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1 von 77
Aus der Frauenldinik
     (Direktor: Prof. Dr. med. R. Buchholz)
        und aus der Medizinischen Klinik
    (Direktor: Prof. Dr. med. G.A. Martini)
      der Philipps- Universitat Marburg/Lahn



           DER NACHWEIS VON
 FIBRINOGEN/FIBRIN SPALTPRODUKTEN MIT
   DEM LATEX-AGGLUTINATIONSTEST, DER
 EINDIMENSIONELL- UND tlBERWANDERUNGS-
IMMUNELEKTROPHORESE BEl FRAUEN UNTER
        SEXUALHORMONTHERAPIE



          INA UGURAL";DISSERTA nON
                      zur
Erl~ngung des Doktorgrades der gesamten Medizin
      dem Fachbereich Humanmedizin der
         Philipps- Universitat Marburg
                 vorgelegt von




            EDWIN OSENI- MOMOnU
            aus Irrua Ishan, Nigeria


               Marburg/Lahn 1979



         Druok: Gorioh & Weiershliuser. Marburg
Angenommen vom Fachbereich Humanmedizin
der Uni versi tat Marburg am .3.0, .l'i0;V~1ll.h~~ .1 97 9




Gedruoltt mit Genehmigung des Faohbereiohes




Dekanl Prof. Dr. med. F. Neurath
Referent: Prof. Dr. med. R. Egbring
Correferent: Prof. Dr. med. E. Daume
-3-




INHALTSVERZEICHNIS                                       Seite
1.00   Einleitung und Problemstellung                     4
1.10   Sexualhormone                                      7
1.20   Blutgerinnung wahl' end des normalen Zyklus       11
1.30   Blutgerinnung wahrend del' normal en Sohwanger-   14
       schaft
1.40   Bisher vorliegende Gerinnungsbefunde bei          17
       Patientinnen unter Sexualhormontherapie
1.41   Anti-Thrombin III Spiegel bei Einnahme von        20
       ~strogenhaltigen Kontrazeptiva
1.42   Ursache del' Entstehung zirkulierender            23
       Fibrinogen Und Fibrin Spaltprodukte
1.50   Nomenklatur der Fibrinogen/Fibrin Spalt-          28
       produkte
2.00   Potenzverhaltnisse und Aquivalentdosen del'       29
       meist benutzten ~strogene
2.10   Patientengut - Normalkontrolle                    30

3000   Methodilt                                         32
3.10   Herstellung del' Seren                            32
3.20   Latex-Agglutinationstest                          32
3.30   Uberwanderungsimmunelektrophorese                 34
3.40   Eindimensionelle Immunelektrophorese              38
4.00   Ergebnisse                                        42
4.10   Diskussion del' Ergebnisse und Beurteilung        62
       del' Methoden
5.00   Zusammenfassung                                   67
6.00   Literaturverzeiohnia                              69
7.00   Lebenslauf                                        75
8.00   Verzeiohnis del' altademiaohen Lehrer             76
-4-




Seit 1950 hat die Einnahme von weibliohen Sexualhor-
monen durch ihre Wirkung als Kontrazeptiva in del'
ganzen ,lel t sprunghaft zugenommen.
1m Jahre 1961 wurde erstmals mit diesel' Einnahme das
Auftreten einer Lungenembolie bei einer jungen Frau,
die Enovid eingenommen hatte, in Beziehung gebraoht (31).
Seit diesel' Zeit wurden eine Reihe von retrospektiven
und prospektiven epidemiologische Studien durchga-
fUhrt, um den eben genannten Zusammenhang zu stUtzen.
DarUberhinaus suohta man naoh Ver~nderungen im
Haemostasesystem, die die Neigung del' thrombotischen
Komplikationen (Venenthrombose) und/odel' Lungenembolie
erkUlren ktlnnte.

Neben anderen Haemostasedefekten wurden bei den
Patientinnen Fibrinogen/Fibrin Spaltprodukte in Form
von 18slichen und thrombinflHlbal'en "Fibrin" Spal t-
produkten zuerst von Pilgeram et al (47), Alkjaersig,
N. et al (2) und letztlich von Asbeck, F. et al (3)
in Serum nachgewiesen.

Bel'ichte Uber den Nachweis von sogenannten Plasmin
induzierten Fibrin/Fibrinogen Spaltprodukten bei
Patientinnen, die tistrogen el'hielten, liegen nicht
nul' sehr sp~rlioh sondern auch mit unterschiedlichen
Ergebnissen VOl' (21,26,41). 1hr Vorkommen w~re aus
vielen GrUnden von Bedeutung, da sie je nach Mole-
kul~rgewicht das Haemostasesystem hemmen oder akti-
vieren k8nnen (Gramse) (24).

Erhtlht sich del' Spiegel des 18s1iohen mit Thrombin
nioht fMllbal'en Anteils del' Fibrinogen und/oder
Fibrin Spaltprodukte im Plasma, so mu~ dies als
pathologisch angesehen werden (41,13,14).

                           -5-
-5-




Allgemein .erfolgt der Abbau des Fibrins odar Fibrino-
gens im Blut durch eine fUr die Fibrinolyse verant-
wortliche Serumprotease, die man als Plasmin be-
zeiohnet. Dabei ant~tehen wie in Abb. 9 zu erkennen
ist, groBmolekulHre und kleinmolekulare Spaltpro-
dukte je naoh Dauer der Einwirkung des Plasmins und
seiner Konzentration.

Normalerweise ist der Spiegel diesar Fibrin/Fibrinogen
Spaltprodukte im Plasma aUffallend niedrig (5,13,14,56).
Sie werden ansoheinend dauernd durch einen varzogerten
Gerinnungsablauf gebildet und im ratiltulo-endothelialen
System abgebaut wie aIle anderen Aktivierungaprodukte
der Blutgerinnung.

Aus diesem Grund ware zu erwarten, daB erhohte Spiegel
der Fibrin/Fibrinogen Spaltprodukte nur bei einer
pathologisch gesteigerten Aktivierung der Gerinnung
auftreten.

Zellular aufgenommene Fibrin/Fibrinogen Spaltprodukte
werden duroh lysoaomale Enzyme verdaut, ( ob dabei
kleinmolekulare Fibrin/Fibrinogen Spaltprodukte wieder
ins Blut gelangen, ist nioht bekannt). Hierbei soheinen
auch Leukozyten, neben den Zellen des retikulo-endo-
thelialen Systems, beteiligt zu sein, die zumindest
zwei Fibrin/Fibrinogen spaltende Enzyme besitzen
(24,55). Durch diese als "Elastase und Chymotrypa1n
lihnliche" bezeichnete und aus Leukozyten stammende
Serinproteasen werden Fibrin und Fibrinogen in Hhnlicher
Weise wie Plasmin gespalten.

Aus diesem Grund muS man erwagen, ob Fibrin/Fibrinogen
Spaltprodukte auch duroh frei im Blut zirkulierende
Leukozytenenzyme erzeugt werden k6nnen.


                           -6-
-6-




Aufgabe meiner Arbeit war es, bei 92 Frauen (wie spater
genau angegeben), die Sexualhormone per os erhielten,
mit zwei bzw. drei Untersuchungsmethoden im Serum nach
Fibrin/Fibrinogen Spaltprodukten zu suchen und ihre
Bedeutung fUr die Thrombosenentstehung darzustellen.




                          -7-
-7-

1.10

Der gesteuerte Einsatz der Sexualhormone wird durch einen
Regelkreis erreicht, in dem als StellgroBen der Hypothalamus,
der Hypophysenvorderlappen und das Ovar eingebaut sind.
Sie sind untereinander durch Hormone verbunden, ohne daB
ein stabiler IIsteady statel! angestrebt und aufrechter-
halten wird, vielmehr wird ein typisch phasisch verlaufender
ProzeB beobachtet (51).
Der Anstieg der Gonadotropinspiegel wird nicht mit sofortiger
AusschUttung von Ostrogenen/Gestagenen beantwortet, vielmehr
muB erst die Bildungsstatte fUr diese Steroidhormone in
Form des reifen Follikels heranwachsen; dies dauert 14 Tage.
Die gebildeten Steroidhormone bremsen die AusschUttung der
Gonadotropine und damit entfallt der Erhaltungsreiz fUr das
Corpus luteum. Danach zerfallt die Produktionsstatte fUr die
Steroidhormone und deren Produktion wird irreversibel ein-
gestellt. Bei einem neuen Zyklus muB dann erst wieder die
neue Produktionsstatte in Form neu heranreifender Follikel
aufgebaut werden (51).
                                       C1I
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                                 -8-
-8-




lm Oval' regen FSH und LH die Follikel in ihrer Reifung
so an, daB sie tlstrogene produzieren. Die Synthese del'
IJstrogene fUhrt Uber Progesteron, das obligat intermedi!!.r
gebildet wird.



                                                                   OH


                        20d.-Hydroxylase ...
                        22 R-Hydroxylase
HO                         (NADPH H+02 1 HO
                                       j



     Cholesterin



                         3~-ot-Dehydrogenase
                       4t(NADI
                         b. 4;'5..1 some rase                           Isocal
                                                HO                      atdeh
     Progesteron                                     Pregnenolon



Abb. 2    I   Umwandlung von Cholesterin in Progesteron
Ausgangsmaterial del' Sexualhormone ist Cholesterin,
welohes die Ovarien selbeI' aus Acetyl-CoA und Acetoaoetyl-
CoA Uber Zyklisierung von Squalen synthetisieren konnen.
Cholesterin wird abel' auch aus del' Leber duroh das Blut
antransportiert.
Progesteron wird Uber 4-Androste~dion in /)stron umge-
wandelt. /)stron kann reversibel in tistradiol und irrever-
sibel in /)striol umgewandelt werden. /)stron, /)stradiol und
/)striol sind alle drei tlstrogenwirksam. Progesteron wird
auch als Zwisohenprodukt bei del' Synthese del' Androgen,
del' Mineralokortikoide und Glukokortikoide synthetisiert.

                                   -9-
-9-

                 o

                      19 - Hydroxyla se
                                          ...
 o                                              '0
  4-Androstendion

                 o                                   o
                                                     II
                                                     CH
                                                          !
                                                          19-0xydc

                                                              0

                       10, 19 Desmolase
                     ·NADPH1 H++02
HO
       Ostron                                   °
Abb. 3 ; Umwandlung des Androstendion in 5stron




                          -10-
-10-



Progeateron wird an Albumin, Ostradiol an ~- und B-Globulin
gebunden tranaportiert (49). Progesteron wird sehr rasoh
in der Leber inaktiviert, deshalb ist per as zugefUhrtes
Progesteron unwirksam. Die kUnstlich hergestelltmProgesteron-
derivate mit guter per os Wirksamkeit werden deshalb am
steranring an versohiedenen stell en substituiert (49).




                         -11-
-11-




Bei der Analyse des Gerinnungssystems von 25 Frauen im Alter
von 19 - 34 Jabren mit durohsohnittliohen Zyklusl~ngen von
28 Tagen, fanden Bayman, E. et al (5) folgende Ver~nderungen.

Der Fibrinogenspiegel lag in der Luteinphase im Mittel urn
8~ h5her als in der Follikelphase. Pr~menstruell kam es zu
einem leiohten Abfall des Fibrinogens. Beim Anti-Thrombin III
so11 ein Anstieg in der Fol1ike1phase, jedoch ein deutlioher
Abfall in der Lutelnphase erfolgen. Mit der Spontan-Papier-
fibrinolyse naoh Goossens war pramenstruell ein Abfall der
lytisohen Aktivitat des plasmas urn 22~ gefunden worden.

           1.1 Thrombinzeit
          1.0J        e _ _ e _ _ _ e_ _ O


          0.9


    ell
    t 0.9
    ell
           1.1 TEG 1+4 r-Zeit
          1.0j        I         i---- ----I
                                      f


    ~
    ~ 1.1 Fibrinogen
                                      i
    :f1.0J
    ~ 0.9
                      i_-I---- - -I
    .~

    ~ 1.1 Faktor X
    z     1.0j        !---lrl---f--
          0.9

           1.1 Antithrombin III
          1.0j        ~~I-                  -I
                                                   ...
          0.9                                     ..:t
                                                  .a
                      I         j     I      I    ~
                      5.        12.   19.   26.
                                      Zyklustag
-12-




Zum Nachweis von Fibrinogen Spaltprodukten wurde Nativ-
blut ohne und mit Trasylolzusatz untersucht. 1m Serum ohne
Trasylol gelang es, bei 12 % der Probandinnen Spaltprodukte
( in vitro FSP ) nachzuweisen. Maximal wurden 5 mg% gemessen.
Die Trasylol enthaltenden Seren waren al1e negativ, d.h.
weniger als 5 mg% (5,6).

In der spaten Luteinphase wurde ein bemerkenswerter
Abfall des Plasminogens gemessen. Sowohl der Abfall des
Plasminogenspiegels als auch der Abfall der Lysequote
pramenstruell muB als Folge einer Aktivierung des fibrino-
lytischen Geschehens gedeutet werden ( 5,6 ).

Durch Radioimmuno-Assay mit 14 C-Glycin erhielten
Pilgeram et al (47) variable Zunahmen der loslichen
Fibrinogenprodukte mit zwei Aktivitatsgipfeln am
11. und um den 28. Zyklustag.

Normalerweise fluktuiert die Produktion von oatrogen
und Gestagen mit dem Menstruationszyklus. Bei normal
menstruierenden Frauen zeigt die Ostrogenausscheidung
zwei Maxima:
                    a) das 1. Maximum um den 13. Zyklustag tmd
                    b) das 2. Maximum gerade dem MenstruaUons-
                       termin vorausgehend (27,62).




                         -13-
-13-




         1200


         1100


         1000


         900

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         100


           0
                1    7          14          21     28
                    Tag des Menstruationszyl<lus




Abb. 5: Zunahme des Itlslichen Fibrins durch Einnahme von
        tlstrogenhaltigen Kontrazeptiva. Beachte: Der Gipfel
        des Fibrins stimmt mit den Maxima der ~strogenaus­
        scheidung Uberein.
        -0-0-    Kontrollfrauen
        -.-,     Frauen, die Kontrazeptiva einnahmen
        --,--, Kontrollml:l.nner (47)
-14-




Die Bildung der weibliohen Sexualhormone und damit ihre
Konzentration im mUtterliohen Plasma nimmt wabrend der
Schwangerschaft k~ntinuierlich zu (34). Post partum
fallen die Sexualhormone eklatant ab zu Werten von 10 %
der vor der Geburt gemessenen Konzentrationen(34).
Aus der Darstellung von Sohander und Egli (Tabelle 1) (53)
lassen sioh die als gesiohert zu betraohtenden Veranderungen
des Gerinnungssystems in der Sohwangersohaft entnehmen.


                500 000                                                50

                                                                            .2
                                                                            "CI
   "I:i                                                                       e
   +"'          400 000                                               40     III
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                                                                             01
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          <!>
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                                                                             111
                                                                            a..
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                                                                             01
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                                                                             0
                                                                            .....
   w
       ...
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                                                                            :0
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   ~      III   200000                                                20    'E
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                                                                            N
    III .2
   ...
    e ....                                                                  .S
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    ell
   ..... ..c:. 100000                                                 10 E
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                                   'l
                     a ~~~~~~~~~~i$~~+Ostradiol
                          2    3    4    5     6   7   8 9      10
                              Schwangerschaftsmonat


Abb. 6          Sohematische Darstellung der.Aussoheidung von HeG,
                ~strogenen sowie des Progesteronmetabo11ten Pregnandl0
                1m Verlauf der Sohwangersohaft (naoh Zander, 1957) (65

                                   -15-
-15-




Relative Obereinstimmung unter einer Reihe von Autoren
(1,30) besteht hinsichtlioh des Ansteigena folgender
plasmatischer Gerinnungsfaktoren, nHmlich Fibrinogen,
Prothrombin, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX und
Faktor X.




                           Zunahme       Unverandert

Fibrinogen                 + (ca.100%)
Prothrombin                +
Faktor V                                      +
Faktor VII                 +
Faktor VIII                + (ca. 20-30%)
Faktor IX                  +
Faktor X                   + (ca. 3096)
Faktor XI                                    +
Faktor XII                                   +
Faktor XIII
Thrombozytenzahl                             +
Thrombozytenadhasivitat                      +
           Tabelle 1 : Veranderungen del' plasmatischen
                       Gerinnungsfaktoren in del' Sohwanger-
                       schaft
Schwangerschaftsspezifische VerHnderungen im fibrinolytisohen
System lassen sich feststellen. Wahrend del' Schwanger-
schaft bis zur LBsung del' Plaoenta solI es zu einer Abnahme
del' lytischen Aktivitat kommen. Naoh LBsung del' Placenta
normalisiert sich diese Elgenschaft (34).
Auch in Toxamie, Hepatose, placental' Insuffizienz und
anderen Kompllkationen del' Sohwangerachaft deponiert sioh
Fibrin in den Nieren, Leber und Placenta. Wenn gespalten,
erscheinen die Spaltprodukte im Blut (56).
                          -16-
-1b-




Nach Svanberg et a1 (56) so11 bei gesunden nicht
Schwangeren und gesunden Schwangeren nur eine sehr
k1eine Menge Fibrinogen Spa1tprodukte im B1ut (weniger
a1s 5 ug/m1) nachweisbar sein. Demnach wiesen
Svanberg et a~ (56) Fibrinogen Spa1tprodukte in
11 ~ von 705 Schwangeren nacho Diese 11 %waren
Risikoschwangerschaften (56).




                         -17-
1.40        Bisher vorliegende Gerinnungsbefunde bei
            P~~!~~~!~~~_~~~r_§~~~!hQr~Q~~!~~~~~~


Nach Untersuchungen von Vessey und Inman (1968) steigt
das "erwartete" Letalitiitsrisiko bei Anwendung von
oralen Kontrazeptiva bei Frauen zwischen 20 und 34 Jahren
von 0,2 auf 1,5 und bei Frauen zwischen 35 und 44 Jahren
von 0,5 auf 3,9 und zwar pro 100.000 gesunder verheirateter
und nicht schwangerer Frauen pro Jahr ( 59 ) •

Wahrend das lIerwartete li Letalitatsrisiko bei diesen
Patientinnen siebenmal htlher vorhanden ist, steigt das
Risiko wahl' end einer Schwangerschaft urn das 17-fache (59).
AUB diesem Grund wurde versucht, dieses Risiko durch
Veranderungen an Haemostasepotential zu erklaren.



Todesrate pro 100.000 Personen             20-34 J.     35-44 J.

Frauen, gesund, verheiratet
nicht gravid; Thromboembolien
jahrlioh - unter oraleI' Kontrazeption
                                            1,5        3,9
          - obne orale   Kon~razeption      0,2        0,5

Schwangere und Wocbnerinnen
          - Schwangerschaftskompli-         7,5        13,8
            kationen
          - Aborte                          5,6        10,4
          - Geburtskomplikationen           7,1        26,5
            Komplikationen im Woohen-
            bett: Thrombophlebitis,
            Thrombose, Embolie              1,3        2,3
          - andere Komplikationen           1,3        4,6

                                           22,8        57,6


Tabelle 2: nach Vessey und Inman    (59)
                         -18-
-18-




Ausge16st wurde diese Suohe naoh Weohselwirkungen zwisohen
tlstrogeneinnahme und Thromboseneigung durch die erste
Besohrelbung einer Lungenembolie bei einer Patientin,
die Enovid erhalten hatte - Jordan 1961 - (31).
Mit gr6Berer Intensitat wurde sie seit der oben er-
wMhnten Publikation von Vessey und Inman (59, 60) fort-
gesetzt.

Tatsaohlich wurden - wie dargestellt - eine Reihe
von VerMnderungen beschrieben (60, 61), die die
Voraussetzungen fUr eine "Gerinnungsaktivierung" bzw.
HyperkoagulabilitMt sein k6nnen. Die Tabelle 3, ent-
nommen aus einer Arbeit von v. Kaulla (60,61,62),
zeigt zusammenfassend solche Gerinnungsparameter, die
wMhrend der Einnahme von Bstrogenhaltigen Kontrazeptiva
erh(lht oder erniedrigt und/oder verbraucht gefunden
wurden.



Fibrinogen                +          Losliohes Fibrin            +
Prothrombin               +          PIMttohenaggregierbarkeit   +
Faktor V                  +          AT-III Alttivi tat          Q
Faktor VII                +          Plasminogen                 +
Faktor VIII               +          Antiplasmin                 +
Faktor IX                 +          Plasminogenaktivator
                                     in Venenwand                Q
Faktor X                  +          Fibrinogen
                                     Spaltprodukte               +


Tabelle 3     EinfluB Bstrogenhaltiger oraler Kontrazeptiva
              auf .die AktivitMt von Komponenten des
              Gerinnungs- und Fibrinolysesystems.
              + = AktivitMt erhoht, Q = Aktivitat erniedrigt

                              -19-
-19-




Neben der gesteigerten Aktivierung einiger Gerinnungs-
faktoren z.B. Faktoren I, VII und X, scheinen drei
Befunde fUr die mogliche Thromboseneigung von besonderer
Bedeutung zu sein:
             1. Die Erhohung des Fibrinogenspiegels, die
                eine erhohte Vlskositat des Blutes ver-
                ursacht.
             2. Die Verminderung von Anti-Thrombin III und
             3. der Nachweis von losliohem Fibrin sowie
                von Abbauprodukten des Fibrinogens oder des
                Fibrins.
Aus diesem Grund wird diesen letzten Befunden im folgenden
besondere Aufmerksamkeit gewidmet.




                         -20-
-20-




1.41     Anti-Thrombin III Spiegel bei Einnahme
         von tlstrogenhaltigen Kontrazeptiva


Nach bisherigen untersuchungen scheint das Verhalten des
Anti-Thrombin III (AT-III) unter einer Behandlung mit
hormonellen Kontrazeptiva von grtlBter Bedeutung fUr
das erhBhte Thromboembolierisiko zu sein. Denn aine
Reihe von Autoren (52,44,4,64,60,46,63) findet das
AT-III bezUglich Aktivitat und nach dem immunologischen
Verhalten reduziert. Da.s ist insefern von groBer Be-
deutung, weil das AT-III einen Inhibitor darstellt,
del' alle im Gerinnungssystem wirksamen Serumproteasen
hemmen kann. Unter anderen sind dies del' Faktor XII a,
Faktor IX a, Faktor IX, Faktor X a, Falder II a und
das Plasmin. Schon ein geringer Abfall des AT-III Spiegels
soheint die intravasale Thrombinbildung zu begUnstigen (29

Bei Konzentrationen ven Werten urn 50 %des Normalen, wie
sie beim sogenannten kongenital AT-III Mangel vorkommen,
besteht eine ausgepragte Neigung zu Thrombosen (17).
Del' kritische Spiegel fUr eine Thromboseneigung Boll nach
Angaben von Heimburger (29) bei 75 %liegen. Die Ursache
del' AT-III Verminderung ist bisher nicht geklart.

Durch die zentrale Stellung als Faktor XII a, Faktor XI a,
Faktor X a, Faktor IX a und Fakter II a Inhibitor, ist
eine Gerinnungsaktivierung bei einem relativen Mangel
von AT-III besonders einlauchtend. Sia wUrde aine intra-
vasale Thrombinbildung mit ihran Konsequenzen zur Folge
haben konnen.
Nach v. Kaulla et al (61) verringern ornle Ovulations-
hemmer z.B. 1 mg Progesteron und 0,08 mg ~strogen bereits
naoh Einnahme weniger "Pillen" die AT-III Aktivi tNt und
beschleunigen die Thrombinbildung. Meistens werden schon
naoh 10 "Pillen" bei allen Pr'oband:lnnen, abel' sioher nach
20 "Pillen" jene Werte erreioht, wie sie als ttZeiohen einer

                          -21-
-21-




 persistierenden Ubergerinnbarkeit bei chronischen
 Thrombotikern ll hEl.ufig beobachtet werden k1:lnnen (61).




                                             Individual trend
                                                                                                   Norm. av,
                  ••• · · · · · · . , · ••••• , •••••••••••••••••••••••• 1 ••••••••••••••••••••••••• , •••••• , •••••••




c
:.a   2
                                                         Thrombos. aVo
E                  ------                  ------- ---------------
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~
«
              o                        2                          5                         7 Pills

Abb. 7    I   Rasche UnterdrUckung del" Anti-Thrombin III
              Aktivitlit (progressive VerkUrzung del" Anti-
              Thrombin III-Zeiten) naoh Beginn 4er Einnahmen
              eines oral en Kontrazeptivums (61)

Auf die VerEl.nderungen des AT-III wird in vorliegender
Arbeit nicht eingegangen, weil sie Hauptthema einer
Dissertation von Wenzel (63) und Reifschneider ist.



                                            -22-
-22-




.-.
 u                                                                                                                                                  Norm
~       40   . , • • • • • • • • • 1 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • :.(• • • • • 11 • • • '




.S:                                                                                                                                                Thromb(
..0     20
 E
 o
 L..
..c
.....
:.:;
 c
«
                  Control                               10                           20                               9       18
                                                                  Pills                                               Days off



  Abb.8       I     Progressive UnterdrUckung der Anti-Thrombin III
                    AkUvitl:i.t nach 10 und 20 Kontrazeptiva-Pillen.
                    RUc:ldtehr zu normalen Werten 18 Tage nach Absetzen.




                                                                             -23-
-23-




1.42      Ursache del" Entstehung zirkulierender
          Fibrinogenspaltprodukte


In ihrem Beitrag zu II Oral contraceptives and increased
formation of soluble fibrin II, berichteten Pilgeram et a1 (47),
daB ostrogen-gestagen Praparate bei 12 Frauen im Alter
von 18-32 Jahren eine signifikante Zunahme del" intravasalen
Umwandlung von. Fibrinogen (92%, p=o,oo1) in ein Derivat
mit gleichen chemischen Eigenschaften wie deren del"
Produkt von Fibrinogen/Thrombin Gemisch in vitro erzeugen.
Nach Absetzen del" Pillen kehrten diese Plasma Fibrinogen-
derivate zur Norm zurUck (47).

Wie auf Seite 12 angegeben, lassen sieh sogar im normalen
Zyklus wlihrend del" Ostrogenmaxima Fibrinogen Spaltprodukte
naehweisen.

Anfangs wurde die Kontrazeption mit Prliparaten durchgefUhrt,
die ostrogen in relativ hoher Konzentration enthielten.
Naeh bisherigen Untersuchungen war die Thrombosefrequenz
zu dieser Zeit relativ hooh (19). Nach v. Kaulla und
anderen (12,32,62,54) wurden VOl" allen Dingen die ostrogene
fUr das Auftreten von Fibrinogen Spaltprodukten verantwortlich
gemacht.
Mogliche Ursaohen des Auftretens des FDP sind;
     1. die Fibrinogen Spaltprodukte entstehen Uber eine
         direkte oder indirekte Steigerung del" fibrinolytisohen
         Aktivitat im Blut,
       2. die Fibrinogen Spaltprodukte entstehen naoh einer
         primal" induzierten Gerinnungsaktivierung, in deren
         Folge auch die Fibrinolyse sekundar gesteigert wird.
         Die Gerinnungsaktivierung solI nach den Autoren
         (13,14,42,43) Uber eine fortsohreitende Proteolyse
         des Substrats (Fibrinogen) erfolgen (39).
         Diese Auffassung wird nicht von allen Autoren geteilt.
         (33)
                            -24-
-24-




     3. In den letzten Jahren wurden von einigen Unter-
        suohern (24,48,55) die Bedeutung zellul~rer
        proteolytischer Fermente fUr die mogliche Spaltung
        von Fibrinogen und Fibrin diskutiert.
        Nach Gramse (24) spalten die leukozytaren Proteasen,
        Elastase-like proteases (ELP) und Chymotrypsin-like
        protease (CLJ;'), von Substrat (Fibrinogen) ebenfalls
        die sogenannten plasmintypisohen Spaltprodukte X,Y,D
        und E ab, obgleich noch zu beweisen sein wird, ob
        es sioh hierbei tatsachlich urn "identische ll oder nur
        urn immunologisoh lihnliche Spaltprodukte handelt.

Wlihrend der in vitro Spaltung von Fibrinogen durch Streptokinaf
und Plasmin werden zahlreiche groBe Fragmente frei, die sehr
wahrscheinlich nach dem Schema gebildet werden (40).




 Fibrinogen. Mol. - Masse 340000



 Fragment X. Mo.- Masse 270 000    +   Fragmente A.B. C



 Fragment V. Mo.- Masse 165 000   I + I Fragment D. Mol.- Masse 85 000
               +
 Fragment D. Mol.-Masse 85 000     I + I Fragment E. Mol.-Masse 55000



Abb.9    Abbau des Fibri~ogens) durch Endopeptidase
         Plasmin (40)

                               -25-
-:25-




Der Abbau des Fibrins/Fibrinogens durch die Endopeptidase
Plasmin ist durch eine fortschreitende Proteolyse des
Substrats gekennzeichnet. Dabei entstehen als erste die
Fragmente X und A, B, C. Als nachstes wird Fragment Y vom
Fragment X abgespaltenj in dem ProzeR entsteht das Fragment D.
Fragment Y wird schlieRlich in Fragmenten D und E gespal ten
(40) •

Alle dieae SpaltstUcke soDen nicht, wie frUher angenommen,
gegen weitere Plasminaktivitat stabil sein, da nach
langerer Inkubation der Produkte D und E mit Plasmin
noch kleinere FSP nachgewiesen worden sind (33).

Die groBen SpaltstUcke besitzen Antigendeterminanten, die
mit einem der multiplen Determinanten des"Elternfibrinogen-
moleltUl" identisch sein sollen (2,8,45).

Die Antigendeterminanten der Fragmente X und Y sind
ahnlich und unteracheiden sich nur quantitativ, besitzen
jedoch mehr Antigendeterminanten ala die Spaltprodukte
D und E. Die Antigendeterminante des Spaltprodukts D ist
deutlich von der des Fragments E verschieden (2,8,45).

Antiseren gegen Fibrinogen reagieren deshalb mit Fibrin,
Fibrinogen, Fragment X, Fragment Y, Fragment D und
Fragment E. Antiseren gegen das Fragment D reagieren mit
Fibrinogen, Fibrin, Fragment X,Y und FragmentD aber nicht
mit Fragment E. Antiseren gegen Fragment E reagieren mit
Fibrinogen, Fibrin, Fragment X, Y und Fragment E, jedoch
nicht mit Fragment D (2,8,45).

Die Nebenfragmente A, B und C reagieren nicht mit Anti-
fibrinogen Seren (2,8,45).



                           -26-
-26-




Antiseren      Anti-
Anti gene      Fibrinogen          Anti-FSP D   Anti-FSP E

Fibrinogen        +                   +             +
Fragment X        +                   +             +
Fragment Y        +                   +             +
Fragment D        +                   +             ¢
Fragment E        +                   ¢             +

Tabelle 4: Ubersicht der Reaktionen von Fibrinogen und
           den Spaltprodukten mit den entsprechenden
           Antiseren.

AuBer in solchen pathologischen Zustgnden wie Abruptio
placentae, Uterine Ruptur, "dead fetus Syndrom ll ,
disseminiertem Krebs, frischem Myokardinfarkt und
AbstoBung renaler Transplantate ist es mit neuaran
empfindlichen ·Haemagglutinationsinhibition-immuno-
Assay's moglich geworden, Fibrinogen Spaltprodukte
auch bei 95 ~ der gesunden Menschen nachzuwaisen.
Dar Mittelwert betragt 4,9 ± 2,8ug/ml (13,42,43).

Eine Zunahme der Serum Fibrinogen bzw. Fibrin Spaltprodukte
fm Blut ist entweder duroh primere Aktivierung des fibrinolytischen
Systems (wie z.B. pathologisohe Fibrinolyse ) bedingt, oder
duroh sekundere Aktivierung des fibrinolytischen Systems
 ( wie z.B. disseminierte intravaskulare Gerinnung ).
Doch wird eine Fibrinogen Spaltprodukterhohung auch nach
korperlicher Belastung gefunden (13,14,42,43).




                            -27-
-27-




                       Aktivierung des
                       Koagulationssystems


      FSP
                                !
                            Thrombin

            "                   1
            Fibrinogen - - - - - - - - - . Fibrin ---II>" FSP
                                         ..

                l
             Plasmin
                                                 l
                                              Plasmin

                1
     Primare Aktivierung
                                                 f
                                          Sekundare Aktivierung
des fibrinolytischen Systems          des fibrinolytischen Systems




 Abb. 10:    Entstehungsschema der Fibrinogen Spaltprodukte




                              -28-
-28-




1.50        Nomenklatur der Fibrinogen Spaltprodukte


Da die Bezeiohnung fUr die Fibrinogen Spaltprodukte in
der Literatur untersohiedlioh benutzt wird, wurden in
der Tabelle 5 a11e gebrijuohliohen Synonyme zusammengeste11t.
Im Deutsohen sprioht man von sogenannten Fibrin bzw.
Fibrinogen Spaltprodukten, die abgelillrzt mit FSP be-
zeiohnet werden.



Hijufigst benutzter Terminus                   Alternative

Fibrinogen degradation                         Fibrin(ogen) split
produots FDP                                   produots (FSP),
                                               Fibrin(ogen) relatl
                                               Antigens.

I!'ragment X .;, FDP X                         Stage 1 digest,
                                               Fraotions 1-8:1-8D
                                                         1-9:1-9D

I!'ragment X + Y                               Early FDP, Stage 2
                                               digest, Intermediate
                                               products.

Fragment D + E                                 Late FDP, stage 3
                                               digest, Terminal
                                               products

Tabelle 5   I   Alternative Namen der Fibrinogen Spaltprodukte



                             -29-
-29-




2.00   Potenzverhaltnisse und Aquivalentdosen del'
       meist benutzten Ostrogene


Ostrogene                     Potenz-             Ungefahre
(Verabreichungsart)           verhlUtnis          Aquivalentdosis (m
Athinylostradiol .            20                  0,05
( oral )
Mestranol                     15                  0,08
( oral )
Quinestrenol                  15                  0,075
( per os )
Ostradiolbenzoat               2                  0,5
( Lm. )
Ostradiolvalerianat            2                  0,5
( Lm. )
SilbOstrol                     1                  1,0
( oral )
[onj. Equine
!:strogene                    0,75               1,25
( oral )
~ethallentstril                0,3                3,0
( oral )

Pabelle 7:   Ubersioht del' relati ven PotenzverhlU tnisse
             und Aquivalentdosen del' weist benutzten '
             Ostrogenel Bezugsmedikament, Stilboestrol.
             ( von Fundamentals of Obstetrics and
             Gynaecology, hrsg Derek Llewellyn-Jones,
             Vol. II, Seite 260) •




                             -30-
-30-




2.10          Patientengut             Normalkontrolle


Da die untersuchten Patientinnen verschiedene ostrogen-
haltige Handelspraparate erhielten, haben wir in der
Tabelle 6 aIle verabreichten Kontrazeptiva zusammenge-
stellt; nach ihrem Dstrogengehalt eriolgte eine Unter-
teilung in Gruppen von A-a. Diese Einteilung in Gruppen
ist notwendig, weil die haemostaseologischen Veranderungen
nach Meinung vieleI' Autoren (12,32,54,62) durch den
ostrogenanteil in den Praparaten bedingt sein sollen.

Handelsname       Ostrogenanteil        Gestagenanteil         Gruppe
                     (ug)                   (mg)
Microgynon        AD = 30    ug         D-Norgestrel 0,15          A
Stediril-D        At) = 30 ug           D-Norgestrel 0,15

Ortho-Novum       Mestranol 50          Norethisterin 1,0          B


Ovysmen           AD           35       Norethisterin 0,5
                                                                   C
Yermonil          AD           40       Lynestrenol      0,5

Exlutona                                Lynestrenol      0,5       D

Ovanon            AD           50       Lynestrenol      2,5
                                                                   E
Duoluton          AD           50       Norgestrel       0,5

Cyclo-            Dstradiol-
Progynova         Valarianat 2000                                 F


Presomen          Konj. ostrogen
                                                                   G
Progynova         Dstradiol-
                  Valerianat

Tabella 6: Tabellarische Ubersicht del' verwendeten
           Sexualhormone. AD = Athinyl-ostradiol.

                               -31 -
-31-




Insgesamt wurde die Untersuchung zum Nachweis von FSP
unter ~strogengabe bei 92 Frauen durchgefUhrt. Davon
waren 11 Frauen im geschleohtsreiien Alter und schwanger;
sie bildeten die erste Gruppe.

Zur 2. Gruppe gehorten 65 Frauen im geschlechtsreifen
Alter von 18-45 Jahren, die wahrend der Einnahme und
nach Absetzen von ostrogenhaltigen Medikamenten unter-
sucht wurden.

Die restlichen 16 Frauen im Alter'von 46-54 Jahren
wurden wegen klimakterischer Beschwerden mit Sexual-
hormonen behandelt.

Die Frauen der 2. Gruppe erhielten die ostrogenhaltigen
Fr~parate zur Kontrazeption.


Bei allen Frauen,wurde das Serum wahrend der Einnabme
von ostrogenhaltigen oral en Kontrazeptiva und nach
Absetzen der Einnahme untersucht. Diese untersuchungen
bildeten eine sogenannte "interne Kontrolle".

DarUberhinaus wurden 20 gesunde Frauen im geschlechts-
reiien Alter und 20 Frauen in der Menopause sporadisch
mituntersucht.
Bei den Patientinnan, die wahrend dar Schwangerschaft
untersucht wurden, eriolgte die Bestimmung der FSP mehr-
mals.

Bei jeder Unter'suchung auf Vorliegen von FSP wurde als
negative Kontrolle Serum von gesunden Mannern getestet.




                         -32-
-32-




3.00                  Methodik


3.10          Herstellung der Seren


Vollblut wurde in einer Spritze durch saubere Venenpunktur
unter sanfter Venenokklusion ohue Schaumbildung von den
Pro bandinnen in IIruhendem Zustand II entnommen.

2 ml Vollblut wurden direkt in ein vorgesehenes
FSP-Rohrchen gebracht. Die Rohrchen enthielten Thrombin
und Sojabohnen-Trypsin Inhibitor, urn eine vollstandige
Gerinnung herbeizufUhren und einen Fibrinogenabbau in
vitro zu verhindern. Das Blut wurde durch Umkippen ge-
mischt. Das geronnene Blut wurde danach scharf ~entri­
fUgiert. Das Uberstehende Serum wurde abpipettiert und
bel etwa -20 0 C bis kurz vor der Untersuchung aufbe-
wahrt. Blut ohne Zusatz von Enz)~-Inhibitoren 1st un-
geeignet fUr FSP-Untersuchungen.

Die Untersuchung des Serum erfolgte im allgemeinen
zweimal:
            1. wahrend der Medikamenteneinnahme und
            2. naoh Absetzen der Kontrazeptiva


3.20          Latex     Agglutinationstest   (Lat)   *
Reagenzien.

Die im Thrombo-Wellcotest Kit enthaltenen Reagenzien
wurden benutzt.

*   Thrombo Wellcome Test.


                             -33-
-33-




Die Reagenzien worden von dem Deutsohen Welloome, Burg-Wedel
geliefert.

Prinzip der Methode.


Der Lat ist ein sogenannter Objekttragertest und fUr die
halbquantitative Bestimmung von FSP geeignet.

Ein Tropfen des mit Glycin-NaCl Puffer 1:5 verdUnnten
Serum wurde mit einem Tropfen der Latex Suspension auf
dem Objekttrager gut mit EinmalrUhrstabohen vermischt
und genau zwei Minuten hin und her umgeschwenkt.

Das Ergebnis des Lats liest man in hell em diffusen Licht
gegen einen entfernten dunklen Hintergrund abo
Die ungefahre Konzentration der FSP in einem unbekannten
Serum worde durch Untersuchung der Seren in verschiedenen
VerdUnnungen bestimmt.

Fand eine Agglutination bei einem Serum der VerdUnnung
z.E. 1 I X statt, so war die Mindestkonzentration dar
FSP 1m 'unverdUnnten Serum X.2 ug/ml, da die Empfindlichkeit
des Thrombo-Wellcotests bei 2 ug/ml liegt. Die Ver-
dUnnungsstufe wird bei der Berechnung mit der Empfindlich-
keit des Tests multipliziert.

Die Latexpartikel sind mit Immunglobuline (Antikorper)
gegen die sogenannte Human FSP - D und FSP - E beladen.
Aus diesem,Grund ist die Empfindlichkeit des Thrombo-
'Iellcotests fUr FSP - D und FSP - E hoher als fUr
~ibrinogen/Fibrin und/oder die hoohmolekUlaren Spalt-
produkte. (14)

Die Ergebnisse des Latex-Agglutinationstests sind in
den Tabellen 12, 13, 14 und 15 zusammengestellt.
-34-




3.30    Uberwanderungsimmunelektrophorese (Counter-
        ourrent immunoeleotrophoresis - ClEP).


Reagenzien

Diathylbarbiturat-Aoetat Puffer von pH 8,2 und lonenstarke
von 0,1 wurde, wie in "Methode del' quantitativen und
qualitativen Immunelektrophorese" (Behringwerke, Marburg)
hergestellt.

Antiseren und Elektrophoresenplatten:

Anti Humanfibrinogen Serum von Kaninohen (Behringwerke)
Anti Humanfibrinogen Spaltprodukt - D Serum von
Kaninohen (Behringwerke, Marburg)
Anti Humanfibrinogen Spaltprodukt - E Serum von Kaninohen
del' Behringwerke, Marburg.

Als Standard Antigene wurden hochgereinigtes Fibrinogen
Spaltprodukt - D (200 ug/ml) und Fibrinogen Spaltprodukt-
E (100 ug/ml) del' Behringwerke benutzt. Gegen Anti-
Fibrinogen Serum wurde Standard Human Plasma (Fibrinogen =
230 ± 20 mg/10o ml) verwendet.

Alle Antiseren und Proben waren mit Diathylbarbiturat-
Acetat Puffer pH 8,2 und lonenstarke von 0,1 entsprechend
verdUnnt.

Verwendet wurden Agar-Gel Platten, die gebrauchsfertiges
1?6 iges Agarose-Gel enthiel ten. Das Agaros'e-Gel wurde mit
Diathylbarbiturat-Acetat Puffer von pH 8,2 und lonenstarke
von 0,05 angesetzt. Als Konservierungsmittel enthielten sie
1 mg/ml Natriumacid.


                          -35-
-35-




Die Elektrophoreseneinrichtung der Behringwerke AG,
Marburg, wurde benutzt. FUr Kontakt zwischen Puffer-
kammer und Gel wurden im Puffer getrankte Filterstreifen
(Schleicher und SchUll Nr. 2668) verwendet.

VersuchdurchfUhrung


Die Fertigplatten eignen sioh zum immunologisohen Nach-
weis von anodenwarts wandernden Proteinen in Korper-
flUssigkeit (u.a. Serum, Urin, Liquor etc.) bei An-
wendung von CIEP.

Drei doppel-parallele Reihen von LBohern wurden auf die
Platten gestanzt. (Abb. 12 u. 13)

Die Auftragsstellen der Elektrophoresenplatten wurden
mit je 15 ul Anti-Serum bzw. Probe besohickt. Die Anti-
Seren wurden in die anodenwarts gestanzten Locher
beschickt (Antikorper wandern durch Elektroendosmose
kathodenwarts). Die Testseren dar VerdUnnungsreihen
von 1 : 1 bis 1 : 1024 wurden jeweils in die kathoden-
warts befindlichen Locher beschiokt.(Antigene wandern
im elektrischen Feld anodenwarts) (22,58)

Nach genau 45 Minuten waren die Untersuchungen beendet,
und da die gebildeten Prazipitationen gut zu sehen waren,
wurde auf eine Farbung verzichtet und die Ergebnisse
gleich nach Versuchsablauf gegen einen dunklen Hinter-
grund abgelesen. Die Einzelheitan der DurchfUhrung sind
unter anderem auch in der Tabelle 8 dargestellt.
-36-




Methode Puffer         Gelkonz. Platten-   Gelvo!. Feld-     Elphores   l

                                gri:lBe            starke    dauer

CIEP            0.05
             U:;:      196       1ox10     20 ml   4-6V/em   45 Min.
             pH=8,2    Agarose    em
             A-A-P



Tab. 8   I    DurehfUhrung del' Uberwanderungsimmunelektrophorese
              - elEP

Die ClEP wurde bei allen Seran mit Anti-F, Anti-D und Anti-E
Serum durchgefUhrt, wobei zum quantitativen Vergleich
Standard Humanplasma, hoehgereinigtes FSP-D und hoehge-
reinigtes FSP-E benutzt wurden.

Bei allen drei Standard Antigenen wurde dureh VerdUnnungs-
reihe die sogenannte Naehweisgrenze bestimmt:
   1. lm Standard Humanplasma (230 ± 20 mg Fibrinogen/1oo ml)
      konnte Fibrinogen mit Anti-Fibrinogen Serum bis zu
      einer VerdUnnting von 1 : 512 naohgewiesen werden.
   2. Das hochgereinigte FSP-D (200 ug/ml) gab mit Anti
      FSP-D Serum bis zu einer VerdUnnung von 1 : 128 nach-
      weisbare Prazipitationsbogen, wHhrend
   3. das hoehgereinigte FSP-E (100 ug/ml) mit
      Anti FSP-E Serum bis zu ainer VerdUnnung von
      1 : 256 nachweisbar war (Abb. 13).

Da sieh die Nachweisgrenze (n) bzw. die Empflndllchkeit
ala VerhlH tnis del' Konzentration des Serums an Ant.l.gan
zur VerdUnnung darstellt, erreehnet sieh die Empfindlichkeit
fUr die einzelnen Antigene wie in del' Tabelle 9 zusammen-
geatellt iat.

                                 -37-
-37-




Anti Serum   VerdUnnung   Empfindlichkeit (n)
                          Eigene Ergebnisse      Lit. Angaben
Anti Fg       1: 5        4.50 ug/ml             1 - 5 ug/ml
Serum

Anti FSP-D    1 :2        1.56 ug/ml       Anti FSP-D bis 20 ug/m:
                                           Anti FSP-E bis 2,0 ug/J
Anti FSP-E    1: 1        0.39 ug/ml
              (pur)


Tabelle 9    Vergleich eigener Empfindliohkeiten mit
             Literaturangaben (28,58)




                           -38-
-38-




3.40         Eindimensionelle Imrnunelektrophorese
             nach Laurell (1 DIE )


Reagenzien


Di~thylbarbiturat-Aeetat Puffer von pH 8.6;
20.6 g Barbital-Natrium (5,5 - Di~thylbarbiturs~ure­
Natrium-Salz) und 4.0 Barbital (5,5 - Di~thylbarbitursaure
wurden mit destiDiertem Wasser gelost und auf 2 Liter
aufgefUllt. Ionenst~rke dieses Puffers betrug 0.05.

Farbelosung wurde aus 50 g Coomassie Brilliant Blue R,
4.5 Liter Athanol (96%), 1 Liter Eisessig und 4,5 Liter
destilliertem Wasser hergestellt.

Zum Entf~rben des Untergrunds wurde eine Losung aus
4.5 Liter 96% Athanol und 1.0 Liter Eisessig und 4.5 Liter
destilliertem Wasser hergestellt.

Prinzip der 1 DIE ist folgendes:
Negativ geladene Proteine werden w~hrend der
elektrophoretischen Wanderung in einem Anti-Serum-haltigen
Gel pr~zipitiert. Die Hohe der entstehenden S~ulen ist
abh~ngig von der Konzentration des entsprechenden Proteins.


AusfUhrung des Versuchs


Auf 5 x 5 em groBen Glasplatten wurde in einer 1%igen
Agarose das entsprechende Antiserum (Anti-Fibrinogen,
Anti FSP-D und Anti FSP-E) nach AbkUhlen auf 530C ge-
mischt und die Serumproben in 2 mm ¢ messende Locher
pipettiert.


                           -~-
-39-




Die Proben wurden innerhalb von 16 Stunden bei 4V/cm
Feldstarke elektrophoretisch aufgetrennt.

Nach Waschen und Trocknen der Glasplatten wurden sie mit
Coomassie Brilliant Blue R Losung gefarbt. Die UberschUssige
Farbe im Hintergrundwurde mit der Entfarbelosung abge-
waschen.

Die Eichkurven wurden mit 1 :32, 1:64 und 1:128 verdUnnter
Flbrlnogenlosung (5mg/ml) hergestellt.

Die Proben wurden fUr die Elektrophorese   verdUnnt wie in
der Tabelle 10 zu ersehen 1st.

Die Empfindliehkeiten bei allen drei Antigenen wurden dureh
VerdUnnungsreihe bestimmt:
    1. In der Standard Fibrinogenlosung ( 5 mg/ml ) wurde
       Fibrlnogen mit Anti-Fibrinogen Serum bls.zu einer
       VerdUnnung von 1:128 nachgewiesen. Daraus errechnet
       sieh die Nachweisgrenze als 0.31 ug
    2. Die Nachweisgrenze fUr Anti FSP-D ergab 0.13 ug und
    3. die Nachweisgrenze fUr Anti FSP-E ergab 0.25 ug.




                          -40-
.Antigen-    Feld-     Lauf-      Agarose   Barbital   .Anti     Verd.          Verd.
                      Menge        starke    zeit       Gel Vol   Puf£er     Serum     Eichskurve     Probe
                                             (Stunde2                        Konz.
        Fibrinogen    5ml          4V/cm     8-16       1%,4ml    pH=8.6     0.2   %   1 :32, 1 :64   1:8,1:16
                                                                  u =0.05              1:128          1:32

        Fragment D    5ml          4V/cm     8-16       1%,4ml    pH=8,6     0.5 %     1:8,1:16       1:1,1:2
                                                                  U =0,05              1 :32          1:4
  (
 0
..:j-
  (
        Fragment E    5ml          4V/cm     8-16       19b,4ml   pH=8,6     2 %       1:8,1:16       1:1,1:2
                                                                  u =0,05              1:32           1 :4


        Tabelle 10: Laurell - Elektrophorese Bedingungen
-41-




Anti Serum    Anti Serum          Empfindliohkeit   (ugjml)
              Konzentra tion      eigene Ergebnisse Literatur

Anti Fg       0.2   %             0.39              0.5 - 2
Anti FSP-D    0.5 %               0.13              0.5 - 2
Anti FSP-E    2     %             0.25              0.5 - 2


Tabelle 11: Vergleich eigener Empfindlichkeiten del'
            1 DIE mit den Literaturangaben (28)




                          -42-
-42-




4.00         Ergebnisse


Von den 92 Patientinnen hatten 47 1m Serum einen
erhl:lhten Gehalt an Fibrinogen Spaltprodukten. Bei
den meisten Patientinnen war der Latex - Agglutinations-
test mit einer Serumverdtinnung von 1 : 5 positiv. Das
bedeutet, daB im unverdUnnten Original-Serum mehr als
10 ug/ml FSP aber weniger als 20 ug/ml FSP vorhanden
waren.(vgl. Tabelle 15) .

Zwei der FSP positiven Seren (Patientinnen 81 und 83)
hatten eine Konzentration der FSP von mindestens 40 ug/ml.
Bemerkenswert war, daB diese beiden Frauen erst 21 und
23 Jahre alt waren. Sie waren sonat gesund. Wie aus der
Tabelle 16 zu ersehen ist, hatten sie Ortho-Novum einge-
nommen.Sowohl die beiden eben genannten Patientinnen als
auch die anderen 47 wurden nach Absetzen der Kontrazeption
beim Beginn des Zyklus zu einem Zeitpunkt, wo man normaler-
weise eine Erh~hung der FSP bei diesen Patientinnen nicht
zu erwarten braucht,nachuntersucht. In keinem Fall wurde
ein erhl:lhter FSP Spiegel gefunden, wie aus der Tabelle
zu ersehen ist.

Auch bei 10 von 16 der Frauen im Klimakterium war der
Gehalt an FSP im Serum mit tiber 10 ug/ml erhl:lht.
(Tabelle 15)

Bei den untersuchten Patientinnen im Verlauf einer
Schwangerschaft war bei 10 der 11 Schwangeren der Gehalt
an FSP im Serum erhoht. (Tabelle 15)

Zur Sicherung des FSP-Nachweis wurde bel den 47
Patientinnen mit positivem Befund semi-quantitativ mit
der sogenannten Countercurrent immunoelectrophoresis (CIEP)
eine Kontrolluntersuchung durchgefUhrt. Die Ergebnisse
sind in den Tabellen 15 und 16 zusammengestellt.

                          -43-
-43-




Man kann daraus ersehen, daB die Ergebnisse, die mit
dem Latex-Agglutinationstest erzielt wurden, auoh mit
denen der CIEP im wesentliohen Ubereinstimmen
( r = 0.607 ).

1m allgemeinen haben gesunde Frauen aller Altersgruppen
unter 5 ug!ml nachweisbare Fibrinogen Spaltprodukte (56,14).
So war es auch bei der von uns durchgefUhrten Kontrolle
im Alter von 18-30 Jahren und bei den 20 Kontroll-Meno-
pausefrauen. Nach Das et al (14) betragt dar FSP Gehalt
im Serum bei gesunden erwacbsenen Frauen und Mannern
4.9 ± 2.8 ug!ml.

Alle mannlichen Kontrollierten batten einen FSP Gehalt
von weniger als 10 ug!ml und somit nicht mit den Methoden
nachweisbar.

Die zwei Seren, die mit dem Welleotest FSP Spiegel
von Uber 40 ug!ml ergaben, wurden mit der Eindimensionellen
Immunelektropborese naeh Laurell (35) mit Anti-Seran gegen
Fibrinogen, FSP - D und FSP - E untersueht. Die Bilder
zeigen nun, daB mit diesen Anti-Seren Prazipitate dar-
gestellt worden sind, die den Anti-Seren entspreehen.

Es konnte FSP mit Anti-Fibrinogen, mit Anti FSP-D Serum
sowie Anti FSP-E Serum naehgewiesen werden. Demnach
handelt es sieh um sogenannte Plasmin-Spaltprodukte bzw.
Abbauprodukte des Fibrins.

Von groBtem Interesse war nun, ob bestimmte Handelspraparate
ostrogenhaltiger Kontrazeptiva beim Einnehmen besonders
oft zu Bildung von FSP fUhrten. Aus diesem Grund haben
wir die bei unserem Patiantengut verabreiehten Kontra-
zeptiva naeh dam 5strogen-Gehalt in sieben Gruppen
unterteilt (s. Tabelle 6)

                          -44-
Bei   den von uns untersuohten Patientinnen waren die FSP
bei   den Gruppen B und E sehr hooh, wahrend die Einnahme
von   anderen Praparaten nur geringgradige Erhohung des
FSP   Spiegels verursachten. (Abb.11)




                           -45-
-45-




Die Zahl der von uns untersuchten Patientinnen, vor all em
dann, wenn man sie in Gruppen je nach Einnahme der Kontra-
zeptiva unterteilt, ist bisher nur gering, so da~ man
hierauB keine Konsequenzen zieben kann. Auff~llig
ist trotzdem, daB mit steigender pstrogendosis die FSP
Spiegel im Serum der Patiantinnan ansteigen (Abb. 12)




Proben Nr. 81:
Standard-Serum = 5 mg/ml Fibrinogen, Anti-Serum = 0,2% (8 ul)
VerdUnnung des Standard-Serums = 1 : 32, 1 : 64, 1 : 128
VerdUnnung der Proben = 1 : 8, 1 ; 16, 1 : 32
Empfindlichkeit = Konzentration in 8 ul
                  Titerstufe (128)
                = 0.31




                          -46-
-46-



Abb. 13:




Proben Nr. 81:
Anti-Fibrinogen Spaltprodukt D Serum = 0.5 % (20 ul)
Standard Serum D = 200 ug/ml
VerdUnnung des Standard D Serums = 1   8, 1 : 16, 1 : 32
VerdUnnung der Probe = 1 : 1, 1 : 2, 1 : 4
Empfindlichkei t = 0,.13 ug
Abb. 14:




Proben Nr. 81:
Anti-Fibrinogen Spaltprodukt E Serum = 2 % (80 ul)
Standard Serum E = 100 ug/ml
VerdUnnungsreihe des Standardserums (E) ~ 1 : 8,     16, 1 : 32
VerdUnnungsreihe der Probe = 1 : 1, 1 : 2, 1 : 4
Empfindlichkeit = 0.25 ug
Handelsname       Gestagenanteil       Cstrogenanteil    FSP Thrombo Test             I              >     >              >
                                                                                 Q)
                                                                                 P-        § ~           ..-i
                                                                                                         .p
                                                                                                                ..-i
                                                                                                                .p
                                                                                                                               ..-i
                                                                                                                               .p
                          (mg)                  (ug)          pos. neg. Summe    §'        .c         a! ..-i    a!            ..-i
                                                                                           o         '+-I OJ     !lD            OJ
                                                                                 $.0       $.0        8 0        Q)             0
                                                                                 0         A.        ::> P-      c         'l!R.P<

     Microgynon        D-Norgestrel         AD   (30)         3    9     12
                          (0.15)
                                                                                 A         14             3      11         21.4
     Stediril-D        D-Norgestrel         AC   (30)         0    2         2
                          (0.15)
     Ortho-Novum       Norethisterin        Mestranol 50      9    5    14       B         14             9            5    64.3
                         (1.0 )
     Ovysmen           Norethisterin        AC (35)           1    7         8
I
:-                      (0.5 bzw. 1.0)                                           C         12             1      11
~                                                                                                                            8.3
I
     Yermonil          Lynestrenol 2.0      AO (40)           0    4     4

     Exlutona          Lynestrenol 0.5                        2    5     7       D               7         2           5    28.6

     Ovanon        .   Lynestrenol 2.5      1i.O (50)         3    2     5
                                                                                       ,
                                                                                 E         15            12            3    80.0
     Duoluton          Norgestrel     0.5   AD (50)           9    1     10

     Cyclo-Progy-      Norgestrel     0.5   Cstradiol-17-     4    7     11      F         11              4           7    36.4
     nova                                   Valerianat 2000
     Presomen/                              konj. Cstrogene   4    5     9       G               9         4           5    44.4
     Progynova                              (O-Valerianat)
     Tabelle 12: Die verwendeten Praparate .
-48-

      .                     FSP - Thrombo    WelIco~es~       und   ~IEP
•
H
     ~            I         Wahrend der Behandlg.     kurz danach                   .......
.
2;

0
      ~
     ..a
           H
           Ql
           ~    ~
                 ro    Ql

                       ~    Uber     unter    ,       Uber    unter   ~~
                                                                               Ql
                                                                               P,
                                                                                      H
                                                                                      Q)


                                                      1oug/ml 1oug/ml 0~
      0
~    t:    ~
                 Ql
                ;:.:
                       Ql
                       a    10 ug/ml 10 ug/ml

1     27   27   Ovanon        -          -                -            -        II
2     28   43   Fresomen      -          -                -            -        IV
~    30    40   Presomen      -          -                -            -        III
4     33   44   Duoluton      +          -                -                -    IV
.2   37    44   Duoluton      +          -                -                -    IV
6    42    28   Ovanon        +          -                -                -    II
L    32    ~9   Duoluton      +          -                -            -        II
8    61    43   Presomen      -          -                -            -        IV
9    62    44   C:~clo-P.     -          -            -                -        IV
10   63    42   Duoluton      +          -            -                -        IV
11   64    44   Duoluton      +          -            -                -        IV
12   67    23   Ovanon        -          -            -                -        II
11   68    19   C~clo-P       -          -            -                -        I
14   79    22    Ovanon      +           -            -                -        II
15   80    22    Ovanon      +           -            -                -        II
16   84    42    Cvclo-P     +           -            -                -        IV
17   88    42    Cvclo-P     +           -            -                -        IV
18   82    30    HCG         +           -            -                -        II
19   35    24    O-Novum     -           -            -                -        II
20   42    22    M'Gvnon     -           -            -                -        II
21   43    20   ·Ovvsmen     -           -            -                -        I
22   44    19    Ovvsmen     -           -            -                -        I
23   45    25    Ovvsmen     -           -            -                -        II
24   46    20   Exlutona     -           -            -                -        I
25   48    20   Exlutona     -           -            -                -        I
26
27
     50
     51
           33
           18
                 Yermonll
                M'Gynon
                             -
                             -
                                         -
                                         -
                                                      -
                                                      -
                                                                       -
                                                                       -
                                                                                III
                                                                                I
28   54    23   M'Gynon      -           -            -                -       II
                                                                                        .,



Gruppe II, Alter von 18 - 45 Jahren



                              -49-
-49-



                          FSP-Thrombo Wellcotest und CIEP

   .          Ql          wiihrend der Behandlg.   kurz danach        ,.....
                                                                       H
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                                                                 Ql
                                                                 Pi
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                                                                       Ql


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                                        ug/ml
                                                   Uber unter
                                                   10    10
                                                                 ~~
                                                                 C.'J'--"
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               Ql
              ::.:

   55   44   Ovysmen        -              -        -       -     IV
   56   20   M'Gvnon        -              -        -       -     I
   57   25   Exlutona       -              -        -       -     II
   58   31   M'Gvnon        -              -        -       -     III
   59   34   M'Gvnon        -              -        -       -     III
   60   20   Stediril       -              -        -       -     I
   61   37   Exlutona       -              -        -       -     III
   62   18   Ovvsmen        -              -        -       -     I
   63   35   Yermonil       -              -        -       -     III
   64   27   M'Gvnon ~.     +              -        -       -     II
   65   20   Ovvsmen        -              -        '-      -     I
   66   33   O-Novum        +              -        -       -     III
   67   24   Yermonil       -              -        -       -     II
   68   25   Yermonil       -              -        -       -     II
   69   40   Exlutona       -              -        -       -     III
   70   37   Stediril       -              -        -       -     III
   71   23   O-Novum        -              -        -       -     II
   72   35   M'Gvnon        -              -        -       -     III
   73   25   M'Gvnon        -              -        '-      -     II
   76   36   Ovvsmen        -              -        -       -     III
   77   29   M'Gvnon        -              -        -       -     II
   78   22   Ovvsmen        +              -        -       -     II
   79   40   M'Gvnon        +              -        -       -     III
   80   24   O-Novum        +              -        -       -     II
                               = Uber
   81   27   O-Novum        ++
                            40 ug/ml
                                           -        -       -     II

   82   34   O-Novwn        +              -        -       -     III
                                  = Uber
   83   21   O-Novum        ++
                            40 ug/ml
                                           -        -       -     II


lppe II. Alter von 18 - 45 Jahren
-50-

Gruppe II, Alter von 18 - 45 Jahren



                               FSP - Thrombo Wellcotest und ClEP           ,......,
                                                                      Q)      H
                               wiihrend der Behandlg.   kurz danach   PJ     Q)

                                                                      e~
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                   Q)
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                   Q)
H                  ~

56    84    22    Exlutona       +            -           -     -           II
57    85    19    O-Novum        +            -           -     -           I
58    86    20    Exlutona       +            -           -     -           I
59    87    25    O-Novum        -            -           -     -          II
60    88    2"3   O-Novum        +            -           -     -          II
61    89    2'i   O-Novum        -            -           -     -          II
62    91    45    O-Novum        +            -           -     -           IV
6"3   9"3   21    O-Novurn       +            -           -     -          II
64    60    45    ProlZvnova     +            -           -     -          IV
65    70    19    Cyclo-
                  Progynova
                                 +            -           -     -          I


                  Summe        (27)         (38)         (65)

Tabella 13: Zusammenstellung der untersuohten Patientinnen,
            ihr Alter, Fabrikat der ostrogenhaltigen Kontra-
            zeptiva und die Ergebnisse der FSP Bestimmung
            wiihrend und nach Behandlung.




                                     -51-
-51-




                                         FSP - Thrombo Wellcotest und CIEP

              .           ()

                         +>
                         g
                                         Wlihrend der Behandlg. kurz    danach
                                                                                       ---.
          ~
                                                                                 <I)    H
                                                                                 PI ()
                                         tiber 10   unter 10   tiber    unter
    ~     Q               ~                                                      e+>
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                  +>                                            ug/ml    ug/ml
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                          Q)
                         ::;::

    1     29      48    Duoluton              +                  -                IV
    2     35      4q    Duoluton              +                  -                IV
    ~     36      47    Duoluton                                 -                IV
!
                                              +
    4     38      52    Cyclo-
                        PrOll:vnova
                                              +                  -                V

    5     39      46    Cyclo-
                                                                 -
                                                      -                           IV
                        Proll:vnova
    6     43      50    Presomen              +                  -                IV
    7     44      47    Duoluton                      -          -                IV
    8     46      50    Presomen              +                  -                IV
    9     53      49    Cyclo-                +                  -                IV
                        Proltvnova
    10    55      47    Cyclo-
                        Pro ltvno va
                                                      -          -                IV

    11 58         48    PrOll:vnova                   -          -                IV
    12 59         54    Duoluton              +                  -                V
    13 65         48    Cyclo-
                        Proltvnova
                                                      -          -                IV

 14 66            53    PrOll:vnova                   -          -                V
 15 81            ')0   Preeomen              +                  -                IV
,16 134           48    MIGvnon               +                  -                IV
                        Summe          (10)          (6 )      (16)
    Tabelle 14: ZUBammenstellung der untersuchten Patientinnen im Alter
                von tiber 46 Jahren. Die Tabelle zeigt daB Verhalten
                von FSP wlihrend der Einnahme und naoh Absetzen der
                Batrogenhaltigen Sexualhormone.


                                          -52-
}ruppe           Alter    Thrombo-Welleotest      Uberwanderungs-    Summe   % der FSP positive
                                                        Immunelektropho-           Seren
                                     (UT)               rese (CIEF)


                                tiber 10    unter 10    pos.    neg.               Welleo      CIEP
                                ug/ml       ug/ml

      3ehwangere                10          1           10      1          11      90.91      90,91
      I)
                                                                                                         I
 I                                                                                                      1<
CJ
U"
      }eschleehtsreii' 18-45    27          38          27      38         65      41,54      41,54     U"
                                                                                                         I
 I     II)

      fuimakterisehe   tiber    10          6           10       6         16      62,50      62,50
       III)            46

      ~umme
                       I       147         I 45        147      45
                                                                       -
                                                                           92      51,09      51,09

      Tabelle 15: Zusammenf'assung der Ergebnisse der FSP Bestimmung bei 92 Frauen mit zwei
                  Methoden : Der Lat und die CIEF. Beide Methoden hatten tibereinstimmende Unter-
                  suehungsbei'unde.
-53-




 ~    100
<'l   0/0

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 ~    80                             r-
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~                            r-


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0..
      20

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            A   8     c      o       E      F    G      Schwonge
                    Gruppe der Priiporote


Abb.11: Graphische Ubersicht der prozentualen FSP-Zunahme
        tiber 10 ug/ml innerhalb der verschiedenen PrMparaten-
        gruppen. Als Vergleich eine Saule der FSP-Zunahme
        der Schwangeren rechts.




                              -54-
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                                                                              .--l
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                                                                                                            .,..j
                                                                                                                                     Ql
                                                                                                                                    .,..j
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                                                                                                                                    :a:l
                                                                                                                                                Medikament    ClEF (Konzentration)
                                                                                                                                                              Anti.   Anti. Anti.
                                                                                                                                                                                      j
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                                                                                      ~
                 0               I       I
        0-4
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                                               ~
                                               0::
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                                                                                             .t::
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                                                                                                      al
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        1       29     48       165     55     130    14      28       47      6        1    TB        -             -       -          -       Duoluton      18.0    12.48    6.24'
                                                80            4
        2       33     44               85     160    16      28        ¢      0        1    ¢         -       ++            -          +       Duoluton      18.0    12.48    6.24
                                               100            5"
        3       35     49               98     180
                                               120
                                                      13      28
                                                              ""4
                                                                        ¢      3        0    ¢         +    +++              -          +       Duoluton      18.0    12.48    6.24

        4       36     47       163     75     150    10      28
                                                              4
                                                                        ¢         2     1    ¢         -             -       -          -       Duoluton      18.0    12.48    6.24
                                               To
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 I
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...;t   5       37     44               85
                                               ~
                                                      16      28
                                                              """'5"
                                                                        ¢         0     1    ¢         +        ++           -          +       Duoluton      18.0     12.48   6.24

        6       38     52               70     120
                                                80
                                                      13      28
                                                              ~
                                                                        47        0      0   ¢         -             -       -          -       Cycloprogy-    9.0     6.2.4   3.12.
                                                                                                                                                nova
        7       42      28               46    125    11      28        ¢         1      0   ¢      ++               -          -           -   Ovanon        9.0      1.56    6.24
                                                80             "3
        8       43      50               63    12.2. 11
                                                80
                                                              28
                                                              ""4
                                                                        47        0      0   ¢          -            -          -           -   Presomen      9.0      3.12    6.24

        9       46      50               73    1·45   13      28        45        1      0   ¢          -            +          -           -   Presomen      9.0      3.12    6.24
                                               100             "3
        10 52           29       162     62    140
                                                 75
                                                      12      28        ¢         1      0   ¢      +++              -          -           -   Duoluton      18.0     12.48   6.24
        -       - - - - --                                                    -
Medikament       CIEP( Konzentration )
                                                                                                 s::                                  Anti Fg Anti FSP-D Anti
          .
                                                                                                              (I)
                                                                    r-I                          0            ..-!
                               .p                                   .<::                         ..-!         s                       0=4.5   n=1.56     FSP-E
         s:..                  .<::                           (I)   <l!          (I)              O'l         :<l!
         Z              0>      0               (I)           O'l   N            ll'l            s::    til    p.
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                               ..-!                                  I                           0>
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                                                                                           <l!
                                                                                          p:;    ::r: ~
                                                                                                      Q
                                                                                                         e:   ::r:
11        53     49     162     75    130
                                       '"9"0
                                               13        28    40    a a -                +      - -           -     Cycloprogynova     9.0     1.56     . 6.24

12        59     54     165     72    175
                                      100
                                               14       28     43    a     0       - -           + -           -     Duoluton           18.0    12.48     6.24

13        60     45     157     60    170      12       28     42    4     0       TB -          - -           -     .Progynova         18.0    12.48     6.24
                                      100
14        63     42     174     78    160      15        28    ¢     2     0         TB   +++    + -           +     Duoluton           -18.0   6.24      12.4C
                                      11"'0
15        64     44     172     67    120
                                       80
                                               14        28
                                                        5"
                                                               ¢     3     0         TB   -      - -           -     Duoluton            9.0    1.56      6.24

16        71     18             49    120
                                      80
                                               12        28    ¢      a    0         -    +++    - -           -     Schwanger           9.0    6.24      3.12

17        72     20     169     59
                                      1~~      13        28    ¢     1     0         - -         - - -               Schwanger           18.0   12.48     6.24

18        73      23                           12        28    ¢      0    0         -    -      - - -               Schwangsr           18.0   12.48     6.24
19        75     32     161     75
                                      -~
                                                         28    ¢      1    0         -    -      - - -               Schwanger           18.0   12.48     6.24

20        76     30     150      48                      28    ¢      2    0         -           - - -               Schwanger           18.0   12.48     6.24
                                      ~
                                                                                          +++

21        77      26    176      76            13        28    ¢      0    0         -    -      - - -               Schwanger           18.0    12.48    6.24
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  • 1. Aus der Frauenldinik (Direktor: Prof. Dr. med. R. Buchholz) und aus der Medizinischen Klinik (Direktor: Prof. Dr. med. G.A. Martini) der Philipps- Universitat Marburg/Lahn DER NACHWEIS VON FIBRINOGEN/FIBRIN SPALTPRODUKTEN MIT DEM LATEX-AGGLUTINATIONSTEST, DER EINDIMENSIONELL- UND tlBERWANDERUNGS- IMMUNELEKTROPHORESE BEl FRAUEN UNTER SEXUALHORMONTHERAPIE INA UGURAL";DISSERTA nON zur Erl~ngung des Doktorgrades der gesamten Medizin dem Fachbereich Humanmedizin der Philipps- Universitat Marburg vorgelegt von EDWIN OSENI- MOMOnU aus Irrua Ishan, Nigeria Marburg/Lahn 1979 Druok: Gorioh & Weiershliuser. Marburg
  • 2. Angenommen vom Fachbereich Humanmedizin der Uni versi tat Marburg am .3.0, .l'i0;V~1ll.h~~ .1 97 9 Gedruoltt mit Genehmigung des Faohbereiohes Dekanl Prof. Dr. med. F. Neurath Referent: Prof. Dr. med. R. Egbring Correferent: Prof. Dr. med. E. Daume
  • 3. -3- INHALTSVERZEICHNIS Seite 1.00 Einleitung und Problemstellung 4 1.10 Sexualhormone 7 1.20 Blutgerinnung wahl' end des normalen Zyklus 11 1.30 Blutgerinnung wahrend del' normal en Sohwanger- 14 schaft 1.40 Bisher vorliegende Gerinnungsbefunde bei 17 Patientinnen unter Sexualhormontherapie 1.41 Anti-Thrombin III Spiegel bei Einnahme von 20 ~strogenhaltigen Kontrazeptiva 1.42 Ursache del' Entstehung zirkulierender 23 Fibrinogen Und Fibrin Spaltprodukte 1.50 Nomenklatur der Fibrinogen/Fibrin Spalt- 28 produkte 2.00 Potenzverhaltnisse und Aquivalentdosen del' 29 meist benutzten ~strogene 2.10 Patientengut - Normalkontrolle 30 3000 Methodilt 32 3.10 Herstellung del' Seren 32 3.20 Latex-Agglutinationstest 32 3.30 Uberwanderungsimmunelektrophorese 34 3.40 Eindimensionelle Immunelektrophorese 38 4.00 Ergebnisse 42 4.10 Diskussion del' Ergebnisse und Beurteilung 62 del' Methoden 5.00 Zusammenfassung 67 6.00 Literaturverzeiohnia 69 7.00 Lebenslauf 75 8.00 Verzeiohnis del' altademiaohen Lehrer 76
  • 4. -4- Seit 1950 hat die Einnahme von weibliohen Sexualhor- monen durch ihre Wirkung als Kontrazeptiva in del' ganzen ,lel t sprunghaft zugenommen. 1m Jahre 1961 wurde erstmals mit diesel' Einnahme das Auftreten einer Lungenembolie bei einer jungen Frau, die Enovid eingenommen hatte, in Beziehung gebraoht (31). Seit diesel' Zeit wurden eine Reihe von retrospektiven und prospektiven epidemiologische Studien durchga- fUhrt, um den eben genannten Zusammenhang zu stUtzen. DarUberhinaus suohta man naoh Ver~nderungen im Haemostasesystem, die die Neigung del' thrombotischen Komplikationen (Venenthrombose) und/odel' Lungenembolie erkUlren ktlnnte. Neben anderen Haemostasedefekten wurden bei den Patientinnen Fibrinogen/Fibrin Spaltprodukte in Form von 18slichen und thrombinflHlbal'en "Fibrin" Spal t- produkten zuerst von Pilgeram et al (47), Alkjaersig, N. et al (2) und letztlich von Asbeck, F. et al (3) in Serum nachgewiesen. Bel'ichte Uber den Nachweis von sogenannten Plasmin induzierten Fibrin/Fibrinogen Spaltprodukten bei Patientinnen, die tistrogen el'hielten, liegen nicht nul' sehr sp~rlioh sondern auch mit unterschiedlichen Ergebnissen VOl' (21,26,41). 1hr Vorkommen w~re aus vielen GrUnden von Bedeutung, da sie je nach Mole- kul~rgewicht das Haemostasesystem hemmen oder akti- vieren k8nnen (Gramse) (24). Erhtlht sich del' Spiegel des 18s1iohen mit Thrombin nioht fMllbal'en Anteils del' Fibrinogen und/oder Fibrin Spaltprodukte im Plasma, so mu~ dies als pathologisch angesehen werden (41,13,14). -5-
  • 5. -5- Allgemein .erfolgt der Abbau des Fibrins odar Fibrino- gens im Blut durch eine fUr die Fibrinolyse verant- wortliche Serumprotease, die man als Plasmin be- zeiohnet. Dabei ant~tehen wie in Abb. 9 zu erkennen ist, groBmolekulHre und kleinmolekulare Spaltpro- dukte je naoh Dauer der Einwirkung des Plasmins und seiner Konzentration. Normalerweise ist der Spiegel diesar Fibrin/Fibrinogen Spaltprodukte im Plasma aUffallend niedrig (5,13,14,56). Sie werden ansoheinend dauernd durch einen varzogerten Gerinnungsablauf gebildet und im ratiltulo-endothelialen System abgebaut wie aIle anderen Aktivierungaprodukte der Blutgerinnung. Aus diesem Grund ware zu erwarten, daB erhohte Spiegel der Fibrin/Fibrinogen Spaltprodukte nur bei einer pathologisch gesteigerten Aktivierung der Gerinnung auftreten. Zellular aufgenommene Fibrin/Fibrinogen Spaltprodukte werden duroh lysoaomale Enzyme verdaut, ( ob dabei kleinmolekulare Fibrin/Fibrinogen Spaltprodukte wieder ins Blut gelangen, ist nioht bekannt). Hierbei soheinen auch Leukozyten, neben den Zellen des retikulo-endo- thelialen Systems, beteiligt zu sein, die zumindest zwei Fibrin/Fibrinogen spaltende Enzyme besitzen (24,55). Durch diese als "Elastase und Chymotrypa1n lihnliche" bezeichnete und aus Leukozyten stammende Serinproteasen werden Fibrin und Fibrinogen in Hhnlicher Weise wie Plasmin gespalten. Aus diesem Grund muS man erwagen, ob Fibrin/Fibrinogen Spaltprodukte auch duroh frei im Blut zirkulierende Leukozytenenzyme erzeugt werden k6nnen. -6-
  • 6. -6- Aufgabe meiner Arbeit war es, bei 92 Frauen (wie spater genau angegeben), die Sexualhormone per os erhielten, mit zwei bzw. drei Untersuchungsmethoden im Serum nach Fibrin/Fibrinogen Spaltprodukten zu suchen und ihre Bedeutung fUr die Thrombosenentstehung darzustellen. -7-
  • 7. -7- 1.10 Der gesteuerte Einsatz der Sexualhormone wird durch einen Regelkreis erreicht, in dem als StellgroBen der Hypothalamus, der Hypophysenvorderlappen und das Ovar eingebaut sind. Sie sind untereinander durch Hormone verbunden, ohne daB ein stabiler IIsteady statel! angestrebt und aufrechter- halten wird, vielmehr wird ein typisch phasisch verlaufender ProzeB beobachtet (51). Der Anstieg der Gonadotropinspiegel wird nicht mit sofortiger AusschUttung von Ostrogenen/Gestagenen beantwortet, vielmehr muB erst die Bildungsstatte fUr diese Steroidhormone in Form des reifen Follikels heranwachsen; dies dauert 14 Tage. Die gebildeten Steroidhormone bremsen die AusschUttung der Gonadotropine und damit entfallt der Erhaltungsreiz fUr das Corpus luteum. Danach zerfallt die Produktionsstatte fUr die Steroidhormone und deren Produktion wird irreversibel ein- gestellt. Bei einem neuen Zyklus muB dann erst wieder die neue Produktionsstatte in Form neu heranreifender Follikel aufgebaut werden (51). C1I CIJ a. a. o .... QJ OCIJ .... c: .... c 1'0 0 .go 0'- a.~ .... E c: E 11 ... >-,c 0 00 :r: a.:r: (!):r: ~ u E ,~ 2 ~ C QJ N VI ~ CIJ (f) '£ ,!!! 3i1 ~ 1 ~ -8-
  • 8. -8- lm Oval' regen FSH und LH die Follikel in ihrer Reifung so an, daB sie tlstrogene produzieren. Die Synthese del' IJstrogene fUhrt Uber Progesteron, das obligat intermedi!!.r gebildet wird. OH 20d.-Hydroxylase ... 22 R-Hydroxylase HO (NADPH H+02 1 HO j Cholesterin 3~-ot-Dehydrogenase 4t(NADI b. 4;'5..1 some rase Isocal HO atdeh Progesteron Pregnenolon Abb. 2 I Umwandlung von Cholesterin in Progesteron Ausgangsmaterial del' Sexualhormone ist Cholesterin, welohes die Ovarien selbeI' aus Acetyl-CoA und Acetoaoetyl- CoA Uber Zyklisierung von Squalen synthetisieren konnen. Cholesterin wird abel' auch aus del' Leber duroh das Blut antransportiert. Progesteron wird Uber 4-Androste~dion in /)stron umge- wandelt. /)stron kann reversibel in tistradiol und irrever- sibel in /)striol umgewandelt werden. /)stron, /)stradiol und /)striol sind alle drei tlstrogenwirksam. Progesteron wird auch als Zwisohenprodukt bei del' Synthese del' Androgen, del' Mineralokortikoide und Glukokortikoide synthetisiert. -9-
  • 9. -9- o 19 - Hydroxyla se ... o '0 4-Androstendion o o II CH ! 19-0xydc 0 10, 19 Desmolase ·NADPH1 H++02 HO Ostron ° Abb. 3 ; Umwandlung des Androstendion in 5stron -10-
  • 10. -10- Progeateron wird an Albumin, Ostradiol an ~- und B-Globulin gebunden tranaportiert (49). Progesteron wird sehr rasoh in der Leber inaktiviert, deshalb ist per as zugefUhrtes Progesteron unwirksam. Die kUnstlich hergestelltmProgesteron- derivate mit guter per os Wirksamkeit werden deshalb am steranring an versohiedenen stell en substituiert (49). -11-
  • 11. -11- Bei der Analyse des Gerinnungssystems von 25 Frauen im Alter von 19 - 34 Jabren mit durohsohnittliohen Zyklusl~ngen von 28 Tagen, fanden Bayman, E. et al (5) folgende Ver~nderungen. Der Fibrinogenspiegel lag in der Luteinphase im Mittel urn 8~ h5her als in der Follikelphase. Pr~menstruell kam es zu einem leiohten Abfall des Fibrinogens. Beim Anti-Thrombin III so11 ein Anstieg in der Fol1ike1phase, jedoch ein deutlioher Abfall in der Lutelnphase erfolgen. Mit der Spontan-Papier- fibrinolyse naoh Goossens war pramenstruell ein Abfall der lytisohen Aktivitat des plasmas urn 22~ gefunden worden. 1.1 Thrombinzeit 1.0J e _ _ e _ _ _ e_ _ O 0.9 ell t 0.9 ell 1.1 TEG 1+4 r-Zeit 1.0j I i---- ----I f ~ ~ 1.1 Fibrinogen i :f1.0J ~ 0.9 i_-I---- - -I .~ ~ 1.1 Faktor X z 1.0j !---lrl---f-- 0.9 1.1 Antithrombin III 1.0j ~~I- -I ... 0.9 ..:t .a I j I I ~ 5. 12. 19. 26. Zyklustag
  • 12. -12- Zum Nachweis von Fibrinogen Spaltprodukten wurde Nativ- blut ohne und mit Trasylolzusatz untersucht. 1m Serum ohne Trasylol gelang es, bei 12 % der Probandinnen Spaltprodukte ( in vitro FSP ) nachzuweisen. Maximal wurden 5 mg% gemessen. Die Trasylol enthaltenden Seren waren al1e negativ, d.h. weniger als 5 mg% (5,6). In der spaten Luteinphase wurde ein bemerkenswerter Abfall des Plasminogens gemessen. Sowohl der Abfall des Plasminogenspiegels als auch der Abfall der Lysequote pramenstruell muB als Folge einer Aktivierung des fibrino- lytischen Geschehens gedeutet werden ( 5,6 ). Durch Radioimmuno-Assay mit 14 C-Glycin erhielten Pilgeram et al (47) variable Zunahmen der loslichen Fibrinogenprodukte mit zwei Aktivitatsgipfeln am 11. und um den 28. Zyklustag. Normalerweise fluktuiert die Produktion von oatrogen und Gestagen mit dem Menstruationszyklus. Bei normal menstruierenden Frauen zeigt die Ostrogenausscheidung zwei Maxima: a) das 1. Maximum um den 13. Zyklustag tmd b) das 2. Maximum gerade dem MenstruaUons- termin vorausgehend (27,62). -13-
  • 13. -13- 1200 1100 1000 900 OJ E -.. 600 E 0- ~ c: 'c 500 .0 iI gj .c .~ 400 U) :0 300 200 100 0 1 7 14 21 28 Tag des Menstruationszyl<lus Abb. 5: Zunahme des Itlslichen Fibrins durch Einnahme von tlstrogenhaltigen Kontrazeptiva. Beachte: Der Gipfel des Fibrins stimmt mit den Maxima der ~strogenaus­ scheidung Uberein. -0-0- Kontrollfrauen -.-, Frauen, die Kontrazeptiva einnahmen --,--, Kontrollml:l.nner (47)
  • 14. -14- Die Bildung der weibliohen Sexualhormone und damit ihre Konzentration im mUtterliohen Plasma nimmt wabrend der Schwangerschaft k~ntinuierlich zu (34). Post partum fallen die Sexualhormone eklatant ab zu Werten von 10 % der vor der Geburt gemessenen Konzentrationen(34). Aus der Darstellung von Sohander und Egli (Tabelle 1) (53) lassen sioh die als gesiohert zu betraohtenden Veranderungen des Gerinnungssystems in der Sohwangersohaft entnehmen. 500 000 50 .2 "CI "I:i e +"' 400 000 40 III V) C 01 N -4 <!> ... 111 a.. .5 u ell' e ::r: e ell +' II 300 000 30 ell 01 e '0; ..c:. '0.. ... 0 ..... w ... .5 ...... 0 I/) :0 0 ell "CI ~ III 200000 20 'E e e U) 0 .2 e +"' C1 ~ N III .2 ... e .... .S 0 Cl ell ..... ..c:. 100000 10 E .£ u /~~"77'".n-:;"77"77'".'7"'7"'J"?"?l/~st ron 'l a ~~~~~~~~~~i$~~+Ostradiol 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Schwangerschaftsmonat Abb. 6 Sohematische Darstellung der.Aussoheidung von HeG, ~strogenen sowie des Progesteronmetabo11ten Pregnandl0 1m Verlauf der Sohwangersohaft (naoh Zander, 1957) (65 -15-
  • 15. -15- Relative Obereinstimmung unter einer Reihe von Autoren (1,30) besteht hinsichtlioh des Ansteigena folgender plasmatischer Gerinnungsfaktoren, nHmlich Fibrinogen, Prothrombin, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX und Faktor X. Zunahme Unverandert Fibrinogen + (ca.100%) Prothrombin + Faktor V + Faktor VII + Faktor VIII + (ca. 20-30%) Faktor IX + Faktor X + (ca. 3096) Faktor XI + Faktor XII + Faktor XIII Thrombozytenzahl + Thrombozytenadhasivitat + Tabelle 1 : Veranderungen del' plasmatischen Gerinnungsfaktoren in del' Sohwanger- schaft Schwangerschaftsspezifische VerHnderungen im fibrinolytisohen System lassen sich feststellen. Wahrend del' Schwanger- schaft bis zur LBsung del' Plaoenta solI es zu einer Abnahme del' lytischen Aktivitat kommen. Naoh LBsung del' Placenta normalisiert sich diese Elgenschaft (34). Auch in Toxamie, Hepatose, placental' Insuffizienz und anderen Kompllkationen del' Sohwangerachaft deponiert sioh Fibrin in den Nieren, Leber und Placenta. Wenn gespalten, erscheinen die Spaltprodukte im Blut (56). -16-
  • 16. -1b- Nach Svanberg et a1 (56) so11 bei gesunden nicht Schwangeren und gesunden Schwangeren nur eine sehr k1eine Menge Fibrinogen Spa1tprodukte im B1ut (weniger a1s 5 ug/m1) nachweisbar sein. Demnach wiesen Svanberg et a~ (56) Fibrinogen Spa1tprodukte in 11 ~ von 705 Schwangeren nacho Diese 11 %waren Risikoschwangerschaften (56). -17-
  • 17. 1.40 Bisher vorliegende Gerinnungsbefunde bei P~~!~~~!~~~_~~~r_§~~~!hQr~Q~~!~~~~~~ Nach Untersuchungen von Vessey und Inman (1968) steigt das "erwartete" Letalitiitsrisiko bei Anwendung von oralen Kontrazeptiva bei Frauen zwischen 20 und 34 Jahren von 0,2 auf 1,5 und bei Frauen zwischen 35 und 44 Jahren von 0,5 auf 3,9 und zwar pro 100.000 gesunder verheirateter und nicht schwangerer Frauen pro Jahr ( 59 ) • Wahrend das lIerwartete li Letalitatsrisiko bei diesen Patientinnen siebenmal htlher vorhanden ist, steigt das Risiko wahl' end einer Schwangerschaft urn das 17-fache (59). AUB diesem Grund wurde versucht, dieses Risiko durch Veranderungen an Haemostasepotential zu erklaren. Todesrate pro 100.000 Personen 20-34 J. 35-44 J. Frauen, gesund, verheiratet nicht gravid; Thromboembolien jahrlioh - unter oraleI' Kontrazeption 1,5 3,9 - obne orale Kon~razeption 0,2 0,5 Schwangere und Wocbnerinnen - Schwangerschaftskompli- 7,5 13,8 kationen - Aborte 5,6 10,4 - Geburtskomplikationen 7,1 26,5 Komplikationen im Woohen- bett: Thrombophlebitis, Thrombose, Embolie 1,3 2,3 - andere Komplikationen 1,3 4,6 22,8 57,6 Tabelle 2: nach Vessey und Inman (59) -18-
  • 18. -18- Ausge16st wurde diese Suohe naoh Weohselwirkungen zwisohen tlstrogeneinnahme und Thromboseneigung durch die erste Besohrelbung einer Lungenembolie bei einer Patientin, die Enovid erhalten hatte - Jordan 1961 - (31). Mit gr6Berer Intensitat wurde sie seit der oben er- wMhnten Publikation von Vessey und Inman (59, 60) fort- gesetzt. Tatsaohlich wurden - wie dargestellt - eine Reihe von VerMnderungen beschrieben (60, 61), die die Voraussetzungen fUr eine "Gerinnungsaktivierung" bzw. HyperkoagulabilitMt sein k6nnen. Die Tabelle 3, ent- nommen aus einer Arbeit von v. Kaulla (60,61,62), zeigt zusammenfassend solche Gerinnungsparameter, die wMhrend der Einnahme von Bstrogenhaltigen Kontrazeptiva erh(lht oder erniedrigt und/oder verbraucht gefunden wurden. Fibrinogen + Losliohes Fibrin + Prothrombin + PIMttohenaggregierbarkeit + Faktor V + AT-III Alttivi tat Q Faktor VII + Plasminogen + Faktor VIII + Antiplasmin + Faktor IX + Plasminogenaktivator in Venenwand Q Faktor X + Fibrinogen Spaltprodukte + Tabelle 3 EinfluB Bstrogenhaltiger oraler Kontrazeptiva auf .die AktivitMt von Komponenten des Gerinnungs- und Fibrinolysesystems. + = AktivitMt erhoht, Q = Aktivitat erniedrigt -19-
  • 19. -19- Neben der gesteigerten Aktivierung einiger Gerinnungs- faktoren z.B. Faktoren I, VII und X, scheinen drei Befunde fUr die mogliche Thromboseneigung von besonderer Bedeutung zu sein: 1. Die Erhohung des Fibrinogenspiegels, die eine erhohte Vlskositat des Blutes ver- ursacht. 2. Die Verminderung von Anti-Thrombin III und 3. der Nachweis von losliohem Fibrin sowie von Abbauprodukten des Fibrinogens oder des Fibrins. Aus diesem Grund wird diesen letzten Befunden im folgenden besondere Aufmerksamkeit gewidmet. -20-
  • 20. -20- 1.41 Anti-Thrombin III Spiegel bei Einnahme von tlstrogenhaltigen Kontrazeptiva Nach bisherigen untersuchungen scheint das Verhalten des Anti-Thrombin III (AT-III) unter einer Behandlung mit hormonellen Kontrazeptiva von grtlBter Bedeutung fUr das erhBhte Thromboembolierisiko zu sein. Denn aine Reihe von Autoren (52,44,4,64,60,46,63) findet das AT-III bezUglich Aktivitat und nach dem immunologischen Verhalten reduziert. Da.s ist insefern von groBer Be- deutung, weil das AT-III einen Inhibitor darstellt, del' alle im Gerinnungssystem wirksamen Serumproteasen hemmen kann. Unter anderen sind dies del' Faktor XII a, Faktor IX a, Faktor IX, Faktor X a, Falder II a und das Plasmin. Schon ein geringer Abfall des AT-III Spiegels soheint die intravasale Thrombinbildung zu begUnstigen (29 Bei Konzentrationen ven Werten urn 50 %des Normalen, wie sie beim sogenannten kongenital AT-III Mangel vorkommen, besteht eine ausgepragte Neigung zu Thrombosen (17). Del' kritische Spiegel fUr eine Thromboseneigung Boll nach Angaben von Heimburger (29) bei 75 %liegen. Die Ursache del' AT-III Verminderung ist bisher nicht geklart. Durch die zentrale Stellung als Faktor XII a, Faktor XI a, Faktor X a, Faktor IX a und Fakter II a Inhibitor, ist eine Gerinnungsaktivierung bei einem relativen Mangel von AT-III besonders einlauchtend. Sia wUrde aine intra- vasale Thrombinbildung mit ihran Konsequenzen zur Folge haben konnen. Nach v. Kaulla et al (61) verringern ornle Ovulations- hemmer z.B. 1 mg Progesteron und 0,08 mg ~strogen bereits naoh Einnahme weniger "Pillen" die AT-III Aktivi tNt und beschleunigen die Thrombinbildung. Meistens werden schon naoh 10 "Pillen" bei allen Pr'oband:lnnen, abel' sioher nach 20 "Pillen" jene Werte erreioht, wie sie als ttZeiohen einer -21-
  • 21. -21- persistierenden Ubergerinnbarkeit bei chronischen Thrombotikern ll hEl.ufig beobachtet werden k1:lnnen (61). Individual trend Norm. av, ••• · · · · · · . , · ••••• , •••••••••••••••••••••••• 1 ••••••••••••••••••••••••• , •••••• , ••••••• c :.a 2 Thrombos. aVo E ------ ------- --------------- e :S ~ « o 2 5 7 Pills Abb. 7 I Rasche UnterdrUckung del" Anti-Thrombin III Aktivitlit (progressive VerkUrzung del" Anti- Thrombin III-Zeiten) naoh Beginn 4er Einnahmen eines oral en Kontrazeptivums (61) Auf die VerEl.nderungen des AT-III wird in vorliegender Arbeit nicht eingegangen, weil sie Hauptthema einer Dissertation von Wenzel (63) und Reifschneider ist. -22-
  • 22. -22- .-. u Norm ~ 40 . , • • • • • • • • • 1 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • :.(• • • • • 11 • • • ' .S: Thromb( ..0 20 E o L.. ..c ..... :.:; c « Control 10 20 9 18 Pills Days off Abb.8 I Progressive UnterdrUckung der Anti-Thrombin III AkUvitl:i.t nach 10 und 20 Kontrazeptiva-Pillen. RUc:ldtehr zu normalen Werten 18 Tage nach Absetzen. -23-
  • 23. -23- 1.42 Ursache del" Entstehung zirkulierender Fibrinogenspaltprodukte In ihrem Beitrag zu II Oral contraceptives and increased formation of soluble fibrin II, berichteten Pilgeram et a1 (47), daB ostrogen-gestagen Praparate bei 12 Frauen im Alter von 18-32 Jahren eine signifikante Zunahme del" intravasalen Umwandlung von. Fibrinogen (92%, p=o,oo1) in ein Derivat mit gleichen chemischen Eigenschaften wie deren del" Produkt von Fibrinogen/Thrombin Gemisch in vitro erzeugen. Nach Absetzen del" Pillen kehrten diese Plasma Fibrinogen- derivate zur Norm zurUck (47). Wie auf Seite 12 angegeben, lassen sieh sogar im normalen Zyklus wlihrend del" Ostrogenmaxima Fibrinogen Spaltprodukte naehweisen. Anfangs wurde die Kontrazeption mit Prliparaten durchgefUhrt, die ostrogen in relativ hoher Konzentration enthielten. Naeh bisherigen Untersuchungen war die Thrombosefrequenz zu dieser Zeit relativ hooh (19). Nach v. Kaulla und anderen (12,32,62,54) wurden VOl" allen Dingen die ostrogene fUr das Auftreten von Fibrinogen Spaltprodukten verantwortlich gemacht. Mogliche Ursaohen des Auftretens des FDP sind; 1. die Fibrinogen Spaltprodukte entstehen Uber eine direkte oder indirekte Steigerung del" fibrinolytisohen Aktivitat im Blut, 2. die Fibrinogen Spaltprodukte entstehen naoh einer primal" induzierten Gerinnungsaktivierung, in deren Folge auch die Fibrinolyse sekundar gesteigert wird. Die Gerinnungsaktivierung solI nach den Autoren (13,14,42,43) Uber eine fortsohreitende Proteolyse des Substrats (Fibrinogen) erfolgen (39). Diese Auffassung wird nicht von allen Autoren geteilt. (33) -24-
  • 24. -24- 3. In den letzten Jahren wurden von einigen Unter- suohern (24,48,55) die Bedeutung zellul~rer proteolytischer Fermente fUr die mogliche Spaltung von Fibrinogen und Fibrin diskutiert. Nach Gramse (24) spalten die leukozytaren Proteasen, Elastase-like proteases (ELP) und Chymotrypsin-like protease (CLJ;'), von Substrat (Fibrinogen) ebenfalls die sogenannten plasmintypisohen Spaltprodukte X,Y,D und E ab, obgleich noch zu beweisen sein wird, ob es sioh hierbei tatsachlich urn "identische ll oder nur urn immunologisoh lihnliche Spaltprodukte handelt. Wlihrend der in vitro Spaltung von Fibrinogen durch Streptokinaf und Plasmin werden zahlreiche groBe Fragmente frei, die sehr wahrscheinlich nach dem Schema gebildet werden (40). Fibrinogen. Mol. - Masse 340000 Fragment X. Mo.- Masse 270 000 + Fragmente A.B. C Fragment V. Mo.- Masse 165 000 I + I Fragment D. Mol.- Masse 85 000 + Fragment D. Mol.-Masse 85 000 I + I Fragment E. Mol.-Masse 55000 Abb.9 Abbau des Fibri~ogens) durch Endopeptidase Plasmin (40) -25-
  • 25. -:25- Der Abbau des Fibrins/Fibrinogens durch die Endopeptidase Plasmin ist durch eine fortschreitende Proteolyse des Substrats gekennzeichnet. Dabei entstehen als erste die Fragmente X und A, B, C. Als nachstes wird Fragment Y vom Fragment X abgespaltenj in dem ProzeR entsteht das Fragment D. Fragment Y wird schlieRlich in Fragmenten D und E gespal ten (40) • Alle dieae SpaltstUcke soDen nicht, wie frUher angenommen, gegen weitere Plasminaktivitat stabil sein, da nach langerer Inkubation der Produkte D und E mit Plasmin noch kleinere FSP nachgewiesen worden sind (33). Die groBen SpaltstUcke besitzen Antigendeterminanten, die mit einem der multiplen Determinanten des"Elternfibrinogen- moleltUl" identisch sein sollen (2,8,45). Die Antigendeterminanten der Fragmente X und Y sind ahnlich und unteracheiden sich nur quantitativ, besitzen jedoch mehr Antigendeterminanten ala die Spaltprodukte D und E. Die Antigendeterminante des Spaltprodukts D ist deutlich von der des Fragments E verschieden (2,8,45). Antiseren gegen Fibrinogen reagieren deshalb mit Fibrin, Fibrinogen, Fragment X, Fragment Y, Fragment D und Fragment E. Antiseren gegen das Fragment D reagieren mit Fibrinogen, Fibrin, Fragment X,Y und FragmentD aber nicht mit Fragment E. Antiseren gegen Fragment E reagieren mit Fibrinogen, Fibrin, Fragment X, Y und Fragment E, jedoch nicht mit Fragment D (2,8,45). Die Nebenfragmente A, B und C reagieren nicht mit Anti- fibrinogen Seren (2,8,45). -26-
  • 26. -26- Antiseren Anti- Anti gene Fibrinogen Anti-FSP D Anti-FSP E Fibrinogen + + + Fragment X + + + Fragment Y + + + Fragment D + + ¢ Fragment E + ¢ + Tabelle 4: Ubersicht der Reaktionen von Fibrinogen und den Spaltprodukten mit den entsprechenden Antiseren. AuBer in solchen pathologischen Zustgnden wie Abruptio placentae, Uterine Ruptur, "dead fetus Syndrom ll , disseminiertem Krebs, frischem Myokardinfarkt und AbstoBung renaler Transplantate ist es mit neuaran empfindlichen ·Haemagglutinationsinhibition-immuno- Assay's moglich geworden, Fibrinogen Spaltprodukte auch bei 95 ~ der gesunden Menschen nachzuwaisen. Dar Mittelwert betragt 4,9 ± 2,8ug/ml (13,42,43). Eine Zunahme der Serum Fibrinogen bzw. Fibrin Spaltprodukte fm Blut ist entweder duroh primere Aktivierung des fibrinolytischen Systems (wie z.B. pathologisohe Fibrinolyse ) bedingt, oder duroh sekundere Aktivierung des fibrinolytischen Systems ( wie z.B. disseminierte intravaskulare Gerinnung ). Doch wird eine Fibrinogen Spaltprodukterhohung auch nach korperlicher Belastung gefunden (13,14,42,43). -27-
  • 27. -27- Aktivierung des Koagulationssystems FSP ! Thrombin " 1 Fibrinogen - - - - - - - - - . Fibrin ---II>" FSP .. l Plasmin l Plasmin 1 Primare Aktivierung f Sekundare Aktivierung des fibrinolytischen Systems des fibrinolytischen Systems Abb. 10: Entstehungsschema der Fibrinogen Spaltprodukte -28-
  • 28. -28- 1.50 Nomenklatur der Fibrinogen Spaltprodukte Da die Bezeiohnung fUr die Fibrinogen Spaltprodukte in der Literatur untersohiedlioh benutzt wird, wurden in der Tabelle 5 a11e gebrijuohliohen Synonyme zusammengeste11t. Im Deutsohen sprioht man von sogenannten Fibrin bzw. Fibrinogen Spaltprodukten, die abgelillrzt mit FSP be- zeiohnet werden. Hijufigst benutzter Terminus Alternative Fibrinogen degradation Fibrin(ogen) split produots FDP produots (FSP), Fibrin(ogen) relatl Antigens. I!'ragment X .;, FDP X Stage 1 digest, Fraotions 1-8:1-8D 1-9:1-9D I!'ragment X + Y Early FDP, Stage 2 digest, Intermediate products. Fragment D + E Late FDP, stage 3 digest, Terminal products Tabelle 5 I Alternative Namen der Fibrinogen Spaltprodukte -29-
  • 29. -29- 2.00 Potenzverhaltnisse und Aquivalentdosen del' meist benutzten Ostrogene Ostrogene Potenz- Ungefahre (Verabreichungsart) verhlUtnis Aquivalentdosis (m Athinylostradiol . 20 0,05 ( oral ) Mestranol 15 0,08 ( oral ) Quinestrenol 15 0,075 ( per os ) Ostradiolbenzoat 2 0,5 ( Lm. ) Ostradiolvalerianat 2 0,5 ( Lm. ) SilbOstrol 1 1,0 ( oral ) [onj. Equine !:strogene 0,75 1,25 ( oral ) ~ethallentstril 0,3 3,0 ( oral ) Pabelle 7: Ubersioht del' relati ven PotenzverhlU tnisse und Aquivalentdosen del' weist benutzten ' Ostrogenel Bezugsmedikament, Stilboestrol. ( von Fundamentals of Obstetrics and Gynaecology, hrsg Derek Llewellyn-Jones, Vol. II, Seite 260) • -30-
  • 30. -30- 2.10 Patientengut Normalkontrolle Da die untersuchten Patientinnen verschiedene ostrogen- haltige Handelspraparate erhielten, haben wir in der Tabelle 6 aIle verabreichten Kontrazeptiva zusammenge- stellt; nach ihrem Dstrogengehalt eriolgte eine Unter- teilung in Gruppen von A-a. Diese Einteilung in Gruppen ist notwendig, weil die haemostaseologischen Veranderungen nach Meinung vieleI' Autoren (12,32,54,62) durch den ostrogenanteil in den Praparaten bedingt sein sollen. Handelsname Ostrogenanteil Gestagenanteil Gruppe (ug) (mg) Microgynon AD = 30 ug D-Norgestrel 0,15 A Stediril-D At) = 30 ug D-Norgestrel 0,15 Ortho-Novum Mestranol 50 Norethisterin 1,0 B Ovysmen AD 35 Norethisterin 0,5 C Yermonil AD 40 Lynestrenol 0,5 Exlutona Lynestrenol 0,5 D Ovanon AD 50 Lynestrenol 2,5 E Duoluton AD 50 Norgestrel 0,5 Cyclo- Dstradiol- Progynova Valarianat 2000 F Presomen Konj. ostrogen G Progynova Dstradiol- Valerianat Tabella 6: Tabellarische Ubersicht del' verwendeten Sexualhormone. AD = Athinyl-ostradiol. -31 -
  • 31. -31- Insgesamt wurde die Untersuchung zum Nachweis von FSP unter ~strogengabe bei 92 Frauen durchgefUhrt. Davon waren 11 Frauen im geschleohtsreiien Alter und schwanger; sie bildeten die erste Gruppe. Zur 2. Gruppe gehorten 65 Frauen im geschlechtsreifen Alter von 18-45 Jahren, die wahrend der Einnahme und nach Absetzen von ostrogenhaltigen Medikamenten unter- sucht wurden. Die restlichen 16 Frauen im Alter'von 46-54 Jahren wurden wegen klimakterischer Beschwerden mit Sexual- hormonen behandelt. Die Frauen der 2. Gruppe erhielten die ostrogenhaltigen Fr~parate zur Kontrazeption. Bei allen Frauen,wurde das Serum wahrend der Einnabme von ostrogenhaltigen oral en Kontrazeptiva und nach Absetzen der Einnahme untersucht. Diese untersuchungen bildeten eine sogenannte "interne Kontrolle". DarUberhinaus wurden 20 gesunde Frauen im geschlechts- reiien Alter und 20 Frauen in der Menopause sporadisch mituntersucht. Bei den Patientinnan, die wahrend dar Schwangerschaft untersucht wurden, eriolgte die Bestimmung der FSP mehr- mals. Bei jeder Unter'suchung auf Vorliegen von FSP wurde als negative Kontrolle Serum von gesunden Mannern getestet. -32-
  • 32. -32- 3.00 Methodik 3.10 Herstellung der Seren Vollblut wurde in einer Spritze durch saubere Venenpunktur unter sanfter Venenokklusion ohue Schaumbildung von den Pro bandinnen in IIruhendem Zustand II entnommen. 2 ml Vollblut wurden direkt in ein vorgesehenes FSP-Rohrchen gebracht. Die Rohrchen enthielten Thrombin und Sojabohnen-Trypsin Inhibitor, urn eine vollstandige Gerinnung herbeizufUhren und einen Fibrinogenabbau in vitro zu verhindern. Das Blut wurde durch Umkippen ge- mischt. Das geronnene Blut wurde danach scharf ~entri­ fUgiert. Das Uberstehende Serum wurde abpipettiert und bel etwa -20 0 C bis kurz vor der Untersuchung aufbe- wahrt. Blut ohne Zusatz von Enz)~-Inhibitoren 1st un- geeignet fUr FSP-Untersuchungen. Die Untersuchung des Serum erfolgte im allgemeinen zweimal: 1. wahrend der Medikamenteneinnahme und 2. naoh Absetzen der Kontrazeptiva 3.20 Latex Agglutinationstest (Lat) * Reagenzien. Die im Thrombo-Wellcotest Kit enthaltenen Reagenzien wurden benutzt. * Thrombo Wellcome Test. -33-
  • 33. -33- Die Reagenzien worden von dem Deutsohen Welloome, Burg-Wedel geliefert. Prinzip der Methode. Der Lat ist ein sogenannter Objekttragertest und fUr die halbquantitative Bestimmung von FSP geeignet. Ein Tropfen des mit Glycin-NaCl Puffer 1:5 verdUnnten Serum wurde mit einem Tropfen der Latex Suspension auf dem Objekttrager gut mit EinmalrUhrstabohen vermischt und genau zwei Minuten hin und her umgeschwenkt. Das Ergebnis des Lats liest man in hell em diffusen Licht gegen einen entfernten dunklen Hintergrund abo Die ungefahre Konzentration der FSP in einem unbekannten Serum worde durch Untersuchung der Seren in verschiedenen VerdUnnungen bestimmt. Fand eine Agglutination bei einem Serum der VerdUnnung z.E. 1 I X statt, so war die Mindestkonzentration dar FSP 1m 'unverdUnnten Serum X.2 ug/ml, da die Empfindlichkeit des Thrombo-Wellcotests bei 2 ug/ml liegt. Die Ver- dUnnungsstufe wird bei der Berechnung mit der Empfindlich- keit des Tests multipliziert. Die Latexpartikel sind mit Immunglobuline (Antikorper) gegen die sogenannte Human FSP - D und FSP - E beladen. Aus diesem,Grund ist die Empfindlichkeit des Thrombo- 'Iellcotests fUr FSP - D und FSP - E hoher als fUr ~ibrinogen/Fibrin und/oder die hoohmolekUlaren Spalt- produkte. (14) Die Ergebnisse des Latex-Agglutinationstests sind in den Tabellen 12, 13, 14 und 15 zusammengestellt.
  • 34. -34- 3.30 Uberwanderungsimmunelektrophorese (Counter- ourrent immunoeleotrophoresis - ClEP). Reagenzien Diathylbarbiturat-Aoetat Puffer von pH 8,2 und lonenstarke von 0,1 wurde, wie in "Methode del' quantitativen und qualitativen Immunelektrophorese" (Behringwerke, Marburg) hergestellt. Antiseren und Elektrophoresenplatten: Anti Humanfibrinogen Serum von Kaninohen (Behringwerke) Anti Humanfibrinogen Spaltprodukt - D Serum von Kaninohen (Behringwerke, Marburg) Anti Humanfibrinogen Spaltprodukt - E Serum von Kaninohen del' Behringwerke, Marburg. Als Standard Antigene wurden hochgereinigtes Fibrinogen Spaltprodukt - D (200 ug/ml) und Fibrinogen Spaltprodukt- E (100 ug/ml) del' Behringwerke benutzt. Gegen Anti- Fibrinogen Serum wurde Standard Human Plasma (Fibrinogen = 230 ± 20 mg/10o ml) verwendet. Alle Antiseren und Proben waren mit Diathylbarbiturat- Acetat Puffer pH 8,2 und lonenstarke von 0,1 entsprechend verdUnnt. Verwendet wurden Agar-Gel Platten, die gebrauchsfertiges 1?6 iges Agarose-Gel enthiel ten. Das Agaros'e-Gel wurde mit Diathylbarbiturat-Acetat Puffer von pH 8,2 und lonenstarke von 0,05 angesetzt. Als Konservierungsmittel enthielten sie 1 mg/ml Natriumacid. -35-
  • 35. -35- Die Elektrophoreseneinrichtung der Behringwerke AG, Marburg, wurde benutzt. FUr Kontakt zwischen Puffer- kammer und Gel wurden im Puffer getrankte Filterstreifen (Schleicher und SchUll Nr. 2668) verwendet. VersuchdurchfUhrung Die Fertigplatten eignen sioh zum immunologisohen Nach- weis von anodenwarts wandernden Proteinen in Korper- flUssigkeit (u.a. Serum, Urin, Liquor etc.) bei An- wendung von CIEP. Drei doppel-parallele Reihen von LBohern wurden auf die Platten gestanzt. (Abb. 12 u. 13) Die Auftragsstellen der Elektrophoresenplatten wurden mit je 15 ul Anti-Serum bzw. Probe besohickt. Die Anti- Seren wurden in die anodenwarts gestanzten Locher beschickt (Antikorper wandern durch Elektroendosmose kathodenwarts). Die Testseren dar VerdUnnungsreihen von 1 : 1 bis 1 : 1024 wurden jeweils in die kathoden- warts befindlichen Locher beschiokt.(Antigene wandern im elektrischen Feld anodenwarts) (22,58) Nach genau 45 Minuten waren die Untersuchungen beendet, und da die gebildeten Prazipitationen gut zu sehen waren, wurde auf eine Farbung verzichtet und die Ergebnisse gleich nach Versuchsablauf gegen einen dunklen Hinter- grund abgelesen. Die Einzelheitan der DurchfUhrung sind unter anderem auch in der Tabelle 8 dargestellt.
  • 36. -36- Methode Puffer Gelkonz. Platten- Gelvo!. Feld- Elphores l gri:lBe starke dauer CIEP 0.05 U:;: 196 1ox10 20 ml 4-6V/em 45 Min. pH=8,2 Agarose em A-A-P Tab. 8 I DurehfUhrung del' Uberwanderungsimmunelektrophorese - elEP Die ClEP wurde bei allen Seran mit Anti-F, Anti-D und Anti-E Serum durchgefUhrt, wobei zum quantitativen Vergleich Standard Humanplasma, hoehgereinigtes FSP-D und hoehge- reinigtes FSP-E benutzt wurden. Bei allen drei Standard Antigenen wurde dureh VerdUnnungs- reihe die sogenannte Naehweisgrenze bestimmt: 1. lm Standard Humanplasma (230 ± 20 mg Fibrinogen/1oo ml) konnte Fibrinogen mit Anti-Fibrinogen Serum bis zu einer VerdUnnting von 1 : 512 naohgewiesen werden. 2. Das hochgereinigte FSP-D (200 ug/ml) gab mit Anti FSP-D Serum bis zu einer VerdUnnung von 1 : 128 nach- weisbare Prazipitationsbogen, wHhrend 3. das hoehgereinigte FSP-E (100 ug/ml) mit Anti FSP-E Serum bis zu ainer VerdUnnung von 1 : 256 nachweisbar war (Abb. 13). Da sieh die Nachweisgrenze (n) bzw. die Empflndllchkeit ala VerhlH tnis del' Konzentration des Serums an Ant.l.gan zur VerdUnnung darstellt, erreehnet sieh die Empfindlichkeit fUr die einzelnen Antigene wie in del' Tabelle 9 zusammen- geatellt iat. -37-
  • 37. -37- Anti Serum VerdUnnung Empfindlichkeit (n) Eigene Ergebnisse Lit. Angaben Anti Fg 1: 5 4.50 ug/ml 1 - 5 ug/ml Serum Anti FSP-D 1 :2 1.56 ug/ml Anti FSP-D bis 20 ug/m: Anti FSP-E bis 2,0 ug/J Anti FSP-E 1: 1 0.39 ug/ml (pur) Tabelle 9 Vergleich eigener Empfindliohkeiten mit Literaturangaben (28,58) -38-
  • 38. -38- 3.40 Eindimensionelle Imrnunelektrophorese nach Laurell (1 DIE ) Reagenzien Di~thylbarbiturat-Aeetat Puffer von pH 8.6; 20.6 g Barbital-Natrium (5,5 - Di~thylbarbiturs~ure­ Natrium-Salz) und 4.0 Barbital (5,5 - Di~thylbarbitursaure wurden mit destiDiertem Wasser gelost und auf 2 Liter aufgefUllt. Ionenst~rke dieses Puffers betrug 0.05. Farbelosung wurde aus 50 g Coomassie Brilliant Blue R, 4.5 Liter Athanol (96%), 1 Liter Eisessig und 4,5 Liter destilliertem Wasser hergestellt. Zum Entf~rben des Untergrunds wurde eine Losung aus 4.5 Liter 96% Athanol und 1.0 Liter Eisessig und 4.5 Liter destilliertem Wasser hergestellt. Prinzip der 1 DIE ist folgendes: Negativ geladene Proteine werden w~hrend der elektrophoretischen Wanderung in einem Anti-Serum-haltigen Gel pr~zipitiert. Die Hohe der entstehenden S~ulen ist abh~ngig von der Konzentration des entsprechenden Proteins. AusfUhrung des Versuchs Auf 5 x 5 em groBen Glasplatten wurde in einer 1%igen Agarose das entsprechende Antiserum (Anti-Fibrinogen, Anti FSP-D und Anti FSP-E) nach AbkUhlen auf 530C ge- mischt und die Serumproben in 2 mm ¢ messende Locher pipettiert. -~-
  • 39. -39- Die Proben wurden innerhalb von 16 Stunden bei 4V/cm Feldstarke elektrophoretisch aufgetrennt. Nach Waschen und Trocknen der Glasplatten wurden sie mit Coomassie Brilliant Blue R Losung gefarbt. Die UberschUssige Farbe im Hintergrundwurde mit der Entfarbelosung abge- waschen. Die Eichkurven wurden mit 1 :32, 1:64 und 1:128 verdUnnter Flbrlnogenlosung (5mg/ml) hergestellt. Die Proben wurden fUr die Elektrophorese verdUnnt wie in der Tabelle 10 zu ersehen 1st. Die Empfindliehkeiten bei allen drei Antigenen wurden dureh VerdUnnungsreihe bestimmt: 1. In der Standard Fibrinogenlosung ( 5 mg/ml ) wurde Fibrlnogen mit Anti-Fibrinogen Serum bls.zu einer VerdUnnung von 1:128 nachgewiesen. Daraus errechnet sieh die Nachweisgrenze als 0.31 ug 2. Die Nachweisgrenze fUr Anti FSP-D ergab 0.13 ug und 3. die Nachweisgrenze fUr Anti FSP-E ergab 0.25 ug. -40-
  • 40. .Antigen- Feld- Lauf- Agarose Barbital .Anti Verd. Verd. Menge starke zeit Gel Vol Puf£er Serum Eichskurve Probe (Stunde2 Konz. Fibrinogen 5ml 4V/cm 8-16 1%,4ml pH=8.6 0.2 % 1 :32, 1 :64 1:8,1:16 u =0.05 1:128 1:32 Fragment D 5ml 4V/cm 8-16 1%,4ml pH=8,6 0.5 % 1:8,1:16 1:1,1:2 U =0,05 1 :32 1:4 ( 0 ..:j- ( Fragment E 5ml 4V/cm 8-16 19b,4ml pH=8,6 2 % 1:8,1:16 1:1,1:2 u =0,05 1:32 1 :4 Tabelle 10: Laurell - Elektrophorese Bedingungen
  • 41. -41- Anti Serum Anti Serum Empfindliohkeit (ugjml) Konzentra tion eigene Ergebnisse Literatur Anti Fg 0.2 % 0.39 0.5 - 2 Anti FSP-D 0.5 % 0.13 0.5 - 2 Anti FSP-E 2 % 0.25 0.5 - 2 Tabelle 11: Vergleich eigener Empfindlichkeiten del' 1 DIE mit den Literaturangaben (28) -42-
  • 42. -42- 4.00 Ergebnisse Von den 92 Patientinnen hatten 47 1m Serum einen erhl:lhten Gehalt an Fibrinogen Spaltprodukten. Bei den meisten Patientinnen war der Latex - Agglutinations- test mit einer Serumverdtinnung von 1 : 5 positiv. Das bedeutet, daB im unverdUnnten Original-Serum mehr als 10 ug/ml FSP aber weniger als 20 ug/ml FSP vorhanden waren.(vgl. Tabelle 15) . Zwei der FSP positiven Seren (Patientinnen 81 und 83) hatten eine Konzentration der FSP von mindestens 40 ug/ml. Bemerkenswert war, daB diese beiden Frauen erst 21 und 23 Jahre alt waren. Sie waren sonat gesund. Wie aus der Tabelle 16 zu ersehen ist, hatten sie Ortho-Novum einge- nommen.Sowohl die beiden eben genannten Patientinnen als auch die anderen 47 wurden nach Absetzen der Kontrazeption beim Beginn des Zyklus zu einem Zeitpunkt, wo man normaler- weise eine Erh~hung der FSP bei diesen Patientinnen nicht zu erwarten braucht,nachuntersucht. In keinem Fall wurde ein erhl:lhter FSP Spiegel gefunden, wie aus der Tabelle zu ersehen ist. Auch bei 10 von 16 der Frauen im Klimakterium war der Gehalt an FSP im Serum mit tiber 10 ug/ml erhl:lht. (Tabelle 15) Bei den untersuchten Patientinnen im Verlauf einer Schwangerschaft war bei 10 der 11 Schwangeren der Gehalt an FSP im Serum erhoht. (Tabelle 15) Zur Sicherung des FSP-Nachweis wurde bel den 47 Patientinnen mit positivem Befund semi-quantitativ mit der sogenannten Countercurrent immunoelectrophoresis (CIEP) eine Kontrolluntersuchung durchgefUhrt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 15 und 16 zusammengestellt. -43-
  • 43. -43- Man kann daraus ersehen, daB die Ergebnisse, die mit dem Latex-Agglutinationstest erzielt wurden, auoh mit denen der CIEP im wesentliohen Ubereinstimmen ( r = 0.607 ). 1m allgemeinen haben gesunde Frauen aller Altersgruppen unter 5 ug!ml nachweisbare Fibrinogen Spaltprodukte (56,14). So war es auch bei der von uns durchgefUhrten Kontrolle im Alter von 18-30 Jahren und bei den 20 Kontroll-Meno- pausefrauen. Nach Das et al (14) betragt dar FSP Gehalt im Serum bei gesunden erwacbsenen Frauen und Mannern 4.9 ± 2.8 ug!ml. Alle mannlichen Kontrollierten batten einen FSP Gehalt von weniger als 10 ug!ml und somit nicht mit den Methoden nachweisbar. Die zwei Seren, die mit dem Welleotest FSP Spiegel von Uber 40 ug!ml ergaben, wurden mit der Eindimensionellen Immunelektropborese naeh Laurell (35) mit Anti-Seran gegen Fibrinogen, FSP - D und FSP - E untersueht. Die Bilder zeigen nun, daB mit diesen Anti-Seren Prazipitate dar- gestellt worden sind, die den Anti-Seren entspreehen. Es konnte FSP mit Anti-Fibrinogen, mit Anti FSP-D Serum sowie Anti FSP-E Serum naehgewiesen werden. Demnach handelt es sieh um sogenannte Plasmin-Spaltprodukte bzw. Abbauprodukte des Fibrins. Von groBtem Interesse war nun, ob bestimmte Handelspraparate ostrogenhaltiger Kontrazeptiva beim Einnehmen besonders oft zu Bildung von FSP fUhrten. Aus diesem Grund haben wir die bei unserem Patiantengut verabreiehten Kontra- zeptiva naeh dam 5strogen-Gehalt in sieben Gruppen unterteilt (s. Tabelle 6) -44-
  • 44. Bei den von uns untersuohten Patientinnen waren die FSP bei den Gruppen B und E sehr hooh, wahrend die Einnahme von anderen Praparaten nur geringgradige Erhohung des FSP Spiegels verursachten. (Abb.11) -45-
  • 45. -45- Die Zahl der von uns untersuchten Patientinnen, vor all em dann, wenn man sie in Gruppen je nach Einnahme der Kontra- zeptiva unterteilt, ist bisher nur gering, so da~ man hierauB keine Konsequenzen zieben kann. Auff~llig ist trotzdem, daB mit steigender pstrogendosis die FSP Spiegel im Serum der Patiantinnan ansteigen (Abb. 12) Proben Nr. 81: Standard-Serum = 5 mg/ml Fibrinogen, Anti-Serum = 0,2% (8 ul) VerdUnnung des Standard-Serums = 1 : 32, 1 : 64, 1 : 128 VerdUnnung der Proben = 1 : 8, 1 ; 16, 1 : 32 Empfindlichkeit = Konzentration in 8 ul Titerstufe (128) = 0.31 -46-
  • 46. -46- Abb. 13: Proben Nr. 81: Anti-Fibrinogen Spaltprodukt D Serum = 0.5 % (20 ul) Standard Serum D = 200 ug/ml VerdUnnung des Standard D Serums = 1 8, 1 : 16, 1 : 32 VerdUnnung der Probe = 1 : 1, 1 : 2, 1 : 4 Empfindlichkei t = 0,.13 ug Abb. 14: Proben Nr. 81: Anti-Fibrinogen Spaltprodukt E Serum = 2 % (80 ul) Standard Serum E = 100 ug/ml VerdUnnungsreihe des Standardserums (E) ~ 1 : 8, 16, 1 : 32 VerdUnnungsreihe der Probe = 1 : 1, 1 : 2, 1 : 4 Empfindlichkeit = 0.25 ug
  • 47. Handelsname Gestagenanteil Cstrogenanteil FSP Thrombo Test I > > > Q) P- § ~ ..-i .p ..-i .p ..-i .p (mg) (ug) pos. neg. Summe §' .c a! ..-i a! ..-i o '+-I OJ !lD OJ $.0 $.0 8 0 Q) 0 0 A. ::> P- c 'l!R.P< Microgynon D-Norgestrel AD (30) 3 9 12 (0.15) A 14 3 11 21.4 Stediril-D D-Norgestrel AC (30) 0 2 2 (0.15) Ortho-Novum Norethisterin Mestranol 50 9 5 14 B 14 9 5 64.3 (1.0 ) Ovysmen Norethisterin AC (35) 1 7 8 I :- (0.5 bzw. 1.0) C 12 1 11 ~ 8.3 I Yermonil Lynestrenol 2.0 AO (40) 0 4 4 Exlutona Lynestrenol 0.5 2 5 7 D 7 2 5 28.6 Ovanon . Lynestrenol 2.5 1i.O (50) 3 2 5 , E 15 12 3 80.0 Duoluton Norgestrel 0.5 AD (50) 9 1 10 Cyclo-Progy- Norgestrel 0.5 Cstradiol-17- 4 7 11 F 11 4 7 36.4 nova Valerianat 2000 Presomen/ konj. Cstrogene 4 5 9 G 9 4 5 44.4 Progynova (O-Valerianat) Tabelle 12: Die verwendeten Praparate .
  • 48. -48- . FSP - Thrombo WelIco~es~ und ~IEP • H ~ I Wahrend der Behandlg. kurz danach ....... . 2; 0 ~ ..a H Ql ~ ~ ro Ql ~ Uber unter , Uber unter ~~ Ql P, H Q) 1oug/ml 1oug/ml 0~ 0 ~ t: ~ Ql ;:.: Ql a 10 ug/ml 10 ug/ml 1 27 27 Ovanon - - - - II 2 28 43 Fresomen - - - - IV ~ 30 40 Presomen - - - - III 4 33 44 Duoluton + - - - IV .2 37 44 Duoluton + - - - IV 6 42 28 Ovanon + - - - II L 32 ~9 Duoluton + - - - II 8 61 43 Presomen - - - - IV 9 62 44 C:~clo-P. - - - - IV 10 63 42 Duoluton + - - - IV 11 64 44 Duoluton + - - - IV 12 67 23 Ovanon - - - - II 11 68 19 C~clo-P - - - - I 14 79 22 Ovanon + - - - II 15 80 22 Ovanon + - - - II 16 84 42 Cvclo-P + - - - IV 17 88 42 Cvclo-P + - - - IV 18 82 30 HCG + - - - II 19 35 24 O-Novum - - - - II 20 42 22 M'Gvnon - - - - II 21 43 20 ·Ovvsmen - - - - I 22 44 19 Ovvsmen - - - - I 23 45 25 Ovvsmen - - - - II 24 46 20 Exlutona - - - - I 25 48 20 Exlutona - - - - I 26 27 50 51 33 18 Yermonll M'Gynon - - - - - - - - III I 28 54 23 M'Gynon - - - - II ., Gruppe II, Alter von 18 - 45 Jahren -49-
  • 49. -49- FSP-Thrombo Wellcotest und CIEP . Ql wiihrend der Behandlg. kurz danach ,..... H ~ Ql Pi ~ Ql I=t Ql H a t1 .!q Uber 10 ug/ml unter 10 ug/ml Uber unter 10 10 ~~ C.'J'--" .a 0 Ql .rj 'd +l ug/ml ug/ml &: ~ Ql ::.: 55 44 Ovysmen - - - - IV 56 20 M'Gvnon - - - - I 57 25 Exlutona - - - - II 58 31 M'Gvnon - - - - III 59 34 M'Gvnon - - - - III 60 20 Stediril - - - - I 61 37 Exlutona - - - - III 62 18 Ovvsmen - - - - I 63 35 Yermonil - - - - III 64 27 M'Gvnon ~. + - - - II 65 20 Ovvsmen - - '- - I 66 33 O-Novum + - - - III 67 24 Yermonil - - - - II 68 25 Yermonil - - - - II 69 40 Exlutona - - - - III 70 37 Stediril - - - - III 71 23 O-Novum - - - - II 72 35 M'Gvnon - - - - III 73 25 M'Gvnon - - '- - II 76 36 Ovvsmen - - - - III 77 29 M'Gvnon - - - - II 78 22 Ovvsmen + - - - II 79 40 M'Gvnon + - - - III 80 24 O-Novum + - - - II = Uber 81 27 O-Novum ++ 40 ug/ml - - - II 82 34 O-Novwn + - - - III = Uber 83 21 O-Novum ++ 40 ug/ml - - - II lppe II. Alter von 18 - 45 Jahren
  • 50. -50- Gruppe II, Alter von 18 - 45 Jahren FSP - Thrombo Wellcotest und ClEP ,......, Q) H wiihrend der Behandlg. kurz danach PJ Q) e~ . ~. Q) Uber 10 unter 10 tiber unter 0""'- ~ OJ H ug/ml ug/ml 10 10 ~ Z . .a ;S ~ Q) 0 H Q) +' ~ ug/ml ug/ml &: ~ Q) H ~ 56 84 22 Exlutona + - - - II 57 85 19 O-Novum + - - - I 58 86 20 Exlutona + - - - I 59 87 25 O-Novum - - - - II 60 88 2"3 O-Novum + - - - II 61 89 2'i O-Novum - - - - II 62 91 45 O-Novum + - - - IV 6"3 9"3 21 O-Novurn + - - - II 64 60 45 ProlZvnova + - - - IV 65 70 19 Cyclo- Progynova + - - - I Summe (27) (38) (65) Tabella 13: Zusammenstellung der untersuohten Patientinnen, ihr Alter, Fabrikat der ostrogenhaltigen Kontra- zeptiva und die Ergebnisse der FSP Bestimmung wiihrend und nach Behandlung. -51-
  • 51. -51- FSP - Thrombo Wellcotest und CIEP . () +> g Wlihrend der Behandlg. kurz danach ---. ~ <I) H PI () tiber 10 unter 10 tiber unter ~ Q ~ e+> 'Cl () p H () .!4 :a ug/ml ug/ml 10 10 r.!l~ +> ug/ml ug/ml 'H H & ~ Q) ::;:: 1 29 48 Duoluton + - IV 2 35 4q Duoluton + - IV ~ 36 47 Duoluton - IV ! + 4 38 52 Cyclo- PrOll:vnova + - V 5 39 46 Cyclo- - - IV Proll:vnova 6 43 50 Presomen + - IV 7 44 47 Duoluton - - IV 8 46 50 Presomen + - IV 9 53 49 Cyclo- + - IV Proltvnova 10 55 47 Cyclo- Pro ltvno va - - IV 11 58 48 PrOll:vnova - - IV 12 59 54 Duoluton + - V 13 65 48 Cyclo- Proltvnova - - IV 14 66 53 PrOll:vnova - - V 15 81 ')0 Preeomen + - IV ,16 134 48 MIGvnon + - IV Summe (10) (6 ) (16) Tabelle 14: ZUBammenstellung der untersuchten Patientinnen im Alter von tiber 46 Jahren. Die Tabelle zeigt daB Verhalten von FSP wlihrend der Einnahme und naoh Absetzen der Batrogenhaltigen Sexualhormone. -52-
  • 52. }ruppe Alter Thrombo-Welleotest Uberwanderungs- Summe % der FSP positive Immunelektropho- Seren (UT) rese (CIEF) tiber 10 unter 10 pos. neg. Welleo CIEP ug/ml ug/ml 3ehwangere 10 1 10 1 11 90.91 90,91 I) I I 1< CJ U" }eschleehtsreii' 18-45 27 38 27 38 65 41,54 41,54 U" I I II) fuimakterisehe tiber 10 6 10 6 16 62,50 62,50 III) 46 ~umme I 147 I 45 147 45 - 92 51,09 51,09 Tabelle 15: Zusammenf'assung der Ergebnisse der FSP Bestimmung bei 92 Frauen mit zwei Methoden : Der Lat und die CIEF. Beide Methoden hatten tibereinstimmende Unter- suehungsbei'unde.
  • 53. -53- ~ 100 <'l 0/0 .f; ~ 80 r- E "8 c ~ 60 I 0.. (J) U. ~ "0 40 r- ~ r- 1 0.. 20 n A 8 c o E F G Schwonge Gruppe der Priiporote Abb.11: Graphische Ubersicht der prozentualen FSP-Zunahme tiber 10 ug/ml innerhalb der verschiedenen PrMparaten- gruppen. Als Vergleich eine Saule der FSP-Zunahme der Schwangeren rechts. -54-
  • 54. . +> .--l .t:: s:: 0 .,..j Ql .,..j s :a:l Medikament ClEF (Konzentration) Anti. Anti. Anti. j !:. .t:: OJ al Ql til !:. Z Ql 0 OJ til N til s:: til Pr :z; co:: :0 .,..j .s::: ~ I 0 s:: Q) Ql .,..j Fg FSp-n!FSP-E s:: ~ !:. .0 +> +> ~ 0 t1l Q) .--l Q) J:.. !:. Q) !:. ;:s Pr Q) E .t:: J:.. Q) J:.. n=4.5 n=1.56 n=0.3 ..a . J:.. -0 .0 Q) C!l C!l a:l .--l 0 -0 0 0 Q) Q) 'H +> s:: 0 s:: s:: H ;:s 0.. al ~ 1 ~ 0 I I 0-4 k ~ ~ ~ ~ 0:: OJ :;:: 0 :>, Q) :;:: .,..j ~ .t:: E-< al 0:: :>, :::r:: .,..j 0 ::r: ug/ml ug/ml ug/mll 1 29 48 165 55 130 14 28 47 6 1 TB - - - - Duoluton 18.0 12.48 6.24' 80 4 2 33 44 85 160 16 28 ¢ 0 1 ¢ - ++ - + Duoluton 18.0 12.48 6.24 100 5" 3 35 49 98 180 120 13 28 ""4 ¢ 3 0 ¢ + +++ - + Duoluton 18.0 12.48 6.24 4 36 47 163 75 150 10 28 4 ¢ 2 1 ¢ - - - - Duoluton 18.0 12.48 6.24 To U I I ...;t 5 37 44 85 ~ 16 28 """'5" ¢ 0 1 ¢ + ++ - + Duoluton 18.0 12.48 6.24 6 38 52 70 120 80 13 28 ~ 47 0 0 ¢ - - - - Cycloprogy- 9.0 6.2.4 3.12. nova 7 42 28 46 125 11 28 ¢ 1 0 ¢ ++ - - - Ovanon 9.0 1.56 6.24 80 "3 8 43 50 63 12.2. 11 80 28 ""4 47 0 0 ¢ - - - - Presomen 9.0 3.12 6.24 9 46 50 73 1·45 13 28 45 1 0 ¢ - + - - Presomen 9.0 3.12 6.24 100 "3 10 52 29 162 62 140 75 12 28 ¢ 1 0 ¢ +++ - - - Duoluton 18.0 12.48 6.24 - - - - - -- -
  • 55. Medikament CIEP( Konzentration ) s:: Anti Fg Anti FSP-D Anti . (I) r-I 0 ..-! .p .<:: ..-! s 0=4.5 n=1.56 FSP-E s:.. .<:: (I) <l! (I) O'l :<l! Z 0> 0 (I) O'l N ll'l s:: til p. s:.. ~ .<:: ;:s 0 s:: ..-! ug/mJ. ug/mJ. n:o.35 ~ ..-! I 0> s:: s:.. .p Z . ~ 0 ll'l <l! .0 r-I :0 (I) (I) s:.. s:.. s:.. ;:s P. .p S .<:: .- ug/mJ. 'g: .0 '" " 0> (I) 0> (I) .0 (I) 0 0 tG r-I 0 'd s:.. 0 0 (I) (I) "d 'H ....:I 0 &:: .;.:> r-I <C ~ I ~ I ~ s:: CD :E: .!<: N » s:: (I) :E: ~ s:: ..; o s:.. .0 .<:: <C E-! ~ <l! p:; ::r: ~ Q e: ::r: 11 53 49 162 75 130 '"9"0 13 28 40 a a - + - - - Cycloprogynova 9.0 1.56 . 6.24 12 59 54 165 72 175 100 14 28 43 a 0 - - + - - Duoluton 18.0 12.48 6.24 13 60 45 157 60 170 12 28 42 4 0 TB - - - - .Progynova 18.0 12.48 6.24 100 14 63 42 174 78 160 15 28 ¢ 2 0 TB +++ + - + Duoluton -18.0 6.24 12.4C 11"'0 15 64 44 172 67 120 80 14 28 5" ¢ 3 0 TB - - - - Duoluton 9.0 1.56 6.24 16 71 18 49 120 80 12 28 ¢ a 0 - +++ - - - Schwanger 9.0 6.24 3.12 17 72 20 169 59 1~~ 13 28 ¢ 1 0 - - - - - Schwanger 18.0 12.48 6.24 18 73 23 12 28 ¢ 0 0 - - - - - Schwangsr 18.0 12.48 6.24 19 75 32 161 75 -~ 28 ¢ 1 0 - - - - - Schwanger 18.0 12.48 6.24 20 76 30 150 48 28 ¢ 2 0 - - - - Schwanger 18.0 12.48 6.24 ~ +++ 21 77 26 176 76 13 28 ¢ 0 0 - - - - - Schwanger 18.0 12.48 6.24