 Software 36
Inhalt
II
Seite
2 METHODEN 37
2.1 Anzucht von Mikroorganismen 37
2.2 Quantifizierung von Bakterienzellen 37
2.3 DNA-Extraktion 37
2.3.1 DNA-Präparation mit enzymatischem Zellaufschluss 38
2.3.2 DNA-Extraktion ShortPrep 38
2.4 DNA-Quantifizierung 38
2.4.1 DNA-Quantifizierung im Photometer 38
2.4.2 DNA-Quantifizierung im LightCycler®
39
2.4.3 Quantifizierung von Amplifikaten 39
2.5 Endonukleasenverdau 39
2.5.1 Restriktionsverdau 39
2.5.2 DNase I-Verdau 39
2.6 Polymerase-Kettenreaktion 40
2.6.1 Standardbedingungen für die konventionelle PCR 40
2.6.2 Standardbedingungen für die Real-Time-PCR 41
2.6.3 Für den Nachweis von Enterobacteriaceae mittels Real-Time-
PCR optimierte Reaktionsbedingungen 43
2.7 Gelelektrophorese 44
2.7.1 Agarosegelelektrophorese 44
2.7.2 Präparative Gelelektrophorese 44
2.8 Klonierung von DNA-Amplifikaten 45
2.8.1 Ligation präparierter Amplifikate 45
2.8.2 Transformation in Escherichia coli 45
2.9 Präparation und Restriktionsverdau von Plasmid-DNA 46
2.9.1 Präparation von Plasmid-DNA 46
2.9.2 Restriktionsverdau präparierter Plasmid-DNA 46
2.10 Sequenzanalyse 47
2.10.1 DNA-Sequenzierung und Sequenzauswertung 47
2.10.2 Bearbeitung von DNA-Sequenzdaten 47
2.11 Überprüfung der Spezifität der Real-Time-PCR-Methode zum
Nachweis von Enterobacteriaceae 47
2.12 Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der
Untersuchung von Lebensmittelproben im Vergleich mit
mikrobiologischen Methoden 48
III ERGEBNISSE
3.1 Auswahl der DNA-Zielregion 50
3.2 Erstellen von Sequenzalignments und Generieren möglicher
Primer für den Nachweis von Enterobacteriaceen-DNA 51
3.3 Amplifikation der 23S-5S-DNA von Enterobacteriaceen 53
3.4 Dekontamination der Taq-Polymerase 55
3.5 Testung der Primer für Enterobacteriaceen 56
Inhalt
III
Seite
3.6 Generieren der Primer und Sonden für das System zum
Nachweis von Enterobacteriaceae 58
3.7 Anwendung und Überprüfung der generierten Oligonukleotide
und der dekontaminierten Taq-Polymerase in der Real-Time-
PCR für den Nachweis von Enterobacteriaceen 60
3.7.1 Amplifikation 60
3.7.1.1 Hook-Effekt 61
3.7.2 Schmelzkurvenanalyse 62
3.8 Interne Amplifikationskontrolle 63
3.8.1 Konstruktion der Internen Amplifikationskontrolle 64
3.8.2 Integration der Internen Amplifikationskontrolle in das
Enterobacteriaceen-Nachweissystem 66
3.9 Optimierung der Reaktionsbedingungen für das
Enterobacteriaceen-Nachweissystem 66
3.10 Spezifität des Enterobacteriaceen-Nachweissytems 67
3.10.1 Inklusivität 68
3.10.2 Exklusivität 69
3.11 Sensitivität des Enterobacteriaceen-Nachweissystems 70
3.11.1 Überprüfung der Sensitivität mit genomischer DNA von Bakterien 71
3.11.2 Überprüfung der Sensitivität mit bakteriellen Zelllinien 74
3.12 Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der
Untersuchung von Lebensmittelproben 75
IV DISKUSSION
4.1 Entwicklung eines spezifischen Real-Time-PCR-Systems für den
Nachweis von Enterobacteriaceae
84
4.2 Kulturelle Anreicherung und DNA-Extraktion 86
4.3 Dekontamination der Taq-DNA-Polymerase 88
4.4 Kompetitive PCR mit Interner Amplifikationskontrolle 90
4.5 Spezifität und Sensitivität 91
4.6 Ausblick 96
V ZUSAMMENFASSUNG 98
VI LITERATUR 99
Inhalt
IV
VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN
Seite
Abb. 1.1 Prozentuale Verteilung der bekannten mit Mikroorganismen
kontaminierten Lebensmittel, deren Verzehr im Jahr 2000 zu
Ausbrüchen von Infektionskrankheiten in den Vereinigten
Staaten von Amerika führten 4
Abb. 1.2: An das Robert Koch Institut in Berlin übermittelte Fälle von
Enteritis-Salmonellosen in Deutschland in den Jahren 1991 bis
2004 12
Abb. 3.1: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der universellen
Primer fw23S und rev5S der Firma BIOTECON Diagnostics
GmbH am rRNA-Operon von Eubakterien 50
Abb. 3.2: Sequenzen der universellen Primer fw23S und rev5S der Firma
BIOTECON Diagnostics GmbH für die Amplifikation der 23S-5S-
DNA im rRNA-Operon von Bakterien 51
Abb. 3.3: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der Primer fw1 - fw8
und rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) für die spezifische Amplifikation von
Enterobacteriaceae-DNA 53
Abb. 3.4: Agarosegelelektrophorese einer PCR für die spezifische
Amplifikation der 23S-5S-Region mit dem Primerpaar fw1/rev3 54
Abb. 3.5: Agarosegelelektrophorese nach PCR mit Perpetual Taq, ohne
und mit DNase I-Verdau der Taq-Polymerase 56
Abb. 3.6: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der Oligonukleotide für
das Real-Time-PCR-System zum Nachweis von Enterobacteria-
ceae-DNA 59
Abb. 3.7: Amplifikationskurven der Real-Time-PCR zum Nachweis von
Enterobacteriaceae-DNA 61
Abb. 3.8: Schmelzkurven der Real-Time-PCR für den Nachweis von
Enterobacteriaceae-DNA 63
Abb. 3.9: Konstruktion des mutagenisierten DNA-Fragments für die Interne
Amplifikationskontrolle des Enterobacteriaceen-Nachweises 65
Abb. 3.10: Fluoreszenz bei Anwendung des Enterobacteriaceen-
Nachweissystems während der Amplifikation von Ziel- und IAK-
DNA im LightCycler®
67
Abb. 3.11: Sensitivitätstest der Real-Time-PCR für den Enterobacteria-
ceen-Nachweis durch Amplifikation genomischer DNA von
Serratia marcescens 72
Abb. 3.12: Überprüfung der Sensitivität des Enterobacteriaceen-
Nachweissystems mit genomischer DNA von Bakterien 73
Abb. 3.13: Überprüfung der Sensitivität des Enterobacteriaceen-
Nachweissystems mit bakteriellen Zelllinien 75
Abb. 3.14: Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der
Untersuchung von Lebensmittelproben 78
Abb. 3.15: Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der
Untersuchung von Säuglingsnahrung 81
Inhalt
V
VERZEICHNIS DER TABELLEN
Seite
Tab. 1.1: Häufig vorkommende, lebensmittelübertragene Gattungen und
Spezies der Familie Enterobacteriaceae sowie Beispiele für
deren Vorkommen und Bedeutung 7
Tab. 1.2: Taxonomische Einteilung der Gattung Salmonella in Spezies und
Subspezies sowie Anzahl der Serovare im Jahr 2002 8
Tab. 2.1: Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitäts- und Sensitivitäts-
tests 26
Tab. 2.2: Nicht-Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitätstests 27
Tab. 2.3: Generierte Primer und Sonden mit Bindungsstellen innerhalb des
DNA-Bereichs für 23S rRNA – Spacer – 5S rRNA im
ribosomalen Operon 32
Tab. 2.4: Generierte Primer und Sonde für die Konstruktion und Detektion
der internen Amplifikationskontrolle 34
Tab. 2.5: Tiefgefrorene Lebensmittel 35
Tab. 2.6: Säuglingsnahrung und Volleipulver 36
Tab. 3.1: Bakterienstämme der Familie Enterobacteriaceae, deren 23S-
5S-Sequenzen im Alignment als Grundlage für das Generieren
der Primer fw1 - fw8 und rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) dienten 52
Tab. 3.2: Bakterienstämme diverser taxonomischer Gruppen, deren 23S-
5S-Sequenzen im Alignment als Grundlage für das Generieren
der Primer fw1 - fw8 und rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) dienten 52
Tab. 3.3: Spezifische Amplifikation mit den Primern fw1 – fw8 und rev1 –
rev8 57
Tab. 3.4: Inklusivität: Im Spezifitätstest des Real-Time-PCR-System
detektierte Stämme der Familie Enterobacteriaceae 68
Tab. 3.5: Exklusivität: Alle im Spezifitätstest des Real-Time-PCR-Systems
mit Nicht-Enterobacteriaceen-Spezies überprüften Stämme 70
Tab. 3.6: Ergebnisse der Untersuchung von Lebensmitteln diverser
Produktgruppen 79
Tab. 3.7 Ergebnisse der Untersuchung von Säuglingsnahrung und
Volleipulver 82
Inhalt
VI
VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN UND ZEICHEN
°C Grad Celsius
µg Mikrogramm (= 10-6
Gramm)
µl Mikroliter (= 10-6
Liter)
µm Mikrometer (= 10-6
Meter)
µM mikromolar (= 10-6
molar)
A Adenin
A. Aeromonas
Abb. Abbildung
abs. absolut
Abs. Absatz
Acc. (englisch Accession) Zugang
Aci Arthrobacter citreus
ag Attogramm (= 10-18
Gramm)
Amp Ampicillin
API (englisch Analytical Profile Index) analytischer Profilindex
Aqua dest. (lateinisch Aqua destillata) destilliertes Wasser
ATCC American Type Culture Collection
BCD BIOTECON Diagnostics GmbH
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
bp Basenpaar
BSA (englisch Bovine Serum Albumin) Rinderserumalbumin
C Cytosin
C. Citrobacter
CASO Caseinpepton-Sojamehlpepton
CP (englisch crossing point)
dATP Desoxyadenosintriphosphat
dCTP Desoxycytidintriphosphat
DGHM Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie
dGTP Desoxyguanosintriphosphat
DNA (englisch deoxyribonucleic acid) Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynukleosidtriphosphat
DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
dTTP Desoxythymidintriphosphat
E. Escherichia
Ed. Edwardsiella
Ed. (englisch editor) Herausgeber
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
Ent. Enterobacter
Er. Erwinia
et al. (lateinisch et alii) und andere
EtBr Ethidiumbromid
Fa. Firma
FAO (englisch Food and Agriculture Organization) Welternährungsorganisation
fg Femtogramm (= 10-15
Gramm)
Fmax maximale Fluoreszenz
fw (englisch forward) vorwärts
g Gramm
G Guanin
GÄ Genomäquivalent
h (englisch hour) Stunde
H. Hafnia
Hrsg. Herausgeber
HS Heringssperma
I Inosin
IAK Interne Amplifikationskontrolle
Inhalt
VII
ICMSF (englisch International Comission on Microbiological Specifications for Foods)
Internationale Kommission für mikrobiologische Lebensmittelspezifikationen
IPTG Isopropyl-Thio-β-D-Galactopyranosid
K. Klebsiella
Kap. Kapitel
Kat. Katalog
KbE Kolonie bildende Einheit
LB Luria Bertani
LPSN List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature
m Meter
M. Morganella
M = A + C
M molar
Mae Methanococcus aeolicus
mg Milligramm (= 10-3
Gramm)
min (englisch minute) Minute
ml Milliliter (= 10-3
Liter)
mM millimolar (= 10-3
molar)
Mse Micrococcus spec.
NCBI National Center of Biotechnology Information
NCTC National Collection of Type Cultures
ng Nanogramm (= 10-9
Gramm)
nm Nanometer (= 10-9
Meter)
nM nanomolar (= 10-9
molar)
Nr. Nummer
OECD (englisch Organisation for Economic Cooperation and Development)
Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung
P. Plesiomonas
Pa. Pantoea
p. a. (lateinisch per analysis) zur Analyse
PCR (englisch Polymerase Chain Reaction) Polymerase-Kettenreaktion
pg Pikogramm (= 10-12
Gramm)
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
pmol Pikomol (= 10-12
Mol)
Prot. Proteus
Prov. Providencia
R = A + G
rev (englisch reverse) rückwärts
RNA (englisch ribonucleic acid) Ribonukleinsäure
rpm (englisch revolutions per minute) Umdrehungen pro Minute
rRNA ribosomale RNA
S. Salmonella
S Sedimentationskoeffizient
Se. Serratia
sek Sekunde
Sh. Shigella
spec. (lateinisch Species) Spezies, unbekannte Art
ssp. Subspezies
T Thymin
Tab. Tabelle
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris Borat EDTA Puffer
TE Tris EDTA Puffer
Tm (englisch melting) Schmelztemperatur
Tris Tris-(hydroxymethyl)aminomethan
tRNA transfer RNA
U (englisch unit) Einheit
ü. N. über Nacht
Inhalt
VIII
UNG Uracil-DNA-N-Glycosylase
UV UltraViolett
V. Vibrio
V/cm Volt pro Zentimeter
v/v (englisch volume per volume) Volumen pro Volumen
VRBD (englisch Violet-red Bile Dextrose Agar) Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Glucose)
WHO (englisch World Health Organization) Weltgesundheitsorganisation
w/v (englisch weight per volume) Gewicht pro Volumen
w/w (englisch weight per weight) Gewicht pro Gewicht
x g Vielfaches der Erdbeschleunigung g (g = 9,81 m/s2
)
X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Galactose
Y = C + T
Y. Yersinia
I Einleitung
1
I EINLEITUNG
1 THEORETISCHER TEIL
ENTEROBACTERIACEAE IN LEBENSMITTELN
1.1 Lebensmittel als Überträger von Infektionkrankheiten
Lebensmittel sind Mittel zum Leben. Sie dienen der Lebenserhaltung und dem
Genuss. Aber ebenso können Lebensmittel Überträger von Krankheitserregern des
Menschen sein. Ihr Verzehr führt zu Erkrankungen, die mitunter tödlich enden. Nach
Definition der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sind durch Lebensmittel
verursachte Erkrankungen „Krankheiten infektiöser oder toxischer Natur, verursacht
durch Agenzien, die durch Nahrungsaufnahme in den Körper gelangen“ (Anonymus
2002a). Kontaminierte Lebensmittel weisen einen gesundheitsgefährdenden Befall
mit Mikroorganismen und ihren Toxinen und/oder Rückständen von
pharmazeutischen, umweltrelevanten und anderen Substanzen auf. Die vorliegende
Arbeit richtet den Fokus auf Lebensmittelkontaminationen mit Bakterien als Ursachen
für lebensmittelbedingte Erkrankungen.
Durch Lebensmittel übertragene Infektionskrankheiten stellen weltweit ein
wachsendes Gesundheits- und Wirtschaftsproblem dar, sowohl in
Entwicklungsländern als auch in hochentwickelten Industrieländern (Elmi 2004). Bis
zu 30 % der Bevölkerung in allen Industrieländern sind jedes Jahr von
lebensmittelassoziierten Infektionen betroffen (Anonymus 2002a). In den USA
erkranken nach einer Studie jährlich ungefähr 76 Millionen Bürger, circa 325.000
Personen werden in ein Krankenhaus eingewiesen und etwa 5.000 Erkrankte
sterben an den Folgen der durch Lebensmittel übertragenen Krankheiten (Mead et
al. 1999). In England und Wales werden pro Jahr rund 2,4 Millionen Erkrankungen,
etwa 21.000 Krankenhauseinweisungen und über 700 Todesfälle als
lebensmittelbedingt ermittelt (Adak et al. 2002). Nach Angaben der WHO ist davon
auszugehen, dass diese Belastung in gleichem Ausmaß auf die meisten Länder der
Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) zutrifft
(Rocourt et al. 2003a).
Innerhalb der letzten zwei Jahrzehnte haben lebensmittelbedingte Erkrankungen der
Bevölkerung stark an Bedeutung gewonnen. Eine Reihe von Faktoren sind für diese
I Einleitung
2
Entwicklung verantwortlich: Intensive Massentierhaltung ermöglicht eine schnelle
Durchseuchung der Tierbestände mit pathogenen Keimen wie Salmonellen, die zum
Beispiel durch kontaminierte Futtermittel eingeführt werden (Jansen et al. 2005). Der
Einsatz von Antibiotika als Masthilfsmittel moderner Tierhaltung führt zur Verbreitung
von Antibiotikaresistenzen humanpathogener Bakterienstämme, die eine Therapie
betroffener Patienten wesentlich erschweren (Klare et al. 1995, Poppe et al. 2006).
Nach dem Verzehr von Lebensmitteln, die mit resistenten Enterobacteriaceen
kontaminiert sind, können diese in der Darmflora persistieren oder sich vermehren
und die Resistenz auf weitere Bakterien einschließlich pathogene Arten übertragen.
Durch das Bundesinstitut für Risikobewertung wurde in Deutschland in den letzten
zehn Jahren bei Salmonella Isolaten verschiedener Serotypen aus Tieren,
Lebensmitteln, Futtermitteln und der Umwelt ein Anstieg der Multiresistenz
gegenüber antimikrobiell wirksamen Substanzen nachgewiesen. So wurden in den
Jahren 2000 bis 2002 Stämme des Serovars Salmonella Typhimurium mit
Mehrfachresistenzen gegenüber Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin,
Tetracyclin und Sulfonamiden aus Lebensmitteln isoliert (Helmuth et al. 2003).
Der Verzehr von naturbelassenem, unbehandeltem Obst und Gemüse gilt
heutzutage als besonders gesund. Fehlende Behandlung zur Keimreduktion sowie
Einsatz natürlicher Dünger und ungeklärten Abwassers mit möglicher Kontamination
für die Bewässerung in der Landwirtschaft erhöhen aber das Risiko von Infektionen
(Beuchat und Ryu 1997, Tauxe et al. 1997). Zu einem größeren Krankheitsausbruch
durch Toxin produzierende Citrobacter freundii kam es in einem Kindergarten in
Deutschland nach dem Verzehr von Butter mit frischer Petersilie. Vehikel für die
Lebensmittelinfektion war die Petersilie aus biologischem Anbau, die mit
kontaminierter Schweinegülle gedüngt worden war (Tschäpe et al. 1995). Im
Rahmen einer Erfassung über weltweite Krankheitsausbrüche durch mit
Enterobacteriaceen kontaminierte rohe Sprossen, besonders von Alfalfa und
Mungbohnen, kommen Taormina et al. (1999) zu der Empfehlung, dass Kinder,
Ältere und Menschen mit eingeschränkter Immunabwehr als besonders gefährdete
Personen grundsätzlich keine rohen Sprossen verzehren sollten. Im Vergleich zu
frischem Obst und Gemüse stellen Sprossen ein deutlich höheres Risiko dar.
Bakterien in kontaminierten Samen können sich durch den Prozess des Sprossens
bei 21 °C bis 25 °C und viel Feuchtigkeit drastisch vermehren, ohne sichtbare
Anzeichen von Qualitätsbeeinträchtigung zu hinterlassen (Breuer et al. 2001).
Auch die Lebensmittelindustrie hat sich auf das geänderte Verbraucherverhalten
eingestellt und stellt Produkte her, die keine Konservierungsstoffe mehr enthalten.
Bei Nichtbeachtung entsprechender Lager- und Transportbedingungen können
Keime in diese Lebensmittel gelangen und sich dort vermehren (Ammon und Bräunig
2002). Die Entwicklung der Lebensmitteltechnologie führt zu einem immer größer
I Einleitung
3
werdenden Angebot von Nahrungsmitteln, besonders sogenanntem „ready-to-eat
food“. Diese Produkte werden oft als Tiefkühlware über längere Zeiträume gelagert
und können zur Verbreitung kälteadaptierter pathogener Keime beitragen (Rocourt et
al. 2003b). Moderne Vermarktungsstrategien und globaler Lebensmittelhandel
erhöhen das Risiko, dass durch zentralisierte Herstellung und Bearbeitung der
Nahrungsmittel und verlängerte Transportwege und -zeiten bei einer Kontamination
eine Vielzahl von Menschen weltweit betroffen sein können, wobei die Vielfalt
möglicher Krankheitserreger für jeden Einzelnen zunimmt (Rocourt et al. 2003a). In
den USA handelt es sich bei dem Angebot an frischem Obst und Gemüse, welches
in Lebensmittelgeschäften und Restaurants erhältlich ist, bereits zu über 75 % um
importierte Ware aus aller Welt (Hedberg et al. 1994).
Ständig wachsender weltweiter Tourismus führt ebenso zu einer Globalisierung
lebensmittelbedingter Erkrankungen. Nach einer Studie der WHO sind 80 % bis 90 %
der gemeldeten Salmonellosen in skandinavischen Ländern auf internationalen
Tourismus zurückzuführen, und die Wahrscheinlichkeit, auf Reisen mit einer
Lebensmittelinfektion konfrontiert zu werden, liegt, je nach Reiseziel, bei 20 % bis 50
% (Käferstein et al. 1997). Auch demographische Veränderugen – eine immer älter
werdende Bevölkerung und mehr immungeschwächte Personen – führten dazu, dass
die Zahl lebensmittelbedingter Infektionskrankheiten in den letzten zwei Jahrzehnten
deutlich angestiegen ist (Ammon 2005).
Die Vielfalt von Risikolebensmitteln, die als Überträger für Krankheitskeime dienen
können, ist auffallend groß. Mikrobiologisch kontaminierte Lebensmittel, die einem
WHO-Bericht zufolge im Jahr 2000 in den USA zu 1493 Krankheitsausbrüchen
führten (Rocourt et al. 2003a), sind in Abbildung 1.1 dargestellt. In 773 der
Ausbrüche konnten die betroffenen Lebensmittel ermittelt werden. 101 Ausbrüche
(etwa 13 % der Fälle, in denen das Lebensmittel bekannt war) wurden durch den
Verzehr von Fleisch und Fleischprodukten ausgelöst. 81 Ausbrüche wurden durch
kontaminiertes Geflügel, 79 Ausbrüche durch Fisch und Meeresfrüchte (jeweils rund
10 %) und 64 Ausbrüche durch Obst und Gemüse (circa 8 %) ausgelöst. In 13 Fällen
(etwa 2 %) waren Getreide oder Teigwaren beziehungsweise Süßwaren
kontaminiert. In 12 (rund 2 % der Ausbrüche mit bekannter Kontaminationsquelle)
der Fälle war der Konsum von Ei und Eiprodukten oder von Milch und
Milchprodukten Ursache für Erkrankungen. Die übrigen kontaminierten Lebensmittel
dieser Studie waren in 183 Fällen der Krankheitsausbrüche Mischgerichte (etwa 23
%), 157 mal zusammengesetzte Lebensmittel (rund 20 %) und 58 mal sonstige
Lebensmittel (etwa 8 %).
I Einleitung
4
Mikrobiologisch kontaminierte Lebensmittel,
die zu Krankheitsausbrüchen führten
Obst und Gemüse
8%
Ei und Eiprodukte
2%
Milch und
Milchprodukte
2%
Süßwaren
2%
Fleisch und
Fleischprodukte
13%
Getreide, Teigwaren
2%
Zusammengesetzte
Lebensmittel
20%
Sonstige Lebensmittel
8%
Fisch und
Meeresfrüchte
10%
Geflügel
10%
Mischgerichte
23%
Abb. 1.1: Prozentuale Verteilung der bekannten mit Mikroorganismen
kontaminierten Lebensmittel, deren Verzehr im Jahr 2000 zu
Ausbrüchen von Infektionskrankheiten in den Vereinigten Staaten von
Amerika führten (nach Rocourt et al. 2003a)
Häufigstes Krankheitsbild lebensmittelassoziierter Erkrankungen sind
Gastroenteritiden. Der Krankheitsverlauf dieser Magen-Darm-Infektionen reicht von
geringer Gesundheitsbeeinträchtigung ohne Notwendigkeit ärztlicher Behandlung
über Erkrankungen mit stationärer Behandlung bis hin zu schwerer systemischer
Infektion und Todesfällen. Das Ausmaß der Erkrankung hängt von einer Reihe
Faktoren wie gesundheitlicher Konstitution, Ernährung und Lebensalter ab.
Infolgedessen sind Auftreten, Schwere der Erkrankung und Sterblichkeitsrate durch
Lebensmittelinfektionen in unterschiedlichen Bevölkerungsgruppen verschieden stark
vertreten. Besonders gefährdet und damit wesentlich häufiger betroffen sind Kinder,
Schwangere, Immungeschwächte und ältere Menschen (Levine et al. 1991). Zum
Personenkreis dieser Risikogruppe zählten in den 1990er Jahren bereits 20 % der
Menschen in den USA, wobei die Tendenz deutlich steigend ist (Gerba et al. 1996,
Rocourt et al. 2003a). Mishu et al. (1994) führten in den USA eine Erhebung zu
Krankheitsausbrüchen durch lebensmittelbedingte Infektionen mit dem Serovar
Salmonella Enteritidis in den Jahren 1985 – 1991 durch. Dabei kamen sie zu dem
Ergebnis, dass die Rate der Todesfälle in Altenheimen und Krankenhäusern 70fach
höher liegt als in anderen Einrichtungen.
I Einleitung
5
1.2 Enterobacteriaceae als Ursachen für Lebensmittel-
infektionen
Typische Keime bakterieller Lebensmittelinfektionen sind neben Campylobacter,
Listeria und Vibrio häufig Vertreter der Familie Enterobacteriaceae. Salmonellosen,
ausgelöst durch die Enterobacteriaceen-Gattung Salmonella, gehören zu den
weltweit häufigsten lebensmittelassoziierten Infektionen und führen jährlich zu
mehreren Millionen gemeldeten Erkrankungen und tausenden Todesfällen
(Anonymus 2005a).
Die Bakterien der Familie Enterobacteriaceae (Rahn 1937) mit der Typspezies
Escherichia coli gehören zur γ-Subklasse der Proteobacteria und umfassen mehr als
200 Spezies in 46 Gattungen. Sie sind gramnegative, nicht sporulierende Stäbchen
mit einer Länge von 1,0 bis 6,0 µm und einem Durchmesser von 0,3 bis 1,5 µm.
Enterobacteriaceen sind fakultativ anaerob, Oxidase-negativ, fermentieren Glucose
und reduzieren Nitrat zu Nitrit (Brenner 1984). Die Fähigkeit, Laktose zu vergären,
differenziert Coliforme, wie zum Beispiel Vertreter der Gattungen Escherichia,
Klebsiella, Enterobacter, und Citrobacter von solchen Enterobacteriaceen, die keine
Laktose umsetzen, wie Shigella, Proteus und fast alle Salmonellen.
Molekularbiologisch wird auch Plesiomonas shigelloides trotz Oxidase-Aktivität
aufgrund genetischer Verwandtschaft zu den Enterobacteriaceae gezählt (Ruimy et
al. 1994).
Enterobacteriaceen kommen weit verbreitet vor, als Kommensale oder
Krankheitserreger im Darm (griechisch enteron: Eingeweide) von Tieren, vom Insekt
bis zum Menschen, sowie ubiquitär in der Umwelt, auf Pflanzen, im Wasser und im
Boden. Als fakultativ anaerobe Eubakterien tolerieren sie für ihr Wachstum sowohl
positive als auch negative Redoxpotentiale und sind damit äußerst anpassungsfähig.
Diverse Stämme sind humanpathogen, phytopathogen oder haben als Saprobionten
beim Verderb von Lebensmitteln eine wichtige Bedeutung. Häufig treten sie als
opportunistische Krankheitskeime auf, für etwa 50 % der nosokomialen Infektionen in
den USA sind Enterobacteriaceen verantwortlich (Paradis et al. 2005). In diversen
Lebensmitteln wie Fleisch, Geflügel, Eiprodukte, Gemüse, Getreide, Kräuter,
Milchprodukte und Süßwaren wurden Enterobacteriaceae nachgewiesen.
Als Kontaminant in Trockenmilch-Säuglingsnahrung ist insbesondere das
Vorkommen der Enterobacteriaceae-Spezies Enterobacter sakazakii - erstmalig als
neue Spezies definiert von Farmer et al. (1980) - von großer Bedeutung im Rahmen
lebensmittelübertragener Erkrankungen und hat in den vergangenen Jahren für viel
Aufsehen gesorgt (Anonymus 2002c, Bowen und Braden 2006). Während Ent.
sakazakii grundsätzlich in den unterschiedlichsten Lebensmittelgruppen
I Einleitung
6
nachgewiesen wurde, trat der Keim ausschließlich in pulverförmiger Kindernahrung
in Verbindung mit Krankheitsausbrüchen auf (Anonymus 2005c). Bei Säuglingen
führen Infektionen mit Ent. sakazakii zu neonatalen Meningitiden, Septikämien und
nekrotisierenden Enterocolitis-Erkrankungen mit extrem hohen Mortalitätsraten von
40 – 80 %. Das Auftreten der Erkrankungen wurde bereits in zahlreichen Ländern
wie England, den Niederlanden, Griechenland, Kanada und den USA beschrieben
(Nazarowec-White und Farber 1997). Selbst geringste Mengen von Enterobacter
sakazakii in sprühgetrockneter Säuglingsnahrung bedeuten eine Gefährdung der
Gesundheit, da sie sich während der Speisenzubereitung und Aufbewahrung der
rehydrierten Nahrung rapide vermehren können (Forsythe 2005, Kandhai et al.
2006). Bisher gibt es zwar keine gesicherten epidemiologischen Untersuchungen
über die minimale infektiöse Dosis (Lehner und Stephan 2004), aufgrund einer
Risikobewertung durch Welternährungsorganisation und Weltgesundheits-
organisation (FAO/WHO) kann aber davon ausgegangen werden, dass es bei einem
Gehalt von 1 KbE/g Trockenprodukt nach Zubereitung der Kindernahrung zur
Erkrankung kommen kann (Anonymus 2004a).
Die Detektion von Enterobacteriaceen in Lebensmitteln spielt als Indikator für
gesundheitsgefährdende Hygienemängel eine wichtige Rolle. In Tabelle 1.1 sind die
häufigsten Vertreter lebensmitelassoziierter Gattungen und Spezies sowie deren
häufiges Vorkommen und Bedeutung aufgeführt. Die weltweit bedeutendsten, für
Lebensmittelinfektionen verantwortlichen Enterobacteriaceae sind Salmonellen und
werden im Folgenden ausführlicher behandelt.
I Einleitung
7
Tab. 1.1: Häufig vorkommende, lebensmittelübertragene Gattungen und Spezies
der Familie Enterobacteriaceae sowie Beispiele für deren Vorkommen
und Bedeutung (nach Baumgart 2006, Müller und Weber 1996)
Gattung Spezies Vorkommen und Bedeutung
Citrobacter C. amalonaticus, C.
freundii, C. koseri
Darm; Durchfall (Verotoxinbildung) durch einige C.
freundii-Stämme
Edwardsiella Ed. tarda Darm; Durchfall durch Ed. tarda
Enterobacter Ent. aerogenes, Ent.
cloacae, Ent. sakazakii
Pflanzen, Darm, Wasser, Boden; Verderb von
Lebensmitteln, Ent. sakazakii in Milchpulvernahrung für
Säuglinge (Mortalitätsraten 40 - 80 %) sowie in Käse,
Fleisch, Gemüse, Getreide, Kräutern, Gewürzen und
erhitzter Milch
Erwinia Er. amylovora, Er.
carotovora
Pflanzen; Verderb pflanzlicher Lebensmittel durch
Pektinasen, phytopatogen (Blockade des Wasser-
leitungssystems)
Escherichia E. coli, E. hermanii, E.
vulneris
Darm; Durchfall, Kontamination und Verderb diverser
Lebensmittel, E. coli fakultativ pathogen, Hygieneindikator,
Pathovare enterovirulenter E. coli : enterohämorrhagische
E. coli (EHEC), Enterotoxin bildende E. coli (ETEC),
enteroinvasive E. coli (EIEC), enteropathogene E. coli
(EPEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), diffus
adhärente E. coli (DAEC)
Hafnia H. alvei Darm, Boden, Wasser; Verderb eiweißreicher
Lebensmittel, Histaminbildung bei Fischen, fakultativ
pathogen bei Immunsupprimierten
Klebsiella K. pneumoniae, K.
oxytoca
Darm, Wasser, Boden, Luft; Verderb von Lebensmitteln,
K. pneumoniae ist pathogen
Morganella M. morganii Darm, Wasser, Boden; Verderb eiweißreicher
Lebensmittel
Pantoea Pa. agglomerans, Pa.
dispersa
Weit verbreitet in der Natur; Pa. agglomerans vermehrt
sich bei 4 °C und führt zum Verderb von Frischfleisch
Plesiomonas P. shigelloides Geflügel, Wasser, nachgewiesen in Muscheln, Fisch, Kot
von Rind, Geflügel, Schwein, Schaf; Durchfall
Proteus Prot. mirabilis, Prot.
vulgaris
Darm, Wasser, Boden; Verderb eiweißreicher
Lebensmitttel (Bildung von Ammoniak und Ketosäuren
durch oxidative Desaminierung von Aminosäuren)
Providencia Prov. alcalifaciens, Prov.
stuartii
Darm, Wasser, Boden; Verderb eiweißreicher
Lebensmittel; Durchfall
Salmonella S. enterica Darm, Lebensmittel tierischen Ursprungs, über
Verunreinigungen auch pflanzliche Lebensmittel und
Futtermittel; pathogen, Infektionskrankheiten, Durchfall
Serratia Se. marcescens, Se.
liquefaciens
Darm, Pflanzen, Insekten, Boden; Verderb tierischer
Lebensmittel
Shigella Sh. boydii, Sh.
dysenteriae, Sh. flexneri,
Sh. sonnei
Darm, Lebensmittel, Wasser; pathogen, Durchfall (Ruhr)
Yersinia Y. enterocolitica, Y.
pseudotuberculosis
Darm, Wasser, Schweinefleisch, Milchprodukte; Y.
pseudotuberculosis und bestimmte Serovare von Y.
enterocolitica sind Erreger intestinaler Yersiniosen des
Menschen
I Einleitung
8
1.2.1 Häufigster Vertreter lebensmittelassoziierter Entero-
bacteriaceae: Salmonella
Salmonellen, benannt nach dem amerikanischen Bakteriologen Daniel Elmer
Salmon, sind 0,7 bis 1,5 µm mal 2,0 bis 5,0 µm große Stäbchenbakterien. Mit
Ausnahme von Salmonella Gallinarum und Salmonella Pullorum sind sie peritrich
begeißelt und beweglich. Sie bilden Säure und Gas aus Glucose, Mannit und
Maltose und sind, abgesehen von den Subspezies arizonae und diarizonae, Laktose
negativ. Gewöhnlich bilden sie Schwefelwasserstoff aus Thiosulfat und assimilieren
Citrat (Brenner 1984).
Das Genus Salmonella gliedert sich in zwei Arten, die Typspezies S. enterica und die
Spezies S. bongori und in sechs Unterarten der Spezies S. enterica. Zur Zeit sind
2541 Serovare der Gattung benannt, von denen 1504 zur Subspezies S. enterica
ssp. enterica gehören (Le Minor und Popoff 1987, Popoff et al. 2004). Eine Übersicht
ist in Tabelle 1.2 gegeben. Die antigenischen Bezeichnungen der Salmonella-
Serotypen werden durch das WHO Collaborating Centre for Reference and
Research on Salmonella am Pasteur Institut in Paris festgelegt und regelmäßig
aktualisiert. Neue Serovare werden in den Updates des Kauffmann-White-Schemas
aufgeführt (Brenner et al. 2000).
Tab. 1.2: Taxonomische Einteilung der Gattung Salmonella in Spezies und
Subspezies sowie Anzahl der Serovare im Jahr 2002 (Popoff et al.
2004, Tindall et al. 2005)
Die korrekte Bezeichnung von, zum Beispiel, dem Serovar typhimurium müsste
Salmonella enterica ssp. enterica Serovar typhimurium heißen. Um derartige Namen
in der Praxis zu vereinfachen, werden die Stämme der Subspezies enterica nach Le
Minor und Popoff (1987) mit großem Anfangsbuchstaben und nicht kursiv
geschrieben. Die Bezeichnung lautet also Salmonella Typhimurium. Die Stämme der
Taxon Bezeichnung Anzahl Serovare
Genus Salmonella 2541
Spezies S. enterica 2519
Subspezies S. enterica ssp. enterica 1504
S. enterica ssp. salamae 502
S. enterica ssp. arizonae 95
S. enterica ssp. diarizonae 333
S. enterica ssp. houtenae 72
S. enterica ssp. indica 13
Spezies S. bongori 22
I Einleitung
9
übrigen fünf Subspezies und die der Spezies S. bongori werden mit der
Kurzbezeichnung und der Antigenformel benannt, zum Beispiel Salmonella IIIb
53:r:z23 (Bockemühl und Seeliger 1985). Die Angabe 53 kennzeichnet das
somatische O-Antigen aus Lipopolysacchariden der Zellwand, die Bezeichnung r und
z zwei Phasen des Geißelantigens H. Beide Antigene werden durch Objektträger-
Agglutination mittels käuflicher Antiseren nachgewiesen. Die Einteilung der Serovare
erfolgt nach dem Antigenschema von Kauffmann-White. Mit Bezug auf Pathogenese,
klinischem Erscheinungsbild und Epidemiologie werden Salmonellen in die typhösen
und die enteritischen Salmonellen unterteilt. Die Serovare Typhi, Erreger des
Typhus, und Paratyphi A, B, C, Erreger des Paratyphus sind die typhösen
Salmonellen. Alle übrigen Serovare gehören zu den enteritischen Salmonellen und
verursachen beim Menschen meist Enteritiden. Alle Salmonellen gelten als
pathogen, in den Industerieländern treten die Enteritis-Salmonellen besonders häufig
auf.
1.2.1.1 Enteritis-Salmonellose
Die Salmonellose ist die häufigste und am weitesten verbreitete durch Lebensmittel
übertragene Infektionskrankheit. In den USA erkranken jährlich etwa 1,4 Millionen
Menschen an einer Enteritis-Salmonellose und rund 400 Erkrankte sterben an den
Folgen (Voetsch et al. 2004). Im Jahr 1995 waren es in England und Wales 102.227
Einwohner, die an einer Infektion mit Enteritis-Salmonellen erkrankten, 3.412 von
ihnen mussten im Krankenhaus behandelt werden und 268 der Betroffenen starben
an der Erkrankung (Adak et al. 2002). Für Kalifornien erfassten Trevejo et al. (2003)
in einer epidemiologischen Studie über einen Zeitraum von zehn Jahren
Erkrankungen, Sterberaten und Hospitalkosten, die durch Infektionen mit Enteritis-
Salmonellen verursacht wurden. Die ermittelten Kosten für Salmonellose-
Behandlungen im Krankenhaus lagen in den Jahren 1990 bis 1999 bei rund 200
Millionen Dollar.
Erregerreservoir dieser Zoonose ist vorwiegend der Darmtrakt zahlreicher Tiere wie
Schweine, Rinder, Kälber, Geflügel, Wild, Tauben, Möwen, Muscheln, Fische, Nager
und Insekten. Die Salmonella-Übertragung vom Tier auf den Menschen erfolgt
überwiegend durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln tierischen
Ursprungs, wobei die Tiere in den seltensten Fällen klinisch erkrankt sind. Besonders
häufig betroffen sind Geflügel – Huhn, Ente, Gans und Pute – , rohe Eier und
Roheispeisen – Eischäume, Cremes, Mayonnaise und Speiseeis – , rohes Fleisch
und nicht oder nicht ausreichend erhitzte Fleischprodukte – Hackfleisch, Rohwurst
und Fleischsalate – sowie nicht pasteurisiete Milch (Anonymus 2002b). Neben
tierischen Produkten können durch Einsatz natürlicher Dünger oder
I Einleitung
10
Verunreinigungen auch pflanzliche Lebensmittel und Futtermittel Salmonellen
enthalten. So waren beispielsweise der Verzehr von Tomaten (Hedberg et al. 1999),
Sprossen (Van Beneden et al. 1999, Mohle-Boetani et al. 2002), nicht sachgemäß
zubereitetem Kräutertee (Koch et al. 2005) und Schokolade (Werber et al. 2005)
Augangspunkt von Salmonella-Infektionen. Direkte Mensch-zu-Mensch-
Übertragungen spielen bei Enteritis-Salmonellosen nur eine sehr untergeordnete
Rolle.
Nach einer Infektion des Menschen mit enteritischen Salmonellen beträgt die
Inkubationszeit, abhängig von der Infektionsdosis, meist 12 - 36 Stunden, mitunter
aber auch 5 - 72 Stunden. Es kommt zu Gastroenteritiden mit wässrigem, teilweise
blutigem Durchfall, Leibschmerzen, Übelkeit, Erbrechen und Kopfschmerzen, zum
Teil auch mit Fieber. Die Symptome dauern in der Regel wenige Stunden oder Tage,
oft kommt ein leichter oder symptomloser Verlauf vor. Bei schweren klinischen Fällen
treten Schüttelfrost, höheres Fieber, Kollaps und weitere systemische
Krankheitsbilder auf. Die Keimausscheidung enteritischer Salmonellen dauert drei bis
sechs Wochen, bei Säuglingen aber auch mehrere Monate (Anonymus 2002b).
Während des gastroenteritischen Infektionsverlaufs überwinden die Salmonellen die
Infektabwehr und gelangen über den Magen in den Darm. Dabei müssen sie
gegenüber der Magensäure mit pH-Werten von 1,0 – 4,0 bestehen. So kann zum
Beispiel S. Typhimurium mit der Synthese von Säureschockproteinen und Induktion
von Protonenpumpenaktivität auf den Säurestress reagieren und ist damit in der
Lage, in extrem saurem Milieu zu überleben (Foster und Hall 1991, Hall und Foster
1996). Im Verlauf der Pathogenese bewirken von Salmonella kodierte Faktoren wie
SEP14, SEF17 und SEF21 als Adhäsine die Anhaftung der Bakterien an die
Epithelzellen des Dünndarms. Somit verhindern sie ihr Ausscheiden durch die
Darmperistaltik und können sich lokal vermehren. Nach dieser Kolonisation dringen
sie über Invasine in die Zellen ein und es kommt zur Bildung von Toxinen.
Thermolabile Exotoxine, die zum unkontrollierten Wasser- und Elektrolytverlust
führen, wurden als Enterotoxin Stn und zotlike (zonula occludens toxin) Toxine
beschrieben. Letztere kommen in allen Enteritis-Salmonellen vor und führen zum
Abbau der „tight junctions“, die für den kontrollierten Stofftransport durch die
Epithelzellen verantwortlich sind (D’Aoust 1991, Tschäpe und Prager 1995). Neben
den Exotoxinen, die bereits während des Lebenszyklus der Salmonellen sekretiert
werden können, wirken auch thermostabile Endotoxine, die nicht kontinuierlich in das
umgebende Medium abgegeben werden. Diese Lipopolysaccharide (LPS) sind
Bestandteil der äußeren Membran der Zellwand gramnegativer Bakterien, also auch
aller anderen Enterobacteriaceen. Sie werden im Allgemeinen erst durch Autolyse
oder artifizielle Zerstörung der Zellen als Zerfallsprodukte freigesetzt. LPS bestehen
aus drei Komponenten, einem Polysaccharid (O-Antigen), einem Core-
I Einleitung
11
Oligosaccharid und einem Lipid. Die Lipid-Komponenete, bezeichnet als Lipid A, löst
die Bildung von Proteinen wie Tumor-Nekrose-Faktor (TNF-α) und Interleukin-1 (IL-
1ß) aus und ist für die Entstehung von Entzündungen und Toxinogenität
verantwortlich (Rietschel et al. 1994, Reynolds et al. 2006). Durch die ausgelösten
Durchfallerkrankungen kommt es in der Regel zum Ausscheiden der enteritischen
Salmonellen.
Die Salmonellose tritt in Form von sporadischen Fällen, Familienerkrankungen oder
als Epidemien auf und ist die nach dem Infektionsschutzgesetz (IfSG) am häufigsten
in Deutschland gemeldete, durch Lebensmittel übertragene Krankheit des Menschen
(Jansen et al. 2005). Nach IfSG §7 ist jeder Nachweis von Salmonellen unverzüglich,
innerhalb von 24 Stunden, durch das Labor, welches den Nachweis erbracht hat,
dem zuständigen Gesundheitsamt zu melden.
Nach einem massiven Anstieg registrierter Fälle im Jahr 1992 ist die Salmonellose
seit 1993 rückläufig. Im Jahr 2004 kam es in Deutschland aber immer noch zu
56.947 Errkankungen mit 52 Todesfällen. Unter den Verstorbenen befanden sich ein
einjähriges und ein zweijähriges Kind sowie eine 41-jährige Frau, acht Personen
zwischen 60 und 69 Jahren und 41 Personen im Alter von mindestens 70 Jahren.
(Anonymus 2005b). Darüber hinaus ist von einer beträchtlichen Dunkelziffer an
Salmonellosen auszugehen, da wegen der oft nur kurzen, leichten und
selbstlimitierenden Symptomatik häufig weder ein Arzt hinzugezogen noch eine
Erregerdiagnostik eingeleitet wird (Anonymus 2003a). Somit bleibt die Salmonellose
weiterhin eine bedeutende lebensmittelassoziierte Infektionskrankheit. Abbildung 1.2
zeigt den quantitativen Verlauf registrierter Enteritis-Salmonellosen des Menschen in
Deutschland in den Jahren 1991 bis 2006 sowie den Anteil der häufigsten
krankheitsauslösenden Serovare. Die größte Bedeutung haben die Stämme der
Serovare Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium. Epidemiologische
Langzeitanalysen zeigen, dass europaweit seit Mitte der 1980er Jahre das Serovar
Enteritidis vorherrscht, nachdem in den Jahren zuvor S. Typhimurium als häufigster
Vertreter nachgewiesen wurde (Rodrigue et al. 1990). Im Rahmen einer
schwedischen Studie über Salmonellenerkrankungen und dadurch verursachte
Kosten in der Europäischen Union, ermittelten de Jong und Ekdahl (2006) innerhalb
des Erfassungsszeitraums von 1997 bis 2003 insgesamt 13.158 Patienten in
Schweden, die nach einer Europareise an einer Infektion mit Salmonella erkrankt
waren. Von diesen Personen waren 10.637 (81 %) an einer Infektion mit S.
Enteritidis und 1.203 (9 %) an einer Infektion mit S. Typhimurium erkrankt.
In Untersuchungen zur Toxinogenität von Salmonellen wurde gezeigt, dass in allen
Serovaren der Spezies S. enterica das Toxin-Gen stn im Genom lokalisiert ist,
tatsächlich exprimiert wird das Gen aber vor allem in den Serovaren S. Enteritidis
I Einleitung
12
und S. Typhimurium, was die auffällige Häufung dieser Serovare in der Diagnostik
erklären könnte (Prager et al. 1995). Nach Angaben des infektionsepidemiologischen
Jahrbuchs meldepflichtiger Krankheiten für 2004 (herausgegeben vom Robert Koch
Institut) wurden im Jahr 2004 in Deutschland für 91 % der übermittelten 56.947
Salmonellose-Fälle genaue Angaben zum Serovar gemacht. In 67 % der Fälle
handelte es sich um S. Enteritidis, in 21 % um S. Typhimurium (Anonymus 2005b).
Salmonellosen in Deutschland
1991 - 2006
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
ProzentualerAnteilder
Salmonella-Isolate(%)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
ErkrankungeninTausend(x103
)
S. Enteritidis in Prozent
S. Typhimurium in Prozent
Erkrankungen in Tausend
Abb. 1.2: An das Robert Koch Institut in Berlin übermittelte Fälle von Enteritis-
Salmonellosen in Deutschland in den Jahren 1991 bis 2006 (Quelle:
Robert-Koch-Institut)
Die optimale Wachstumstemperatur von Salmonellen beträgt 37 °C, es kann aber
auch bei niedrigen Temperaturen bis 2 °C und höheren Temperaturen bis 54 °C zur
Vermehrung kommen. Die minimale infektiöse Dosis von Salmonella für den
erwachsenen Menschen liegt im Regelfall bei 104
bis 106
Kolonie bildenden
Einheiten (KbE), bei besonderer Disposition wie Abwehrschwäche auch darunter.
Handelte es sich bei den kontaminierten Lebensmitteln aber um stark fetthaltige wie
Käse, Salami oder Schokolade oder um Gewürze, kam es bereits bei
Infektionsdosen unter 50 Keimen zu Erkrankungen (Blaser und Newman 1982,
Lehmacher et al. 1995). Seit den 1960er Jahren ist weltweit immer wieder von
Salmonellenerkrankungen durch den Verzehr von Schokoladenprodukten berichtet
worden, wobei außerordentlich niedrige Keimzahlen ausreichten, um eine
Erkrankung auzulösen (Anonymus 2001).
I Einleitung
13
Im Zeitraum Oktober 2001 bis März 2002 kam es zu einem internationalen
Krankheitsausbruch durch Infektion mit dem Serovar Salmonella Oranienburg, der
auf eine Kontamination deutscher Schokolade zurückzuführen war. Neben
Deutschland waren zeitgleich Schweden, die Niederlande, Finnland, Dänemark,
Belgien, Österreich sowie Kanada durch Erkrankungen betroffen. Nachdem durch
das Bundesinstitut für Risikobewertung am 18. Dezember 2001 in den Resten von
Schokolade, die ein Erkrankter gegessen hatte, S. Oranienburg nachgewiesen war,
wurde öffentlich vor dem Verzehr gewarnt. In einer Rückrufaktion in Europa und
Kanada wurden Schokoladen und später auch weitere Produkte des Herstellers vom
Markt genommen. Sowohl in Kanada als auch in Finnland und Schweden wurden
Proben zurückgezogener Schokolade positiv auf S. Oranienburg getestet. Die
nachgewiesene Kontaminationsmenge der Schokolade lag zwischen 1,1 und 2,8
KbE/g. Diese niedrige krankheitsauslösende Dosis wird darauf zurückgeführt, dass
die Bakterien in der fettreichen Schokolade sehr gut gegen Magensäure geschützt
sind und größtenteils noch lebend in den Darm gelangen, um dort eine Infektion
auszulösen. Bedingt durch niedrigen Wassergehalt und hohe Zuckerkonzentrationen
in der Schokolade weisen sie außerdem eine hohe Hitzeresistenz auf und können in
dem Vehikel bis zu mehrere Jahre überleben. Maßnahmen zur Keimreduktion wie
Rösten der Kakobohnen oder Hitzebehandlung der Kakaomasse mit Wasserdampf
führen nicht zur sicheren Abtötung der Salmonellen. Als Ursache für die
Kontamination der Schokolade konnte keine Quelle ermittelt werden. In erster Linie
werden bei dem Befall von Schokoladenprodukten kontaminierte Kakaobohnen oder
Milchpulver, je nach Rezeptur aber auch andere Zutaten wie kontaminierte
Kokosnüsse und Gewürze angenommen. Dies ist der bisher größte erfasste
lebensmittelbedingte Krankheitsausbruch durch kontaminierte Schokolade. Allein in
Deutschland erkrankten insgesamt 439 Menschen, von denen 29 % in einem
Krankenhaus behandelt werden mussten. 21 % der Betroffenen litten nach eigenen
Angaben an blutigen Durchfällen (Werber et al. 2005).
Das internationale Ausmaß dieses Ausbruchs macht deutlich, wie leicht durch
globalen Nahrungsmittelhandel Menschen weltweit von lebensmittelbedingten
bakteriellen Infektionen gleichen Ursprungs betroffen werden können. Angesichts
des bestehenden Risikos ist eine lückenlose Kontrolle der kritischen Prozessstufen
seitens der lebensmittelproduzierenden Betriebe von entscheidender Bedeutung.
Besonders häufig sind die Produktionsstätten selbst der Ort der
Lebensmittelkontamination. In einem Überwachungsprogramm der WHO zur
Kontrolle lebensmittelbedingter Infektionen wurden die Bereiche, in denen es zu
einer Kontamination kam, erfasst. Im Jahr 2000 waren es in Deutschland in 87 %
der Fälle die lebensmittelproduzierenden Betriebe (Anonymus 2003b). Die Detektion
von Kontaminationen mit Salmonellen erfolgt in der Regel als Nachweis ihrer
I Einleitung
14
Anwesenheit beziehungsweise Abwesenheit. Eine Keimzahlbestimmung entfällt, da
alle Salmonellen als pathogen gelten (Baumgart 2006).
1.3 Enterobacteriaceae als Markerorganismen
Markerorganismen sind nachweisbare Mikroorganismen, die Hinweise auf
gesundheitsgefährdende Kontaminationen geben können. Ihr Nachweis in
Lebensmitteln ist ein wichtiges Werkzeug für die Qualitätskontrolle. Mossel (1982)
definiert Markerorganismen als Index- und Indikatororganismen. Eine
Unterscheidung, die nicht immer auf Zustimmung stößt. Demnach weisen
Indexorganismen auf potenzielle Gesundheitsgefährdung durch Anwesenheit
spezifischer Krankheitserreger hin. Indikatororganismen weisen Mängel in
Prozessabläufen, wie beispielsweise unzureichende Desinfektion, nach. Dabei
können die gleichen Markerorganismen je nach Art der Produkte einerseits
Indexorganismen, andererseits Indikatororganismen und auch beides zugleich sein.
Stadhouders et al. (1982) sind der Ansicht, dass eine Unterscheidung zwischen
Index- und Indikatororganismen unzweckmäßig und in vielen Lebensmitteln gar nicht
möglich ist. Am Beispiel von sprühgetrocknetem Milchpulver zeigen sie, dass
hygienische Sicherheit am besten durch ständige Prüfungen der kritischen
Prozessstufen, in denen Kontaminationen erfolgen können, erreichbar ist.
Als Markerorganismen besonders geeignet sind Darmbakterien, da sie auf fäkale
Verunreinigungen hinweisen. Der Nachweis von Escherichia coli als Marker für
fäkale Kontaminationen von Trinkwasser wurde bereits vor rund 100 Jahren
eingeführt und wird bis heute angewandt. In den 1920er Jahren wurde er durch den
Nachweis von Coliformen ergänzt und bald darauf auch in Milch, zum Beispiel zur
Kontrolle auf ausreichende Behandlung durch Pasteurisation, und anderen
Lebensmitteln durchgeführt. Der Nachweis von Coliformen bei verarbeiteten
Produkten erwies sich als geeigneter Hinweis auf Rekontaminationen und
unzureichende Verarbeitungs-, Betriebs- und Distributionshygiene. Seit den 1950er
Jahren wird der Nachweis der gesamten Enterobacteriaceae-Familie in der
Lebensmittelkontrolle und Überprüfung von Produktionsabläufen oft bevorzugt, weil
er mehr signifikante Lebensmittelkeime detektiert (Mossel und Struijk 1995). Neben
Laktose positiven Coliformen werden auch Laktose negative pathogene Keime wie
Stämme der Gattungen Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Proteus, Yersinia, Hafnia
sowie Stämme von Escherichia coli, die sehr langsam Laktose fermentieren, erfasst.
Da Coliforme weniger resistent gegenüber Behandlungsverfahren von Lebensmitteln,
zum Beispiel Bestrahlung, milde Erhitzung, Gefrieren und Trocknen sind als einige
pathogene Enterobacteriaceen wie Salmonellen, ist der Nachweis der gesamten
Familie Enterobacteriaceae besser geeignet als der Coliformen-Nachweis (Mossel et
I Einleitung
15
al. 1979). Auch Rekontaminationen von Lebensmitteln erfolgen außer durch
Coliforme auch durch andere Enterobacteriaceen wie Spezies der Gattung Serratia,
die oftmals bei dem Verderb von Fleisch dominieren (Stiles und Ng 1980).
Häufig kommt es zur Rekontamination durch Verschleppung von Keimen im
Produktionsbereich. Diese können über ihre Anreicherung im Produkt oder
Nebenprodukt weitere Bereiche des Produktionsumfeldes wie Anlagenteile, Geräte,
Böden, Abwasser und Luft besiedeln. Werden derartige Keime nicht detektiert und
vollständig inaktiviert, stellen sie potenzielle Rekontaminationsherde dar. Die
ursprüngliche Kontamination mit Enterobacteriaceen kann durch fäkale
Verunreinigungen entstehen, wobei die Fäkalien von an Infektionskrankheiten
erkrankten Tieren oder Menschen oder Dauerausscheidern stammen können.
Direkte Kontamination kann durch Produktionsabläufe wie Schlachtung und
Zerlegung von Tierkörpern, Rohmilchgewinnung oder Aufschlagen von Schaleneiern,
aber auch bei ungenügender Personen- und Händehygiene durch das Personal
zustande kommen. Indirekte Kontamination erfolgt über Verarbeitungsgeräte wie
Metzgermesser und Fleischerhaken nach ursprünglich direkter fäkaler
Verunreinigung.
Für eine Vielzahl von Lebensmitteln ist der Nachweis von Kontaminationen mit den
artenreichen Enterobacteriaceen, vor allem im Hinblick auf deren Markerfunktion für
Gesundheitsgefährdung, besonders geeignet. Er hat in der Verarbeitungs- und
Betriebshygiene, idealerweise durchgeführt in Form von mehrfachen
Stufenkontrollen, einen essenziellen Stellenwert (Schmidt-Lorenz und Spillmann
1988).
I Einleitung
16
2 PRAKTISCHER TEIL
DETEKTION BAKTERIELLER KONTAMINATIONEN IN
LEBENSMITTELN
2.1 Mikrobiologischer Nachweis von Enterobacteriaceen
Klassische mikrobiologische Verfahren für die Identifizierung von Mikroorganismen in
Lebensmitteln werden in selektiven oder unselektiven Kulturen in flüssigem Medium
oder auf festen Nährböden durchgeführt. Sie kommen in sämtlichen
Lebensmittelbereichen zur Anwendung und basieren auf dem Nachweis
morphologischer und physiologischer Merkmale. Ist eine ausreichende Identifizierung
der kultivierten Keime nicht möglich, wird in der Regel die Anwendung biochemischer
Identifizierungssysteme angeschlossen.
Der qualitative mikrobiologische Nachweis von Enterobacteriaceen erfolgt gemäß der
analytischen Referenzmethode ISO 21528-1 in mehreren Schritten als unselektive
Voranreicherung und selektive Anreicherung in flüssigem Medium, selektive
Vereinzelung auf festen Nährböden und Auswertung der Agarplatten. Bei Bedarf
erfolgt eine biochemische Bestätigung beziehungsweise Ausdifferenzierung.
Der erste Schritt im qualitativen Nachweisverfahren, die Bebrütung der
Lebensmittelprobe in unselektivem Nährmedium, dient der Resuszitation
vorhandener Enterobacteriaceen vor der Überführung in Selektivmedien. Subletal
geschädigten Zellen soll die Möglichkeit der Revitalisierung gegeben werden, damit
auch diese im Nachweis erfasst werden können. Zu einer Schädigung der Bakterien
kann es durch Wasserverlust, Nährstoffmangel, Hitze, Kälte, Gefrieren, ionisierende
Strahlung, Chemikalien, Gefriertrocknung und osmotischen Stress kommen (Webb
1969, Colwell 2000). Derartige, nicht unmittelbar zum Zelltod führende
Beeinträchtigungen, äußern sich durch verlängerte lag-Phasen, Verlust von
Zellbestandteilen, insbesondere Nukleinsäuren, hohe Sensitivität gegenüber
Selektivmedien und erhöhten Nährstoffbedarf der Mikroorganismen. Es ist bekannt,
dass Enterobacteriaceen, die in getrockneten Lebensmitteln und Trockenfutter
nachgewiesen wurden, erhebliche Stoffwechselschäden aufwiesen (Sinskey und
Silverman 1970). Ihre Physiologie kann derartig beeinträchtigt sein, dass sie in
Selektivmedien ihre Proliferation komplett einstellen, während unbeschädigte
Bakterien gleicher Spezies die üblichen Inhibitoren im Medium problemlos tolerieren
(Alford und Knight 1969). Kommt es für subletal geschädigte Bakterienzellen wieder
I Einleitung
17
zu geeigneten Lebensbedingungen, können sie regenerieren und die Proliferation
wieder aufnehmen. So ist es für den qualitativen Markernachweis von
Enterobacteriaceae in Lebensmitteln, besonders in technologisch verarbeiteten,
wichtig, diesen Schritt der Resuszitation durchzuführen, bevor die Probe in für die
Bakteriengruppe selektives Nährmedium überführt wird. Nur bei mehrstündiger
nichtselektiver Vorbebrütung, üblicherweise durchgeführt in CASO-Bouillon oder
Pepton-Wasser, besteht die Möglichkeit, auch das Vorhandensein gestresster Zellen
zu detektieren (Mossel und Ratto 1970, Schmidt-Lorenz und Spillmann 1988).
Im nächsten Schritt erfolgt die selektive Anreicherung der Enterobacteriaceen aus
Lebensmitteln innerhalb von ein bis zwei Tagen in Mossel-Bouillon (Mossel et al.
1963, Mossel und Martin 1964), einem Medium entsprechend der Eiprodukte-
Verordnung (Anonymus 1975) und der European Pharmacopeia II. Durch
Brillantgrün und Ochsengalle in der Mossel-Bouillon wird die unerwünschte
Begleitflora weitgehend gehemmt, während das Wachstum aller Entreobacteriaceen
durch den Glucose-Gehalt begünstigt wird. Die starke Pufferung des Nährmediums
verhindert das Absinken des pH-Wertes und eine dadurch bedingte
Wachstumshemmung der Kultur.
Für die selektive Vereinzelung der Enterobacteriaceen im nächsten Schritt wird ein
Oberflächenausstrich auf Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Glucose-Agar (VRBD-Agar)
durchgeführt und mindestens einen Tag anaerob bebrütet. Agarplatten, auf denen
nach einem Tag keine Kolonien gewachsen sind, werden ein bis zwei weitere Tage
inkubiert, um die Abwesenheit von Enterobacteriaceae sicher zu stellen. Die
Bebrütung unter anaeroben Bedingungen ist für das Wachstum der fakultativ
anaeroben Enterobacteriaceen nicht notwendig, dient aber der Wachstumshemmung
obligat aerober Keime in der Begleitflora, wie zum Beispiel Pseudomonaden. Aus
dem ursprünglichen MacCONKEY-Agar (MacConkey 1905), einem Selektivmedium
zur Isolierung von Salmonellen, Shigellen und coliformen Bakterien, entwickelten
Mossel et al. (1962) VRBD-Agar für den Nachweis von Enterobacteriaceae. Sie
ersetzten zunächst, dem Vorschlag von Henriksen (1955) folgend, die Laktose im
MacCONKEY-Agar durch Mannitol, danach durch Glucose und schlugen für das
Medium die Bezeichnung MacCONKEY-Glucose-Agar vor. Im Gegensatz zu Laktose
und Mannitol wird Glucose von sämtlichen Enterobacteriaceen unter Säurebildung
abgebaut. Kristallviolett und Gallensalze im VRBD-Agar hemmen weitgehend die
Begleitflora. Säurebildung aus Glucose wird durch einen Farbumschlag der Kolonien
nach Rot, eventuelle Ausfällung von Gallensäuren durch Bildung eines hellen
Präzipitathofs um die positiven Kolonien angezeigt. Mit dieser Versuchsdurchführung
sind alle Bakterien der Familie Enterobacteriacaea erfassbar. Der Auslesenährboden
ist jedoch für sie nicht absolut spezifisch, da auch einige mitwachsende
Begleitkeime, wie Aeromonas spp., die gleiche Reaktion zeigen können.
I Einleitung
18
Ist eine ausreichende Identifizierung der Kolonien nicht möglich, müssen
entsprechende Keime biochemisch ausdifferenziert werden. Die Durchführung erfolgt
zum Beispiel unter Anwendung von API®
20E, einem System zur Enterobacteriaceae-
Diagnostik der Firma bioMérieux, oder auch mittels Cytochromoxidasetest.
Enterobacteriaceen sind Oxidase-negativ. Zur Überprüfung der Oxidaseaktivität
können Teststreifen mit Farbstoffindikator verwendet werden. Der Oxidasetest ist
unzuverlässig, wenn er direkt auf den VRBD-Platten oder direkt mit Material von
Kolonien, die auf VRBD-Agar gewachsen sind, durchgeführt wird. Die zu
untersuchende Kolonie sollte vor dem Test auf ein Universalnährmedium überimpft
und bebrütet werden (Baumgart 2006). Es sind kohlenhydratfreie Medien für die
Subkultivierung zu wählen, da der Oxidasetest auf kohlenhydrathaltigen Nährböden
wegen Säuerung des Mediums falsch negative Reaktionen zeigen kann (Amtliche
Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, Lebensmittel- und
Futtermittelgesetzbuch).
Der klassische mikrobiologische Nachweis von Enterobacteriaceae leistet nur eine
eingeschränkte Spezifität. Bedingt durch eine hohe Begleitflora kann auch die
Sensitivität des Verfahrens wesentlich verringert werden, wenn überwachsende
Begleitkeime das Wachstum der Enterobacteriaceen hemmen. In diesem Fall kann
es zu falsch negativen Ergebnissen in mikrobiologischen Untersuchungen kommen.
2.2 Molekularbiologischer Bakterien-Nachweis mittels PCR
Der mikrobiologische Nachweis von Bakterien und anderen Mikroorganismen in
Lebensmitteln basiert auf der Gesamtheit eines Organismus und seiner
physiologischen Merkmale. Neben diesem konventionellen phänotypischen
Nachweis wurden in den vergangenen Jahren vermehrt molekularbiologische
Methoden für den genotypischen Nachweis bakterieller Kontaminationen durch
Detektion spezifischer Nukleinsäuren entwickelt. Im Vergleich zu klassischen
Verfahren handelt es sich hierbei um schnellere Methoden, deren Durchführung
nicht vom Wachstumsstadium der Mikrorganismen oder Umwelteinflüssen abhängig
ist. Es werden auch molekularbiologische mit mikrobiologischen Methoden
kombiniert, indem vor der Detektion eine kulturelle Anreicherung erfolgt (Blackburn
1993, Olsen et al. 1995, Feng 1997). Neben der Anwendung im klinischen und
ökologischen Bereich wird ebenso im Lebensmittelsektor der Nachweis bakterieller
DNA- und RNA-Moleküle heute weit verbreitet durchgeführt.
Die Detektion diverser enterobakterieller Spezies erfolgt bereits über den Nachweis
ihrer DNA (Feng 2001). Als besonders geeignet werden häufig DNA-Sequenzen der
für ribosomale RNA kodierenden Gene bevorzugt, die universell und vielfach in der
I Einleitung
19
Zelle vorhanden sind (Ward et al. 1990, Wilson et al. 1990). Die hohe Spezifität und
Sensitivität dieser Nachweisverfahren sowie ein großes Potential zur
Automatisierbarkeit sind entscheidende Vorteile gegenüber herkömmlichen
Methoden, die innerhalb der letzten zwei Jahrzehnte eine intensive Forschung
vorangetrieben haben. Für den Nachweis von Bakterien in Lebensmitteln stehen
heute molekularbiologische Verfahren im Vordergrund (Mozola 2006, Seo et al.
2006).
Das sensitivste und am häufigsten eingesetzte Verfahren zur Detektion von
Nukleinsäuren ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Selbst geringste Mengen
vorhandener DNA-Moleküle werden mit dieser Methode durch wiederholte selektive
Vervielfältigung nachweisbar amplifiziert. Kornberg und seine Mitarbeiter entdeckten
1955 das zelluläre Enzym DNA-Polymerase als Katalysator der DNA-Replikation und
führten Versuche zur Synthese viraler DNA mittels DNA-Polymerase durch (Goulian
und Kornberg 1967, Mullis 1990). Anfang der 1970er Jahre postulierten Panet und
Khorana (1974) aufgrund ihrer Forschung zur DNA-Replikation die Möglichkeit, dass
sich dieser Prozess auch in mehreren Zyklen wiederholen ließe. Das Verfahren der
PCR als vielfache Amplifikation doppelsträngiger DNA in vitro mittels DNA-
Polymerase wurde schließlich 1983 von Mullis et al. (1986) begründet. Wesentlich
vereinfacht wurde die Durchführung der PCR, als man die aus Escherichia coli
isolierte DNA-Polymerase durch die thermostabile Taq Polymerase aus Thermus
aquaticus ersetzte (Saiki et al. 1988).
Das Prinzip der PCR basiert auf der enzymatischen Amplifikation eines DNA-
Bereichs, der von zwei Oligonukleotiden (Primer) flankiert wird, die jeweils am Ende
der zu amplifizierenden DNA-Sequenz komplementär binden. Die zyklisch
verlaufende Reaktion wird in einem so genannten Cycler durchgeführt und besteht in
der Regel aus drei Phasen mit unterschiedlichen Temperaturen. In der ersten Phase
werden die Wasserstoffbrückenbindungen der doppelsträngigen DNA durch
Temperaturerhöhung aufgebrochen, um sie in Einzelstränge zu trennen
(Denaturierung). In der nächsten Phase wird die Temperatur abgesenkt und es
kommt unter Bildung von Basenpaaren zur Hybridisierung der Primer an die
komplementären Sequenzen der DNA (Annealing). Eine stabile Bindung der Primer
ist Voraussetzung für die Initiation der Polymerisation. In der dritten Phase wird die
Temperatur wieder erhöht, unspezifisch angelagerte Primer werden denaturiert. Die
DNA-Polymerase katalysiert nun, ausgehend vom 3’-Ende der gebundenen Primer,
den selektiven Einbau freier Nukleotide aus dem Reaktionsansatz komplementär zur
DNA-Matrize (Elongation). Jedes neu synthetisierte DNA-Fragment dient dann als
Matrize für den nächsten PCR-Zyklus. Durch beliebiges Wiederholen dieses drei-
Phasen-Zyklus lässt sich mit jedem Durchgang die Anzahl der Zielmoleküle
verdoppeln, solange ausreichend Primer und Nukleotide für die DNA-Amplifikation
I Einleitung
20
zur Verfügung stehen. Nach 20 Zyklen entstehen auf diese Weise von einem
einzigen DNA-Doppelstrang theoretisch etwa eine Million Kopien. Damit können
durch Anwendung der PCR geringste Ausgangsmengen, bis hin zu nur einem
einzigen Molekül, vorhandener DNA detektiert werden.
Der Nachweis der entstandenen DNA-Amplifikate kann mit Durchführung einer
Gelelektrophorese erfolgen. Aufgrund ihrer negativ geladenen Phosphatgruppen
lässt sich DNA im Agarosegel durch Anlegen elektrischer Spannung ihrer Größe
nach auftrennen. Während der Elektrophorese wird neben den zu untersuchenden
Proben ein Molekulargewichtsstandard mitgeführt. Die Visualisierung der DNA erfolgt
mit interkalierenden Fluoreszenz-Farbstoffen wie Ethidiumbromid unter UV-Licht. Im
Vergleich mit den Banden des Standards oder einer parallel durchgeführten
konkurrierenden PCR (kompetitive PCR) mit bekannter DNA-Ausgangsmenge
werden Größe und Menge der in der PCR amplifizierten DNA abgeschätzt.
Eine bedeutende Weiterentwicklung dieser Anwendungen mit wesentlich reduziertem
Zeitaufwand ist die Durchführung einer Real-Time-PCR (Higuchi et al. 1992). Bei
diesem Verfahren finden Reaktion und Detektion der Amplifikate im selben
Reaktionsansatz statt. Während der Amplifikation binden unspezifische
fluoreszierende Farbstoffe wie SYBR®
Green I oder sequenzspezifische, mit
fluoreszierendem Farbstoff modifizierte Moleküle (Sonden) komplementärer Sequenz
an die DNA und werden gleichzeitig detektiert. Die entstehende DNA wird in Echtzeit
als in der Intensität steigendes Fluoreszenzsignal, in Relation zur Ausgangsmenge,
ermittelt und online dokumentiert.
Eine Möglichkeit zur spezifischen Detektion von Amplifikaten ist die Durchführung
der Real-Time-PCR mit HybProbes (Hybridisierungssonden) der Firma Roche.
HybProbes sind Oligonukleotide, die nebeneinander mit einem mittleren Bereich der
Template-DNA zwischen den Bindungsstellen der Primer hybridisieren. Sie tragen
an den benachbarten Enden zwei Fluorophore, die über Fluoreszenz Resonanz
Energietransfer (FRET) miteinander interagieren können. Dabei überträgt der
kurzwelligere Farbstoff Fluorescein, der mittels blauem Licht angeregt wird, seine
Energie strahlungslos an den langwelligeren Farbstoff LCRed. Dieser gibt nach
Anregung ein höher welliges rotes Licht ab, das detektiert wird. Das Signal kommt
also nur zustande, wenn beide Sonden in räumlicher Nähe binden. Die
Signalfluoreszenz ist proportional zur Menge der vorliegenden Zielsequenz. Die
Reaktion wird in einem LightCycler®
durchgeführt und mit entsprechender Software
zeitgleich dokumentiert. Der Eintritt der Amplifikation in die exponentielle Phase wird
als „Crossing Point“ dargestellt. Der Schmelzpunkt der Sonden lässt sich durch eine
Schmelzkurvenanalyse ermitteln, indem nach der PCR die Temperatur unter stetiger
Messung der Fluoreszenz erhöht wird. Mit steigender Temperatur nimmt die
I Einleitung
21
Fluoreszenz ab. Die gemessene Schmelztemperatur Tm ist der Wert, bei dem
gebundene und abgeschmolzene Hybridisierungssonden miteinander im
Gleichgewicht stehen. Differente Tm-Werte stehen demnach für unterschiedlich
starke Bindungen zwischen verschiedenen Amplifikaten und Sonden. Eine hohe
Sequenzübereinstimmung führt zu einer stabileren Bindung und damit zu einem
höheren Tm-Wert.
2.2.1 Aspekte der PCR
Die PCR ist eine hoch sensible Technik, deren Effizienz von diversen Faktoren
beeinflusst wird. Mögliche Ursachen für eine Inhibition der PCR wurden mit
unzureichender Zelllyse zur Extraktion der DNA, Degradieren der Nukleinsäuren
oder Blockieren der Polymerase-Aktivität beschrieben (Wilson 1997). Das
Zyklusprofil der PCR, die Reaktionskomponenten sowie deren Konzentration, die
Qualität der nachzuweisenden DNA, die Beschaffenheit der Probenmatrix und die
ausgewählten Primer sind entscheidene Faktoren für die Durchführung der Reaktion.
Alle Komponenten müssen jeweils für einen optimalen Ablauf der PCR angepasst
werden, um einen möglichst sensitiven und spezifischen Nachweis zu ermöglichen
(Rossen et al. 1992).
Eine stabile Bindung der Primer an die zu amplifizierende DNA ist Voraussetzung für
die Spezifität des Systems. Die Primersequenz sollte demnach eine hohe
komplementäre Übereinstimmung mit der Ziel-DNA aufweisen, um die
Wahrscheinlichkeit unspezifischer Bindung an anderen DNA-Abschnitten zu
verringern. Nicht spezifische Primer reduzieren, wenn sie in der PCR verlängert
werden, nicht nur die Anzahl der Primer, die für die Amplifikation der Ziel-DNA zur
Verfügung stehen, sondern begünstigen auch die Entstehung von Artefakten sowie
falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen (Kwok et al. 1990, Newton und
Graham 1994). Durch Erhöhung der Annealingtemperatur lässt sich die Stringenz
der PCR erhöhen und die Wahrscheinlichkeit der Entstehung von „primer-template
mismatches“ reduzierern (Bej et al. 1990).
Auch das Vorhandensein großer Mengen unspezifischer DNA kann die Spezifität
herabsetzen und zu falsch negativen Resultaten führen (Abbott et al. 1988, Rossen
et al. 1992). Derartige Beeinträchtigungen können entstehen, wenn Bakterien
taxonomischer Gruppen, die mit dem PCR-System nicht nachgewiesen werden
sollen, im Überschuss gegenüber den nachzuweisenden Bakterien in der Probe
vorhanden sind. In Lebensmitteln können Polysaccharide, Fette und Proteine zur
Inhibition der PCR führen und erfordern mitunter eine Purifikation der DNA über
Silikasäulen vor Durchführung der Reaktion. In vielen Fällen können Inhibitionen der
I Einleitung
22
PCR durch Zugabe unterstützender Reagenzien verringert werden. Die DNA-
Präparation kann unter Zugabe des Ionenaustauschers Chelex®
100 durchgeführt
werden, um die Zelllyse zu begünstigen und die Degradierung der DNA in
Gegenwart von Metallionen bei hohen Temperaturen zu verhindern (Walsh et al.
1991, de Lamballerie et al. 1992). Als besonders wirkungsvoller Zusatz der PCR hat
sich Rinderserumalbumin (BSA) erwiesen, durch das Inhibitoren gebunden werden
und die Anlagerung der DNA-Polymerase an die DNA stabilisiert wird. Es wurde
gezeigt, dass sowohl Substanzen mit phenolischen Gruppen, als auch Lipide und
Anionen durch BSA gebunden werden (Kreader 1996, Forbes und Hicks 1996). Die
inhibitorische Wirkung auf DNA-Polymerasen durch Proteinasen in Milch konnte
durch Zugabe von BSA unterbunden werden (Powell et al. 1994, Abu Al-Soud und
Rådström 2000).
Um durch Inhibition bedingte falsch negative Ergebnisse zu vermeiden, empfiehlt es
sich, als Indikator für die Effizienz der Reaktion, in jedem PCR-Ansatz eine Interne
Amplifikationskontrolle (IAK) mitzuführen (Ursi et al. 1992, Ballagi-Pordany und Belak
1996). Dabei handelt es sich um eine Kontroll-DNA, die in einer definierten Menge
der PCR-Reaktion zugegeben und zeitgleich mit der zu detektierenden DNA kopiert
wird. Entsteht in der PCR kein spezifisches Amplifikat der gesuchten DNA, kann
durch die Amplifikation der Kontroll-DNA die grundsätzliche Funktionalität der
Reaktion belegt werden. Ein falsch negatives Ergebnis kann somit ausgeschlossen
werden. Idealerweise werden die zu detektierende DNA und die Kontroll-DNA von
Primern mit derselben Sequenz amplifiziert, so dass sie in einer kompetitiven PCR
um das gleiche Primerpaaar konkurrieren (Rosenstraus et al. 1998, Courtney et al.
1999). Bei Anwendung einer Real-Time-PCR mit markierten Sonden lassen sich die
Amplifikate der nachzuweisenden DNA und der Kontroll-DNA unterscheidbar
detektieren, wenn die jeweiligen Sonden mit Farbstoffen verschiedener
Emmissionsfluoreszenz modifiziert wurden (Elenitoba-Johnson et al. 2001).
Mit der besonders hohen Sensitivität der PCR geht eine große Anfälligkeit für
Kontaminationen einher. Bei allen Schritten der praktischen Durchführung einer
diagnostischen PCR müssen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationen und
daraus resultierenden falsch positiven Ergebnissen angewendet werden. Kwok und
Higuchi (1989) beschreiben die strikte räumliche Trennung aller Arbeitsschritte.
Arbeiten mit Nukleinsäuren, wie die Probenaufarbeitung, werden von denen ohne
Nukleinsäuren, wie die Herstellung von Reaktionslösungen, in getrennten Laboren
durchgeführt. Alle Reagenzien sollten in möglichst geringe Mengen aliquotiert
werden. Erst unmittelbar vor dem Start der Reaktion wird die DNA zum Ansatz
gegeben. Sämtliche Materialien und Arbeitsräume sollten, soweit möglich, zur
Dekontamination mit UV-Licht bestrahlt werden (Sarkar und Sommer 1993).
I Einleitung
23
Besonders leicht kann es durch die Anwesenheit von Amplifikaten vorangegangener
PCR-Reaktionen zu Kreuzkontaminationen kommen. Um diese Kontaminationen zu
vermeiden, kann ein enzymatischer Verdau vorhandener Amplifikate im
Reaktionsansatz mit Uracil-DNA-N-Glycosylase (UNG) erfolgen. Durch den UNG-
Verdau werden Amplifikate vorangegangener PCR-Reaktionen gespalten und dienen
der DNA-Polymerase nicht mehr als Matrize. Voraussetzung ist, dass in jeder PCR
dTTP durch dUTP ersetzt wird, wodurch es während der DNA-Synthese zum Einbau
von Uracil statt Thymin kommt. UNG hydrolysiert selektiv Uracil-glycosidische
Bindungen, während sie gegenüber nativer thyminhaltiger DNA inaktiv ist (Longo et
al. 1990, Rys und Persing 1993).
Durch Anwendung der PCR wird sowohl von lebenden als auch von toten
Bakterienzellen die DNA nachgewiesen. Ein positives Signal sagt also nichts über
die Lebensfähigkeit der Zielorganismen aus. Ist in der Probe ausschließlich DNA
toter Zellen vorhanden, kann dies zu einem falsch positiven Ergebnis führen. Die
Möglichkeit, tote Bakterienzellen nachzuweisen, kann aber auch zu wichtigen
Informationen über den hygienischen Zustand der Untersuchungsprobe führen. Im
Gegensatz zu klassischen mikrobiologischen Kultivierungsmethoden werden durch
Anwendung der PCR auch Bakterien im „viable but nonculturable“ Stadium
nachgewiesen. Ein der Umgebung angepasster Zustand in Stresssituationen durch
Nährstoffmangel, niedrige Temperaturen oder ähnliches, in dem sich auch Bakterien
befinden können, von denen eine erhebliche gesundheitliche Gefährdung ausgeht,
sobald sie günstigere Lebensbedingungen vorfinden (Roszak und Colwell 1987,
McKay 1992, Makino et al. 2000). Für Gattungen der Familie Enterobacteriaceae,
wie Escherichia (Xu et al. 1982), Salmonella (Roszak et al. 1984) und Shigella
(Colwell et al. 1985, Rahman et al. 1996), wurde dieses Phänomen beschrieben.
Byrd et al. (1991), die den Zustand auch für Klebsiella pneumoniae und Enterobacter
aerogenes beschreiben, warnen davor, dass eine Detektion der Bakterien allein mit
kulturellen Methoden nicht gewährleistet ist. Selbst nach dem Pasteurisieren können
sich in Milch noch Escherichia coli im „viable but nonculturable“ Stadium befinden
(Binderova und Rysanek 1999, Gunasekera et al. 2002).
Entwicklung und Fortschritt der PCR-Technologie ermöglichen im Bereich der
Lebensmittelhygiene und -überwachung den genotypischen Nachweis bakterieller
Kontaminationen durch Detektion spezifischer Nukleinsäuren. Vergleichende
Untersuchungen konventioneller mikrobiologischer Verfahren zum Nachweis
lebensmittelassoziierter Bakterien mit denen der PCR belegen deutlich die höhere
Nachweisrate der PCR (Swaminathan und Feng 1994, Allmann et al 1995). Während
herkömmliche Methoden in ihrer Durchführung sehr zeitaufwändig und
arbeitsintensiv sind, werden PCR-Techniken als schnelle und zuverlässige
I Einleitung
24
Alternative mit hoher Spezifität meist bevorzugt und kontinuierlich weiterentwickelt
(Hill 1996, Naravaneni und Jamil 2005).
Für den Nachweis von Bakterien in Lebensmitteln entwickelte PCR-Systeme müssen
auf ihre Tauglichkeit im Vergleich zu konventionellen Methoden geprüft und mit
Lebensmitteln validiert werden. Wenn jedoch Standardprotokolle und Validierungen
nicht gegeben sind und die Qualität von PCR-Reagenzien und Geräten unbeständig
ist, kann keine Weitergabe entwickelter PCR-Nachweismethoden vom
Forschungslabor zum diagnostischen Routinelabor des Anwenders erfolgen. Von
Seiten der Lebensmittelindustrie wird aber ein offiziell zugelassener Standard
verlangt. Um dieser Situation gerecht zu werden, begründete die Kommission der
Europäischen Union 1999 das Forschungsvorhaben „Food-PCR“, ein Projekt zur
Validierung und Standardisierung diagnostischer PCR-Methoden für den Nachweis
pathogener Bakterien in Lebensmitteln (Malorny et al. 2003). In der Bundesrepublik
Deutschland ist das Deutsche Institut für Normung (DIN) in Zusammenarbeit mit dem
Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) für die Standardisierung
molekularbiologischer Methoden wie der PCR verantwortlich. Auf internationaler
Ebene werden diese Aufgaben vom Europäischen Komitee für Normung (CEN) und
von der Internationalen Organisation für Standardisierung (ISO) übernommen.
2.3 Zielsetzung der Arbeit
Im Rahmen dieser Arbeit soll ein molekularbiologisches System für die Detektion von
Bakterien der Familie Enterobacteriaceae entwickelt werden. Der spezifische
Indikatornachweis soll mittels Real-Time-PCR erfolgen und für die Untersuchung von
Lebensmitteln auf das Vorhandensein von Enterobacteriaceen anwendbar sein.
Für die Durchführung sind folgende Arbeitsschritte geplant:
• Ermitteln geeigneter DNA-Sequenzen innerhalb des für ribosomale RNA (rRNA)
kodierenden Bereichs von Enterobacteriaceae-Spezies und Generieren von
Oligonukleotiden als Primer und Sonden für die PCR. Hierfür werden die
entsprechenden DNA-Sequenzen verschiedener Enterobacteriaceae-Stämme
sowie anderer, nicht nachzuweisender Eubakterien-Stämme im Alignment
vergleichend dargestellt. Anhand der Daten werden mögliche Primer- und
Sondensequenzen abgeleitet.
• Entwicklung eines Real-Time-PCR-Systems. Die generierten Primer und Sonden,
alle weiteren PCR-Komponenten und entsprechende Zyklusprofile werden in der
PCR getestet. Mit dem Ziel, möglichst viele lebensmittelrelevante
I Einleitung
25
Enterobacteriaceae-Spezies mit hoher Sensitivität zu amplifizieren, aber andere
Eubakterien nicht zu erfassen, werden die Komponenten und
Reaktionsbedingungen entsprechend modifiziert und optimiert.
• Etablierung eines Verfahrens zur Dekontamination rekombinanter DNA-
Polymerasen, falls es zur Amplifikation von Enzymkontaminationen kommt. Da
rekombinante Polymerasen in Escherichia coli synthetisiert werden und über eine
ausgeprägte Affinität gegenüber DNA verfügen, können sich Spuren
amplifizierbarer Nukleinsäuren in der Polymerase und dem Lagerpuffer befinden.
Diese würden durch das zu entwickelnde Enterobacteriaceae-Nachweissystem in
der PCR amplifiziert werden und könnten zu falsch positiven Ergebnissen führen.
In diesem Fall muss eine zuverlässige Dekontamination der eingesetzten DNA-
Polymerasen erreicht werden.
• Überprüfung der Spezifität des entwickelten Systems, indem die Nachweisbarkeit
der lebensmittelrelevanten Enterobacteriaceae getestet wird (Inklusivität).
Ebenso werden diverse Spezies anderer Bakterientaxa, die mit dem System nicht
erfasst werden sollen, in der Real-Time-PCR überprüft (Exklusivität).
• Entwicklung einer Internen Amplifikationskontrolle mit spezifischer Sonde für die
Überprüfung der Negativ-Ergebnisse. Durch Coamplifikation von Kontroll-DNA
und Probe, idealerweise durchgeführt als kompetitive PCR mit den gleichen
Primern, werden falsch negative Ergebnisse ausgeschlossen.
• Nachweis der Sensitivität des Detektionssystems. Definierte Zellzahlen
verschiedener Enterobacteriaceen sowie deren quantifizierte genomische DNA
werden hinsichtlich ihrer Nachweisgrenzen getestet.
• Vergleichende Überprüfung des PCR-Systems, insbesondere unter dem Aspekt
einer schnellen, spezifischen und sensitiven Detektion, gegenüber klassischen
mikrobiologischen Tests auf Abwesenheit beziehungsweise Anwesenheit von
Enterobacteriaceae in Lebensmitteln. Zu diesem Zweck werden von identischem
Ausgangsmaterial diverser Lebensmittelproben Anreicherungen durchgeführt und
auf das Vorhandensein von Enterobacteriaceae sowohl durch Ösenausstrich auf
Selektiv-Agar als auch durch Amplifikation ihrer DNA mit dem entwickelten Real-
Time-PCR-System überprüft.
II Material und Methoden
26
II MATERIAL UND METHODEN
1 MATERIAL
1.1 Bakterienstämme
Tab. 2.1: Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitäts- und Sensitivitätstests
Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm
1 Budvicia aquatica DSM 5075 35 Kluyvera cryocrescens DSM 4588
2 Buttiauxella agrestis DSM 4586 36 Leclercia adecarboxylata DSM 5077
3 Cedecea davisae DSM 4568 37 Moellerella wisconsensis DSM 5076
4 Citrobacter amalonaticus DSM 4593 38 Morganella morganii DSM 30164
5 Citrobacter braakii DSM 30040 39 Pantoea agglomerans BCD 2151
6 Citrobacter diversus BCD 5366 40 Pantoea ananatis DSM 30070
7 Citrobacter freundii BCD 5893 41 Pantoea dispersa DSM 30073
8 Citrobacter koseri DSM 4595 42 Photorhabdus luminescens DSM 3368
9 Edwardsiella tarda DSM 30052 43 Plesiomonas shigelloides DSM 8224
10 Enterobacter aerogenes DSM 30053 44 Proteus mirabilis DSM 788
11 Enterobacter agglomerans BCD 8600 45 Proteus vulgaris BCD 915
12 Enterobacter amnigenus DSM 4486 46 Providencia alcalifaciens DSM 30120
13 Enterobacter cloacae ssp. cloacae DSM 30054 47 Providencia rettgeri DSM 1131
14 Enterobacter gergoviae BCD 511 48 Providencia stuartii DSM 4539
15 Enterobacter intermedius DSM 45481 49 Rahnella aquatilis DSM 4594
16 Enterobacter sakazakii DSM 4485 50 Raoultella planticola DSM 4617
17 Enterobacter sakazakii ATCC 51329 51 Raoultella terrigena DSM 2687
18 Erwinia carotovora DSM 30168 52 Salmonella Abony DSM 4224
19 Erwinia chrysanthemi DSM 4610 53 Salmonella Senftenberg BCD 6173
20 Erwinia mallotivora DSM 4565 54 Salmonella Typhimurium BCD 14285
21 Escherichia blattae NCTC 12127 55 Serratia ficaria DSM 4569
22 Escherichia coli DSM 30083 56 Serratia grimesii DSM 30063
23 Escherichia coli DSM 1576 57 Serratia liquefaciens BCD 676
II Material und Methoden
27
Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm
24 Escherichia coli EHEC BCD 7856 58 Serratia marcescens DSM 1636
25 Escherichia hermanii DSM 4560 59 Serratia plymuthica DSM 49
26 Escherichia hermanii BCD 8467 60 Serratia proteamaculans BCD 8916
27 Escherichia vulneris DSM 4564 61 Serratia rubidaea DSM 4480
28 Ewingella americana DSM 4580 62 Shigella boydii DSM 7532
29 Hafnia alvei DSM 30163 63 Shigella sonnei BCD 4301
30 Klebsiella oxytoca DSM 5175 64 Xenorhabdus beddingii DSM 4764
31 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 65
Yersinia enterocolitica ssp.
enterocolitica
DSM 4780
32
Klebsiella pneumoniae ssp.
pneumoniae
DSM 2026 66 Yersinia pseudotuberculosis DSM 8992
33 Klebsiella terrigena DSM 2687 67 Yokenella regensburgei DSM 5079
34 Kluyvera ascorbata DSM 4611
Tab. 2.2: Nicht-Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitätstests
Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm
1 Acetobacter aceti DSM 3508 26 Gluconobacter oxydans DSM 7145
2 Achromobacter spec. BCD 1193 27 Haemophilus influenzae DSM 4690
3 Acinetobacter baumanii BCD 10388 28 Helicobacter pylori DSM 4867
4 Acinetobacter calcoaceticus BCD 1209 29 Listeria monocytogenes ATCC 19118
5 Aeromonas caviae DSM 7323 30 Megasphaera cerevisiae DSM 20462
6 Aeromonas enteropelogenes DSM 6394 31 Moraxella catarrhalis DSM 9143
7
Aeromonas hydrophila ssp.
anaerogenes
DSM 30188 32 Pasteurella pneumotropica BCD 2891
8
Aeromonas hydrophila ssp.
hydrophila
DSM 6173 33 Photobacterium phosphoreum BCD 5162
9 Aeromonas media DSM 4881 34 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145
10 Aeromonas sobria ATCC 43979 35 Pseudomonas aeruginosa DSM 1128
11 Alcaligenes spec. DSM 2625 36 Pseudomonas stutzeri DSM 5190
12 Bacillus cereus BCD 8832 37 Psychrobacter immobilis DSM 7229
13 Brevundimonas vesicularis DSM 7226 38 Ralstonia pickettii DSM 6297
14 Burkholderia cepacia DSM 7288 39 Sphingobacterium multivorum DSM 6175
15 Burkholderia cepacia BCD 3134 40 Sphingomonas paucimobilis DSM 1098
II Material und Methoden
28
Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm
16 Campylobacter fetus DSM 5361 41 Staphylococcus aureus DSM 20231
17 Campylobacter jejuni BCD 15108 42 Vibrio alginolyticus DSM 2171
18 Chromobacterium violaceum DSM 30191 43 Vibrio fischeri DSM 5075
19 Clostridium perfringens BCD 8799 44 Vibrio fluvialis ATCC 33809
20 Clostridium tyrobutyricum DSM 663 45 Vibrio harveyi DSM 6904
21 Comamonas acidovorans DSM 39 46 Vibrio parahaemolyticus DSM 10027
22 Comamonas testosteroni DSM 1622 47 Vibrio proteolyticus DSM 30189
23 Enterococcus faecalis DSM 20478 48 Vibrio vulnificus DSM 10143
24 Flavobacterium resinovorum DSM 7478 49 Xanthomonas maltophila BCD 4273
25 Flavobacterium spec. BCD 2539 50 Zymomonas mobilis BCD 5724
Escherichia coli-Stamm für die Transformation
XL1-blue: recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rk- mk+), supE44, relA1, lac, [F´
proAB, lacIq
Z∆M15 Tn10 (Tetr
)] (Fa. Stratagene, Kat. Nr. #200236).
1.2 Nährmedien
Alle Nährmedien wurden, soweit nicht anders angegeben, 15 min bei 121 °C
autoklaviert.
CASO-Bouillon
(Merck Kat. Nr. 1.05459)
17,0 g/l Pepton aus Casein
3,0 g/l Pepton aus Sojamehl
2,5 g/l D(+)-Glukose
5,0 g/l NaCl
2,5 g/l K2HPO4
pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C
CASO-Agar
(Merck Kat. Nr. 1.05458)
15,0 g/l Pepton aus Casein
5,0 g/l Pepton aus Sojamehl
5,0 g/l NaCl
15,0 g/l Agar-Agar
pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C
II Material und Methoden
29
1.3 Reagenzien
Zur Herstellung der Lösungen und Puffer wurden ausschließlich Chemikalien des
Reinheitsgrades p. a. verwendet, welche von den Firmen Merck, Roche Diagnostics
und Sigma bezogen wurden.
LB-Medium (Sambrook et al. 1989)
10,0 g/l Bacto Trypton
5,0 g/l Hefeextrakt
5,0 g/l NaCl
15,0 g/l Agar-Agar (Zusatz optional)
pH 7,0 ± 0,2 bei 25 °C
Supplement (zur Analyse nach Transformation)
100 µg/ml Ampicillin
80 µg/ml X-Gal
0,5 mM IPTG
Meerwasser-Bouillon
10,0 g/l Fleischextrakt
10,0 g/l Pepton
21,1 g/l NaCl
0,58 g/l KCl
1,2 g/l CaCl2 · 2 H2O
3,6 g/l MgCl2 · 6 H2O
0,08 g/l NaHCO3
2,63 g/l MgSO4 · 7 H2O
pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C
SOC-Medium
(Sambrook et al. 1989)
20,0 g/l Bacto Trypton
5,0 g/l Hefeextrakt
0,5 g/l NaCl
Vor Gebrauch zugeben:
10 mM MgCl2, sterilfiltriert
10 mM MgSO4, sterilfiltriert
20 mM Glucose, sterilfiltriert
pH 7,0 ± 0,2 bei 25 °C
MOSSEL-Bouillon
(Merck Kat. Nr. 1.05394)
10,0 g/l Peptone
5,0 g/l D(+)-Glukose
20,0 g/l Ochsengalle, getrocknet
0,015 g/l Brillantgrün
8,0 g/l Na2HPO4
2,0 g/l KH2PO4
pH 7,2 ± 0,2 bei 25 °C
Schonend autoklavieren, 5 min bei 121 °C.
VRBD-Agar nach MOSSEL (Merck Kat. Nr. 1.10275)
7,0 g/l Pepton aus Fleisch
3,0 g/l Hefeextrakt
5,0 g/l NaCl
10,0 g/l D(+)-Glukose
1,5 g/l Gallesalzmischung
0,03 g/l Neutralrot
0,002 g/l Kristallviolett
13,0 g/l Agar-Agar
pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C
Unter ständigem Rühren kochen bis zum vollständigen Lösen, nicht autoklavieren.
1x TE-Puffer 1x TBE-Puffer
10 mM Tris-HCl 90 mM Tris-Borat
1 mM EDTA 2 mM EDTA
pH 8,0 pH 8,3
II Material und Methoden
30
api®
20 E (Fa. bioMérieux, Kat. Nr. 20100)
Anaerotest®
(Fa. Merck, Kat. Nr. 1.15112.0001)
Anaerocult®
A (Fa. Merck, Kat. Nr. 1.13829.0001)
Oxidase Teststreifen (Fa. Biotest, Kat. Nr. 934260)
DNA-Längenstandards
DNA-Längenstandard VI (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 11062590001)
Größe in bp: 2176, 1766, 1230, 1033, 653, 517, 453, 394, 298, 234, 220, 154.
DNA-Längenstandard 1 kb (Fa. Applichem, Kat. Nr. A5207)
Größe in bp: 10.000, 8.000, 6.000, 5.000, 4.000, 3.000 x 2, 2.500, 2.000, 1.500, 1.000 x 2, 750, 500,
250.
DNA-Längenstandard 100 bp (Fa. Applichem, Kat. Nr. A5191)
Größe in bp: 1000, 900, 800, 700, 600, 500 x 2, 400, 300, 200, 100.
HSTE-Puffer 1x PBS-Puffer
10 mM Tris-HCl 137 mM NaCl
0,5 mM EDTA 2,7 mM KCl
0,01 g/l Heringssperma-DNA 4,3 mM Na2HPO4
1,4 mM KH2PO4
pH 7,3
Ladepuffer für Agarosegele
0,25 % (w/w) Bromphenolblau
0,25 % (w/w) Xylencyanol FF
30,0 % (w/w) Glycerin
II Material und Methoden
31
1.4 Enzyme
Alle Enzyme wurden mit den dazugehörigen 10x Reaktionspuffern eingesetzt.
Taq-DNA-Polymerasen
Perpetual Taq DNA Polymerase mit monoklonalem anti-Taq Antikörper (Fa.
Roboklon GmbH, Kat. Nr. E2700-01)
HotStarTaq™ DNA Polymerase (Kit, Fa. Qiagen, Kat. Nr. 203203)
FastStart Taq DNA Polymerase (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 12158264001)
Taq DNA Polymerase (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 11146165001)
LightCycler®
-FastStart DNA Master Hybridization Probes (Kit, Fa. Roche Diagnostics,
Kat. Nr. 03003248001)
Restriktionsendonukleasen
Aci I (Fa. New England BioLabs®
Inc., Kat. Nr. R0551S)
HpyCH4 IV, Isoschizomer: Mae II (Fa. New England BioLabs®
Inc., Kat. Nr. R0619S)
Mse I (Fa. New England BioLabs®
Inc., Kat. Nr. R0525S)
Desoxyribonuklease
DNase I (Kit, Fa. Sigma, Kat. Nr. AMP-D1)
Uracil-DNA-Glycosylase
LightCycler®
Uracil-DNA-Glycosylase (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 3 539 806)
II Material und Methoden
32
1.5 Reaktionskits
QIAquick Gel Extraction Kit (Fa. QIAGEN, Kat. Nr. 28704)
QIAprep Spin Miniprep Kit (Fa. QIAGEN, Kat. Nr. 27104)
High Pure PCR Template Preparation Kit (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr.
11796828001)
ShortPrep foodproof II Kit (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 03358062001)
pGEM®
-T Vector System I (Fa. Promega, Kat. Nr. A3600)
PicoGreen®
dsDNA Quantitation Kit (Fa. Invitrogen, Kat. Nr. P-7589)
1.6 Primer und Sonden
Die Synthese der eingesetzten Primer erfolgte durch die Firma MWG Biotech. Die
mit LCRed 640 beziehungsweise LCRed 705 am 5’-Ende oder Fluorescein am 3’-
Ende markierten Sonden wurden von der Metabion GmbH synthetisiert.
Die Buchstaben R, K, V und H stehen für Basengemische: R = A + G, K = G + T, V =
A + G + C, H = A + C + T.
Tab. 2.3: Generierte Primer und Sonden mit Bindungsstellen innerhalb des DNA-
Bereichs für 23S rRNA – Spacer – 5S rRNA im ribosomalen Operon
Name Länge/Markierung Zielregion Funktion
fw 1.1 20 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 1.2 20 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 1.3 20 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 1.4 20 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 1 II.1 18 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 1 II.2 18 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 1 II.3 18 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 2.1 23 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 2.2 23 mer 23S-Gen forward-Primer
II Material und Methoden
33
Name Länge/Markierung Zielregion Funktion
fw 3.1 17 mer 5S-Gen forward-Primer
fw 3.2 17 mer 5S-Gen forward-Primer
fw 4.1 21 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 4.2 21 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 5.1 26 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 6.1 20 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 7.1 26 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 8.1 17 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 9.1 21 mer 23S-Gen forward-Primer
fw 9.2 22 mer 23S-Gen forward-Primer
rev 1.1 27 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 1.2 27 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 1.3 26 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 1.4 25 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 1.5 24 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 1.6 25 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 1.7 25 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 1.8 25 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 2.1 18 mer 5S-Gen reverse-Primer
rev 3.1 18 mer 5S-Gen reverse-Primer
rev 3 II .1 17 mer 5S-Gen reverse-Primer
rev 4.1 23 mer 23S-Gen-Spacer reverse-Primer
rev 4.2 24 mer 23S-Gen-Spacer reverse-Primer
rev 5.1 25 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 6.1 18 mer Spacer-5S-Gen reverse-Primer
rev 7.1 17 mer 5S-Gen reverse-Primer
rev 8.1 16 mer 5S-Gen reverse-Primer
rev 9.1 25 mer 23S-Gen reverse-Primer
rev 10.1 26 mer 23S-Gen-Spacer reverse-Primer
rev 10.2 26 mer 23S-Gen-Spacer reverse-Primer
II Material und Methoden
34
Name Länge/Markierung Zielregion Funktion
Flu 1 33 mer - 3' Fluorescein 23S-Gen Sonde
Red 1 LCRed 640 - 30 mer - Phosphat 23S-Gen Sonde
HzFlu 31 mer - 3' Fluorescein 23S-Gen Sonde
HzRed LCRed 640 - 32 mer - Phosphat 23S-Gen Sonde
Tab. 2.4: Generierte Primer und Sonde für die Konstruktion und Detektion der
Internen Amplifikationskontrolle
Name Länge/Markierung Zielregion Funktion
IAKrev 45 mer 23S-Gen reverse-Primer
IAKfw 49 mer 23S-Gen forward-Primer
IAKRed LCRed 705 - 28 mer - Phosphat 23S-Gen Sonde
Primer der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH zur Amplifikation der 23S-5S-DNA
fw23S, forward: 5’ – GGT ACG CGA GCT GGG TTT AGA ACG – 3’
rev5S, reverse: 5’ – GGC RRT KHC CTA CTC TCV C – 3’
Etablierte Primer zur Amplifikation der 16S-DNA (Barry et al. 1990)
41F, forward: 5’ – GCT CAG ATT GAA CGC TGG CG – 3’
1066R, reverse: 5’ – ACA TTT CAC AAC ACG AGC TG – 3’
Primer für die Sequenzierung durch Firma GATC Biotech AG
M13-FP, forward: 5’ – TGT AAA ACG ACG GCC AGT – 3’
M13-RP, reverse: 5’ – CAG GAA ACA GCT ATG ACC – 3’
II Material und Methoden
35
1.7 Lebensmittelproben
Tab. 2.5: Tiefgefrorene Lebensmittel
Nr. Produkt Nr. Produkt
1 Kinder-Eis Piraten Mix, Krokodil 26 Himbeer-Käse-Sahnetorte
2 Eismann Minis/Riegel Mix, Karamell 27 Tiramisu-Eisriegel
3 Butter-Tee-Gebäck, helle Teigmischprobe 28 Suppengemüse
4 Grünkohl 29 Gemüse-Reispfanne
5 Porree/Lauch 30 Kräutermischung mit Bärlauch
6 Buntes Gartengemüse 31 Petersilie
7 Asia Pfanne Bombay 32 Schnittlauch
8 Pangasiusfilet 33 Knoblauch-Würfel
9 Lachsforelle Ammerländer Art 34 Kaiserschmarrn, Vanillesoße
10 Garnelen in Knusperteig 35 Garnelensnack
11 Fleischtopf Toscana 36 Schollenfilet
12 Lammmedaillons 37 Wiener Würstchen
13 Gnocci 38 Original Thüringer Rostbratwurst
14 Westfälischer Grünkohl mit Räucherwurst 39 Cevapcici
15 Blätterteigkörbchen Schinken Käse 40 Donuts
16 Blumenkohl-Broccoli-Gratinos 41 Bunte Tortenmischung, Nuss-Sahne
17 Marinierte Gänsekeulen 42 Hähnchenkeule
18 Ente Classic 43 Hähnchenbrustfilet paniert
19 Marinierte Entenpfanne 44 Reibekuchen
20 Markklößchen 45 Suppenklößchen
21 Kartoffelgratin 46 Donauwelle
22 Tex Mex Box, Mozzarella Sticks 47 Herzoginkartoffeln
23 Bratapfelplunder 48 Lachstulpe, Lachs und Gemüse
24 Pizza Schinken Champignon 49 Hähnchenbrustfilet unpaniert
25 Mini Sahnewindbeutel 50 Eddy's Fisch, Seefisch
II Material und Methoden
36
Tab. 2.6: Säuglingsnahrung und Volleipulver
Nr. Produkt Hersteller/Vertrieb
1 Milasan Milchbrei Früchte, nach dem 4. Monat Milasan GmbH
2
Getreidebrei BIO 3-Korn, milchfrei, nach EG-Öko-
Verordnung, ab dem 6. Monat
Milupa GmbH
3 Milasan Milchbrei Grieß, nach dem 4. Monat Milasan GmbH
4
BEBA Sensitive Spezialnahrung, diätetisches Lebensmittel,
von Geburt an
Nestlé Deutschland AG
5 Milumil 1, Dauermilch, von Geburt an Milupa GmbH
6 Alete Anfangsmilchnahrung PRE, von Geburt an Nestlé Nutriton GmbH
7 Alete Hypoallergene Anfangsnahrung H.A.1, von Geburt an Nestlé Nutriton GmbH
8 Folgemilch 3, prebiotisch, ab dem 8. Monat Humana GmbH
9 Aptamil Pre Säuglingsmilchnahrung, von Geburt an Milupa GmbH
10 Babydream Milchbrei Grieß, nach dem 4. Monat Rossmann GmbH
11 BEBA Start Anfangsmilchnahrung Pre, von Geburt an Nestlé Deutschland AG
12 HiPP Bio-Anfangsmilch, von Geburt an HiPP GmbH & Co. Vertrieb KG
13 HiPP Folgemilch 3, ab dem 8. Monat HiPP GmbH & Co. Vertrieb KG
14 Babydream Folgemilch 2, nach dem 4. Monat Rossmann GmbH
15 Bebivita, Baby-Aktiv Folgemilch, ab dem 8. Monat Bebivita GmbH
16 Humana Anfangsmilch PRE, von Geburt an Humana GmbH
17 Pre Milasan Säuglings-Milchnahrung, von Geburt an Milasan GmbH
18 Milasan 2 Folgemilch, nach dem 4. Monat Milasan GmbH
19
Alete Abendmilchbrei Banane mit Milchreis, ab dem 8.
Monat
Nestlé Nutriton GmbH
20 Bebivita Abendmilchbrei Grieß-Vanille, nach dem 4. Monat Bebivita GmbH
21
Milasan BIO Milchgrießbrei m. Vanille, nach EG-Öko-
Verordnung, nach 4. Monat
Milasan GmbH
22 Volleipulver Sanovo Eiprodukte GmbH & Co KG
1.8 Software
Apilab Version V 4.0 api®
20 E (Fa. bioMérieux)
Vector NTI®
Suite Version 7.1 (Fa. InforMax®
, Inc.)
MeltCalcPro Version 2.06 (Fa. MeltCalc©
Software GbR)
II Material und Methoden
37
Chromas Version 1.45, Copyright©
1996-1998 Conor McCarthy, School of Health
Science, Griffith University, Gold Coast Campus, Southport, Queensland, Australia
LightCycler®
Software Version 3.5 (Fa. Roche Molecular Systems, Inc.)
LightCycler®
Software Version 4.0 (Fa. Roche Molecular Systems, Inc.)
2 METHODEN
2.1 Anzucht von Mikroorganismen
Die meisten Mikroorganismen wurden in CASO-Bouillon angezogen, Vibrio-Arten in
Meerwasser-Bouillon (Kap. II 1.2). Die Kultivierungsbedingungen entsprachen der
jeweiligen Spezies. In der Regel erfolgte die Anzucht aerob für ein bis zwei Tage bei
30 °C bis 37 °C.
2.2 Quantifizierung von Bakterienzellen
Die Quantifizierung der Bakterienzellen erfolgte in einer Thomakammer mit 400
Kleinquadraten und einer Tiefe von 0,1 mm unter dem Mikroskop. Es wurden pro
Quantifizierung vier Großquadrate à 16 Kleinquadrate in einer Diagonale ausgezählt.
Die Zahl der Zellen pro ml (N) wurde nach der Formel N = (Zahl der Zellen pro
Großquadrat · 106
) / 4 berechnet. Jede Zählung wurde einmal mit neu gefüllter
Kammer wiederholt. Durch Ausplattieren und Inkubation auf CASO-Agar (Kap. II 1.2)
wurde die Lebendkeimzahl überprüft.
2.3 DNA-Extraktion
Für die DNA-Extraktion wurde 1 ml einer Bakterienzellkultur für 5 min in einer
Tischzentrifuge (Eppendorf 5415C) bei 10.000 x g sedimentiert. Je nach benötigtem
Reinheitsgrad wurde die DNA nach verschiedenen Verfahren extrahiert und direkt
weiterverwendet oder bei –20 °C gelagert.
II Material und Methoden
38
2.3.1 DNA-Präparation mit enzymatischem Zellaufschluss
Präparation und Reinigung der Bakterien-DNA über Silikasäulen erfolgte mit dem
High Pure PCR Template Preparation Kit (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 1796828).
Zusätzlich wurden phosphatgepufferte Saline (PBS, Kap. II 1.3), Lysozym (Fa.
Sigma, Kt. Nr. L6876), RNase A (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 109142),
Isopropylalkohol abs. und Tris EDTA-Puffer (TE, Kap. II 1.3) verwendet.
Die sedimentierten Bakterienzellen wurden in 200 µl PBS resuspendiert. Für die
Zelllyse und den RNA-Verdau erfolgte eine Inkubation mit je 10 µl Lysozym (10
mg/ml in Tris-HCl, pH 8,0) und RNase A (10 mg/ml) bei 37 °C für 20 min. Der
Proteinverdau wurde mit 40 µl Proteinase K (20 mg/ml) in 200 µl Bindungspuffer bei
72 °C für 10 min durchgeführt. Nach Zugabe von 100 µl Isopropylalkohol abs. wurde
die DNA auf der Säule entsprechend den Anweisungen des Kit-Herstellers gereinigt.
Die Elution der DNA erfolgte mit 100 µl TE-Puffer.
2.3.2 DNA-Extraktion ShortPrep
Die Aufarbeitung der genomischen DNA erfolgte mit dem ShortPrep foodproof II Kit
(Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 03358062001) entsprechend den Anweisungen des
Herstellers. Nach Inkubation bei 95 °C für 5 min, 2 sek vortexen und 1 min
Zentrifugation bei 13.000 x g befindet sich die Bakterien-DNA im Überstand des
Resuspensionspuffers.
2.4 DNA-Quantifizierung
Die Quantifizierung präparierter DNA (Kap. II 2.3.1) erfolgte photometrisch oder im
LightCycler®
. Die Menge von Amplifikationsprodukten der PCR wurde durch
Visualisierung im Geldokumentationsgerät ermittelt.
2.4.1 DNA-Quantifizierung im Photometer
Die DNA wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm mit dem Gene
Quant II Photometer (Fa. Pharmacia) quantifiziert. Bei dieser Wellenlänge entspricht
eine optische Dichte (OD) von 1 einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml. Eine
mögliche Verunreinigung durch Proteine wurde durch die OD280nm ermittelt. Der
Quotient aus OD260nm/ OD280nm für reine DNA sollte bei 1,8 bis 1,9 liegen (Sambrook
et al.1989).
II Material und Methoden
39
2.4.2 DNA-Quantifizierung im LightCycler®
Die Quantifizierung der DNA im LightCycler®
2.0 Instrument erfolgte mit dem
Programm „Nucleic Acid Quantification“ der LightCycler®
Software Version 4.0 unter
Verwendung des PicoGreen®
dsDNA Quantitation Kit (Fa. Invitrogen, Kap. II 1.5)
entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Die Fluoreszenz des in DNA
interkalierenden Farbstoffs PicoGreen®
wurde bei 530 nm gemessen. Die Zunahme
der Fluoreszenzintensität ist über einen DNA-Konzentrationsbereich von 25 pg/ml bis
1 µg/ml linear und wurde über eine Standardgerade bestimmt. Als Standard diente
der PicoGreen®
Lambda-DNA-Standard (100 µg/ml) aus dem Kit.
2.4.3 Quantifizierung von Amplifikaten
Die Quantifizierung von Amplifikationsprodukten erfolgte nach deren Auftrennung im
Agarosegel (Kap. II 2.2.7). Die mit Ethidiumbromid markierten DNA-Banden wurden
unter UV-Licht visualisiert, mit dem Geldokumentationssystem E.A.S.Y. Win32 (Fa.
Herolab) dokumentiert und mit der integrierten Software ausgewertet. Die
Quantifizierung erfolgte durch Vergleich der Lichtemissionsintensitäten der
Amplifikatbanden mit den Banden des mitgeführten DNA-
Molekulargewichtsstandard.
2.5 Endonukleasenverdau
2.5.1 Restriktionsverdau
Der Restriktionsverdau von DNA erfolgte mit der entsprechenden
Restriktionsendonuklease (Kap. II 1.4) und dem dazugehörigen 10x Reaktionspuffer
in einem Gesamtvolumen von 20 bis 150 µl und bei der für das Enzym geeigneten
Reaktionstemperatur. Die Reaktion wurde in 1 bis 3 h oder über Nacht durchgeführt.
Gestoppt wurde die Restriktion durch Zugabe von 5 mM EDTA oder
Hitzeinaktivierung des Enzyms bei 65 °C für 20 min.
2.5.2 DNase I-Verdau
Der DNA-Verdau wurde mit DNase I (Kap. II 1.4) und dazugehörigem 10x
Reaktionspuffer in einem Gesamtvolumen von 20 bis 200 µl bei 24 °C oder 37 °C in
1 bis 6 h katalysiert. Das Enzym wurde durch Zugabe von 5 mM EDTA und
Inkubation bei 70 °C für 10 min denaturiert.
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barbara heinze dissertation

  • 1. Entwicklung eines Real-Time-PCR-Systems für den spezifischen Nachweis von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln vorgelegt von Diplom-Biologin Barbara A. E. Heinze Von der Fakultät III – Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doktorin der Naturwissenschaften – Dr. rer. nat. – genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dipl.-Ing. Dr. D. Knorr Berichter: Prof. Dipl.-Ing. Dr. U. Stahl Berichterin: Dipl.-Ing. Dr. K. Berghof-Jäger Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 10.09.2007 Berlin 2007 D 83
  • 2. DANKSAGUNG Mein Dank gilt an erster Stelle meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Ulf Stahl für die wissenschaftliche Betreuung und Unterstützung beim Erstellen dieser Arbeit. Frau Dr. Kornelia Berghof-Jäger, Geschätsführerin der BIOTECON Diagnostics GmbH, danke ich für die Möglichkeit, die vorliegende Arbeit anzufertigen sowie für die ständige Hilfestellung und zielorientierte Diskussionsbereitschaft. Herrn Dr. Cordt Grönewald danke ich für die Betreuung dieser Arbeit, wertvolle Anregungen, Ratschläge und Gespräche und für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Frau Astrid Schneider gilt mein herzlicher Dank für die hilfreichen fachlichen Diskussionen und auch die weniger fachlichen Gespräche sowie für das kritische Lesen des Manuskripts. Frau Astrid Seemann danke ich für ihre fachliche Unterstützung und Diskussion zu allen Fragen der Mikrobiologie. Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der BIOTECON Diagnostics GmbH bin ich sehr dankbar für ihre Hilfsbereitschaft, die gute Zusammenarbeit und freundliche Arbeitsatmosphäre. Ganz besonders bedanke ich mich bei Herrn Dirk Eimer für seine intensive Auseinandersetzung mit mir und meiner Arbeit, das Korrekturlesen, seine unermütliche Diskussionsbereitschaft und seine starken Nerven. Ich bedanke mich ganz herzlich für die Motivierung und Stärkung bei meiner Familie Christiane, Erika und Joachim Heinze. Frau Sonja Körber bin ich sehr dankbar für ihre entscheidende Unterstützung.
  • 3. Inhalt I INHALT Seite Inhalt I Verzeichnis der Abbildungen IV Verzeichnis der Tabellen V Verzeichnis der Abkürzungen und Zeichen VI I EINLEITUNG 1 THEORETISCHER TEIL ENTEROBACTERIACEAE IN LEBENSMITTELN 1 1.1 Lebensmittel als Überträger von Infektionskrankheiten 1 1.2 Enterobacteriaceae als Ursachen für Lebensmittelinfektionen 5 1.2.1 Häufigster Vertreter lebensmittelassoziierter Enterobacteriaceae: Salmonella 8 1.2.1.1 Enteritis-Salmonellose 9 1.3 Enterobacteriaceae als Markerorganismen 14 2 PRAKTISCHER TEIL DETEKTION BAKTERIELLER KONTAMINATIONEN IN LEBENSMITTELN 16 2.1 Mikrobiologischer Nachweis von Enterobacteriaceen 16 2.2 Molekularbiologischer Bakterien-Nachweis mittels PCR 18 2.2.1 Aspekte der PCR 21 2.3 Zielsetzung der Arbeit 24 II MATERIAL UND METHODEN 1 MATERIAL 26 1.1 Bakterienstämme 26 1.2 Nährmedien 28 1.3 Reagenzien 29 1.4 Enzyme 31 1.5 Reaktionskits 32 1.6 Primer und Sonden 32 1.7 Lebensmittelproben 35 1.8 Software 36
  • 4. Inhalt II Seite 2 METHODEN 37 2.1 Anzucht von Mikroorganismen 37 2.2 Quantifizierung von Bakterienzellen 37 2.3 DNA-Extraktion 37 2.3.1 DNA-Präparation mit enzymatischem Zellaufschluss 38 2.3.2 DNA-Extraktion ShortPrep 38 2.4 DNA-Quantifizierung 38 2.4.1 DNA-Quantifizierung im Photometer 38 2.4.2 DNA-Quantifizierung im LightCycler® 39 2.4.3 Quantifizierung von Amplifikaten 39 2.5 Endonukleasenverdau 39 2.5.1 Restriktionsverdau 39 2.5.2 DNase I-Verdau 39 2.6 Polymerase-Kettenreaktion 40 2.6.1 Standardbedingungen für die konventionelle PCR 40 2.6.2 Standardbedingungen für die Real-Time-PCR 41 2.6.3 Für den Nachweis von Enterobacteriaceae mittels Real-Time- PCR optimierte Reaktionsbedingungen 43 2.7 Gelelektrophorese 44 2.7.1 Agarosegelelektrophorese 44 2.7.2 Präparative Gelelektrophorese 44 2.8 Klonierung von DNA-Amplifikaten 45 2.8.1 Ligation präparierter Amplifikate 45 2.8.2 Transformation in Escherichia coli 45 2.9 Präparation und Restriktionsverdau von Plasmid-DNA 46 2.9.1 Präparation von Plasmid-DNA 46 2.9.2 Restriktionsverdau präparierter Plasmid-DNA 46 2.10 Sequenzanalyse 47 2.10.1 DNA-Sequenzierung und Sequenzauswertung 47 2.10.2 Bearbeitung von DNA-Sequenzdaten 47 2.11 Überprüfung der Spezifität der Real-Time-PCR-Methode zum Nachweis von Enterobacteriaceae 47 2.12 Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der Untersuchung von Lebensmittelproben im Vergleich mit mikrobiologischen Methoden 48 III ERGEBNISSE 3.1 Auswahl der DNA-Zielregion 50 3.2 Erstellen von Sequenzalignments und Generieren möglicher Primer für den Nachweis von Enterobacteriaceen-DNA 51 3.3 Amplifikation der 23S-5S-DNA von Enterobacteriaceen 53 3.4 Dekontamination der Taq-Polymerase 55 3.5 Testung der Primer für Enterobacteriaceen 56
  • 5. Inhalt III Seite 3.6 Generieren der Primer und Sonden für das System zum Nachweis von Enterobacteriaceae 58 3.7 Anwendung und Überprüfung der generierten Oligonukleotide und der dekontaminierten Taq-Polymerase in der Real-Time- PCR für den Nachweis von Enterobacteriaceen 60 3.7.1 Amplifikation 60 3.7.1.1 Hook-Effekt 61 3.7.2 Schmelzkurvenanalyse 62 3.8 Interne Amplifikationskontrolle 63 3.8.1 Konstruktion der Internen Amplifikationskontrolle 64 3.8.2 Integration der Internen Amplifikationskontrolle in das Enterobacteriaceen-Nachweissystem 66 3.9 Optimierung der Reaktionsbedingungen für das Enterobacteriaceen-Nachweissystem 66 3.10 Spezifität des Enterobacteriaceen-Nachweissytems 67 3.10.1 Inklusivität 68 3.10.2 Exklusivität 69 3.11 Sensitivität des Enterobacteriaceen-Nachweissystems 70 3.11.1 Überprüfung der Sensitivität mit genomischer DNA von Bakterien 71 3.11.2 Überprüfung der Sensitivität mit bakteriellen Zelllinien 74 3.12 Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der Untersuchung von Lebensmittelproben 75 IV DISKUSSION 4.1 Entwicklung eines spezifischen Real-Time-PCR-Systems für den Nachweis von Enterobacteriaceae 84 4.2 Kulturelle Anreicherung und DNA-Extraktion 86 4.3 Dekontamination der Taq-DNA-Polymerase 88 4.4 Kompetitive PCR mit Interner Amplifikationskontrolle 90 4.5 Spezifität und Sensitivität 91 4.6 Ausblick 96 V ZUSAMMENFASSUNG 98 VI LITERATUR 99
  • 6. Inhalt IV VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN Seite Abb. 1.1 Prozentuale Verteilung der bekannten mit Mikroorganismen kontaminierten Lebensmittel, deren Verzehr im Jahr 2000 zu Ausbrüchen von Infektionskrankheiten in den Vereinigten Staaten von Amerika führten 4 Abb. 1.2: An das Robert Koch Institut in Berlin übermittelte Fälle von Enteritis-Salmonellosen in Deutschland in den Jahren 1991 bis 2004 12 Abb. 3.1: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der universellen Primer fw23S und rev5S der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH am rRNA-Operon von Eubakterien 50 Abb. 3.2: Sequenzen der universellen Primer fw23S und rev5S der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH für die Amplifikation der 23S-5S- DNA im rRNA-Operon von Bakterien 51 Abb. 3.3: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der Primer fw1 - fw8 und rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) für die spezifische Amplifikation von Enterobacteriaceae-DNA 53 Abb. 3.4: Agarosegelelektrophorese einer PCR für die spezifische Amplifikation der 23S-5S-Region mit dem Primerpaar fw1/rev3 54 Abb. 3.5: Agarosegelelektrophorese nach PCR mit Perpetual Taq, ohne und mit DNase I-Verdau der Taq-Polymerase 56 Abb. 3.6: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der Oligonukleotide für das Real-Time-PCR-System zum Nachweis von Enterobacteria- ceae-DNA 59 Abb. 3.7: Amplifikationskurven der Real-Time-PCR zum Nachweis von Enterobacteriaceae-DNA 61 Abb. 3.8: Schmelzkurven der Real-Time-PCR für den Nachweis von Enterobacteriaceae-DNA 63 Abb. 3.9: Konstruktion des mutagenisierten DNA-Fragments für die Interne Amplifikationskontrolle des Enterobacteriaceen-Nachweises 65 Abb. 3.10: Fluoreszenz bei Anwendung des Enterobacteriaceen- Nachweissystems während der Amplifikation von Ziel- und IAK- DNA im LightCycler® 67 Abb. 3.11: Sensitivitätstest der Real-Time-PCR für den Enterobacteria- ceen-Nachweis durch Amplifikation genomischer DNA von Serratia marcescens 72 Abb. 3.12: Überprüfung der Sensitivität des Enterobacteriaceen- Nachweissystems mit genomischer DNA von Bakterien 73 Abb. 3.13: Überprüfung der Sensitivität des Enterobacteriaceen- Nachweissystems mit bakteriellen Zelllinien 75 Abb. 3.14: Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der Untersuchung von Lebensmittelproben 78 Abb. 3.15: Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der Untersuchung von Säuglingsnahrung 81
  • 7. Inhalt V VERZEICHNIS DER TABELLEN Seite Tab. 1.1: Häufig vorkommende, lebensmittelübertragene Gattungen und Spezies der Familie Enterobacteriaceae sowie Beispiele für deren Vorkommen und Bedeutung 7 Tab. 1.2: Taxonomische Einteilung der Gattung Salmonella in Spezies und Subspezies sowie Anzahl der Serovare im Jahr 2002 8 Tab. 2.1: Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitäts- und Sensitivitäts- tests 26 Tab. 2.2: Nicht-Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitätstests 27 Tab. 2.3: Generierte Primer und Sonden mit Bindungsstellen innerhalb des DNA-Bereichs für 23S rRNA – Spacer – 5S rRNA im ribosomalen Operon 32 Tab. 2.4: Generierte Primer und Sonde für die Konstruktion und Detektion der internen Amplifikationskontrolle 34 Tab. 2.5: Tiefgefrorene Lebensmittel 35 Tab. 2.6: Säuglingsnahrung und Volleipulver 36 Tab. 3.1: Bakterienstämme der Familie Enterobacteriaceae, deren 23S- 5S-Sequenzen im Alignment als Grundlage für das Generieren der Primer fw1 - fw8 und rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) dienten 52 Tab. 3.2: Bakterienstämme diverser taxonomischer Gruppen, deren 23S- 5S-Sequenzen im Alignment als Grundlage für das Generieren der Primer fw1 - fw8 und rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) dienten 52 Tab. 3.3: Spezifische Amplifikation mit den Primern fw1 – fw8 und rev1 – rev8 57 Tab. 3.4: Inklusivität: Im Spezifitätstest des Real-Time-PCR-System detektierte Stämme der Familie Enterobacteriaceae 68 Tab. 3.5: Exklusivität: Alle im Spezifitätstest des Real-Time-PCR-Systems mit Nicht-Enterobacteriaceen-Spezies überprüften Stämme 70 Tab. 3.6: Ergebnisse der Untersuchung von Lebensmitteln diverser Produktgruppen 79 Tab. 3.7 Ergebnisse der Untersuchung von Säuglingsnahrung und Volleipulver 82
  • 8. Inhalt VI VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN UND ZEICHEN °C Grad Celsius µg Mikrogramm (= 10-6 Gramm) µl Mikroliter (= 10-6 Liter) µm Mikrometer (= 10-6 Meter) µM mikromolar (= 10-6 molar) A Adenin A. Aeromonas Abb. Abbildung abs. absolut Abs. Absatz Acc. (englisch Accession) Zugang Aci Arthrobacter citreus ag Attogramm (= 10-18 Gramm) Amp Ampicillin API (englisch Analytical Profile Index) analytischer Profilindex Aqua dest. (lateinisch Aqua destillata) destilliertes Wasser ATCC American Type Culture Collection BCD BIOTECON Diagnostics GmbH BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Basenpaar BSA (englisch Bovine Serum Albumin) Rinderserumalbumin C Cytosin C. Citrobacter CASO Caseinpepton-Sojamehlpepton CP (englisch crossing point) dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytidintriphosphat DGHM Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie dGTP Desoxyguanosintriphosphat DNA (englisch deoxyribonucleic acid) Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleosidtriphosphat DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen dTTP Desoxythymidintriphosphat E. Escherichia Ed. Edwardsiella Ed. (englisch editor) Herausgeber EDTA Ethylendiamintetraessigsäure Ent. Enterobacter Er. Erwinia et al. (lateinisch et alii) und andere EtBr Ethidiumbromid Fa. Firma FAO (englisch Food and Agriculture Organization) Welternährungsorganisation fg Femtogramm (= 10-15 Gramm) Fmax maximale Fluoreszenz fw (englisch forward) vorwärts g Gramm G Guanin GÄ Genomäquivalent h (englisch hour) Stunde H. Hafnia Hrsg. Herausgeber HS Heringssperma I Inosin IAK Interne Amplifikationskontrolle
  • 9. Inhalt VII ICMSF (englisch International Comission on Microbiological Specifications for Foods) Internationale Kommission für mikrobiologische Lebensmittelspezifikationen IPTG Isopropyl-Thio-β-D-Galactopyranosid K. Klebsiella Kap. Kapitel Kat. Katalog KbE Kolonie bildende Einheit LB Luria Bertani LPSN List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature m Meter M. Morganella M = A + C M molar Mae Methanococcus aeolicus mg Milligramm (= 10-3 Gramm) min (englisch minute) Minute ml Milliliter (= 10-3 Liter) mM millimolar (= 10-3 molar) Mse Micrococcus spec. NCBI National Center of Biotechnology Information NCTC National Collection of Type Cultures ng Nanogramm (= 10-9 Gramm) nm Nanometer (= 10-9 Meter) nM nanomolar (= 10-9 molar) Nr. Nummer OECD (englisch Organisation for Economic Cooperation and Development) Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung P. Plesiomonas Pa. Pantoea p. a. (lateinisch per analysis) zur Analyse PCR (englisch Polymerase Chain Reaction) Polymerase-Kettenreaktion pg Pikogramm (= 10-12 Gramm) pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration pmol Pikomol (= 10-12 Mol) Prot. Proteus Prov. Providencia R = A + G rev (englisch reverse) rückwärts RNA (englisch ribonucleic acid) Ribonukleinsäure rpm (englisch revolutions per minute) Umdrehungen pro Minute rRNA ribosomale RNA S. Salmonella S Sedimentationskoeffizient Se. Serratia sek Sekunde Sh. Shigella spec. (lateinisch Species) Spezies, unbekannte Art ssp. Subspezies T Thymin Tab. Tabelle Taq Thermus aquaticus TBE Tris Borat EDTA Puffer TE Tris EDTA Puffer Tm (englisch melting) Schmelztemperatur Tris Tris-(hydroxymethyl)aminomethan tRNA transfer RNA U (englisch unit) Einheit ü. N. über Nacht
  • 10. Inhalt VIII UNG Uracil-DNA-N-Glycosylase UV UltraViolett V. Vibrio V/cm Volt pro Zentimeter v/v (englisch volume per volume) Volumen pro Volumen VRBD (englisch Violet-red Bile Dextrose Agar) Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Glucose) WHO (englisch World Health Organization) Weltgesundheitsorganisation w/v (englisch weight per volume) Gewicht pro Volumen w/w (englisch weight per weight) Gewicht pro Gewicht x g Vielfaches der Erdbeschleunigung g (g = 9,81 m/s2 ) X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Galactose Y = C + T Y. Yersinia
  • 11. I Einleitung 1 I EINLEITUNG 1 THEORETISCHER TEIL ENTEROBACTERIACEAE IN LEBENSMITTELN 1.1 Lebensmittel als Überträger von Infektionkrankheiten Lebensmittel sind Mittel zum Leben. Sie dienen der Lebenserhaltung und dem Genuss. Aber ebenso können Lebensmittel Überträger von Krankheitserregern des Menschen sein. Ihr Verzehr führt zu Erkrankungen, die mitunter tödlich enden. Nach Definition der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sind durch Lebensmittel verursachte Erkrankungen „Krankheiten infektiöser oder toxischer Natur, verursacht durch Agenzien, die durch Nahrungsaufnahme in den Körper gelangen“ (Anonymus 2002a). Kontaminierte Lebensmittel weisen einen gesundheitsgefährdenden Befall mit Mikroorganismen und ihren Toxinen und/oder Rückständen von pharmazeutischen, umweltrelevanten und anderen Substanzen auf. Die vorliegende Arbeit richtet den Fokus auf Lebensmittelkontaminationen mit Bakterien als Ursachen für lebensmittelbedingte Erkrankungen. Durch Lebensmittel übertragene Infektionskrankheiten stellen weltweit ein wachsendes Gesundheits- und Wirtschaftsproblem dar, sowohl in Entwicklungsländern als auch in hochentwickelten Industrieländern (Elmi 2004). Bis zu 30 % der Bevölkerung in allen Industrieländern sind jedes Jahr von lebensmittelassoziierten Infektionen betroffen (Anonymus 2002a). In den USA erkranken nach einer Studie jährlich ungefähr 76 Millionen Bürger, circa 325.000 Personen werden in ein Krankenhaus eingewiesen und etwa 5.000 Erkrankte sterben an den Folgen der durch Lebensmittel übertragenen Krankheiten (Mead et al. 1999). In England und Wales werden pro Jahr rund 2,4 Millionen Erkrankungen, etwa 21.000 Krankenhauseinweisungen und über 700 Todesfälle als lebensmittelbedingt ermittelt (Adak et al. 2002). Nach Angaben der WHO ist davon auszugehen, dass diese Belastung in gleichem Ausmaß auf die meisten Länder der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) zutrifft (Rocourt et al. 2003a). Innerhalb der letzten zwei Jahrzehnte haben lebensmittelbedingte Erkrankungen der Bevölkerung stark an Bedeutung gewonnen. Eine Reihe von Faktoren sind für diese
  • 12. I Einleitung 2 Entwicklung verantwortlich: Intensive Massentierhaltung ermöglicht eine schnelle Durchseuchung der Tierbestände mit pathogenen Keimen wie Salmonellen, die zum Beispiel durch kontaminierte Futtermittel eingeführt werden (Jansen et al. 2005). Der Einsatz von Antibiotika als Masthilfsmittel moderner Tierhaltung führt zur Verbreitung von Antibiotikaresistenzen humanpathogener Bakterienstämme, die eine Therapie betroffener Patienten wesentlich erschweren (Klare et al. 1995, Poppe et al. 2006). Nach dem Verzehr von Lebensmitteln, die mit resistenten Enterobacteriaceen kontaminiert sind, können diese in der Darmflora persistieren oder sich vermehren und die Resistenz auf weitere Bakterien einschließlich pathogene Arten übertragen. Durch das Bundesinstitut für Risikobewertung wurde in Deutschland in den letzten zehn Jahren bei Salmonella Isolaten verschiedener Serotypen aus Tieren, Lebensmitteln, Futtermitteln und der Umwelt ein Anstieg der Multiresistenz gegenüber antimikrobiell wirksamen Substanzen nachgewiesen. So wurden in den Jahren 2000 bis 2002 Stämme des Serovars Salmonella Typhimurium mit Mehrfachresistenzen gegenüber Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Tetracyclin und Sulfonamiden aus Lebensmitteln isoliert (Helmuth et al. 2003). Der Verzehr von naturbelassenem, unbehandeltem Obst und Gemüse gilt heutzutage als besonders gesund. Fehlende Behandlung zur Keimreduktion sowie Einsatz natürlicher Dünger und ungeklärten Abwassers mit möglicher Kontamination für die Bewässerung in der Landwirtschaft erhöhen aber das Risiko von Infektionen (Beuchat und Ryu 1997, Tauxe et al. 1997). Zu einem größeren Krankheitsausbruch durch Toxin produzierende Citrobacter freundii kam es in einem Kindergarten in Deutschland nach dem Verzehr von Butter mit frischer Petersilie. Vehikel für die Lebensmittelinfektion war die Petersilie aus biologischem Anbau, die mit kontaminierter Schweinegülle gedüngt worden war (Tschäpe et al. 1995). Im Rahmen einer Erfassung über weltweite Krankheitsausbrüche durch mit Enterobacteriaceen kontaminierte rohe Sprossen, besonders von Alfalfa und Mungbohnen, kommen Taormina et al. (1999) zu der Empfehlung, dass Kinder, Ältere und Menschen mit eingeschränkter Immunabwehr als besonders gefährdete Personen grundsätzlich keine rohen Sprossen verzehren sollten. Im Vergleich zu frischem Obst und Gemüse stellen Sprossen ein deutlich höheres Risiko dar. Bakterien in kontaminierten Samen können sich durch den Prozess des Sprossens bei 21 °C bis 25 °C und viel Feuchtigkeit drastisch vermehren, ohne sichtbare Anzeichen von Qualitätsbeeinträchtigung zu hinterlassen (Breuer et al. 2001). Auch die Lebensmittelindustrie hat sich auf das geänderte Verbraucherverhalten eingestellt und stellt Produkte her, die keine Konservierungsstoffe mehr enthalten. Bei Nichtbeachtung entsprechender Lager- und Transportbedingungen können Keime in diese Lebensmittel gelangen und sich dort vermehren (Ammon und Bräunig 2002). Die Entwicklung der Lebensmitteltechnologie führt zu einem immer größer
  • 13. I Einleitung 3 werdenden Angebot von Nahrungsmitteln, besonders sogenanntem „ready-to-eat food“. Diese Produkte werden oft als Tiefkühlware über längere Zeiträume gelagert und können zur Verbreitung kälteadaptierter pathogener Keime beitragen (Rocourt et al. 2003b). Moderne Vermarktungsstrategien und globaler Lebensmittelhandel erhöhen das Risiko, dass durch zentralisierte Herstellung und Bearbeitung der Nahrungsmittel und verlängerte Transportwege und -zeiten bei einer Kontamination eine Vielzahl von Menschen weltweit betroffen sein können, wobei die Vielfalt möglicher Krankheitserreger für jeden Einzelnen zunimmt (Rocourt et al. 2003a). In den USA handelt es sich bei dem Angebot an frischem Obst und Gemüse, welches in Lebensmittelgeschäften und Restaurants erhältlich ist, bereits zu über 75 % um importierte Ware aus aller Welt (Hedberg et al. 1994). Ständig wachsender weltweiter Tourismus führt ebenso zu einer Globalisierung lebensmittelbedingter Erkrankungen. Nach einer Studie der WHO sind 80 % bis 90 % der gemeldeten Salmonellosen in skandinavischen Ländern auf internationalen Tourismus zurückzuführen, und die Wahrscheinlichkeit, auf Reisen mit einer Lebensmittelinfektion konfrontiert zu werden, liegt, je nach Reiseziel, bei 20 % bis 50 % (Käferstein et al. 1997). Auch demographische Veränderugen – eine immer älter werdende Bevölkerung und mehr immungeschwächte Personen – führten dazu, dass die Zahl lebensmittelbedingter Infektionskrankheiten in den letzten zwei Jahrzehnten deutlich angestiegen ist (Ammon 2005). Die Vielfalt von Risikolebensmitteln, die als Überträger für Krankheitskeime dienen können, ist auffallend groß. Mikrobiologisch kontaminierte Lebensmittel, die einem WHO-Bericht zufolge im Jahr 2000 in den USA zu 1493 Krankheitsausbrüchen führten (Rocourt et al. 2003a), sind in Abbildung 1.1 dargestellt. In 773 der Ausbrüche konnten die betroffenen Lebensmittel ermittelt werden. 101 Ausbrüche (etwa 13 % der Fälle, in denen das Lebensmittel bekannt war) wurden durch den Verzehr von Fleisch und Fleischprodukten ausgelöst. 81 Ausbrüche wurden durch kontaminiertes Geflügel, 79 Ausbrüche durch Fisch und Meeresfrüchte (jeweils rund 10 %) und 64 Ausbrüche durch Obst und Gemüse (circa 8 %) ausgelöst. In 13 Fällen (etwa 2 %) waren Getreide oder Teigwaren beziehungsweise Süßwaren kontaminiert. In 12 (rund 2 % der Ausbrüche mit bekannter Kontaminationsquelle) der Fälle war der Konsum von Ei und Eiprodukten oder von Milch und Milchprodukten Ursache für Erkrankungen. Die übrigen kontaminierten Lebensmittel dieser Studie waren in 183 Fällen der Krankheitsausbrüche Mischgerichte (etwa 23 %), 157 mal zusammengesetzte Lebensmittel (rund 20 %) und 58 mal sonstige Lebensmittel (etwa 8 %).
  • 14. I Einleitung 4 Mikrobiologisch kontaminierte Lebensmittel, die zu Krankheitsausbrüchen führten Obst und Gemüse 8% Ei und Eiprodukte 2% Milch und Milchprodukte 2% Süßwaren 2% Fleisch und Fleischprodukte 13% Getreide, Teigwaren 2% Zusammengesetzte Lebensmittel 20% Sonstige Lebensmittel 8% Fisch und Meeresfrüchte 10% Geflügel 10% Mischgerichte 23% Abb. 1.1: Prozentuale Verteilung der bekannten mit Mikroorganismen kontaminierten Lebensmittel, deren Verzehr im Jahr 2000 zu Ausbrüchen von Infektionskrankheiten in den Vereinigten Staaten von Amerika führten (nach Rocourt et al. 2003a) Häufigstes Krankheitsbild lebensmittelassoziierter Erkrankungen sind Gastroenteritiden. Der Krankheitsverlauf dieser Magen-Darm-Infektionen reicht von geringer Gesundheitsbeeinträchtigung ohne Notwendigkeit ärztlicher Behandlung über Erkrankungen mit stationärer Behandlung bis hin zu schwerer systemischer Infektion und Todesfällen. Das Ausmaß der Erkrankung hängt von einer Reihe Faktoren wie gesundheitlicher Konstitution, Ernährung und Lebensalter ab. Infolgedessen sind Auftreten, Schwere der Erkrankung und Sterblichkeitsrate durch Lebensmittelinfektionen in unterschiedlichen Bevölkerungsgruppen verschieden stark vertreten. Besonders gefährdet und damit wesentlich häufiger betroffen sind Kinder, Schwangere, Immungeschwächte und ältere Menschen (Levine et al. 1991). Zum Personenkreis dieser Risikogruppe zählten in den 1990er Jahren bereits 20 % der Menschen in den USA, wobei die Tendenz deutlich steigend ist (Gerba et al. 1996, Rocourt et al. 2003a). Mishu et al. (1994) führten in den USA eine Erhebung zu Krankheitsausbrüchen durch lebensmittelbedingte Infektionen mit dem Serovar Salmonella Enteritidis in den Jahren 1985 – 1991 durch. Dabei kamen sie zu dem Ergebnis, dass die Rate der Todesfälle in Altenheimen und Krankenhäusern 70fach höher liegt als in anderen Einrichtungen.
  • 15. I Einleitung 5 1.2 Enterobacteriaceae als Ursachen für Lebensmittel- infektionen Typische Keime bakterieller Lebensmittelinfektionen sind neben Campylobacter, Listeria und Vibrio häufig Vertreter der Familie Enterobacteriaceae. Salmonellosen, ausgelöst durch die Enterobacteriaceen-Gattung Salmonella, gehören zu den weltweit häufigsten lebensmittelassoziierten Infektionen und führen jährlich zu mehreren Millionen gemeldeten Erkrankungen und tausenden Todesfällen (Anonymus 2005a). Die Bakterien der Familie Enterobacteriaceae (Rahn 1937) mit der Typspezies Escherichia coli gehören zur γ-Subklasse der Proteobacteria und umfassen mehr als 200 Spezies in 46 Gattungen. Sie sind gramnegative, nicht sporulierende Stäbchen mit einer Länge von 1,0 bis 6,0 µm und einem Durchmesser von 0,3 bis 1,5 µm. Enterobacteriaceen sind fakultativ anaerob, Oxidase-negativ, fermentieren Glucose und reduzieren Nitrat zu Nitrit (Brenner 1984). Die Fähigkeit, Laktose zu vergären, differenziert Coliforme, wie zum Beispiel Vertreter der Gattungen Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, und Citrobacter von solchen Enterobacteriaceen, die keine Laktose umsetzen, wie Shigella, Proteus und fast alle Salmonellen. Molekularbiologisch wird auch Plesiomonas shigelloides trotz Oxidase-Aktivität aufgrund genetischer Verwandtschaft zu den Enterobacteriaceae gezählt (Ruimy et al. 1994). Enterobacteriaceen kommen weit verbreitet vor, als Kommensale oder Krankheitserreger im Darm (griechisch enteron: Eingeweide) von Tieren, vom Insekt bis zum Menschen, sowie ubiquitär in der Umwelt, auf Pflanzen, im Wasser und im Boden. Als fakultativ anaerobe Eubakterien tolerieren sie für ihr Wachstum sowohl positive als auch negative Redoxpotentiale und sind damit äußerst anpassungsfähig. Diverse Stämme sind humanpathogen, phytopathogen oder haben als Saprobionten beim Verderb von Lebensmitteln eine wichtige Bedeutung. Häufig treten sie als opportunistische Krankheitskeime auf, für etwa 50 % der nosokomialen Infektionen in den USA sind Enterobacteriaceen verantwortlich (Paradis et al. 2005). In diversen Lebensmitteln wie Fleisch, Geflügel, Eiprodukte, Gemüse, Getreide, Kräuter, Milchprodukte und Süßwaren wurden Enterobacteriaceae nachgewiesen. Als Kontaminant in Trockenmilch-Säuglingsnahrung ist insbesondere das Vorkommen der Enterobacteriaceae-Spezies Enterobacter sakazakii - erstmalig als neue Spezies definiert von Farmer et al. (1980) - von großer Bedeutung im Rahmen lebensmittelübertragener Erkrankungen und hat in den vergangenen Jahren für viel Aufsehen gesorgt (Anonymus 2002c, Bowen und Braden 2006). Während Ent. sakazakii grundsätzlich in den unterschiedlichsten Lebensmittelgruppen
  • 16. I Einleitung 6 nachgewiesen wurde, trat der Keim ausschließlich in pulverförmiger Kindernahrung in Verbindung mit Krankheitsausbrüchen auf (Anonymus 2005c). Bei Säuglingen führen Infektionen mit Ent. sakazakii zu neonatalen Meningitiden, Septikämien und nekrotisierenden Enterocolitis-Erkrankungen mit extrem hohen Mortalitätsraten von 40 – 80 %. Das Auftreten der Erkrankungen wurde bereits in zahlreichen Ländern wie England, den Niederlanden, Griechenland, Kanada und den USA beschrieben (Nazarowec-White und Farber 1997). Selbst geringste Mengen von Enterobacter sakazakii in sprühgetrockneter Säuglingsnahrung bedeuten eine Gefährdung der Gesundheit, da sie sich während der Speisenzubereitung und Aufbewahrung der rehydrierten Nahrung rapide vermehren können (Forsythe 2005, Kandhai et al. 2006). Bisher gibt es zwar keine gesicherten epidemiologischen Untersuchungen über die minimale infektiöse Dosis (Lehner und Stephan 2004), aufgrund einer Risikobewertung durch Welternährungsorganisation und Weltgesundheits- organisation (FAO/WHO) kann aber davon ausgegangen werden, dass es bei einem Gehalt von 1 KbE/g Trockenprodukt nach Zubereitung der Kindernahrung zur Erkrankung kommen kann (Anonymus 2004a). Die Detektion von Enterobacteriaceen in Lebensmitteln spielt als Indikator für gesundheitsgefährdende Hygienemängel eine wichtige Rolle. In Tabelle 1.1 sind die häufigsten Vertreter lebensmitelassoziierter Gattungen und Spezies sowie deren häufiges Vorkommen und Bedeutung aufgeführt. Die weltweit bedeutendsten, für Lebensmittelinfektionen verantwortlichen Enterobacteriaceae sind Salmonellen und werden im Folgenden ausführlicher behandelt.
  • 17. I Einleitung 7 Tab. 1.1: Häufig vorkommende, lebensmittelübertragene Gattungen und Spezies der Familie Enterobacteriaceae sowie Beispiele für deren Vorkommen und Bedeutung (nach Baumgart 2006, Müller und Weber 1996) Gattung Spezies Vorkommen und Bedeutung Citrobacter C. amalonaticus, C. freundii, C. koseri Darm; Durchfall (Verotoxinbildung) durch einige C. freundii-Stämme Edwardsiella Ed. tarda Darm; Durchfall durch Ed. tarda Enterobacter Ent. aerogenes, Ent. cloacae, Ent. sakazakii Pflanzen, Darm, Wasser, Boden; Verderb von Lebensmitteln, Ent. sakazakii in Milchpulvernahrung für Säuglinge (Mortalitätsraten 40 - 80 %) sowie in Käse, Fleisch, Gemüse, Getreide, Kräutern, Gewürzen und erhitzter Milch Erwinia Er. amylovora, Er. carotovora Pflanzen; Verderb pflanzlicher Lebensmittel durch Pektinasen, phytopatogen (Blockade des Wasser- leitungssystems) Escherichia E. coli, E. hermanii, E. vulneris Darm; Durchfall, Kontamination und Verderb diverser Lebensmittel, E. coli fakultativ pathogen, Hygieneindikator, Pathovare enterovirulenter E. coli : enterohämorrhagische E. coli (EHEC), Enterotoxin bildende E. coli (ETEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), enteropathogene E. coli (EPEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), diffus adhärente E. coli (DAEC) Hafnia H. alvei Darm, Boden, Wasser; Verderb eiweißreicher Lebensmittel, Histaminbildung bei Fischen, fakultativ pathogen bei Immunsupprimierten Klebsiella K. pneumoniae, K. oxytoca Darm, Wasser, Boden, Luft; Verderb von Lebensmitteln, K. pneumoniae ist pathogen Morganella M. morganii Darm, Wasser, Boden; Verderb eiweißreicher Lebensmittel Pantoea Pa. agglomerans, Pa. dispersa Weit verbreitet in der Natur; Pa. agglomerans vermehrt sich bei 4 °C und führt zum Verderb von Frischfleisch Plesiomonas P. shigelloides Geflügel, Wasser, nachgewiesen in Muscheln, Fisch, Kot von Rind, Geflügel, Schwein, Schaf; Durchfall Proteus Prot. mirabilis, Prot. vulgaris Darm, Wasser, Boden; Verderb eiweißreicher Lebensmitttel (Bildung von Ammoniak und Ketosäuren durch oxidative Desaminierung von Aminosäuren) Providencia Prov. alcalifaciens, Prov. stuartii Darm, Wasser, Boden; Verderb eiweißreicher Lebensmittel; Durchfall Salmonella S. enterica Darm, Lebensmittel tierischen Ursprungs, über Verunreinigungen auch pflanzliche Lebensmittel und Futtermittel; pathogen, Infektionskrankheiten, Durchfall Serratia Se. marcescens, Se. liquefaciens Darm, Pflanzen, Insekten, Boden; Verderb tierischer Lebensmittel Shigella Sh. boydii, Sh. dysenteriae, Sh. flexneri, Sh. sonnei Darm, Lebensmittel, Wasser; pathogen, Durchfall (Ruhr) Yersinia Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis Darm, Wasser, Schweinefleisch, Milchprodukte; Y. pseudotuberculosis und bestimmte Serovare von Y. enterocolitica sind Erreger intestinaler Yersiniosen des Menschen
  • 18. I Einleitung 8 1.2.1 Häufigster Vertreter lebensmittelassoziierter Entero- bacteriaceae: Salmonella Salmonellen, benannt nach dem amerikanischen Bakteriologen Daniel Elmer Salmon, sind 0,7 bis 1,5 µm mal 2,0 bis 5,0 µm große Stäbchenbakterien. Mit Ausnahme von Salmonella Gallinarum und Salmonella Pullorum sind sie peritrich begeißelt und beweglich. Sie bilden Säure und Gas aus Glucose, Mannit und Maltose und sind, abgesehen von den Subspezies arizonae und diarizonae, Laktose negativ. Gewöhnlich bilden sie Schwefelwasserstoff aus Thiosulfat und assimilieren Citrat (Brenner 1984). Das Genus Salmonella gliedert sich in zwei Arten, die Typspezies S. enterica und die Spezies S. bongori und in sechs Unterarten der Spezies S. enterica. Zur Zeit sind 2541 Serovare der Gattung benannt, von denen 1504 zur Subspezies S. enterica ssp. enterica gehören (Le Minor und Popoff 1987, Popoff et al. 2004). Eine Übersicht ist in Tabelle 1.2 gegeben. Die antigenischen Bezeichnungen der Salmonella- Serotypen werden durch das WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella am Pasteur Institut in Paris festgelegt und regelmäßig aktualisiert. Neue Serovare werden in den Updates des Kauffmann-White-Schemas aufgeführt (Brenner et al. 2000). Tab. 1.2: Taxonomische Einteilung der Gattung Salmonella in Spezies und Subspezies sowie Anzahl der Serovare im Jahr 2002 (Popoff et al. 2004, Tindall et al. 2005) Die korrekte Bezeichnung von, zum Beispiel, dem Serovar typhimurium müsste Salmonella enterica ssp. enterica Serovar typhimurium heißen. Um derartige Namen in der Praxis zu vereinfachen, werden die Stämme der Subspezies enterica nach Le Minor und Popoff (1987) mit großem Anfangsbuchstaben und nicht kursiv geschrieben. Die Bezeichnung lautet also Salmonella Typhimurium. Die Stämme der Taxon Bezeichnung Anzahl Serovare Genus Salmonella 2541 Spezies S. enterica 2519 Subspezies S. enterica ssp. enterica 1504 S. enterica ssp. salamae 502 S. enterica ssp. arizonae 95 S. enterica ssp. diarizonae 333 S. enterica ssp. houtenae 72 S. enterica ssp. indica 13 Spezies S. bongori 22
  • 19. I Einleitung 9 übrigen fünf Subspezies und die der Spezies S. bongori werden mit der Kurzbezeichnung und der Antigenformel benannt, zum Beispiel Salmonella IIIb 53:r:z23 (Bockemühl und Seeliger 1985). Die Angabe 53 kennzeichnet das somatische O-Antigen aus Lipopolysacchariden der Zellwand, die Bezeichnung r und z zwei Phasen des Geißelantigens H. Beide Antigene werden durch Objektträger- Agglutination mittels käuflicher Antiseren nachgewiesen. Die Einteilung der Serovare erfolgt nach dem Antigenschema von Kauffmann-White. Mit Bezug auf Pathogenese, klinischem Erscheinungsbild und Epidemiologie werden Salmonellen in die typhösen und die enteritischen Salmonellen unterteilt. Die Serovare Typhi, Erreger des Typhus, und Paratyphi A, B, C, Erreger des Paratyphus sind die typhösen Salmonellen. Alle übrigen Serovare gehören zu den enteritischen Salmonellen und verursachen beim Menschen meist Enteritiden. Alle Salmonellen gelten als pathogen, in den Industerieländern treten die Enteritis-Salmonellen besonders häufig auf. 1.2.1.1 Enteritis-Salmonellose Die Salmonellose ist die häufigste und am weitesten verbreitete durch Lebensmittel übertragene Infektionskrankheit. In den USA erkranken jährlich etwa 1,4 Millionen Menschen an einer Enteritis-Salmonellose und rund 400 Erkrankte sterben an den Folgen (Voetsch et al. 2004). Im Jahr 1995 waren es in England und Wales 102.227 Einwohner, die an einer Infektion mit Enteritis-Salmonellen erkrankten, 3.412 von ihnen mussten im Krankenhaus behandelt werden und 268 der Betroffenen starben an der Erkrankung (Adak et al. 2002). Für Kalifornien erfassten Trevejo et al. (2003) in einer epidemiologischen Studie über einen Zeitraum von zehn Jahren Erkrankungen, Sterberaten und Hospitalkosten, die durch Infektionen mit Enteritis- Salmonellen verursacht wurden. Die ermittelten Kosten für Salmonellose- Behandlungen im Krankenhaus lagen in den Jahren 1990 bis 1999 bei rund 200 Millionen Dollar. Erregerreservoir dieser Zoonose ist vorwiegend der Darmtrakt zahlreicher Tiere wie Schweine, Rinder, Kälber, Geflügel, Wild, Tauben, Möwen, Muscheln, Fische, Nager und Insekten. Die Salmonella-Übertragung vom Tier auf den Menschen erfolgt überwiegend durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln tierischen Ursprungs, wobei die Tiere in den seltensten Fällen klinisch erkrankt sind. Besonders häufig betroffen sind Geflügel – Huhn, Ente, Gans und Pute – , rohe Eier und Roheispeisen – Eischäume, Cremes, Mayonnaise und Speiseeis – , rohes Fleisch und nicht oder nicht ausreichend erhitzte Fleischprodukte – Hackfleisch, Rohwurst und Fleischsalate – sowie nicht pasteurisiete Milch (Anonymus 2002b). Neben tierischen Produkten können durch Einsatz natürlicher Dünger oder
  • 20. I Einleitung 10 Verunreinigungen auch pflanzliche Lebensmittel und Futtermittel Salmonellen enthalten. So waren beispielsweise der Verzehr von Tomaten (Hedberg et al. 1999), Sprossen (Van Beneden et al. 1999, Mohle-Boetani et al. 2002), nicht sachgemäß zubereitetem Kräutertee (Koch et al. 2005) und Schokolade (Werber et al. 2005) Augangspunkt von Salmonella-Infektionen. Direkte Mensch-zu-Mensch- Übertragungen spielen bei Enteritis-Salmonellosen nur eine sehr untergeordnete Rolle. Nach einer Infektion des Menschen mit enteritischen Salmonellen beträgt die Inkubationszeit, abhängig von der Infektionsdosis, meist 12 - 36 Stunden, mitunter aber auch 5 - 72 Stunden. Es kommt zu Gastroenteritiden mit wässrigem, teilweise blutigem Durchfall, Leibschmerzen, Übelkeit, Erbrechen und Kopfschmerzen, zum Teil auch mit Fieber. Die Symptome dauern in der Regel wenige Stunden oder Tage, oft kommt ein leichter oder symptomloser Verlauf vor. Bei schweren klinischen Fällen treten Schüttelfrost, höheres Fieber, Kollaps und weitere systemische Krankheitsbilder auf. Die Keimausscheidung enteritischer Salmonellen dauert drei bis sechs Wochen, bei Säuglingen aber auch mehrere Monate (Anonymus 2002b). Während des gastroenteritischen Infektionsverlaufs überwinden die Salmonellen die Infektabwehr und gelangen über den Magen in den Darm. Dabei müssen sie gegenüber der Magensäure mit pH-Werten von 1,0 – 4,0 bestehen. So kann zum Beispiel S. Typhimurium mit der Synthese von Säureschockproteinen und Induktion von Protonenpumpenaktivität auf den Säurestress reagieren und ist damit in der Lage, in extrem saurem Milieu zu überleben (Foster und Hall 1991, Hall und Foster 1996). Im Verlauf der Pathogenese bewirken von Salmonella kodierte Faktoren wie SEP14, SEF17 und SEF21 als Adhäsine die Anhaftung der Bakterien an die Epithelzellen des Dünndarms. Somit verhindern sie ihr Ausscheiden durch die Darmperistaltik und können sich lokal vermehren. Nach dieser Kolonisation dringen sie über Invasine in die Zellen ein und es kommt zur Bildung von Toxinen. Thermolabile Exotoxine, die zum unkontrollierten Wasser- und Elektrolytverlust führen, wurden als Enterotoxin Stn und zotlike (zonula occludens toxin) Toxine beschrieben. Letztere kommen in allen Enteritis-Salmonellen vor und führen zum Abbau der „tight junctions“, die für den kontrollierten Stofftransport durch die Epithelzellen verantwortlich sind (D’Aoust 1991, Tschäpe und Prager 1995). Neben den Exotoxinen, die bereits während des Lebenszyklus der Salmonellen sekretiert werden können, wirken auch thermostabile Endotoxine, die nicht kontinuierlich in das umgebende Medium abgegeben werden. Diese Lipopolysaccharide (LPS) sind Bestandteil der äußeren Membran der Zellwand gramnegativer Bakterien, also auch aller anderen Enterobacteriaceen. Sie werden im Allgemeinen erst durch Autolyse oder artifizielle Zerstörung der Zellen als Zerfallsprodukte freigesetzt. LPS bestehen aus drei Komponenten, einem Polysaccharid (O-Antigen), einem Core-
  • 21. I Einleitung 11 Oligosaccharid und einem Lipid. Die Lipid-Komponenete, bezeichnet als Lipid A, löst die Bildung von Proteinen wie Tumor-Nekrose-Faktor (TNF-α) und Interleukin-1 (IL- 1ß) aus und ist für die Entstehung von Entzündungen und Toxinogenität verantwortlich (Rietschel et al. 1994, Reynolds et al. 2006). Durch die ausgelösten Durchfallerkrankungen kommt es in der Regel zum Ausscheiden der enteritischen Salmonellen. Die Salmonellose tritt in Form von sporadischen Fällen, Familienerkrankungen oder als Epidemien auf und ist die nach dem Infektionsschutzgesetz (IfSG) am häufigsten in Deutschland gemeldete, durch Lebensmittel übertragene Krankheit des Menschen (Jansen et al. 2005). Nach IfSG §7 ist jeder Nachweis von Salmonellen unverzüglich, innerhalb von 24 Stunden, durch das Labor, welches den Nachweis erbracht hat, dem zuständigen Gesundheitsamt zu melden. Nach einem massiven Anstieg registrierter Fälle im Jahr 1992 ist die Salmonellose seit 1993 rückläufig. Im Jahr 2004 kam es in Deutschland aber immer noch zu 56.947 Errkankungen mit 52 Todesfällen. Unter den Verstorbenen befanden sich ein einjähriges und ein zweijähriges Kind sowie eine 41-jährige Frau, acht Personen zwischen 60 und 69 Jahren und 41 Personen im Alter von mindestens 70 Jahren. (Anonymus 2005b). Darüber hinaus ist von einer beträchtlichen Dunkelziffer an Salmonellosen auszugehen, da wegen der oft nur kurzen, leichten und selbstlimitierenden Symptomatik häufig weder ein Arzt hinzugezogen noch eine Erregerdiagnostik eingeleitet wird (Anonymus 2003a). Somit bleibt die Salmonellose weiterhin eine bedeutende lebensmittelassoziierte Infektionskrankheit. Abbildung 1.2 zeigt den quantitativen Verlauf registrierter Enteritis-Salmonellosen des Menschen in Deutschland in den Jahren 1991 bis 2006 sowie den Anteil der häufigsten krankheitsauslösenden Serovare. Die größte Bedeutung haben die Stämme der Serovare Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium. Epidemiologische Langzeitanalysen zeigen, dass europaweit seit Mitte der 1980er Jahre das Serovar Enteritidis vorherrscht, nachdem in den Jahren zuvor S. Typhimurium als häufigster Vertreter nachgewiesen wurde (Rodrigue et al. 1990). Im Rahmen einer schwedischen Studie über Salmonellenerkrankungen und dadurch verursachte Kosten in der Europäischen Union, ermittelten de Jong und Ekdahl (2006) innerhalb des Erfassungsszeitraums von 1997 bis 2003 insgesamt 13.158 Patienten in Schweden, die nach einer Europareise an einer Infektion mit Salmonella erkrankt waren. Von diesen Personen waren 10.637 (81 %) an einer Infektion mit S. Enteritidis und 1.203 (9 %) an einer Infektion mit S. Typhimurium erkrankt. In Untersuchungen zur Toxinogenität von Salmonellen wurde gezeigt, dass in allen Serovaren der Spezies S. enterica das Toxin-Gen stn im Genom lokalisiert ist, tatsächlich exprimiert wird das Gen aber vor allem in den Serovaren S. Enteritidis
  • 22. I Einleitung 12 und S. Typhimurium, was die auffällige Häufung dieser Serovare in der Diagnostik erklären könnte (Prager et al. 1995). Nach Angaben des infektionsepidemiologischen Jahrbuchs meldepflichtiger Krankheiten für 2004 (herausgegeben vom Robert Koch Institut) wurden im Jahr 2004 in Deutschland für 91 % der übermittelten 56.947 Salmonellose-Fälle genaue Angaben zum Serovar gemacht. In 67 % der Fälle handelte es sich um S. Enteritidis, in 21 % um S. Typhimurium (Anonymus 2005b). Salmonellosen in Deutschland 1991 - 2006 0 10 20 30 40 50 60 70 80 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 ProzentualerAnteilder Salmonella-Isolate(%) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 ErkrankungeninTausend(x103 ) S. Enteritidis in Prozent S. Typhimurium in Prozent Erkrankungen in Tausend Abb. 1.2: An das Robert Koch Institut in Berlin übermittelte Fälle von Enteritis- Salmonellosen in Deutschland in den Jahren 1991 bis 2006 (Quelle: Robert-Koch-Institut) Die optimale Wachstumstemperatur von Salmonellen beträgt 37 °C, es kann aber auch bei niedrigen Temperaturen bis 2 °C und höheren Temperaturen bis 54 °C zur Vermehrung kommen. Die minimale infektiöse Dosis von Salmonella für den erwachsenen Menschen liegt im Regelfall bei 104 bis 106 Kolonie bildenden Einheiten (KbE), bei besonderer Disposition wie Abwehrschwäche auch darunter. Handelte es sich bei den kontaminierten Lebensmitteln aber um stark fetthaltige wie Käse, Salami oder Schokolade oder um Gewürze, kam es bereits bei Infektionsdosen unter 50 Keimen zu Erkrankungen (Blaser und Newman 1982, Lehmacher et al. 1995). Seit den 1960er Jahren ist weltweit immer wieder von Salmonellenerkrankungen durch den Verzehr von Schokoladenprodukten berichtet worden, wobei außerordentlich niedrige Keimzahlen ausreichten, um eine Erkrankung auzulösen (Anonymus 2001).
  • 23. I Einleitung 13 Im Zeitraum Oktober 2001 bis März 2002 kam es zu einem internationalen Krankheitsausbruch durch Infektion mit dem Serovar Salmonella Oranienburg, der auf eine Kontamination deutscher Schokolade zurückzuführen war. Neben Deutschland waren zeitgleich Schweden, die Niederlande, Finnland, Dänemark, Belgien, Österreich sowie Kanada durch Erkrankungen betroffen. Nachdem durch das Bundesinstitut für Risikobewertung am 18. Dezember 2001 in den Resten von Schokolade, die ein Erkrankter gegessen hatte, S. Oranienburg nachgewiesen war, wurde öffentlich vor dem Verzehr gewarnt. In einer Rückrufaktion in Europa und Kanada wurden Schokoladen und später auch weitere Produkte des Herstellers vom Markt genommen. Sowohl in Kanada als auch in Finnland und Schweden wurden Proben zurückgezogener Schokolade positiv auf S. Oranienburg getestet. Die nachgewiesene Kontaminationsmenge der Schokolade lag zwischen 1,1 und 2,8 KbE/g. Diese niedrige krankheitsauslösende Dosis wird darauf zurückgeführt, dass die Bakterien in der fettreichen Schokolade sehr gut gegen Magensäure geschützt sind und größtenteils noch lebend in den Darm gelangen, um dort eine Infektion auszulösen. Bedingt durch niedrigen Wassergehalt und hohe Zuckerkonzentrationen in der Schokolade weisen sie außerdem eine hohe Hitzeresistenz auf und können in dem Vehikel bis zu mehrere Jahre überleben. Maßnahmen zur Keimreduktion wie Rösten der Kakobohnen oder Hitzebehandlung der Kakaomasse mit Wasserdampf führen nicht zur sicheren Abtötung der Salmonellen. Als Ursache für die Kontamination der Schokolade konnte keine Quelle ermittelt werden. In erster Linie werden bei dem Befall von Schokoladenprodukten kontaminierte Kakaobohnen oder Milchpulver, je nach Rezeptur aber auch andere Zutaten wie kontaminierte Kokosnüsse und Gewürze angenommen. Dies ist der bisher größte erfasste lebensmittelbedingte Krankheitsausbruch durch kontaminierte Schokolade. Allein in Deutschland erkrankten insgesamt 439 Menschen, von denen 29 % in einem Krankenhaus behandelt werden mussten. 21 % der Betroffenen litten nach eigenen Angaben an blutigen Durchfällen (Werber et al. 2005). Das internationale Ausmaß dieses Ausbruchs macht deutlich, wie leicht durch globalen Nahrungsmittelhandel Menschen weltweit von lebensmittelbedingten bakteriellen Infektionen gleichen Ursprungs betroffen werden können. Angesichts des bestehenden Risikos ist eine lückenlose Kontrolle der kritischen Prozessstufen seitens der lebensmittelproduzierenden Betriebe von entscheidender Bedeutung. Besonders häufig sind die Produktionsstätten selbst der Ort der Lebensmittelkontamination. In einem Überwachungsprogramm der WHO zur Kontrolle lebensmittelbedingter Infektionen wurden die Bereiche, in denen es zu einer Kontamination kam, erfasst. Im Jahr 2000 waren es in Deutschland in 87 % der Fälle die lebensmittelproduzierenden Betriebe (Anonymus 2003b). Die Detektion von Kontaminationen mit Salmonellen erfolgt in der Regel als Nachweis ihrer
  • 24. I Einleitung 14 Anwesenheit beziehungsweise Abwesenheit. Eine Keimzahlbestimmung entfällt, da alle Salmonellen als pathogen gelten (Baumgart 2006). 1.3 Enterobacteriaceae als Markerorganismen Markerorganismen sind nachweisbare Mikroorganismen, die Hinweise auf gesundheitsgefährdende Kontaminationen geben können. Ihr Nachweis in Lebensmitteln ist ein wichtiges Werkzeug für die Qualitätskontrolle. Mossel (1982) definiert Markerorganismen als Index- und Indikatororganismen. Eine Unterscheidung, die nicht immer auf Zustimmung stößt. Demnach weisen Indexorganismen auf potenzielle Gesundheitsgefährdung durch Anwesenheit spezifischer Krankheitserreger hin. Indikatororganismen weisen Mängel in Prozessabläufen, wie beispielsweise unzureichende Desinfektion, nach. Dabei können die gleichen Markerorganismen je nach Art der Produkte einerseits Indexorganismen, andererseits Indikatororganismen und auch beides zugleich sein. Stadhouders et al. (1982) sind der Ansicht, dass eine Unterscheidung zwischen Index- und Indikatororganismen unzweckmäßig und in vielen Lebensmitteln gar nicht möglich ist. Am Beispiel von sprühgetrocknetem Milchpulver zeigen sie, dass hygienische Sicherheit am besten durch ständige Prüfungen der kritischen Prozessstufen, in denen Kontaminationen erfolgen können, erreichbar ist. Als Markerorganismen besonders geeignet sind Darmbakterien, da sie auf fäkale Verunreinigungen hinweisen. Der Nachweis von Escherichia coli als Marker für fäkale Kontaminationen von Trinkwasser wurde bereits vor rund 100 Jahren eingeführt und wird bis heute angewandt. In den 1920er Jahren wurde er durch den Nachweis von Coliformen ergänzt und bald darauf auch in Milch, zum Beispiel zur Kontrolle auf ausreichende Behandlung durch Pasteurisation, und anderen Lebensmitteln durchgeführt. Der Nachweis von Coliformen bei verarbeiteten Produkten erwies sich als geeigneter Hinweis auf Rekontaminationen und unzureichende Verarbeitungs-, Betriebs- und Distributionshygiene. Seit den 1950er Jahren wird der Nachweis der gesamten Enterobacteriaceae-Familie in der Lebensmittelkontrolle und Überprüfung von Produktionsabläufen oft bevorzugt, weil er mehr signifikante Lebensmittelkeime detektiert (Mossel und Struijk 1995). Neben Laktose positiven Coliformen werden auch Laktose negative pathogene Keime wie Stämme der Gattungen Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Proteus, Yersinia, Hafnia sowie Stämme von Escherichia coli, die sehr langsam Laktose fermentieren, erfasst. Da Coliforme weniger resistent gegenüber Behandlungsverfahren von Lebensmitteln, zum Beispiel Bestrahlung, milde Erhitzung, Gefrieren und Trocknen sind als einige pathogene Enterobacteriaceen wie Salmonellen, ist der Nachweis der gesamten Familie Enterobacteriaceae besser geeignet als der Coliformen-Nachweis (Mossel et
  • 25. I Einleitung 15 al. 1979). Auch Rekontaminationen von Lebensmitteln erfolgen außer durch Coliforme auch durch andere Enterobacteriaceen wie Spezies der Gattung Serratia, die oftmals bei dem Verderb von Fleisch dominieren (Stiles und Ng 1980). Häufig kommt es zur Rekontamination durch Verschleppung von Keimen im Produktionsbereich. Diese können über ihre Anreicherung im Produkt oder Nebenprodukt weitere Bereiche des Produktionsumfeldes wie Anlagenteile, Geräte, Böden, Abwasser und Luft besiedeln. Werden derartige Keime nicht detektiert und vollständig inaktiviert, stellen sie potenzielle Rekontaminationsherde dar. Die ursprüngliche Kontamination mit Enterobacteriaceen kann durch fäkale Verunreinigungen entstehen, wobei die Fäkalien von an Infektionskrankheiten erkrankten Tieren oder Menschen oder Dauerausscheidern stammen können. Direkte Kontamination kann durch Produktionsabläufe wie Schlachtung und Zerlegung von Tierkörpern, Rohmilchgewinnung oder Aufschlagen von Schaleneiern, aber auch bei ungenügender Personen- und Händehygiene durch das Personal zustande kommen. Indirekte Kontamination erfolgt über Verarbeitungsgeräte wie Metzgermesser und Fleischerhaken nach ursprünglich direkter fäkaler Verunreinigung. Für eine Vielzahl von Lebensmitteln ist der Nachweis von Kontaminationen mit den artenreichen Enterobacteriaceen, vor allem im Hinblick auf deren Markerfunktion für Gesundheitsgefährdung, besonders geeignet. Er hat in der Verarbeitungs- und Betriebshygiene, idealerweise durchgeführt in Form von mehrfachen Stufenkontrollen, einen essenziellen Stellenwert (Schmidt-Lorenz und Spillmann 1988).
  • 26. I Einleitung 16 2 PRAKTISCHER TEIL DETEKTION BAKTERIELLER KONTAMINATIONEN IN LEBENSMITTELN 2.1 Mikrobiologischer Nachweis von Enterobacteriaceen Klassische mikrobiologische Verfahren für die Identifizierung von Mikroorganismen in Lebensmitteln werden in selektiven oder unselektiven Kulturen in flüssigem Medium oder auf festen Nährböden durchgeführt. Sie kommen in sämtlichen Lebensmittelbereichen zur Anwendung und basieren auf dem Nachweis morphologischer und physiologischer Merkmale. Ist eine ausreichende Identifizierung der kultivierten Keime nicht möglich, wird in der Regel die Anwendung biochemischer Identifizierungssysteme angeschlossen. Der qualitative mikrobiologische Nachweis von Enterobacteriaceen erfolgt gemäß der analytischen Referenzmethode ISO 21528-1 in mehreren Schritten als unselektive Voranreicherung und selektive Anreicherung in flüssigem Medium, selektive Vereinzelung auf festen Nährböden und Auswertung der Agarplatten. Bei Bedarf erfolgt eine biochemische Bestätigung beziehungsweise Ausdifferenzierung. Der erste Schritt im qualitativen Nachweisverfahren, die Bebrütung der Lebensmittelprobe in unselektivem Nährmedium, dient der Resuszitation vorhandener Enterobacteriaceen vor der Überführung in Selektivmedien. Subletal geschädigten Zellen soll die Möglichkeit der Revitalisierung gegeben werden, damit auch diese im Nachweis erfasst werden können. Zu einer Schädigung der Bakterien kann es durch Wasserverlust, Nährstoffmangel, Hitze, Kälte, Gefrieren, ionisierende Strahlung, Chemikalien, Gefriertrocknung und osmotischen Stress kommen (Webb 1969, Colwell 2000). Derartige, nicht unmittelbar zum Zelltod führende Beeinträchtigungen, äußern sich durch verlängerte lag-Phasen, Verlust von Zellbestandteilen, insbesondere Nukleinsäuren, hohe Sensitivität gegenüber Selektivmedien und erhöhten Nährstoffbedarf der Mikroorganismen. Es ist bekannt, dass Enterobacteriaceen, die in getrockneten Lebensmitteln und Trockenfutter nachgewiesen wurden, erhebliche Stoffwechselschäden aufwiesen (Sinskey und Silverman 1970). Ihre Physiologie kann derartig beeinträchtigt sein, dass sie in Selektivmedien ihre Proliferation komplett einstellen, während unbeschädigte Bakterien gleicher Spezies die üblichen Inhibitoren im Medium problemlos tolerieren (Alford und Knight 1969). Kommt es für subletal geschädigte Bakterienzellen wieder
  • 27. I Einleitung 17 zu geeigneten Lebensbedingungen, können sie regenerieren und die Proliferation wieder aufnehmen. So ist es für den qualitativen Markernachweis von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln, besonders in technologisch verarbeiteten, wichtig, diesen Schritt der Resuszitation durchzuführen, bevor die Probe in für die Bakteriengruppe selektives Nährmedium überführt wird. Nur bei mehrstündiger nichtselektiver Vorbebrütung, üblicherweise durchgeführt in CASO-Bouillon oder Pepton-Wasser, besteht die Möglichkeit, auch das Vorhandensein gestresster Zellen zu detektieren (Mossel und Ratto 1970, Schmidt-Lorenz und Spillmann 1988). Im nächsten Schritt erfolgt die selektive Anreicherung der Enterobacteriaceen aus Lebensmitteln innerhalb von ein bis zwei Tagen in Mossel-Bouillon (Mossel et al. 1963, Mossel und Martin 1964), einem Medium entsprechend der Eiprodukte- Verordnung (Anonymus 1975) und der European Pharmacopeia II. Durch Brillantgrün und Ochsengalle in der Mossel-Bouillon wird die unerwünschte Begleitflora weitgehend gehemmt, während das Wachstum aller Entreobacteriaceen durch den Glucose-Gehalt begünstigt wird. Die starke Pufferung des Nährmediums verhindert das Absinken des pH-Wertes und eine dadurch bedingte Wachstumshemmung der Kultur. Für die selektive Vereinzelung der Enterobacteriaceen im nächsten Schritt wird ein Oberflächenausstrich auf Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Glucose-Agar (VRBD-Agar) durchgeführt und mindestens einen Tag anaerob bebrütet. Agarplatten, auf denen nach einem Tag keine Kolonien gewachsen sind, werden ein bis zwei weitere Tage inkubiert, um die Abwesenheit von Enterobacteriaceae sicher zu stellen. Die Bebrütung unter anaeroben Bedingungen ist für das Wachstum der fakultativ anaeroben Enterobacteriaceen nicht notwendig, dient aber der Wachstumshemmung obligat aerober Keime in der Begleitflora, wie zum Beispiel Pseudomonaden. Aus dem ursprünglichen MacCONKEY-Agar (MacConkey 1905), einem Selektivmedium zur Isolierung von Salmonellen, Shigellen und coliformen Bakterien, entwickelten Mossel et al. (1962) VRBD-Agar für den Nachweis von Enterobacteriaceae. Sie ersetzten zunächst, dem Vorschlag von Henriksen (1955) folgend, die Laktose im MacCONKEY-Agar durch Mannitol, danach durch Glucose und schlugen für das Medium die Bezeichnung MacCONKEY-Glucose-Agar vor. Im Gegensatz zu Laktose und Mannitol wird Glucose von sämtlichen Enterobacteriaceen unter Säurebildung abgebaut. Kristallviolett und Gallensalze im VRBD-Agar hemmen weitgehend die Begleitflora. Säurebildung aus Glucose wird durch einen Farbumschlag der Kolonien nach Rot, eventuelle Ausfällung von Gallensäuren durch Bildung eines hellen Präzipitathofs um die positiven Kolonien angezeigt. Mit dieser Versuchsdurchführung sind alle Bakterien der Familie Enterobacteriacaea erfassbar. Der Auslesenährboden ist jedoch für sie nicht absolut spezifisch, da auch einige mitwachsende Begleitkeime, wie Aeromonas spp., die gleiche Reaktion zeigen können.
  • 28. I Einleitung 18 Ist eine ausreichende Identifizierung der Kolonien nicht möglich, müssen entsprechende Keime biochemisch ausdifferenziert werden. Die Durchführung erfolgt zum Beispiel unter Anwendung von API® 20E, einem System zur Enterobacteriaceae- Diagnostik der Firma bioMérieux, oder auch mittels Cytochromoxidasetest. Enterobacteriaceen sind Oxidase-negativ. Zur Überprüfung der Oxidaseaktivität können Teststreifen mit Farbstoffindikator verwendet werden. Der Oxidasetest ist unzuverlässig, wenn er direkt auf den VRBD-Platten oder direkt mit Material von Kolonien, die auf VRBD-Agar gewachsen sind, durchgeführt wird. Die zu untersuchende Kolonie sollte vor dem Test auf ein Universalnährmedium überimpft und bebrütet werden (Baumgart 2006). Es sind kohlenhydratfreie Medien für die Subkultivierung zu wählen, da der Oxidasetest auf kohlenhydrathaltigen Nährböden wegen Säuerung des Mediums falsch negative Reaktionen zeigen kann (Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch). Der klassische mikrobiologische Nachweis von Enterobacteriaceae leistet nur eine eingeschränkte Spezifität. Bedingt durch eine hohe Begleitflora kann auch die Sensitivität des Verfahrens wesentlich verringert werden, wenn überwachsende Begleitkeime das Wachstum der Enterobacteriaceen hemmen. In diesem Fall kann es zu falsch negativen Ergebnissen in mikrobiologischen Untersuchungen kommen. 2.2 Molekularbiologischer Bakterien-Nachweis mittels PCR Der mikrobiologische Nachweis von Bakterien und anderen Mikroorganismen in Lebensmitteln basiert auf der Gesamtheit eines Organismus und seiner physiologischen Merkmale. Neben diesem konventionellen phänotypischen Nachweis wurden in den vergangenen Jahren vermehrt molekularbiologische Methoden für den genotypischen Nachweis bakterieller Kontaminationen durch Detektion spezifischer Nukleinsäuren entwickelt. Im Vergleich zu klassischen Verfahren handelt es sich hierbei um schnellere Methoden, deren Durchführung nicht vom Wachstumsstadium der Mikrorganismen oder Umwelteinflüssen abhängig ist. Es werden auch molekularbiologische mit mikrobiologischen Methoden kombiniert, indem vor der Detektion eine kulturelle Anreicherung erfolgt (Blackburn 1993, Olsen et al. 1995, Feng 1997). Neben der Anwendung im klinischen und ökologischen Bereich wird ebenso im Lebensmittelsektor der Nachweis bakterieller DNA- und RNA-Moleküle heute weit verbreitet durchgeführt. Die Detektion diverser enterobakterieller Spezies erfolgt bereits über den Nachweis ihrer DNA (Feng 2001). Als besonders geeignet werden häufig DNA-Sequenzen der für ribosomale RNA kodierenden Gene bevorzugt, die universell und vielfach in der
  • 29. I Einleitung 19 Zelle vorhanden sind (Ward et al. 1990, Wilson et al. 1990). Die hohe Spezifität und Sensitivität dieser Nachweisverfahren sowie ein großes Potential zur Automatisierbarkeit sind entscheidende Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden, die innerhalb der letzten zwei Jahrzehnte eine intensive Forschung vorangetrieben haben. Für den Nachweis von Bakterien in Lebensmitteln stehen heute molekularbiologische Verfahren im Vordergrund (Mozola 2006, Seo et al. 2006). Das sensitivste und am häufigsten eingesetzte Verfahren zur Detektion von Nukleinsäuren ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Selbst geringste Mengen vorhandener DNA-Moleküle werden mit dieser Methode durch wiederholte selektive Vervielfältigung nachweisbar amplifiziert. Kornberg und seine Mitarbeiter entdeckten 1955 das zelluläre Enzym DNA-Polymerase als Katalysator der DNA-Replikation und führten Versuche zur Synthese viraler DNA mittels DNA-Polymerase durch (Goulian und Kornberg 1967, Mullis 1990). Anfang der 1970er Jahre postulierten Panet und Khorana (1974) aufgrund ihrer Forschung zur DNA-Replikation die Möglichkeit, dass sich dieser Prozess auch in mehreren Zyklen wiederholen ließe. Das Verfahren der PCR als vielfache Amplifikation doppelsträngiger DNA in vitro mittels DNA- Polymerase wurde schließlich 1983 von Mullis et al. (1986) begründet. Wesentlich vereinfacht wurde die Durchführung der PCR, als man die aus Escherichia coli isolierte DNA-Polymerase durch die thermostabile Taq Polymerase aus Thermus aquaticus ersetzte (Saiki et al. 1988). Das Prinzip der PCR basiert auf der enzymatischen Amplifikation eines DNA- Bereichs, der von zwei Oligonukleotiden (Primer) flankiert wird, die jeweils am Ende der zu amplifizierenden DNA-Sequenz komplementär binden. Die zyklisch verlaufende Reaktion wird in einem so genannten Cycler durchgeführt und besteht in der Regel aus drei Phasen mit unterschiedlichen Temperaturen. In der ersten Phase werden die Wasserstoffbrückenbindungen der doppelsträngigen DNA durch Temperaturerhöhung aufgebrochen, um sie in Einzelstränge zu trennen (Denaturierung). In der nächsten Phase wird die Temperatur abgesenkt und es kommt unter Bildung von Basenpaaren zur Hybridisierung der Primer an die komplementären Sequenzen der DNA (Annealing). Eine stabile Bindung der Primer ist Voraussetzung für die Initiation der Polymerisation. In der dritten Phase wird die Temperatur wieder erhöht, unspezifisch angelagerte Primer werden denaturiert. Die DNA-Polymerase katalysiert nun, ausgehend vom 3’-Ende der gebundenen Primer, den selektiven Einbau freier Nukleotide aus dem Reaktionsansatz komplementär zur DNA-Matrize (Elongation). Jedes neu synthetisierte DNA-Fragment dient dann als Matrize für den nächsten PCR-Zyklus. Durch beliebiges Wiederholen dieses drei- Phasen-Zyklus lässt sich mit jedem Durchgang die Anzahl der Zielmoleküle verdoppeln, solange ausreichend Primer und Nukleotide für die DNA-Amplifikation
  • 30. I Einleitung 20 zur Verfügung stehen. Nach 20 Zyklen entstehen auf diese Weise von einem einzigen DNA-Doppelstrang theoretisch etwa eine Million Kopien. Damit können durch Anwendung der PCR geringste Ausgangsmengen, bis hin zu nur einem einzigen Molekül, vorhandener DNA detektiert werden. Der Nachweis der entstandenen DNA-Amplifikate kann mit Durchführung einer Gelelektrophorese erfolgen. Aufgrund ihrer negativ geladenen Phosphatgruppen lässt sich DNA im Agarosegel durch Anlegen elektrischer Spannung ihrer Größe nach auftrennen. Während der Elektrophorese wird neben den zu untersuchenden Proben ein Molekulargewichtsstandard mitgeführt. Die Visualisierung der DNA erfolgt mit interkalierenden Fluoreszenz-Farbstoffen wie Ethidiumbromid unter UV-Licht. Im Vergleich mit den Banden des Standards oder einer parallel durchgeführten konkurrierenden PCR (kompetitive PCR) mit bekannter DNA-Ausgangsmenge werden Größe und Menge der in der PCR amplifizierten DNA abgeschätzt. Eine bedeutende Weiterentwicklung dieser Anwendungen mit wesentlich reduziertem Zeitaufwand ist die Durchführung einer Real-Time-PCR (Higuchi et al. 1992). Bei diesem Verfahren finden Reaktion und Detektion der Amplifikate im selben Reaktionsansatz statt. Während der Amplifikation binden unspezifische fluoreszierende Farbstoffe wie SYBR® Green I oder sequenzspezifische, mit fluoreszierendem Farbstoff modifizierte Moleküle (Sonden) komplementärer Sequenz an die DNA und werden gleichzeitig detektiert. Die entstehende DNA wird in Echtzeit als in der Intensität steigendes Fluoreszenzsignal, in Relation zur Ausgangsmenge, ermittelt und online dokumentiert. Eine Möglichkeit zur spezifischen Detektion von Amplifikaten ist die Durchführung der Real-Time-PCR mit HybProbes (Hybridisierungssonden) der Firma Roche. HybProbes sind Oligonukleotide, die nebeneinander mit einem mittleren Bereich der Template-DNA zwischen den Bindungsstellen der Primer hybridisieren. Sie tragen an den benachbarten Enden zwei Fluorophore, die über Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) miteinander interagieren können. Dabei überträgt der kurzwelligere Farbstoff Fluorescein, der mittels blauem Licht angeregt wird, seine Energie strahlungslos an den langwelligeren Farbstoff LCRed. Dieser gibt nach Anregung ein höher welliges rotes Licht ab, das detektiert wird. Das Signal kommt also nur zustande, wenn beide Sonden in räumlicher Nähe binden. Die Signalfluoreszenz ist proportional zur Menge der vorliegenden Zielsequenz. Die Reaktion wird in einem LightCycler® durchgeführt und mit entsprechender Software zeitgleich dokumentiert. Der Eintritt der Amplifikation in die exponentielle Phase wird als „Crossing Point“ dargestellt. Der Schmelzpunkt der Sonden lässt sich durch eine Schmelzkurvenanalyse ermitteln, indem nach der PCR die Temperatur unter stetiger Messung der Fluoreszenz erhöht wird. Mit steigender Temperatur nimmt die
  • 31. I Einleitung 21 Fluoreszenz ab. Die gemessene Schmelztemperatur Tm ist der Wert, bei dem gebundene und abgeschmolzene Hybridisierungssonden miteinander im Gleichgewicht stehen. Differente Tm-Werte stehen demnach für unterschiedlich starke Bindungen zwischen verschiedenen Amplifikaten und Sonden. Eine hohe Sequenzübereinstimmung führt zu einer stabileren Bindung und damit zu einem höheren Tm-Wert. 2.2.1 Aspekte der PCR Die PCR ist eine hoch sensible Technik, deren Effizienz von diversen Faktoren beeinflusst wird. Mögliche Ursachen für eine Inhibition der PCR wurden mit unzureichender Zelllyse zur Extraktion der DNA, Degradieren der Nukleinsäuren oder Blockieren der Polymerase-Aktivität beschrieben (Wilson 1997). Das Zyklusprofil der PCR, die Reaktionskomponenten sowie deren Konzentration, die Qualität der nachzuweisenden DNA, die Beschaffenheit der Probenmatrix und die ausgewählten Primer sind entscheidene Faktoren für die Durchführung der Reaktion. Alle Komponenten müssen jeweils für einen optimalen Ablauf der PCR angepasst werden, um einen möglichst sensitiven und spezifischen Nachweis zu ermöglichen (Rossen et al. 1992). Eine stabile Bindung der Primer an die zu amplifizierende DNA ist Voraussetzung für die Spezifität des Systems. Die Primersequenz sollte demnach eine hohe komplementäre Übereinstimmung mit der Ziel-DNA aufweisen, um die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Bindung an anderen DNA-Abschnitten zu verringern. Nicht spezifische Primer reduzieren, wenn sie in der PCR verlängert werden, nicht nur die Anzahl der Primer, die für die Amplifikation der Ziel-DNA zur Verfügung stehen, sondern begünstigen auch die Entstehung von Artefakten sowie falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen (Kwok et al. 1990, Newton und Graham 1994). Durch Erhöhung der Annealingtemperatur lässt sich die Stringenz der PCR erhöhen und die Wahrscheinlichkeit der Entstehung von „primer-template mismatches“ reduzierern (Bej et al. 1990). Auch das Vorhandensein großer Mengen unspezifischer DNA kann die Spezifität herabsetzen und zu falsch negativen Resultaten führen (Abbott et al. 1988, Rossen et al. 1992). Derartige Beeinträchtigungen können entstehen, wenn Bakterien taxonomischer Gruppen, die mit dem PCR-System nicht nachgewiesen werden sollen, im Überschuss gegenüber den nachzuweisenden Bakterien in der Probe vorhanden sind. In Lebensmitteln können Polysaccharide, Fette und Proteine zur Inhibition der PCR führen und erfordern mitunter eine Purifikation der DNA über Silikasäulen vor Durchführung der Reaktion. In vielen Fällen können Inhibitionen der
  • 32. I Einleitung 22 PCR durch Zugabe unterstützender Reagenzien verringert werden. Die DNA- Präparation kann unter Zugabe des Ionenaustauschers Chelex® 100 durchgeführt werden, um die Zelllyse zu begünstigen und die Degradierung der DNA in Gegenwart von Metallionen bei hohen Temperaturen zu verhindern (Walsh et al. 1991, de Lamballerie et al. 1992). Als besonders wirkungsvoller Zusatz der PCR hat sich Rinderserumalbumin (BSA) erwiesen, durch das Inhibitoren gebunden werden und die Anlagerung der DNA-Polymerase an die DNA stabilisiert wird. Es wurde gezeigt, dass sowohl Substanzen mit phenolischen Gruppen, als auch Lipide und Anionen durch BSA gebunden werden (Kreader 1996, Forbes und Hicks 1996). Die inhibitorische Wirkung auf DNA-Polymerasen durch Proteinasen in Milch konnte durch Zugabe von BSA unterbunden werden (Powell et al. 1994, Abu Al-Soud und Rådström 2000). Um durch Inhibition bedingte falsch negative Ergebnisse zu vermeiden, empfiehlt es sich, als Indikator für die Effizienz der Reaktion, in jedem PCR-Ansatz eine Interne Amplifikationskontrolle (IAK) mitzuführen (Ursi et al. 1992, Ballagi-Pordany und Belak 1996). Dabei handelt es sich um eine Kontroll-DNA, die in einer definierten Menge der PCR-Reaktion zugegeben und zeitgleich mit der zu detektierenden DNA kopiert wird. Entsteht in der PCR kein spezifisches Amplifikat der gesuchten DNA, kann durch die Amplifikation der Kontroll-DNA die grundsätzliche Funktionalität der Reaktion belegt werden. Ein falsch negatives Ergebnis kann somit ausgeschlossen werden. Idealerweise werden die zu detektierende DNA und die Kontroll-DNA von Primern mit derselben Sequenz amplifiziert, so dass sie in einer kompetitiven PCR um das gleiche Primerpaaar konkurrieren (Rosenstraus et al. 1998, Courtney et al. 1999). Bei Anwendung einer Real-Time-PCR mit markierten Sonden lassen sich die Amplifikate der nachzuweisenden DNA und der Kontroll-DNA unterscheidbar detektieren, wenn die jeweiligen Sonden mit Farbstoffen verschiedener Emmissionsfluoreszenz modifiziert wurden (Elenitoba-Johnson et al. 2001). Mit der besonders hohen Sensitivität der PCR geht eine große Anfälligkeit für Kontaminationen einher. Bei allen Schritten der praktischen Durchführung einer diagnostischen PCR müssen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationen und daraus resultierenden falsch positiven Ergebnissen angewendet werden. Kwok und Higuchi (1989) beschreiben die strikte räumliche Trennung aller Arbeitsschritte. Arbeiten mit Nukleinsäuren, wie die Probenaufarbeitung, werden von denen ohne Nukleinsäuren, wie die Herstellung von Reaktionslösungen, in getrennten Laboren durchgeführt. Alle Reagenzien sollten in möglichst geringe Mengen aliquotiert werden. Erst unmittelbar vor dem Start der Reaktion wird die DNA zum Ansatz gegeben. Sämtliche Materialien und Arbeitsräume sollten, soweit möglich, zur Dekontamination mit UV-Licht bestrahlt werden (Sarkar und Sommer 1993).
  • 33. I Einleitung 23 Besonders leicht kann es durch die Anwesenheit von Amplifikaten vorangegangener PCR-Reaktionen zu Kreuzkontaminationen kommen. Um diese Kontaminationen zu vermeiden, kann ein enzymatischer Verdau vorhandener Amplifikate im Reaktionsansatz mit Uracil-DNA-N-Glycosylase (UNG) erfolgen. Durch den UNG- Verdau werden Amplifikate vorangegangener PCR-Reaktionen gespalten und dienen der DNA-Polymerase nicht mehr als Matrize. Voraussetzung ist, dass in jeder PCR dTTP durch dUTP ersetzt wird, wodurch es während der DNA-Synthese zum Einbau von Uracil statt Thymin kommt. UNG hydrolysiert selektiv Uracil-glycosidische Bindungen, während sie gegenüber nativer thyminhaltiger DNA inaktiv ist (Longo et al. 1990, Rys und Persing 1993). Durch Anwendung der PCR wird sowohl von lebenden als auch von toten Bakterienzellen die DNA nachgewiesen. Ein positives Signal sagt also nichts über die Lebensfähigkeit der Zielorganismen aus. Ist in der Probe ausschließlich DNA toter Zellen vorhanden, kann dies zu einem falsch positiven Ergebnis führen. Die Möglichkeit, tote Bakterienzellen nachzuweisen, kann aber auch zu wichtigen Informationen über den hygienischen Zustand der Untersuchungsprobe führen. Im Gegensatz zu klassischen mikrobiologischen Kultivierungsmethoden werden durch Anwendung der PCR auch Bakterien im „viable but nonculturable“ Stadium nachgewiesen. Ein der Umgebung angepasster Zustand in Stresssituationen durch Nährstoffmangel, niedrige Temperaturen oder ähnliches, in dem sich auch Bakterien befinden können, von denen eine erhebliche gesundheitliche Gefährdung ausgeht, sobald sie günstigere Lebensbedingungen vorfinden (Roszak und Colwell 1987, McKay 1992, Makino et al. 2000). Für Gattungen der Familie Enterobacteriaceae, wie Escherichia (Xu et al. 1982), Salmonella (Roszak et al. 1984) und Shigella (Colwell et al. 1985, Rahman et al. 1996), wurde dieses Phänomen beschrieben. Byrd et al. (1991), die den Zustand auch für Klebsiella pneumoniae und Enterobacter aerogenes beschreiben, warnen davor, dass eine Detektion der Bakterien allein mit kulturellen Methoden nicht gewährleistet ist. Selbst nach dem Pasteurisieren können sich in Milch noch Escherichia coli im „viable but nonculturable“ Stadium befinden (Binderova und Rysanek 1999, Gunasekera et al. 2002). Entwicklung und Fortschritt der PCR-Technologie ermöglichen im Bereich der Lebensmittelhygiene und -überwachung den genotypischen Nachweis bakterieller Kontaminationen durch Detektion spezifischer Nukleinsäuren. Vergleichende Untersuchungen konventioneller mikrobiologischer Verfahren zum Nachweis lebensmittelassoziierter Bakterien mit denen der PCR belegen deutlich die höhere Nachweisrate der PCR (Swaminathan und Feng 1994, Allmann et al 1995). Während herkömmliche Methoden in ihrer Durchführung sehr zeitaufwändig und arbeitsintensiv sind, werden PCR-Techniken als schnelle und zuverlässige
  • 34. I Einleitung 24 Alternative mit hoher Spezifität meist bevorzugt und kontinuierlich weiterentwickelt (Hill 1996, Naravaneni und Jamil 2005). Für den Nachweis von Bakterien in Lebensmitteln entwickelte PCR-Systeme müssen auf ihre Tauglichkeit im Vergleich zu konventionellen Methoden geprüft und mit Lebensmitteln validiert werden. Wenn jedoch Standardprotokolle und Validierungen nicht gegeben sind und die Qualität von PCR-Reagenzien und Geräten unbeständig ist, kann keine Weitergabe entwickelter PCR-Nachweismethoden vom Forschungslabor zum diagnostischen Routinelabor des Anwenders erfolgen. Von Seiten der Lebensmittelindustrie wird aber ein offiziell zugelassener Standard verlangt. Um dieser Situation gerecht zu werden, begründete die Kommission der Europäischen Union 1999 das Forschungsvorhaben „Food-PCR“, ein Projekt zur Validierung und Standardisierung diagnostischer PCR-Methoden für den Nachweis pathogener Bakterien in Lebensmitteln (Malorny et al. 2003). In der Bundesrepublik Deutschland ist das Deutsche Institut für Normung (DIN) in Zusammenarbeit mit dem Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) für die Standardisierung molekularbiologischer Methoden wie der PCR verantwortlich. Auf internationaler Ebene werden diese Aufgaben vom Europäischen Komitee für Normung (CEN) und von der Internationalen Organisation für Standardisierung (ISO) übernommen. 2.3 Zielsetzung der Arbeit Im Rahmen dieser Arbeit soll ein molekularbiologisches System für die Detektion von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae entwickelt werden. Der spezifische Indikatornachweis soll mittels Real-Time-PCR erfolgen und für die Untersuchung von Lebensmitteln auf das Vorhandensein von Enterobacteriaceen anwendbar sein. Für die Durchführung sind folgende Arbeitsschritte geplant: • Ermitteln geeigneter DNA-Sequenzen innerhalb des für ribosomale RNA (rRNA) kodierenden Bereichs von Enterobacteriaceae-Spezies und Generieren von Oligonukleotiden als Primer und Sonden für die PCR. Hierfür werden die entsprechenden DNA-Sequenzen verschiedener Enterobacteriaceae-Stämme sowie anderer, nicht nachzuweisender Eubakterien-Stämme im Alignment vergleichend dargestellt. Anhand der Daten werden mögliche Primer- und Sondensequenzen abgeleitet. • Entwicklung eines Real-Time-PCR-Systems. Die generierten Primer und Sonden, alle weiteren PCR-Komponenten und entsprechende Zyklusprofile werden in der PCR getestet. Mit dem Ziel, möglichst viele lebensmittelrelevante
  • 35. I Einleitung 25 Enterobacteriaceae-Spezies mit hoher Sensitivität zu amplifizieren, aber andere Eubakterien nicht zu erfassen, werden die Komponenten und Reaktionsbedingungen entsprechend modifiziert und optimiert. • Etablierung eines Verfahrens zur Dekontamination rekombinanter DNA- Polymerasen, falls es zur Amplifikation von Enzymkontaminationen kommt. Da rekombinante Polymerasen in Escherichia coli synthetisiert werden und über eine ausgeprägte Affinität gegenüber DNA verfügen, können sich Spuren amplifizierbarer Nukleinsäuren in der Polymerase und dem Lagerpuffer befinden. Diese würden durch das zu entwickelnde Enterobacteriaceae-Nachweissystem in der PCR amplifiziert werden und könnten zu falsch positiven Ergebnissen führen. In diesem Fall muss eine zuverlässige Dekontamination der eingesetzten DNA- Polymerasen erreicht werden. • Überprüfung der Spezifität des entwickelten Systems, indem die Nachweisbarkeit der lebensmittelrelevanten Enterobacteriaceae getestet wird (Inklusivität). Ebenso werden diverse Spezies anderer Bakterientaxa, die mit dem System nicht erfasst werden sollen, in der Real-Time-PCR überprüft (Exklusivität). • Entwicklung einer Internen Amplifikationskontrolle mit spezifischer Sonde für die Überprüfung der Negativ-Ergebnisse. Durch Coamplifikation von Kontroll-DNA und Probe, idealerweise durchgeführt als kompetitive PCR mit den gleichen Primern, werden falsch negative Ergebnisse ausgeschlossen. • Nachweis der Sensitivität des Detektionssystems. Definierte Zellzahlen verschiedener Enterobacteriaceen sowie deren quantifizierte genomische DNA werden hinsichtlich ihrer Nachweisgrenzen getestet. • Vergleichende Überprüfung des PCR-Systems, insbesondere unter dem Aspekt einer schnellen, spezifischen und sensitiven Detektion, gegenüber klassischen mikrobiologischen Tests auf Abwesenheit beziehungsweise Anwesenheit von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln. Zu diesem Zweck werden von identischem Ausgangsmaterial diverser Lebensmittelproben Anreicherungen durchgeführt und auf das Vorhandensein von Enterobacteriaceae sowohl durch Ösenausstrich auf Selektiv-Agar als auch durch Amplifikation ihrer DNA mit dem entwickelten Real- Time-PCR-System überprüft.
  • 36. II Material und Methoden 26 II MATERIAL UND METHODEN 1 MATERIAL 1.1 Bakterienstämme Tab. 2.1: Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitäts- und Sensitivitätstests Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm 1 Budvicia aquatica DSM 5075 35 Kluyvera cryocrescens DSM 4588 2 Buttiauxella agrestis DSM 4586 36 Leclercia adecarboxylata DSM 5077 3 Cedecea davisae DSM 4568 37 Moellerella wisconsensis DSM 5076 4 Citrobacter amalonaticus DSM 4593 38 Morganella morganii DSM 30164 5 Citrobacter braakii DSM 30040 39 Pantoea agglomerans BCD 2151 6 Citrobacter diversus BCD 5366 40 Pantoea ananatis DSM 30070 7 Citrobacter freundii BCD 5893 41 Pantoea dispersa DSM 30073 8 Citrobacter koseri DSM 4595 42 Photorhabdus luminescens DSM 3368 9 Edwardsiella tarda DSM 30052 43 Plesiomonas shigelloides DSM 8224 10 Enterobacter aerogenes DSM 30053 44 Proteus mirabilis DSM 788 11 Enterobacter agglomerans BCD 8600 45 Proteus vulgaris BCD 915 12 Enterobacter amnigenus DSM 4486 46 Providencia alcalifaciens DSM 30120 13 Enterobacter cloacae ssp. cloacae DSM 30054 47 Providencia rettgeri DSM 1131 14 Enterobacter gergoviae BCD 511 48 Providencia stuartii DSM 4539 15 Enterobacter intermedius DSM 45481 49 Rahnella aquatilis DSM 4594 16 Enterobacter sakazakii DSM 4485 50 Raoultella planticola DSM 4617 17 Enterobacter sakazakii ATCC 51329 51 Raoultella terrigena DSM 2687 18 Erwinia carotovora DSM 30168 52 Salmonella Abony DSM 4224 19 Erwinia chrysanthemi DSM 4610 53 Salmonella Senftenberg BCD 6173 20 Erwinia mallotivora DSM 4565 54 Salmonella Typhimurium BCD 14285 21 Escherichia blattae NCTC 12127 55 Serratia ficaria DSM 4569 22 Escherichia coli DSM 30083 56 Serratia grimesii DSM 30063 23 Escherichia coli DSM 1576 57 Serratia liquefaciens BCD 676
  • 37. II Material und Methoden 27 Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm 24 Escherichia coli EHEC BCD 7856 58 Serratia marcescens DSM 1636 25 Escherichia hermanii DSM 4560 59 Serratia plymuthica DSM 49 26 Escherichia hermanii BCD 8467 60 Serratia proteamaculans BCD 8916 27 Escherichia vulneris DSM 4564 61 Serratia rubidaea DSM 4480 28 Ewingella americana DSM 4580 62 Shigella boydii DSM 7532 29 Hafnia alvei DSM 30163 63 Shigella sonnei BCD 4301 30 Klebsiella oxytoca DSM 5175 64 Xenorhabdus beddingii DSM 4764 31 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 65 Yersinia enterocolitica ssp. enterocolitica DSM 4780 32 Klebsiella pneumoniae ssp. pneumoniae DSM 2026 66 Yersinia pseudotuberculosis DSM 8992 33 Klebsiella terrigena DSM 2687 67 Yokenella regensburgei DSM 5079 34 Kluyvera ascorbata DSM 4611 Tab. 2.2: Nicht-Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitätstests Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm 1 Acetobacter aceti DSM 3508 26 Gluconobacter oxydans DSM 7145 2 Achromobacter spec. BCD 1193 27 Haemophilus influenzae DSM 4690 3 Acinetobacter baumanii BCD 10388 28 Helicobacter pylori DSM 4867 4 Acinetobacter calcoaceticus BCD 1209 29 Listeria monocytogenes ATCC 19118 5 Aeromonas caviae DSM 7323 30 Megasphaera cerevisiae DSM 20462 6 Aeromonas enteropelogenes DSM 6394 31 Moraxella catarrhalis DSM 9143 7 Aeromonas hydrophila ssp. anaerogenes DSM 30188 32 Pasteurella pneumotropica BCD 2891 8 Aeromonas hydrophila ssp. hydrophila DSM 6173 33 Photobacterium phosphoreum BCD 5162 9 Aeromonas media DSM 4881 34 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 10 Aeromonas sobria ATCC 43979 35 Pseudomonas aeruginosa DSM 1128 11 Alcaligenes spec. DSM 2625 36 Pseudomonas stutzeri DSM 5190 12 Bacillus cereus BCD 8832 37 Psychrobacter immobilis DSM 7229 13 Brevundimonas vesicularis DSM 7226 38 Ralstonia pickettii DSM 6297 14 Burkholderia cepacia DSM 7288 39 Sphingobacterium multivorum DSM 6175 15 Burkholderia cepacia BCD 3134 40 Sphingomonas paucimobilis DSM 1098
  • 38. II Material und Methoden 28 Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm 16 Campylobacter fetus DSM 5361 41 Staphylococcus aureus DSM 20231 17 Campylobacter jejuni BCD 15108 42 Vibrio alginolyticus DSM 2171 18 Chromobacterium violaceum DSM 30191 43 Vibrio fischeri DSM 5075 19 Clostridium perfringens BCD 8799 44 Vibrio fluvialis ATCC 33809 20 Clostridium tyrobutyricum DSM 663 45 Vibrio harveyi DSM 6904 21 Comamonas acidovorans DSM 39 46 Vibrio parahaemolyticus DSM 10027 22 Comamonas testosteroni DSM 1622 47 Vibrio proteolyticus DSM 30189 23 Enterococcus faecalis DSM 20478 48 Vibrio vulnificus DSM 10143 24 Flavobacterium resinovorum DSM 7478 49 Xanthomonas maltophila BCD 4273 25 Flavobacterium spec. BCD 2539 50 Zymomonas mobilis BCD 5724 Escherichia coli-Stamm für die Transformation XL1-blue: recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rk- mk+), supE44, relA1, lac, [F´ proAB, lacIq Z∆M15 Tn10 (Tetr )] (Fa. Stratagene, Kat. Nr. #200236). 1.2 Nährmedien Alle Nährmedien wurden, soweit nicht anders angegeben, 15 min bei 121 °C autoklaviert. CASO-Bouillon (Merck Kat. Nr. 1.05459) 17,0 g/l Pepton aus Casein 3,0 g/l Pepton aus Sojamehl 2,5 g/l D(+)-Glukose 5,0 g/l NaCl 2,5 g/l K2HPO4 pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C CASO-Agar (Merck Kat. Nr. 1.05458) 15,0 g/l Pepton aus Casein 5,0 g/l Pepton aus Sojamehl 5,0 g/l NaCl 15,0 g/l Agar-Agar pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C
  • 39. II Material und Methoden 29 1.3 Reagenzien Zur Herstellung der Lösungen und Puffer wurden ausschließlich Chemikalien des Reinheitsgrades p. a. verwendet, welche von den Firmen Merck, Roche Diagnostics und Sigma bezogen wurden. LB-Medium (Sambrook et al. 1989) 10,0 g/l Bacto Trypton 5,0 g/l Hefeextrakt 5,0 g/l NaCl 15,0 g/l Agar-Agar (Zusatz optional) pH 7,0 ± 0,2 bei 25 °C Supplement (zur Analyse nach Transformation) 100 µg/ml Ampicillin 80 µg/ml X-Gal 0,5 mM IPTG Meerwasser-Bouillon 10,0 g/l Fleischextrakt 10,0 g/l Pepton 21,1 g/l NaCl 0,58 g/l KCl 1,2 g/l CaCl2 · 2 H2O 3,6 g/l MgCl2 · 6 H2O 0,08 g/l NaHCO3 2,63 g/l MgSO4 · 7 H2O pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C SOC-Medium (Sambrook et al. 1989) 20,0 g/l Bacto Trypton 5,0 g/l Hefeextrakt 0,5 g/l NaCl Vor Gebrauch zugeben: 10 mM MgCl2, sterilfiltriert 10 mM MgSO4, sterilfiltriert 20 mM Glucose, sterilfiltriert pH 7,0 ± 0,2 bei 25 °C MOSSEL-Bouillon (Merck Kat. Nr. 1.05394) 10,0 g/l Peptone 5,0 g/l D(+)-Glukose 20,0 g/l Ochsengalle, getrocknet 0,015 g/l Brillantgrün 8,0 g/l Na2HPO4 2,0 g/l KH2PO4 pH 7,2 ± 0,2 bei 25 °C Schonend autoklavieren, 5 min bei 121 °C. VRBD-Agar nach MOSSEL (Merck Kat. Nr. 1.10275) 7,0 g/l Pepton aus Fleisch 3,0 g/l Hefeextrakt 5,0 g/l NaCl 10,0 g/l D(+)-Glukose 1,5 g/l Gallesalzmischung 0,03 g/l Neutralrot 0,002 g/l Kristallviolett 13,0 g/l Agar-Agar pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C Unter ständigem Rühren kochen bis zum vollständigen Lösen, nicht autoklavieren. 1x TE-Puffer 1x TBE-Puffer 10 mM Tris-HCl 90 mM Tris-Borat 1 mM EDTA 2 mM EDTA pH 8,0 pH 8,3
  • 40. II Material und Methoden 30 api® 20 E (Fa. bioMérieux, Kat. Nr. 20100) Anaerotest® (Fa. Merck, Kat. Nr. 1.15112.0001) Anaerocult® A (Fa. Merck, Kat. Nr. 1.13829.0001) Oxidase Teststreifen (Fa. Biotest, Kat. Nr. 934260) DNA-Längenstandards DNA-Längenstandard VI (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 11062590001) Größe in bp: 2176, 1766, 1230, 1033, 653, 517, 453, 394, 298, 234, 220, 154. DNA-Längenstandard 1 kb (Fa. Applichem, Kat. Nr. A5207) Größe in bp: 10.000, 8.000, 6.000, 5.000, 4.000, 3.000 x 2, 2.500, 2.000, 1.500, 1.000 x 2, 750, 500, 250. DNA-Längenstandard 100 bp (Fa. Applichem, Kat. Nr. A5191) Größe in bp: 1000, 900, 800, 700, 600, 500 x 2, 400, 300, 200, 100. HSTE-Puffer 1x PBS-Puffer 10 mM Tris-HCl 137 mM NaCl 0,5 mM EDTA 2,7 mM KCl 0,01 g/l Heringssperma-DNA 4,3 mM Na2HPO4 1,4 mM KH2PO4 pH 7,3 Ladepuffer für Agarosegele 0,25 % (w/w) Bromphenolblau 0,25 % (w/w) Xylencyanol FF 30,0 % (w/w) Glycerin
  • 41. II Material und Methoden 31 1.4 Enzyme Alle Enzyme wurden mit den dazugehörigen 10x Reaktionspuffern eingesetzt. Taq-DNA-Polymerasen Perpetual Taq DNA Polymerase mit monoklonalem anti-Taq Antikörper (Fa. Roboklon GmbH, Kat. Nr. E2700-01) HotStarTaq™ DNA Polymerase (Kit, Fa. Qiagen, Kat. Nr. 203203) FastStart Taq DNA Polymerase (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 12158264001) Taq DNA Polymerase (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 11146165001) LightCycler® -FastStart DNA Master Hybridization Probes (Kit, Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 03003248001) Restriktionsendonukleasen Aci I (Fa. New England BioLabs® Inc., Kat. Nr. R0551S) HpyCH4 IV, Isoschizomer: Mae II (Fa. New England BioLabs® Inc., Kat. Nr. R0619S) Mse I (Fa. New England BioLabs® Inc., Kat. Nr. R0525S) Desoxyribonuklease DNase I (Kit, Fa. Sigma, Kat. Nr. AMP-D1) Uracil-DNA-Glycosylase LightCycler® Uracil-DNA-Glycosylase (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 3 539 806)
  • 42. II Material und Methoden 32 1.5 Reaktionskits QIAquick Gel Extraction Kit (Fa. QIAGEN, Kat. Nr. 28704) QIAprep Spin Miniprep Kit (Fa. QIAGEN, Kat. Nr. 27104) High Pure PCR Template Preparation Kit (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 11796828001) ShortPrep foodproof II Kit (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 03358062001) pGEM® -T Vector System I (Fa. Promega, Kat. Nr. A3600) PicoGreen® dsDNA Quantitation Kit (Fa. Invitrogen, Kat. Nr. P-7589) 1.6 Primer und Sonden Die Synthese der eingesetzten Primer erfolgte durch die Firma MWG Biotech. Die mit LCRed 640 beziehungsweise LCRed 705 am 5’-Ende oder Fluorescein am 3’- Ende markierten Sonden wurden von der Metabion GmbH synthetisiert. Die Buchstaben R, K, V und H stehen für Basengemische: R = A + G, K = G + T, V = A + G + C, H = A + C + T. Tab. 2.3: Generierte Primer und Sonden mit Bindungsstellen innerhalb des DNA- Bereichs für 23S rRNA – Spacer – 5S rRNA im ribosomalen Operon Name Länge/Markierung Zielregion Funktion fw 1.1 20 mer 23S-Gen forward-Primer fw 1.2 20 mer 23S-Gen forward-Primer fw 1.3 20 mer 23S-Gen forward-Primer fw 1.4 20 mer 23S-Gen forward-Primer fw 1 II.1 18 mer 23S-Gen forward-Primer fw 1 II.2 18 mer 23S-Gen forward-Primer fw 1 II.3 18 mer 23S-Gen forward-Primer fw 2.1 23 mer 23S-Gen forward-Primer fw 2.2 23 mer 23S-Gen forward-Primer
  • 43. II Material und Methoden 33 Name Länge/Markierung Zielregion Funktion fw 3.1 17 mer 5S-Gen forward-Primer fw 3.2 17 mer 5S-Gen forward-Primer fw 4.1 21 mer 23S-Gen forward-Primer fw 4.2 21 mer 23S-Gen forward-Primer fw 5.1 26 mer 23S-Gen forward-Primer fw 6.1 20 mer 23S-Gen forward-Primer fw 7.1 26 mer 23S-Gen forward-Primer fw 8.1 17 mer 23S-Gen forward-Primer fw 9.1 21 mer 23S-Gen forward-Primer fw 9.2 22 mer 23S-Gen forward-Primer rev 1.1 27 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 1.2 27 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 1.3 26 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 1.4 25 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 1.5 24 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 1.6 25 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 1.7 25 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 1.8 25 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 2.1 18 mer 5S-Gen reverse-Primer rev 3.1 18 mer 5S-Gen reverse-Primer rev 3 II .1 17 mer 5S-Gen reverse-Primer rev 4.1 23 mer 23S-Gen-Spacer reverse-Primer rev 4.2 24 mer 23S-Gen-Spacer reverse-Primer rev 5.1 25 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 6.1 18 mer Spacer-5S-Gen reverse-Primer rev 7.1 17 mer 5S-Gen reverse-Primer rev 8.1 16 mer 5S-Gen reverse-Primer rev 9.1 25 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 10.1 26 mer 23S-Gen-Spacer reverse-Primer rev 10.2 26 mer 23S-Gen-Spacer reverse-Primer
  • 44. II Material und Methoden 34 Name Länge/Markierung Zielregion Funktion Flu 1 33 mer - 3' Fluorescein 23S-Gen Sonde Red 1 LCRed 640 - 30 mer - Phosphat 23S-Gen Sonde HzFlu 31 mer - 3' Fluorescein 23S-Gen Sonde HzRed LCRed 640 - 32 mer - Phosphat 23S-Gen Sonde Tab. 2.4: Generierte Primer und Sonde für die Konstruktion und Detektion der Internen Amplifikationskontrolle Name Länge/Markierung Zielregion Funktion IAKrev 45 mer 23S-Gen reverse-Primer IAKfw 49 mer 23S-Gen forward-Primer IAKRed LCRed 705 - 28 mer - Phosphat 23S-Gen Sonde Primer der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH zur Amplifikation der 23S-5S-DNA fw23S, forward: 5’ – GGT ACG CGA GCT GGG TTT AGA ACG – 3’ rev5S, reverse: 5’ – GGC RRT KHC CTA CTC TCV C – 3’ Etablierte Primer zur Amplifikation der 16S-DNA (Barry et al. 1990) 41F, forward: 5’ – GCT CAG ATT GAA CGC TGG CG – 3’ 1066R, reverse: 5’ – ACA TTT CAC AAC ACG AGC TG – 3’ Primer für die Sequenzierung durch Firma GATC Biotech AG M13-FP, forward: 5’ – TGT AAA ACG ACG GCC AGT – 3’ M13-RP, reverse: 5’ – CAG GAA ACA GCT ATG ACC – 3’
  • 45. II Material und Methoden 35 1.7 Lebensmittelproben Tab. 2.5: Tiefgefrorene Lebensmittel Nr. Produkt Nr. Produkt 1 Kinder-Eis Piraten Mix, Krokodil 26 Himbeer-Käse-Sahnetorte 2 Eismann Minis/Riegel Mix, Karamell 27 Tiramisu-Eisriegel 3 Butter-Tee-Gebäck, helle Teigmischprobe 28 Suppengemüse 4 Grünkohl 29 Gemüse-Reispfanne 5 Porree/Lauch 30 Kräutermischung mit Bärlauch 6 Buntes Gartengemüse 31 Petersilie 7 Asia Pfanne Bombay 32 Schnittlauch 8 Pangasiusfilet 33 Knoblauch-Würfel 9 Lachsforelle Ammerländer Art 34 Kaiserschmarrn, Vanillesoße 10 Garnelen in Knusperteig 35 Garnelensnack 11 Fleischtopf Toscana 36 Schollenfilet 12 Lammmedaillons 37 Wiener Würstchen 13 Gnocci 38 Original Thüringer Rostbratwurst 14 Westfälischer Grünkohl mit Räucherwurst 39 Cevapcici 15 Blätterteigkörbchen Schinken Käse 40 Donuts 16 Blumenkohl-Broccoli-Gratinos 41 Bunte Tortenmischung, Nuss-Sahne 17 Marinierte Gänsekeulen 42 Hähnchenkeule 18 Ente Classic 43 Hähnchenbrustfilet paniert 19 Marinierte Entenpfanne 44 Reibekuchen 20 Markklößchen 45 Suppenklößchen 21 Kartoffelgratin 46 Donauwelle 22 Tex Mex Box, Mozzarella Sticks 47 Herzoginkartoffeln 23 Bratapfelplunder 48 Lachstulpe, Lachs und Gemüse 24 Pizza Schinken Champignon 49 Hähnchenbrustfilet unpaniert 25 Mini Sahnewindbeutel 50 Eddy's Fisch, Seefisch
  • 46. II Material und Methoden 36 Tab. 2.6: Säuglingsnahrung und Volleipulver Nr. Produkt Hersteller/Vertrieb 1 Milasan Milchbrei Früchte, nach dem 4. Monat Milasan GmbH 2 Getreidebrei BIO 3-Korn, milchfrei, nach EG-Öko- Verordnung, ab dem 6. Monat Milupa GmbH 3 Milasan Milchbrei Grieß, nach dem 4. Monat Milasan GmbH 4 BEBA Sensitive Spezialnahrung, diätetisches Lebensmittel, von Geburt an Nestlé Deutschland AG 5 Milumil 1, Dauermilch, von Geburt an Milupa GmbH 6 Alete Anfangsmilchnahrung PRE, von Geburt an Nestlé Nutriton GmbH 7 Alete Hypoallergene Anfangsnahrung H.A.1, von Geburt an Nestlé Nutriton GmbH 8 Folgemilch 3, prebiotisch, ab dem 8. Monat Humana GmbH 9 Aptamil Pre Säuglingsmilchnahrung, von Geburt an Milupa GmbH 10 Babydream Milchbrei Grieß, nach dem 4. Monat Rossmann GmbH 11 BEBA Start Anfangsmilchnahrung Pre, von Geburt an Nestlé Deutschland AG 12 HiPP Bio-Anfangsmilch, von Geburt an HiPP GmbH & Co. Vertrieb KG 13 HiPP Folgemilch 3, ab dem 8. Monat HiPP GmbH & Co. Vertrieb KG 14 Babydream Folgemilch 2, nach dem 4. Monat Rossmann GmbH 15 Bebivita, Baby-Aktiv Folgemilch, ab dem 8. Monat Bebivita GmbH 16 Humana Anfangsmilch PRE, von Geburt an Humana GmbH 17 Pre Milasan Säuglings-Milchnahrung, von Geburt an Milasan GmbH 18 Milasan 2 Folgemilch, nach dem 4. Monat Milasan GmbH 19 Alete Abendmilchbrei Banane mit Milchreis, ab dem 8. Monat Nestlé Nutriton GmbH 20 Bebivita Abendmilchbrei Grieß-Vanille, nach dem 4. Monat Bebivita GmbH 21 Milasan BIO Milchgrießbrei m. Vanille, nach EG-Öko- Verordnung, nach 4. Monat Milasan GmbH 22 Volleipulver Sanovo Eiprodukte GmbH & Co KG 1.8 Software Apilab Version V 4.0 api® 20 E (Fa. bioMérieux) Vector NTI® Suite Version 7.1 (Fa. InforMax® , Inc.) MeltCalcPro Version 2.06 (Fa. MeltCalc© Software GbR)
  • 47. II Material und Methoden 37 Chromas Version 1.45, Copyright© 1996-1998 Conor McCarthy, School of Health Science, Griffith University, Gold Coast Campus, Southport, Queensland, Australia LightCycler® Software Version 3.5 (Fa. Roche Molecular Systems, Inc.) LightCycler® Software Version 4.0 (Fa. Roche Molecular Systems, Inc.) 2 METHODEN 2.1 Anzucht von Mikroorganismen Die meisten Mikroorganismen wurden in CASO-Bouillon angezogen, Vibrio-Arten in Meerwasser-Bouillon (Kap. II 1.2). Die Kultivierungsbedingungen entsprachen der jeweiligen Spezies. In der Regel erfolgte die Anzucht aerob für ein bis zwei Tage bei 30 °C bis 37 °C. 2.2 Quantifizierung von Bakterienzellen Die Quantifizierung der Bakterienzellen erfolgte in einer Thomakammer mit 400 Kleinquadraten und einer Tiefe von 0,1 mm unter dem Mikroskop. Es wurden pro Quantifizierung vier Großquadrate à 16 Kleinquadrate in einer Diagonale ausgezählt. Die Zahl der Zellen pro ml (N) wurde nach der Formel N = (Zahl der Zellen pro Großquadrat · 106 ) / 4 berechnet. Jede Zählung wurde einmal mit neu gefüllter Kammer wiederholt. Durch Ausplattieren und Inkubation auf CASO-Agar (Kap. II 1.2) wurde die Lebendkeimzahl überprüft. 2.3 DNA-Extraktion Für die DNA-Extraktion wurde 1 ml einer Bakterienzellkultur für 5 min in einer Tischzentrifuge (Eppendorf 5415C) bei 10.000 x g sedimentiert. Je nach benötigtem Reinheitsgrad wurde die DNA nach verschiedenen Verfahren extrahiert und direkt weiterverwendet oder bei –20 °C gelagert.
  • 48. II Material und Methoden 38 2.3.1 DNA-Präparation mit enzymatischem Zellaufschluss Präparation und Reinigung der Bakterien-DNA über Silikasäulen erfolgte mit dem High Pure PCR Template Preparation Kit (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 1796828). Zusätzlich wurden phosphatgepufferte Saline (PBS, Kap. II 1.3), Lysozym (Fa. Sigma, Kt. Nr. L6876), RNase A (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 109142), Isopropylalkohol abs. und Tris EDTA-Puffer (TE, Kap. II 1.3) verwendet. Die sedimentierten Bakterienzellen wurden in 200 µl PBS resuspendiert. Für die Zelllyse und den RNA-Verdau erfolgte eine Inkubation mit je 10 µl Lysozym (10 mg/ml in Tris-HCl, pH 8,0) und RNase A (10 mg/ml) bei 37 °C für 20 min. Der Proteinverdau wurde mit 40 µl Proteinase K (20 mg/ml) in 200 µl Bindungspuffer bei 72 °C für 10 min durchgeführt. Nach Zugabe von 100 µl Isopropylalkohol abs. wurde die DNA auf der Säule entsprechend den Anweisungen des Kit-Herstellers gereinigt. Die Elution der DNA erfolgte mit 100 µl TE-Puffer. 2.3.2 DNA-Extraktion ShortPrep Die Aufarbeitung der genomischen DNA erfolgte mit dem ShortPrep foodproof II Kit (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 03358062001) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Nach Inkubation bei 95 °C für 5 min, 2 sek vortexen und 1 min Zentrifugation bei 13.000 x g befindet sich die Bakterien-DNA im Überstand des Resuspensionspuffers. 2.4 DNA-Quantifizierung Die Quantifizierung präparierter DNA (Kap. II 2.3.1) erfolgte photometrisch oder im LightCycler® . Die Menge von Amplifikationsprodukten der PCR wurde durch Visualisierung im Geldokumentationsgerät ermittelt. 2.4.1 DNA-Quantifizierung im Photometer Die DNA wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm mit dem Gene Quant II Photometer (Fa. Pharmacia) quantifiziert. Bei dieser Wellenlänge entspricht eine optische Dichte (OD) von 1 einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml. Eine mögliche Verunreinigung durch Proteine wurde durch die OD280nm ermittelt. Der Quotient aus OD260nm/ OD280nm für reine DNA sollte bei 1,8 bis 1,9 liegen (Sambrook et al.1989).
  • 49. II Material und Methoden 39 2.4.2 DNA-Quantifizierung im LightCycler® Die Quantifizierung der DNA im LightCycler® 2.0 Instrument erfolgte mit dem Programm „Nucleic Acid Quantification“ der LightCycler® Software Version 4.0 unter Verwendung des PicoGreen® dsDNA Quantitation Kit (Fa. Invitrogen, Kap. II 1.5) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Die Fluoreszenz des in DNA interkalierenden Farbstoffs PicoGreen® wurde bei 530 nm gemessen. Die Zunahme der Fluoreszenzintensität ist über einen DNA-Konzentrationsbereich von 25 pg/ml bis 1 µg/ml linear und wurde über eine Standardgerade bestimmt. Als Standard diente der PicoGreen® Lambda-DNA-Standard (100 µg/ml) aus dem Kit. 2.4.3 Quantifizierung von Amplifikaten Die Quantifizierung von Amplifikationsprodukten erfolgte nach deren Auftrennung im Agarosegel (Kap. II 2.2.7). Die mit Ethidiumbromid markierten DNA-Banden wurden unter UV-Licht visualisiert, mit dem Geldokumentationssystem E.A.S.Y. Win32 (Fa. Herolab) dokumentiert und mit der integrierten Software ausgewertet. Die Quantifizierung erfolgte durch Vergleich der Lichtemissionsintensitäten der Amplifikatbanden mit den Banden des mitgeführten DNA- Molekulargewichtsstandard. 2.5 Endonukleasenverdau 2.5.1 Restriktionsverdau Der Restriktionsverdau von DNA erfolgte mit der entsprechenden Restriktionsendonuklease (Kap. II 1.4) und dem dazugehörigen 10x Reaktionspuffer in einem Gesamtvolumen von 20 bis 150 µl und bei der für das Enzym geeigneten Reaktionstemperatur. Die Reaktion wurde in 1 bis 3 h oder über Nacht durchgeführt. Gestoppt wurde die Restriktion durch Zugabe von 5 mM EDTA oder Hitzeinaktivierung des Enzyms bei 65 °C für 20 min. 2.5.2 DNase I-Verdau Der DNA-Verdau wurde mit DNase I (Kap. II 1.4) und dazugehörigem 10x Reaktionspuffer in einem Gesamtvolumen von 20 bis 200 µl bei 24 °C oder 37 °C in 1 bis 6 h katalysiert. Das Enzym wurde durch Zugabe von 5 mM EDTA und Inkubation bei 70 °C für 10 min denaturiert.