Entwicklung eines
Real-Time-PCR-Systems
für den spezifischen Nachweis von
Enterobacteriaceae
in Lebensmitteln
vorgelegt vo...
DANKSAGUNG
Mein Dank gilt an erster Stelle meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Ulf Stahl für die
wissenschaftliche Betreuun...
Inhalt
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INHALT
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Inhalt I
Verzeichnis der Abbildungen IV
Verzeichnis der Tabellen V
Verzeichnis der Abkürzungen und Z...
Inhalt
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2 METHODEN 37
2.1 Anzucht von Mikroorganismen 37
2.2 Quantifizierung von Bakterienzellen 37
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3.6 Generieren der Primer und Sonden für das System zum
Nachweis von Enterobacteriaceae 58
3.7 Anwendung ...
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kontaminiert...
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Tab. 1.1: Häufig vorkommende, lebensmittelübertragene Gattungen und
Spezies der Fa...
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VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN UND ZEICHEN
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µg Mikrogramm (= 10-6
Gramm)
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UV UltraViolett
V. Vibrio
V/cm Volt pro Zentimeter
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I Einleitung
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I EINLEITUNG
1 THEORETISCHER TEIL
ENTEROBACTERIACEAE IN LEBENSMITTELN
1.1 Lebensmittel als Überträger von I...
I Einleitung
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DETEKTION BAKTERIELLER KONTAMINATIONEN IN
LEBENSMITTELN
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zu geeigneten Lebensbedingungen, können sie regenerieren und die Proliferation
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Ist eine ausreichende Identifizierung der Kolonien nicht möglich, müssen
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Zelle vorhanden sind (Ward et al. 1990, Wilson et al. 1990). Die hohe Spezifität und
Sensitivität dieser N...
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zur Verfügung stehen. Nach 20 Zyklen entstehen auf diese Weise von einem
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Besonders leicht kann es durch die Anwesenheit von Amplifikaten vorangegangener
PCR-Reaktionen zu Kreuzkon...
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Enterobacteriaceae-Spezies mit hoher Sensitivität zu amplifizieren, aber andere
Eubakterien nicht zu erfas...
II Material und Methoden
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II MATERIAL UND METHODEN
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1.1 Bakterienstämme
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II Material und Methoden
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Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm
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1.4 Enzyme
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1.5 Reaktionskits
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fw 3.1 17 mer 5S-Gen forward-Primer
fw 3.2 17 mer 5S...
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Name Länge/Markierung Zielregion Funktion
Flu 1 33 mer - 3' Fluorescein 23S-Gen Sonde
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1.7 Lebensmittelproben
Tab. 2.5: Tiefgefrorene Lebensmittel
Nr. Produkt Nr. Produkt
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Tab. 2.6: Säuglingsnahrung und Volleipulver
Nr. Produkt Hersteller/Vertrieb
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Chromas Version 1.45, Copyright©
1996-1998 Conor McCarthy, School of Health
Science, Griffith ...
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2.3.1 DNA-Präparation mit enzymatischem Zellaufschluss
Präparation und Reinigung der Bakterien...
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2.4.2 DNA-Quantifizierung im LightCycler®
Die Quantifizierung der DNA im LightCycler®
2.0 Inst...
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Barbara Heinze,
Für den qualitativen Indikatornachweis von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln wurde eine spezifische Real-Time-PCR-Anwendung entwickelt. Nach kultureller Anreicherung der Lebensmittelprobe erfolgt die Durchführung der PCR im LightCycler®. Das entwickelte Nachweisverfahren erreicht gegenüber den konventionellen mikrobiologischen Methoden eine Spezifität von 100 % und führt mit einem zeitlichen Aufwand von maximal einem Tag bei einem Drittel der Zeit für Horizontalverfahren zum zuverlässigen Ergebnis. Überprüft wurde die Spezifität mit 92 taxonomisch definierten Bakterienstämmen sowohl der Familie Enterobacteriaceae als auch anderer, nicht zu amplifizierender Gruppen. Mit hoher Sensitivität ermöglicht der Enterobacteriaceen-Nachweis die Detektion einer einzelnen Bakterienzelle. Er eignet sich für die Qualitätskontrolle von Lebensmitteln unterschiedlichster Produktgruppen sowie die Überwachung aller kritischen Prozessstufen in lebensmittelproduzierenden Betrieben. Mögliche Gesundheitsge-fährdungen durch Rekontaminationen und unzureichende Verarbeitungs-, Betriebs- und Distributionshygiene werden sicher nachgewiesen. Mit 72 Lebensmittelproben verschiedener Produzenten, Kategorien und Matrices wurde die Funktionalität des Nachweises im Vergleich mit den Horizontalverfahren zum qualitativen Nachweis von Enterobacteriaceae überprüft. Die Ergebnisse aller Untersuchungen stimmten mit denen der Mikrobiologie überein, 30 Proben wurden positiv auf das Vorhandensein der Markerorganismen Enterobacteriaceen getestet.

Zielmolekül der Real-Time-PCR ist die für 23S rRNA codierende DNA-Sequenz der Enterobacteriaceen. Für das Nachweissystem wurden die forward- und reverse-Primer fw9 und rev10 sowie die Sonden HzFlu und HzRed generiert. Das in der PCR entstehende partielle Amplifikat der 23S rDNA hat eine Größe von 225 bp und wird zeitgleich mit seiner Amplifikation im Kanal F2/Back-F1 des LightCycler® detektiert. Zum Ausschluss falsch negativer Ergebnisse wurde eine Interne Amplifikationskontrolle entwickelt. In Form einer kompetitiven PCR erfolgt die Amplifikation der Kontroll-DNA zusammen mit der Ziel-DNA mit den gleichen fw9- und rev10-Primern im selben PCR-Ansatz. Detektiert wird die Interne Amplifikationskontrolle während ihrer Entstehung anhand der generierten Sonden IAKRed und HzFlu im Kanal F3/Back-F1 des LightCycler®.

In der Entwicklung der Konsensus-PCR kam es zur unerwünschten Amplifikation spezifischer DNA in PCR-Reaktionen ohne Untersuchungsprobe und damit zu falsch positiven Ergebnissen. Es wurde gezeigt, dass es sich hierbei um Amplifikationen kontaminierender DNA in allen getesteten Taq-DNA-Polymerasen diverser Hersteller handelte. Durch enzymatischen Verdau mit DNase I konnte reproduzierbar die vollständige Dekontamination der rekombinanten Taq-Polymerasen erreicht und die Entstehung falsch positiver Ergebnisse ausgeschlossen werden.

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  1. 1. Entwicklung eines Real-Time-PCR-Systems für den spezifischen Nachweis von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln vorgelegt von Diplom-Biologin Barbara A. E. Heinze Von der Fakultät III – Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doktorin der Naturwissenschaften – Dr. rer. nat. – genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dipl.-Ing. Dr. D. Knorr Berichter: Prof. Dipl.-Ing. Dr. U. Stahl Berichterin: Dipl.-Ing. Dr. K. Berghof-Jäger Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 10.09.2007 Berlin 2007 D 83
  2. 2. DANKSAGUNG Mein Dank gilt an erster Stelle meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Ulf Stahl für die wissenschaftliche Betreuung und Unterstützung beim Erstellen dieser Arbeit. Frau Dr. Kornelia Berghof-Jäger, Geschätsführerin der BIOTECON Diagnostics GmbH, danke ich für die Möglichkeit, die vorliegende Arbeit anzufertigen sowie für die ständige Hilfestellung und zielorientierte Diskussionsbereitschaft. Herrn Dr. Cordt Grönewald danke ich für die Betreuung dieser Arbeit, wertvolle Anregungen, Ratschläge und Gespräche und für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Frau Astrid Schneider gilt mein herzlicher Dank für die hilfreichen fachlichen Diskussionen und auch die weniger fachlichen Gespräche sowie für das kritische Lesen des Manuskripts. Frau Astrid Seemann danke ich für ihre fachliche Unterstützung und Diskussion zu allen Fragen der Mikrobiologie. Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der BIOTECON Diagnostics GmbH bin ich sehr dankbar für ihre Hilfsbereitschaft, die gute Zusammenarbeit und freundliche Arbeitsatmosphäre. Ganz besonders bedanke ich mich bei Herrn Dirk Eimer für seine intensive Auseinandersetzung mit mir und meiner Arbeit, das Korrekturlesen, seine unermütliche Diskussionsbereitschaft und seine starken Nerven. Ich bedanke mich ganz herzlich für die Motivierung und Stärkung bei meiner Familie Christiane, Erika und Joachim Heinze. Frau Sonja Körber bin ich sehr dankbar für ihre entscheidende Unterstützung.
  3. 3. Inhalt I INHALT Seite Inhalt I Verzeichnis der Abbildungen IV Verzeichnis der Tabellen V Verzeichnis der Abkürzungen und Zeichen VI I EINLEITUNG 1 THEORETISCHER TEIL ENTEROBACTERIACEAE IN LEBENSMITTELN 1 1.1 Lebensmittel als Überträger von Infektionskrankheiten 1 1.2 Enterobacteriaceae als Ursachen für Lebensmittelinfektionen 5 1.2.1 Häufigster Vertreter lebensmittelassoziierter Enterobacteriaceae: Salmonella 8 1.2.1.1 Enteritis-Salmonellose 9 1.3 Enterobacteriaceae als Markerorganismen 14 2 PRAKTISCHER TEIL DETEKTION BAKTERIELLER KONTAMINATIONEN IN LEBENSMITTELN 16 2.1 Mikrobiologischer Nachweis von Enterobacteriaceen 16 2.2 Molekularbiologischer Bakterien-Nachweis mittels PCR 18 2.2.1 Aspekte der PCR 21 2.3 Zielsetzung der Arbeit 24 II MATERIAL UND METHODEN 1 MATERIAL 26 1.1 Bakterienstämme 26 1.2 Nährmedien 28 1.3 Reagenzien 29 1.4 Enzyme 31 1.5 Reaktionskits 32 1.6 Primer und Sonden 32 1.7 Lebensmittelproben 35 1.8 Software 36
  4. 4. Inhalt II Seite 2 METHODEN 37 2.1 Anzucht von Mikroorganismen 37 2.2 Quantifizierung von Bakterienzellen 37 2.3 DNA-Extraktion 37 2.3.1 DNA-Präparation mit enzymatischem Zellaufschluss 38 2.3.2 DNA-Extraktion ShortPrep 38 2.4 DNA-Quantifizierung 38 2.4.1 DNA-Quantifizierung im Photometer 38 2.4.2 DNA-Quantifizierung im LightCycler® 39 2.4.3 Quantifizierung von Amplifikaten 39 2.5 Endonukleasenverdau 39 2.5.1 Restriktionsverdau 39 2.5.2 DNase I-Verdau 39 2.6 Polymerase-Kettenreaktion 40 2.6.1 Standardbedingungen für die konventionelle PCR 40 2.6.2 Standardbedingungen für die Real-Time-PCR 41 2.6.3 Für den Nachweis von Enterobacteriaceae mittels Real-Time- PCR optimierte Reaktionsbedingungen 43 2.7 Gelelektrophorese 44 2.7.1 Agarosegelelektrophorese 44 2.7.2 Präparative Gelelektrophorese 44 2.8 Klonierung von DNA-Amplifikaten 45 2.8.1 Ligation präparierter Amplifikate 45 2.8.2 Transformation in Escherichia coli 45 2.9 Präparation und Restriktionsverdau von Plasmid-DNA 46 2.9.1 Präparation von Plasmid-DNA 46 2.9.2 Restriktionsverdau präparierter Plasmid-DNA 46 2.10 Sequenzanalyse 47 2.10.1 DNA-Sequenzierung und Sequenzauswertung 47 2.10.2 Bearbeitung von DNA-Sequenzdaten 47 2.11 Überprüfung der Spezifität der Real-Time-PCR-Methode zum Nachweis von Enterobacteriaceae 47 2.12 Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der Untersuchung von Lebensmittelproben im Vergleich mit mikrobiologischen Methoden 48 III ERGEBNISSE 3.1 Auswahl der DNA-Zielregion 50 3.2 Erstellen von Sequenzalignments und Generieren möglicher Primer für den Nachweis von Enterobacteriaceen-DNA 51 3.3 Amplifikation der 23S-5S-DNA von Enterobacteriaceen 53 3.4 Dekontamination der Taq-Polymerase 55 3.5 Testung der Primer für Enterobacteriaceen 56
  5. 5. Inhalt III Seite 3.6 Generieren der Primer und Sonden für das System zum Nachweis von Enterobacteriaceae 58 3.7 Anwendung und Überprüfung der generierten Oligonukleotide und der dekontaminierten Taq-Polymerase in der Real-Time- PCR für den Nachweis von Enterobacteriaceen 60 3.7.1 Amplifikation 60 3.7.1.1 Hook-Effekt 61 3.7.2 Schmelzkurvenanalyse 62 3.8 Interne Amplifikationskontrolle 63 3.8.1 Konstruktion der Internen Amplifikationskontrolle 64 3.8.2 Integration der Internen Amplifikationskontrolle in das Enterobacteriaceen-Nachweissystem 66 3.9 Optimierung der Reaktionsbedingungen für das Enterobacteriaceen-Nachweissystem 66 3.10 Spezifität des Enterobacteriaceen-Nachweissytems 67 3.10.1 Inklusivität 68 3.10.2 Exklusivität 69 3.11 Sensitivität des Enterobacteriaceen-Nachweissystems 70 3.11.1 Überprüfung der Sensitivität mit genomischer DNA von Bakterien 71 3.11.2 Überprüfung der Sensitivität mit bakteriellen Zelllinien 74 3.12 Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der Untersuchung von Lebensmittelproben 75 IV DISKUSSION 4.1 Entwicklung eines spezifischen Real-Time-PCR-Systems für den Nachweis von Enterobacteriaceae 84 4.2 Kulturelle Anreicherung und DNA-Extraktion 86 4.3 Dekontamination der Taq-DNA-Polymerase 88 4.4 Kompetitive PCR mit Interner Amplifikationskontrolle 90 4.5 Spezifität und Sensitivität 91 4.6 Ausblick 96 V ZUSAMMENFASSUNG 98 VI LITERATUR 99
  6. 6. Inhalt IV VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN Seite Abb. 1.1 Prozentuale Verteilung der bekannten mit Mikroorganismen kontaminierten Lebensmittel, deren Verzehr im Jahr 2000 zu Ausbrüchen von Infektionskrankheiten in den Vereinigten Staaten von Amerika führten 4 Abb. 1.2: An das Robert Koch Institut in Berlin übermittelte Fälle von Enteritis-Salmonellosen in Deutschland in den Jahren 1991 bis 2004 12 Abb. 3.1: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der universellen Primer fw23S und rev5S der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH am rRNA-Operon von Eubakterien 50 Abb. 3.2: Sequenzen der universellen Primer fw23S und rev5S der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH für die Amplifikation der 23S-5S- DNA im rRNA-Operon von Bakterien 51 Abb. 3.3: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der Primer fw1 - fw8 und rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) für die spezifische Amplifikation von Enterobacteriaceae-DNA 53 Abb. 3.4: Agarosegelelektrophorese einer PCR für die spezifische Amplifikation der 23S-5S-Region mit dem Primerpaar fw1/rev3 54 Abb. 3.5: Agarosegelelektrophorese nach PCR mit Perpetual Taq, ohne und mit DNase I-Verdau der Taq-Polymerase 56 Abb. 3.6: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der Oligonukleotide für das Real-Time-PCR-System zum Nachweis von Enterobacteria- ceae-DNA 59 Abb. 3.7: Amplifikationskurven der Real-Time-PCR zum Nachweis von Enterobacteriaceae-DNA 61 Abb. 3.8: Schmelzkurven der Real-Time-PCR für den Nachweis von Enterobacteriaceae-DNA 63 Abb. 3.9: Konstruktion des mutagenisierten DNA-Fragments für die Interne Amplifikationskontrolle des Enterobacteriaceen-Nachweises 65 Abb. 3.10: Fluoreszenz bei Anwendung des Enterobacteriaceen- Nachweissystems während der Amplifikation von Ziel- und IAK- DNA im LightCycler® 67 Abb. 3.11: Sensitivitätstest der Real-Time-PCR für den Enterobacteria- ceen-Nachweis durch Amplifikation genomischer DNA von Serratia marcescens 72 Abb. 3.12: Überprüfung der Sensitivität des Enterobacteriaceen- Nachweissystems mit genomischer DNA von Bakterien 73 Abb. 3.13: Überprüfung der Sensitivität des Enterobacteriaceen- Nachweissystems mit bakteriellen Zelllinien 75 Abb. 3.14: Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der Untersuchung von Lebensmittelproben 78 Abb. 3.15: Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der Untersuchung von Säuglingsnahrung 81
  7. 7. Inhalt V VERZEICHNIS DER TABELLEN Seite Tab. 1.1: Häufig vorkommende, lebensmittelübertragene Gattungen und Spezies der Familie Enterobacteriaceae sowie Beispiele für deren Vorkommen und Bedeutung 7 Tab. 1.2: Taxonomische Einteilung der Gattung Salmonella in Spezies und Subspezies sowie Anzahl der Serovare im Jahr 2002 8 Tab. 2.1: Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitäts- und Sensitivitäts- tests 26 Tab. 2.2: Nicht-Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitätstests 27 Tab. 2.3: Generierte Primer und Sonden mit Bindungsstellen innerhalb des DNA-Bereichs für 23S rRNA – Spacer – 5S rRNA im ribosomalen Operon 32 Tab. 2.4: Generierte Primer und Sonde für die Konstruktion und Detektion der internen Amplifikationskontrolle 34 Tab. 2.5: Tiefgefrorene Lebensmittel 35 Tab. 2.6: Säuglingsnahrung und Volleipulver 36 Tab. 3.1: Bakterienstämme der Familie Enterobacteriaceae, deren 23S- 5S-Sequenzen im Alignment als Grundlage für das Generieren der Primer fw1 - fw8 und rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) dienten 52 Tab. 3.2: Bakterienstämme diverser taxonomischer Gruppen, deren 23S- 5S-Sequenzen im Alignment als Grundlage für das Generieren der Primer fw1 - fw8 und rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) dienten 52 Tab. 3.3: Spezifische Amplifikation mit den Primern fw1 – fw8 und rev1 – rev8 57 Tab. 3.4: Inklusivität: Im Spezifitätstest des Real-Time-PCR-System detektierte Stämme der Familie Enterobacteriaceae 68 Tab. 3.5: Exklusivität: Alle im Spezifitätstest des Real-Time-PCR-Systems mit Nicht-Enterobacteriaceen-Spezies überprüften Stämme 70 Tab. 3.6: Ergebnisse der Untersuchung von Lebensmitteln diverser Produktgruppen 79 Tab. 3.7 Ergebnisse der Untersuchung von Säuglingsnahrung und Volleipulver 82
  8. 8. Inhalt VI VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN UND ZEICHEN °C Grad Celsius µg Mikrogramm (= 10-6 Gramm) µl Mikroliter (= 10-6 Liter) µm Mikrometer (= 10-6 Meter) µM mikromolar (= 10-6 molar) A Adenin A. Aeromonas Abb. Abbildung abs. absolut Abs. Absatz Acc. (englisch Accession) Zugang Aci Arthrobacter citreus ag Attogramm (= 10-18 Gramm) Amp Ampicillin API (englisch Analytical Profile Index) analytischer Profilindex Aqua dest. (lateinisch Aqua destillata) destilliertes Wasser ATCC American Type Culture Collection BCD BIOTECON Diagnostics GmbH BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Basenpaar BSA (englisch Bovine Serum Albumin) Rinderserumalbumin C Cytosin C. Citrobacter CASO Caseinpepton-Sojamehlpepton CP (englisch crossing point) dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytidintriphosphat DGHM Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie dGTP Desoxyguanosintriphosphat DNA (englisch deoxyribonucleic acid) Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleosidtriphosphat DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen dTTP Desoxythymidintriphosphat E. Escherichia Ed. Edwardsiella Ed. (englisch editor) Herausgeber EDTA Ethylendiamintetraessigsäure Ent. Enterobacter Er. Erwinia et al. (lateinisch et alii) und andere EtBr Ethidiumbromid Fa. Firma FAO (englisch Food and Agriculture Organization) Welternährungsorganisation fg Femtogramm (= 10-15 Gramm) Fmax maximale Fluoreszenz fw (englisch forward) vorwärts g Gramm G Guanin GÄ Genomäquivalent h (englisch hour) Stunde H. Hafnia Hrsg. Herausgeber HS Heringssperma I Inosin IAK Interne Amplifikationskontrolle
  9. 9. Inhalt VII ICMSF (englisch International Comission on Microbiological Specifications for Foods) Internationale Kommission für mikrobiologische Lebensmittelspezifikationen IPTG Isopropyl-Thio-β-D-Galactopyranosid K. Klebsiella Kap. Kapitel Kat. Katalog KbE Kolonie bildende Einheit LB Luria Bertani LPSN List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature m Meter M. Morganella M = A + C M molar Mae Methanococcus aeolicus mg Milligramm (= 10-3 Gramm) min (englisch minute) Minute ml Milliliter (= 10-3 Liter) mM millimolar (= 10-3 molar) Mse Micrococcus spec. NCBI National Center of Biotechnology Information NCTC National Collection of Type Cultures ng Nanogramm (= 10-9 Gramm) nm Nanometer (= 10-9 Meter) nM nanomolar (= 10-9 molar) Nr. Nummer OECD (englisch Organisation for Economic Cooperation and Development) Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung P. Plesiomonas Pa. Pantoea p. a. (lateinisch per analysis) zur Analyse PCR (englisch Polymerase Chain Reaction) Polymerase-Kettenreaktion pg Pikogramm (= 10-12 Gramm) pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration pmol Pikomol (= 10-12 Mol) Prot. Proteus Prov. Providencia R = A + G rev (englisch reverse) rückwärts RNA (englisch ribonucleic acid) Ribonukleinsäure rpm (englisch revolutions per minute) Umdrehungen pro Minute rRNA ribosomale RNA S. Salmonella S Sedimentationskoeffizient Se. Serratia sek Sekunde Sh. Shigella spec. (lateinisch Species) Spezies, unbekannte Art ssp. Subspezies T Thymin Tab. Tabelle Taq Thermus aquaticus TBE Tris Borat EDTA Puffer TE Tris EDTA Puffer Tm (englisch melting) Schmelztemperatur Tris Tris-(hydroxymethyl)aminomethan tRNA transfer RNA U (englisch unit) Einheit ü. N. über Nacht
  10. 10. Inhalt VIII UNG Uracil-DNA-N-Glycosylase UV UltraViolett V. Vibrio V/cm Volt pro Zentimeter v/v (englisch volume per volume) Volumen pro Volumen VRBD (englisch Violet-red Bile Dextrose Agar) Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Glucose) WHO (englisch World Health Organization) Weltgesundheitsorganisation w/v (englisch weight per volume) Gewicht pro Volumen w/w (englisch weight per weight) Gewicht pro Gewicht x g Vielfaches der Erdbeschleunigung g (g = 9,81 m/s2 ) X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Galactose Y = C + T Y. Yersinia
  11. 11. I Einleitung 1 I EINLEITUNG 1 THEORETISCHER TEIL ENTEROBACTERIACEAE IN LEBENSMITTELN 1.1 Lebensmittel als Überträger von Infektionkrankheiten Lebensmittel sind Mittel zum Leben. Sie dienen der Lebenserhaltung und dem Genuss. Aber ebenso können Lebensmittel Überträger von Krankheitserregern des Menschen sein. Ihr Verzehr führt zu Erkrankungen, die mitunter tödlich enden. Nach Definition der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sind durch Lebensmittel verursachte Erkrankungen „Krankheiten infektiöser oder toxischer Natur, verursacht durch Agenzien, die durch Nahrungsaufnahme in den Körper gelangen“ (Anonymus 2002a). Kontaminierte Lebensmittel weisen einen gesundheitsgefährdenden Befall mit Mikroorganismen und ihren Toxinen und/oder Rückständen von pharmazeutischen, umweltrelevanten und anderen Substanzen auf. Die vorliegende Arbeit richtet den Fokus auf Lebensmittelkontaminationen mit Bakterien als Ursachen für lebensmittelbedingte Erkrankungen. Durch Lebensmittel übertragene Infektionskrankheiten stellen weltweit ein wachsendes Gesundheits- und Wirtschaftsproblem dar, sowohl in Entwicklungsländern als auch in hochentwickelten Industrieländern (Elmi 2004). Bis zu 30 % der Bevölkerung in allen Industrieländern sind jedes Jahr von lebensmittelassoziierten Infektionen betroffen (Anonymus 2002a). In den USA erkranken nach einer Studie jährlich ungefähr 76 Millionen Bürger, circa 325.000 Personen werden in ein Krankenhaus eingewiesen und etwa 5.000 Erkrankte sterben an den Folgen der durch Lebensmittel übertragenen Krankheiten (Mead et al. 1999). In England und Wales werden pro Jahr rund 2,4 Millionen Erkrankungen, etwa 21.000 Krankenhauseinweisungen und über 700 Todesfälle als lebensmittelbedingt ermittelt (Adak et al. 2002). Nach Angaben der WHO ist davon auszugehen, dass diese Belastung in gleichem Ausmaß auf die meisten Länder der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) zutrifft (Rocourt et al. 2003a). Innerhalb der letzten zwei Jahrzehnte haben lebensmittelbedingte Erkrankungen der Bevölkerung stark an Bedeutung gewonnen. Eine Reihe von Faktoren sind für diese
  12. 12. I Einleitung 2 Entwicklung verantwortlich: Intensive Massentierhaltung ermöglicht eine schnelle Durchseuchung der Tierbestände mit pathogenen Keimen wie Salmonellen, die zum Beispiel durch kontaminierte Futtermittel eingeführt werden (Jansen et al. 2005). Der Einsatz von Antibiotika als Masthilfsmittel moderner Tierhaltung führt zur Verbreitung von Antibiotikaresistenzen humanpathogener Bakterienstämme, die eine Therapie betroffener Patienten wesentlich erschweren (Klare et al. 1995, Poppe et al. 2006). Nach dem Verzehr von Lebensmitteln, die mit resistenten Enterobacteriaceen kontaminiert sind, können diese in der Darmflora persistieren oder sich vermehren und die Resistenz auf weitere Bakterien einschließlich pathogene Arten übertragen. Durch das Bundesinstitut für Risikobewertung wurde in Deutschland in den letzten zehn Jahren bei Salmonella Isolaten verschiedener Serotypen aus Tieren, Lebensmitteln, Futtermitteln und der Umwelt ein Anstieg der Multiresistenz gegenüber antimikrobiell wirksamen Substanzen nachgewiesen. So wurden in den Jahren 2000 bis 2002 Stämme des Serovars Salmonella Typhimurium mit Mehrfachresistenzen gegenüber Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Tetracyclin und Sulfonamiden aus Lebensmitteln isoliert (Helmuth et al. 2003). Der Verzehr von naturbelassenem, unbehandeltem Obst und Gemüse gilt heutzutage als besonders gesund. Fehlende Behandlung zur Keimreduktion sowie Einsatz natürlicher Dünger und ungeklärten Abwassers mit möglicher Kontamination für die Bewässerung in der Landwirtschaft erhöhen aber das Risiko von Infektionen (Beuchat und Ryu 1997, Tauxe et al. 1997). Zu einem größeren Krankheitsausbruch durch Toxin produzierende Citrobacter freundii kam es in einem Kindergarten in Deutschland nach dem Verzehr von Butter mit frischer Petersilie. Vehikel für die Lebensmittelinfektion war die Petersilie aus biologischem Anbau, die mit kontaminierter Schweinegülle gedüngt worden war (Tschäpe et al. 1995). Im Rahmen einer Erfassung über weltweite Krankheitsausbrüche durch mit Enterobacteriaceen kontaminierte rohe Sprossen, besonders von Alfalfa und Mungbohnen, kommen Taormina et al. (1999) zu der Empfehlung, dass Kinder, Ältere und Menschen mit eingeschränkter Immunabwehr als besonders gefährdete Personen grundsätzlich keine rohen Sprossen verzehren sollten. Im Vergleich zu frischem Obst und Gemüse stellen Sprossen ein deutlich höheres Risiko dar. Bakterien in kontaminierten Samen können sich durch den Prozess des Sprossens bei 21 °C bis 25 °C und viel Feuchtigkeit drastisch vermehren, ohne sichtbare Anzeichen von Qualitätsbeeinträchtigung zu hinterlassen (Breuer et al. 2001). Auch die Lebensmittelindustrie hat sich auf das geänderte Verbraucherverhalten eingestellt und stellt Produkte her, die keine Konservierungsstoffe mehr enthalten. Bei Nichtbeachtung entsprechender Lager- und Transportbedingungen können Keime in diese Lebensmittel gelangen und sich dort vermehren (Ammon und Bräunig 2002). Die Entwicklung der Lebensmitteltechnologie führt zu einem immer größer
  13. 13. I Einleitung 3 werdenden Angebot von Nahrungsmitteln, besonders sogenanntem „ready-to-eat food“. Diese Produkte werden oft als Tiefkühlware über längere Zeiträume gelagert und können zur Verbreitung kälteadaptierter pathogener Keime beitragen (Rocourt et al. 2003b). Moderne Vermarktungsstrategien und globaler Lebensmittelhandel erhöhen das Risiko, dass durch zentralisierte Herstellung und Bearbeitung der Nahrungsmittel und verlängerte Transportwege und -zeiten bei einer Kontamination eine Vielzahl von Menschen weltweit betroffen sein können, wobei die Vielfalt möglicher Krankheitserreger für jeden Einzelnen zunimmt (Rocourt et al. 2003a). In den USA handelt es sich bei dem Angebot an frischem Obst und Gemüse, welches in Lebensmittelgeschäften und Restaurants erhältlich ist, bereits zu über 75 % um importierte Ware aus aller Welt (Hedberg et al. 1994). Ständig wachsender weltweiter Tourismus führt ebenso zu einer Globalisierung lebensmittelbedingter Erkrankungen. Nach einer Studie der WHO sind 80 % bis 90 % der gemeldeten Salmonellosen in skandinavischen Ländern auf internationalen Tourismus zurückzuführen, und die Wahrscheinlichkeit, auf Reisen mit einer Lebensmittelinfektion konfrontiert zu werden, liegt, je nach Reiseziel, bei 20 % bis 50 % (Käferstein et al. 1997). Auch demographische Veränderugen – eine immer älter werdende Bevölkerung und mehr immungeschwächte Personen – führten dazu, dass die Zahl lebensmittelbedingter Infektionskrankheiten in den letzten zwei Jahrzehnten deutlich angestiegen ist (Ammon 2005). Die Vielfalt von Risikolebensmitteln, die als Überträger für Krankheitskeime dienen können, ist auffallend groß. Mikrobiologisch kontaminierte Lebensmittel, die einem WHO-Bericht zufolge im Jahr 2000 in den USA zu 1493 Krankheitsausbrüchen führten (Rocourt et al. 2003a), sind in Abbildung 1.1 dargestellt. In 773 der Ausbrüche konnten die betroffenen Lebensmittel ermittelt werden. 101 Ausbrüche (etwa 13 % der Fälle, in denen das Lebensmittel bekannt war) wurden durch den Verzehr von Fleisch und Fleischprodukten ausgelöst. 81 Ausbrüche wurden durch kontaminiertes Geflügel, 79 Ausbrüche durch Fisch und Meeresfrüchte (jeweils rund 10 %) und 64 Ausbrüche durch Obst und Gemüse (circa 8 %) ausgelöst. In 13 Fällen (etwa 2 %) waren Getreide oder Teigwaren beziehungsweise Süßwaren kontaminiert. In 12 (rund 2 % der Ausbrüche mit bekannter Kontaminationsquelle) der Fälle war der Konsum von Ei und Eiprodukten oder von Milch und Milchprodukten Ursache für Erkrankungen. Die übrigen kontaminierten Lebensmittel dieser Studie waren in 183 Fällen der Krankheitsausbrüche Mischgerichte (etwa 23 %), 157 mal zusammengesetzte Lebensmittel (rund 20 %) und 58 mal sonstige Lebensmittel (etwa 8 %).
  14. 14. I Einleitung 4 Mikrobiologisch kontaminierte Lebensmittel, die zu Krankheitsausbrüchen führten Obst und Gemüse 8% Ei und Eiprodukte 2% Milch und Milchprodukte 2% Süßwaren 2% Fleisch und Fleischprodukte 13% Getreide, Teigwaren 2% Zusammengesetzte Lebensmittel 20% Sonstige Lebensmittel 8% Fisch und Meeresfrüchte 10% Geflügel 10% Mischgerichte 23% Abb. 1.1: Prozentuale Verteilung der bekannten mit Mikroorganismen kontaminierten Lebensmittel, deren Verzehr im Jahr 2000 zu Ausbrüchen von Infektionskrankheiten in den Vereinigten Staaten von Amerika führten (nach Rocourt et al. 2003a) Häufigstes Krankheitsbild lebensmittelassoziierter Erkrankungen sind Gastroenteritiden. Der Krankheitsverlauf dieser Magen-Darm-Infektionen reicht von geringer Gesundheitsbeeinträchtigung ohne Notwendigkeit ärztlicher Behandlung über Erkrankungen mit stationärer Behandlung bis hin zu schwerer systemischer Infektion und Todesfällen. Das Ausmaß der Erkrankung hängt von einer Reihe Faktoren wie gesundheitlicher Konstitution, Ernährung und Lebensalter ab. Infolgedessen sind Auftreten, Schwere der Erkrankung und Sterblichkeitsrate durch Lebensmittelinfektionen in unterschiedlichen Bevölkerungsgruppen verschieden stark vertreten. Besonders gefährdet und damit wesentlich häufiger betroffen sind Kinder, Schwangere, Immungeschwächte und ältere Menschen (Levine et al. 1991). Zum Personenkreis dieser Risikogruppe zählten in den 1990er Jahren bereits 20 % der Menschen in den USA, wobei die Tendenz deutlich steigend ist (Gerba et al. 1996, Rocourt et al. 2003a). Mishu et al. (1994) führten in den USA eine Erhebung zu Krankheitsausbrüchen durch lebensmittelbedingte Infektionen mit dem Serovar Salmonella Enteritidis in den Jahren 1985 – 1991 durch. Dabei kamen sie zu dem Ergebnis, dass die Rate der Todesfälle in Altenheimen und Krankenhäusern 70fach höher liegt als in anderen Einrichtungen.
  15. 15. I Einleitung 5 1.2 Enterobacteriaceae als Ursachen für Lebensmittel- infektionen Typische Keime bakterieller Lebensmittelinfektionen sind neben Campylobacter, Listeria und Vibrio häufig Vertreter der Familie Enterobacteriaceae. Salmonellosen, ausgelöst durch die Enterobacteriaceen-Gattung Salmonella, gehören zu den weltweit häufigsten lebensmittelassoziierten Infektionen und führen jährlich zu mehreren Millionen gemeldeten Erkrankungen und tausenden Todesfällen (Anonymus 2005a). Die Bakterien der Familie Enterobacteriaceae (Rahn 1937) mit der Typspezies Escherichia coli gehören zur γ-Subklasse der Proteobacteria und umfassen mehr als 200 Spezies in 46 Gattungen. Sie sind gramnegative, nicht sporulierende Stäbchen mit einer Länge von 1,0 bis 6,0 µm und einem Durchmesser von 0,3 bis 1,5 µm. Enterobacteriaceen sind fakultativ anaerob, Oxidase-negativ, fermentieren Glucose und reduzieren Nitrat zu Nitrit (Brenner 1984). Die Fähigkeit, Laktose zu vergären, differenziert Coliforme, wie zum Beispiel Vertreter der Gattungen Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, und Citrobacter von solchen Enterobacteriaceen, die keine Laktose umsetzen, wie Shigella, Proteus und fast alle Salmonellen. Molekularbiologisch wird auch Plesiomonas shigelloides trotz Oxidase-Aktivität aufgrund genetischer Verwandtschaft zu den Enterobacteriaceae gezählt (Ruimy et al. 1994). Enterobacteriaceen kommen weit verbreitet vor, als Kommensale oder Krankheitserreger im Darm (griechisch enteron: Eingeweide) von Tieren, vom Insekt bis zum Menschen, sowie ubiquitär in der Umwelt, auf Pflanzen, im Wasser und im Boden. Als fakultativ anaerobe Eubakterien tolerieren sie für ihr Wachstum sowohl positive als auch negative Redoxpotentiale und sind damit äußerst anpassungsfähig. Diverse Stämme sind humanpathogen, phytopathogen oder haben als Saprobionten beim Verderb von Lebensmitteln eine wichtige Bedeutung. Häufig treten sie als opportunistische Krankheitskeime auf, für etwa 50 % der nosokomialen Infektionen in den USA sind Enterobacteriaceen verantwortlich (Paradis et al. 2005). In diversen Lebensmitteln wie Fleisch, Geflügel, Eiprodukte, Gemüse, Getreide, Kräuter, Milchprodukte und Süßwaren wurden Enterobacteriaceae nachgewiesen. Als Kontaminant in Trockenmilch-Säuglingsnahrung ist insbesondere das Vorkommen der Enterobacteriaceae-Spezies Enterobacter sakazakii - erstmalig als neue Spezies definiert von Farmer et al. (1980) - von großer Bedeutung im Rahmen lebensmittelübertragener Erkrankungen und hat in den vergangenen Jahren für viel Aufsehen gesorgt (Anonymus 2002c, Bowen und Braden 2006). Während Ent. sakazakii grundsätzlich in den unterschiedlichsten Lebensmittelgruppen
  16. 16. I Einleitung 6 nachgewiesen wurde, trat der Keim ausschließlich in pulverförmiger Kindernahrung in Verbindung mit Krankheitsausbrüchen auf (Anonymus 2005c). Bei Säuglingen führen Infektionen mit Ent. sakazakii zu neonatalen Meningitiden, Septikämien und nekrotisierenden Enterocolitis-Erkrankungen mit extrem hohen Mortalitätsraten von 40 – 80 %. Das Auftreten der Erkrankungen wurde bereits in zahlreichen Ländern wie England, den Niederlanden, Griechenland, Kanada und den USA beschrieben (Nazarowec-White und Farber 1997). Selbst geringste Mengen von Enterobacter sakazakii in sprühgetrockneter Säuglingsnahrung bedeuten eine Gefährdung der Gesundheit, da sie sich während der Speisenzubereitung und Aufbewahrung der rehydrierten Nahrung rapide vermehren können (Forsythe 2005, Kandhai et al. 2006). Bisher gibt es zwar keine gesicherten epidemiologischen Untersuchungen über die minimale infektiöse Dosis (Lehner und Stephan 2004), aufgrund einer Risikobewertung durch Welternährungsorganisation und Weltgesundheits- organisation (FAO/WHO) kann aber davon ausgegangen werden, dass es bei einem Gehalt von 1 KbE/g Trockenprodukt nach Zubereitung der Kindernahrung zur Erkrankung kommen kann (Anonymus 2004a). Die Detektion von Enterobacteriaceen in Lebensmitteln spielt als Indikator für gesundheitsgefährdende Hygienemängel eine wichtige Rolle. In Tabelle 1.1 sind die häufigsten Vertreter lebensmitelassoziierter Gattungen und Spezies sowie deren häufiges Vorkommen und Bedeutung aufgeführt. Die weltweit bedeutendsten, für Lebensmittelinfektionen verantwortlichen Enterobacteriaceae sind Salmonellen und werden im Folgenden ausführlicher behandelt.
  17. 17. I Einleitung 7 Tab. 1.1: Häufig vorkommende, lebensmittelübertragene Gattungen und Spezies der Familie Enterobacteriaceae sowie Beispiele für deren Vorkommen und Bedeutung (nach Baumgart 2006, Müller und Weber 1996) Gattung Spezies Vorkommen und Bedeutung Citrobacter C. amalonaticus, C. freundii, C. koseri Darm; Durchfall (Verotoxinbildung) durch einige C. freundii-Stämme Edwardsiella Ed. tarda Darm; Durchfall durch Ed. tarda Enterobacter Ent. aerogenes, Ent. cloacae, Ent. sakazakii Pflanzen, Darm, Wasser, Boden; Verderb von Lebensmitteln, Ent. sakazakii in Milchpulvernahrung für Säuglinge (Mortalitätsraten 40 - 80 %) sowie in Käse, Fleisch, Gemüse, Getreide, Kräutern, Gewürzen und erhitzter Milch Erwinia Er. amylovora, Er. carotovora Pflanzen; Verderb pflanzlicher Lebensmittel durch Pektinasen, phytopatogen (Blockade des Wasser- leitungssystems) Escherichia E. coli, E. hermanii, E. vulneris Darm; Durchfall, Kontamination und Verderb diverser Lebensmittel, E. coli fakultativ pathogen, Hygieneindikator, Pathovare enterovirulenter E. coli : enterohämorrhagische E. coli (EHEC), Enterotoxin bildende E. coli (ETEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), enteropathogene E. coli (EPEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), diffus adhärente E. coli (DAEC) Hafnia H. alvei Darm, Boden, Wasser; Verderb eiweißreicher Lebensmittel, Histaminbildung bei Fischen, fakultativ pathogen bei Immunsupprimierten Klebsiella K. pneumoniae, K. oxytoca Darm, Wasser, Boden, Luft; Verderb von Lebensmitteln, K. pneumoniae ist pathogen Morganella M. morganii Darm, Wasser, Boden; Verderb eiweißreicher Lebensmittel Pantoea Pa. agglomerans, Pa. dispersa Weit verbreitet in der Natur; Pa. agglomerans vermehrt sich bei 4 °C und führt zum Verderb von Frischfleisch Plesiomonas P. shigelloides Geflügel, Wasser, nachgewiesen in Muscheln, Fisch, Kot von Rind, Geflügel, Schwein, Schaf; Durchfall Proteus Prot. mirabilis, Prot. vulgaris Darm, Wasser, Boden; Verderb eiweißreicher Lebensmitttel (Bildung von Ammoniak und Ketosäuren durch oxidative Desaminierung von Aminosäuren) Providencia Prov. alcalifaciens, Prov. stuartii Darm, Wasser, Boden; Verderb eiweißreicher Lebensmittel; Durchfall Salmonella S. enterica Darm, Lebensmittel tierischen Ursprungs, über Verunreinigungen auch pflanzliche Lebensmittel und Futtermittel; pathogen, Infektionskrankheiten, Durchfall Serratia Se. marcescens, Se. liquefaciens Darm, Pflanzen, Insekten, Boden; Verderb tierischer Lebensmittel Shigella Sh. boydii, Sh. dysenteriae, Sh. flexneri, Sh. sonnei Darm, Lebensmittel, Wasser; pathogen, Durchfall (Ruhr) Yersinia Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis Darm, Wasser, Schweinefleisch, Milchprodukte; Y. pseudotuberculosis und bestimmte Serovare von Y. enterocolitica sind Erreger intestinaler Yersiniosen des Menschen
  18. 18. I Einleitung 8 1.2.1 Häufigster Vertreter lebensmittelassoziierter Entero- bacteriaceae: Salmonella Salmonellen, benannt nach dem amerikanischen Bakteriologen Daniel Elmer Salmon, sind 0,7 bis 1,5 µm mal 2,0 bis 5,0 µm große Stäbchenbakterien. Mit Ausnahme von Salmonella Gallinarum und Salmonella Pullorum sind sie peritrich begeißelt und beweglich. Sie bilden Säure und Gas aus Glucose, Mannit und Maltose und sind, abgesehen von den Subspezies arizonae und diarizonae, Laktose negativ. Gewöhnlich bilden sie Schwefelwasserstoff aus Thiosulfat und assimilieren Citrat (Brenner 1984). Das Genus Salmonella gliedert sich in zwei Arten, die Typspezies S. enterica und die Spezies S. bongori und in sechs Unterarten der Spezies S. enterica. Zur Zeit sind 2541 Serovare der Gattung benannt, von denen 1504 zur Subspezies S. enterica ssp. enterica gehören (Le Minor und Popoff 1987, Popoff et al. 2004). Eine Übersicht ist in Tabelle 1.2 gegeben. Die antigenischen Bezeichnungen der Salmonella- Serotypen werden durch das WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella am Pasteur Institut in Paris festgelegt und regelmäßig aktualisiert. Neue Serovare werden in den Updates des Kauffmann-White-Schemas aufgeführt (Brenner et al. 2000). Tab. 1.2: Taxonomische Einteilung der Gattung Salmonella in Spezies und Subspezies sowie Anzahl der Serovare im Jahr 2002 (Popoff et al. 2004, Tindall et al. 2005) Die korrekte Bezeichnung von, zum Beispiel, dem Serovar typhimurium müsste Salmonella enterica ssp. enterica Serovar typhimurium heißen. Um derartige Namen in der Praxis zu vereinfachen, werden die Stämme der Subspezies enterica nach Le Minor und Popoff (1987) mit großem Anfangsbuchstaben und nicht kursiv geschrieben. Die Bezeichnung lautet also Salmonella Typhimurium. Die Stämme der Taxon Bezeichnung Anzahl Serovare Genus Salmonella 2541 Spezies S. enterica 2519 Subspezies S. enterica ssp. enterica 1504 S. enterica ssp. salamae 502 S. enterica ssp. arizonae 95 S. enterica ssp. diarizonae 333 S. enterica ssp. houtenae 72 S. enterica ssp. indica 13 Spezies S. bongori 22
  19. 19. I Einleitung 9 übrigen fünf Subspezies und die der Spezies S. bongori werden mit der Kurzbezeichnung und der Antigenformel benannt, zum Beispiel Salmonella IIIb 53:r:z23 (Bockemühl und Seeliger 1985). Die Angabe 53 kennzeichnet das somatische O-Antigen aus Lipopolysacchariden der Zellwand, die Bezeichnung r und z zwei Phasen des Geißelantigens H. Beide Antigene werden durch Objektträger- Agglutination mittels käuflicher Antiseren nachgewiesen. Die Einteilung der Serovare erfolgt nach dem Antigenschema von Kauffmann-White. Mit Bezug auf Pathogenese, klinischem Erscheinungsbild und Epidemiologie werden Salmonellen in die typhösen und die enteritischen Salmonellen unterteilt. Die Serovare Typhi, Erreger des Typhus, und Paratyphi A, B, C, Erreger des Paratyphus sind die typhösen Salmonellen. Alle übrigen Serovare gehören zu den enteritischen Salmonellen und verursachen beim Menschen meist Enteritiden. Alle Salmonellen gelten als pathogen, in den Industerieländern treten die Enteritis-Salmonellen besonders häufig auf. 1.2.1.1 Enteritis-Salmonellose Die Salmonellose ist die häufigste und am weitesten verbreitete durch Lebensmittel übertragene Infektionskrankheit. In den USA erkranken jährlich etwa 1,4 Millionen Menschen an einer Enteritis-Salmonellose und rund 400 Erkrankte sterben an den Folgen (Voetsch et al. 2004). Im Jahr 1995 waren es in England und Wales 102.227 Einwohner, die an einer Infektion mit Enteritis-Salmonellen erkrankten, 3.412 von ihnen mussten im Krankenhaus behandelt werden und 268 der Betroffenen starben an der Erkrankung (Adak et al. 2002). Für Kalifornien erfassten Trevejo et al. (2003) in einer epidemiologischen Studie über einen Zeitraum von zehn Jahren Erkrankungen, Sterberaten und Hospitalkosten, die durch Infektionen mit Enteritis- Salmonellen verursacht wurden. Die ermittelten Kosten für Salmonellose- Behandlungen im Krankenhaus lagen in den Jahren 1990 bis 1999 bei rund 200 Millionen Dollar. Erregerreservoir dieser Zoonose ist vorwiegend der Darmtrakt zahlreicher Tiere wie Schweine, Rinder, Kälber, Geflügel, Wild, Tauben, Möwen, Muscheln, Fische, Nager und Insekten. Die Salmonella-Übertragung vom Tier auf den Menschen erfolgt überwiegend durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln tierischen Ursprungs, wobei die Tiere in den seltensten Fällen klinisch erkrankt sind. Besonders häufig betroffen sind Geflügel – Huhn, Ente, Gans und Pute – , rohe Eier und Roheispeisen – Eischäume, Cremes, Mayonnaise und Speiseeis – , rohes Fleisch und nicht oder nicht ausreichend erhitzte Fleischprodukte – Hackfleisch, Rohwurst und Fleischsalate – sowie nicht pasteurisiete Milch (Anonymus 2002b). Neben tierischen Produkten können durch Einsatz natürlicher Dünger oder
  20. 20. I Einleitung 10 Verunreinigungen auch pflanzliche Lebensmittel und Futtermittel Salmonellen enthalten. So waren beispielsweise der Verzehr von Tomaten (Hedberg et al. 1999), Sprossen (Van Beneden et al. 1999, Mohle-Boetani et al. 2002), nicht sachgemäß zubereitetem Kräutertee (Koch et al. 2005) und Schokolade (Werber et al. 2005) Augangspunkt von Salmonella-Infektionen. Direkte Mensch-zu-Mensch- Übertragungen spielen bei Enteritis-Salmonellosen nur eine sehr untergeordnete Rolle. Nach einer Infektion des Menschen mit enteritischen Salmonellen beträgt die Inkubationszeit, abhängig von der Infektionsdosis, meist 12 - 36 Stunden, mitunter aber auch 5 - 72 Stunden. Es kommt zu Gastroenteritiden mit wässrigem, teilweise blutigem Durchfall, Leibschmerzen, Übelkeit, Erbrechen und Kopfschmerzen, zum Teil auch mit Fieber. Die Symptome dauern in der Regel wenige Stunden oder Tage, oft kommt ein leichter oder symptomloser Verlauf vor. Bei schweren klinischen Fällen treten Schüttelfrost, höheres Fieber, Kollaps und weitere systemische Krankheitsbilder auf. Die Keimausscheidung enteritischer Salmonellen dauert drei bis sechs Wochen, bei Säuglingen aber auch mehrere Monate (Anonymus 2002b). Während des gastroenteritischen Infektionsverlaufs überwinden die Salmonellen die Infektabwehr und gelangen über den Magen in den Darm. Dabei müssen sie gegenüber der Magensäure mit pH-Werten von 1,0 – 4,0 bestehen. So kann zum Beispiel S. Typhimurium mit der Synthese von Säureschockproteinen und Induktion von Protonenpumpenaktivität auf den Säurestress reagieren und ist damit in der Lage, in extrem saurem Milieu zu überleben (Foster und Hall 1991, Hall und Foster 1996). Im Verlauf der Pathogenese bewirken von Salmonella kodierte Faktoren wie SEP14, SEF17 und SEF21 als Adhäsine die Anhaftung der Bakterien an die Epithelzellen des Dünndarms. Somit verhindern sie ihr Ausscheiden durch die Darmperistaltik und können sich lokal vermehren. Nach dieser Kolonisation dringen sie über Invasine in die Zellen ein und es kommt zur Bildung von Toxinen. Thermolabile Exotoxine, die zum unkontrollierten Wasser- und Elektrolytverlust führen, wurden als Enterotoxin Stn und zotlike (zonula occludens toxin) Toxine beschrieben. Letztere kommen in allen Enteritis-Salmonellen vor und führen zum Abbau der „tight junctions“, die für den kontrollierten Stofftransport durch die Epithelzellen verantwortlich sind (D’Aoust 1991, Tschäpe und Prager 1995). Neben den Exotoxinen, die bereits während des Lebenszyklus der Salmonellen sekretiert werden können, wirken auch thermostabile Endotoxine, die nicht kontinuierlich in das umgebende Medium abgegeben werden. Diese Lipopolysaccharide (LPS) sind Bestandteil der äußeren Membran der Zellwand gramnegativer Bakterien, also auch aller anderen Enterobacteriaceen. Sie werden im Allgemeinen erst durch Autolyse oder artifizielle Zerstörung der Zellen als Zerfallsprodukte freigesetzt. LPS bestehen aus drei Komponenten, einem Polysaccharid (O-Antigen), einem Core-
  21. 21. I Einleitung 11 Oligosaccharid und einem Lipid. Die Lipid-Komponenete, bezeichnet als Lipid A, löst die Bildung von Proteinen wie Tumor-Nekrose-Faktor (TNF-α) und Interleukin-1 (IL- 1ß) aus und ist für die Entstehung von Entzündungen und Toxinogenität verantwortlich (Rietschel et al. 1994, Reynolds et al. 2006). Durch die ausgelösten Durchfallerkrankungen kommt es in der Regel zum Ausscheiden der enteritischen Salmonellen. Die Salmonellose tritt in Form von sporadischen Fällen, Familienerkrankungen oder als Epidemien auf und ist die nach dem Infektionsschutzgesetz (IfSG) am häufigsten in Deutschland gemeldete, durch Lebensmittel übertragene Krankheit des Menschen (Jansen et al. 2005). Nach IfSG §7 ist jeder Nachweis von Salmonellen unverzüglich, innerhalb von 24 Stunden, durch das Labor, welches den Nachweis erbracht hat, dem zuständigen Gesundheitsamt zu melden. Nach einem massiven Anstieg registrierter Fälle im Jahr 1992 ist die Salmonellose seit 1993 rückläufig. Im Jahr 2004 kam es in Deutschland aber immer noch zu 56.947 Errkankungen mit 52 Todesfällen. Unter den Verstorbenen befanden sich ein einjähriges und ein zweijähriges Kind sowie eine 41-jährige Frau, acht Personen zwischen 60 und 69 Jahren und 41 Personen im Alter von mindestens 70 Jahren. (Anonymus 2005b). Darüber hinaus ist von einer beträchtlichen Dunkelziffer an Salmonellosen auszugehen, da wegen der oft nur kurzen, leichten und selbstlimitierenden Symptomatik häufig weder ein Arzt hinzugezogen noch eine Erregerdiagnostik eingeleitet wird (Anonymus 2003a). Somit bleibt die Salmonellose weiterhin eine bedeutende lebensmittelassoziierte Infektionskrankheit. Abbildung 1.2 zeigt den quantitativen Verlauf registrierter Enteritis-Salmonellosen des Menschen in Deutschland in den Jahren 1991 bis 2006 sowie den Anteil der häufigsten krankheitsauslösenden Serovare. Die größte Bedeutung haben die Stämme der Serovare Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium. Epidemiologische Langzeitanalysen zeigen, dass europaweit seit Mitte der 1980er Jahre das Serovar Enteritidis vorherrscht, nachdem in den Jahren zuvor S. Typhimurium als häufigster Vertreter nachgewiesen wurde (Rodrigue et al. 1990). Im Rahmen einer schwedischen Studie über Salmonellenerkrankungen und dadurch verursachte Kosten in der Europäischen Union, ermittelten de Jong und Ekdahl (2006) innerhalb des Erfassungsszeitraums von 1997 bis 2003 insgesamt 13.158 Patienten in Schweden, die nach einer Europareise an einer Infektion mit Salmonella erkrankt waren. Von diesen Personen waren 10.637 (81 %) an einer Infektion mit S. Enteritidis und 1.203 (9 %) an einer Infektion mit S. Typhimurium erkrankt. In Untersuchungen zur Toxinogenität von Salmonellen wurde gezeigt, dass in allen Serovaren der Spezies S. enterica das Toxin-Gen stn im Genom lokalisiert ist, tatsächlich exprimiert wird das Gen aber vor allem in den Serovaren S. Enteritidis
  22. 22. I Einleitung 12 und S. Typhimurium, was die auffällige Häufung dieser Serovare in der Diagnostik erklären könnte (Prager et al. 1995). Nach Angaben des infektionsepidemiologischen Jahrbuchs meldepflichtiger Krankheiten für 2004 (herausgegeben vom Robert Koch Institut) wurden im Jahr 2004 in Deutschland für 91 % der übermittelten 56.947 Salmonellose-Fälle genaue Angaben zum Serovar gemacht. In 67 % der Fälle handelte es sich um S. Enteritidis, in 21 % um S. Typhimurium (Anonymus 2005b). Salmonellosen in Deutschland 1991 - 2006 0 10 20 30 40 50 60 70 80 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 ProzentualerAnteilder Salmonella-Isolate(%) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 ErkrankungeninTausend(x103 ) S. Enteritidis in Prozent S. Typhimurium in Prozent Erkrankungen in Tausend Abb. 1.2: An das Robert Koch Institut in Berlin übermittelte Fälle von Enteritis- Salmonellosen in Deutschland in den Jahren 1991 bis 2006 (Quelle: Robert-Koch-Institut) Die optimale Wachstumstemperatur von Salmonellen beträgt 37 °C, es kann aber auch bei niedrigen Temperaturen bis 2 °C und höheren Temperaturen bis 54 °C zur Vermehrung kommen. Die minimale infektiöse Dosis von Salmonella für den erwachsenen Menschen liegt im Regelfall bei 104 bis 106 Kolonie bildenden Einheiten (KbE), bei besonderer Disposition wie Abwehrschwäche auch darunter. Handelte es sich bei den kontaminierten Lebensmitteln aber um stark fetthaltige wie Käse, Salami oder Schokolade oder um Gewürze, kam es bereits bei Infektionsdosen unter 50 Keimen zu Erkrankungen (Blaser und Newman 1982, Lehmacher et al. 1995). Seit den 1960er Jahren ist weltweit immer wieder von Salmonellenerkrankungen durch den Verzehr von Schokoladenprodukten berichtet worden, wobei außerordentlich niedrige Keimzahlen ausreichten, um eine Erkrankung auzulösen (Anonymus 2001).
  23. 23. I Einleitung 13 Im Zeitraum Oktober 2001 bis März 2002 kam es zu einem internationalen Krankheitsausbruch durch Infektion mit dem Serovar Salmonella Oranienburg, der auf eine Kontamination deutscher Schokolade zurückzuführen war. Neben Deutschland waren zeitgleich Schweden, die Niederlande, Finnland, Dänemark, Belgien, Österreich sowie Kanada durch Erkrankungen betroffen. Nachdem durch das Bundesinstitut für Risikobewertung am 18. Dezember 2001 in den Resten von Schokolade, die ein Erkrankter gegessen hatte, S. Oranienburg nachgewiesen war, wurde öffentlich vor dem Verzehr gewarnt. In einer Rückrufaktion in Europa und Kanada wurden Schokoladen und später auch weitere Produkte des Herstellers vom Markt genommen. Sowohl in Kanada als auch in Finnland und Schweden wurden Proben zurückgezogener Schokolade positiv auf S. Oranienburg getestet. Die nachgewiesene Kontaminationsmenge der Schokolade lag zwischen 1,1 und 2,8 KbE/g. Diese niedrige krankheitsauslösende Dosis wird darauf zurückgeführt, dass die Bakterien in der fettreichen Schokolade sehr gut gegen Magensäure geschützt sind und größtenteils noch lebend in den Darm gelangen, um dort eine Infektion auszulösen. Bedingt durch niedrigen Wassergehalt und hohe Zuckerkonzentrationen in der Schokolade weisen sie außerdem eine hohe Hitzeresistenz auf und können in dem Vehikel bis zu mehrere Jahre überleben. Maßnahmen zur Keimreduktion wie Rösten der Kakobohnen oder Hitzebehandlung der Kakaomasse mit Wasserdampf führen nicht zur sicheren Abtötung der Salmonellen. Als Ursache für die Kontamination der Schokolade konnte keine Quelle ermittelt werden. In erster Linie werden bei dem Befall von Schokoladenprodukten kontaminierte Kakaobohnen oder Milchpulver, je nach Rezeptur aber auch andere Zutaten wie kontaminierte Kokosnüsse und Gewürze angenommen. Dies ist der bisher größte erfasste lebensmittelbedingte Krankheitsausbruch durch kontaminierte Schokolade. Allein in Deutschland erkrankten insgesamt 439 Menschen, von denen 29 % in einem Krankenhaus behandelt werden mussten. 21 % der Betroffenen litten nach eigenen Angaben an blutigen Durchfällen (Werber et al. 2005). Das internationale Ausmaß dieses Ausbruchs macht deutlich, wie leicht durch globalen Nahrungsmittelhandel Menschen weltweit von lebensmittelbedingten bakteriellen Infektionen gleichen Ursprungs betroffen werden können. Angesichts des bestehenden Risikos ist eine lückenlose Kontrolle der kritischen Prozessstufen seitens der lebensmittelproduzierenden Betriebe von entscheidender Bedeutung. Besonders häufig sind die Produktionsstätten selbst der Ort der Lebensmittelkontamination. In einem Überwachungsprogramm der WHO zur Kontrolle lebensmittelbedingter Infektionen wurden die Bereiche, in denen es zu einer Kontamination kam, erfasst. Im Jahr 2000 waren es in Deutschland in 87 % der Fälle die lebensmittelproduzierenden Betriebe (Anonymus 2003b). Die Detektion von Kontaminationen mit Salmonellen erfolgt in der Regel als Nachweis ihrer
  24. 24. I Einleitung 14 Anwesenheit beziehungsweise Abwesenheit. Eine Keimzahlbestimmung entfällt, da alle Salmonellen als pathogen gelten (Baumgart 2006). 1.3 Enterobacteriaceae als Markerorganismen Markerorganismen sind nachweisbare Mikroorganismen, die Hinweise auf gesundheitsgefährdende Kontaminationen geben können. Ihr Nachweis in Lebensmitteln ist ein wichtiges Werkzeug für die Qualitätskontrolle. Mossel (1982) definiert Markerorganismen als Index- und Indikatororganismen. Eine Unterscheidung, die nicht immer auf Zustimmung stößt. Demnach weisen Indexorganismen auf potenzielle Gesundheitsgefährdung durch Anwesenheit spezifischer Krankheitserreger hin. Indikatororganismen weisen Mängel in Prozessabläufen, wie beispielsweise unzureichende Desinfektion, nach. Dabei können die gleichen Markerorganismen je nach Art der Produkte einerseits Indexorganismen, andererseits Indikatororganismen und auch beides zugleich sein. Stadhouders et al. (1982) sind der Ansicht, dass eine Unterscheidung zwischen Index- und Indikatororganismen unzweckmäßig und in vielen Lebensmitteln gar nicht möglich ist. Am Beispiel von sprühgetrocknetem Milchpulver zeigen sie, dass hygienische Sicherheit am besten durch ständige Prüfungen der kritischen Prozessstufen, in denen Kontaminationen erfolgen können, erreichbar ist. Als Markerorganismen besonders geeignet sind Darmbakterien, da sie auf fäkale Verunreinigungen hinweisen. Der Nachweis von Escherichia coli als Marker für fäkale Kontaminationen von Trinkwasser wurde bereits vor rund 100 Jahren eingeführt und wird bis heute angewandt. In den 1920er Jahren wurde er durch den Nachweis von Coliformen ergänzt und bald darauf auch in Milch, zum Beispiel zur Kontrolle auf ausreichende Behandlung durch Pasteurisation, und anderen Lebensmitteln durchgeführt. Der Nachweis von Coliformen bei verarbeiteten Produkten erwies sich als geeigneter Hinweis auf Rekontaminationen und unzureichende Verarbeitungs-, Betriebs- und Distributionshygiene. Seit den 1950er Jahren wird der Nachweis der gesamten Enterobacteriaceae-Familie in der Lebensmittelkontrolle und Überprüfung von Produktionsabläufen oft bevorzugt, weil er mehr signifikante Lebensmittelkeime detektiert (Mossel und Struijk 1995). Neben Laktose positiven Coliformen werden auch Laktose negative pathogene Keime wie Stämme der Gattungen Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Proteus, Yersinia, Hafnia sowie Stämme von Escherichia coli, die sehr langsam Laktose fermentieren, erfasst. Da Coliforme weniger resistent gegenüber Behandlungsverfahren von Lebensmitteln, zum Beispiel Bestrahlung, milde Erhitzung, Gefrieren und Trocknen sind als einige pathogene Enterobacteriaceen wie Salmonellen, ist der Nachweis der gesamten Familie Enterobacteriaceae besser geeignet als der Coliformen-Nachweis (Mossel et
  25. 25. I Einleitung 15 al. 1979). Auch Rekontaminationen von Lebensmitteln erfolgen außer durch Coliforme auch durch andere Enterobacteriaceen wie Spezies der Gattung Serratia, die oftmals bei dem Verderb von Fleisch dominieren (Stiles und Ng 1980). Häufig kommt es zur Rekontamination durch Verschleppung von Keimen im Produktionsbereich. Diese können über ihre Anreicherung im Produkt oder Nebenprodukt weitere Bereiche des Produktionsumfeldes wie Anlagenteile, Geräte, Böden, Abwasser und Luft besiedeln. Werden derartige Keime nicht detektiert und vollständig inaktiviert, stellen sie potenzielle Rekontaminationsherde dar. Die ursprüngliche Kontamination mit Enterobacteriaceen kann durch fäkale Verunreinigungen entstehen, wobei die Fäkalien von an Infektionskrankheiten erkrankten Tieren oder Menschen oder Dauerausscheidern stammen können. Direkte Kontamination kann durch Produktionsabläufe wie Schlachtung und Zerlegung von Tierkörpern, Rohmilchgewinnung oder Aufschlagen von Schaleneiern, aber auch bei ungenügender Personen- und Händehygiene durch das Personal zustande kommen. Indirekte Kontamination erfolgt über Verarbeitungsgeräte wie Metzgermesser und Fleischerhaken nach ursprünglich direkter fäkaler Verunreinigung. Für eine Vielzahl von Lebensmitteln ist der Nachweis von Kontaminationen mit den artenreichen Enterobacteriaceen, vor allem im Hinblick auf deren Markerfunktion für Gesundheitsgefährdung, besonders geeignet. Er hat in der Verarbeitungs- und Betriebshygiene, idealerweise durchgeführt in Form von mehrfachen Stufenkontrollen, einen essenziellen Stellenwert (Schmidt-Lorenz und Spillmann 1988).
  26. 26. I Einleitung 16 2 PRAKTISCHER TEIL DETEKTION BAKTERIELLER KONTAMINATIONEN IN LEBENSMITTELN 2.1 Mikrobiologischer Nachweis von Enterobacteriaceen Klassische mikrobiologische Verfahren für die Identifizierung von Mikroorganismen in Lebensmitteln werden in selektiven oder unselektiven Kulturen in flüssigem Medium oder auf festen Nährböden durchgeführt. Sie kommen in sämtlichen Lebensmittelbereichen zur Anwendung und basieren auf dem Nachweis morphologischer und physiologischer Merkmale. Ist eine ausreichende Identifizierung der kultivierten Keime nicht möglich, wird in der Regel die Anwendung biochemischer Identifizierungssysteme angeschlossen. Der qualitative mikrobiologische Nachweis von Enterobacteriaceen erfolgt gemäß der analytischen Referenzmethode ISO 21528-1 in mehreren Schritten als unselektive Voranreicherung und selektive Anreicherung in flüssigem Medium, selektive Vereinzelung auf festen Nährböden und Auswertung der Agarplatten. Bei Bedarf erfolgt eine biochemische Bestätigung beziehungsweise Ausdifferenzierung. Der erste Schritt im qualitativen Nachweisverfahren, die Bebrütung der Lebensmittelprobe in unselektivem Nährmedium, dient der Resuszitation vorhandener Enterobacteriaceen vor der Überführung in Selektivmedien. Subletal geschädigten Zellen soll die Möglichkeit der Revitalisierung gegeben werden, damit auch diese im Nachweis erfasst werden können. Zu einer Schädigung der Bakterien kann es durch Wasserverlust, Nährstoffmangel, Hitze, Kälte, Gefrieren, ionisierende Strahlung, Chemikalien, Gefriertrocknung und osmotischen Stress kommen (Webb 1969, Colwell 2000). Derartige, nicht unmittelbar zum Zelltod führende Beeinträchtigungen, äußern sich durch verlängerte lag-Phasen, Verlust von Zellbestandteilen, insbesondere Nukleinsäuren, hohe Sensitivität gegenüber Selektivmedien und erhöhten Nährstoffbedarf der Mikroorganismen. Es ist bekannt, dass Enterobacteriaceen, die in getrockneten Lebensmitteln und Trockenfutter nachgewiesen wurden, erhebliche Stoffwechselschäden aufwiesen (Sinskey und Silverman 1970). Ihre Physiologie kann derartig beeinträchtigt sein, dass sie in Selektivmedien ihre Proliferation komplett einstellen, während unbeschädigte Bakterien gleicher Spezies die üblichen Inhibitoren im Medium problemlos tolerieren (Alford und Knight 1969). Kommt es für subletal geschädigte Bakterienzellen wieder
  27. 27. I Einleitung 17 zu geeigneten Lebensbedingungen, können sie regenerieren und die Proliferation wieder aufnehmen. So ist es für den qualitativen Markernachweis von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln, besonders in technologisch verarbeiteten, wichtig, diesen Schritt der Resuszitation durchzuführen, bevor die Probe in für die Bakteriengruppe selektives Nährmedium überführt wird. Nur bei mehrstündiger nichtselektiver Vorbebrütung, üblicherweise durchgeführt in CASO-Bouillon oder Pepton-Wasser, besteht die Möglichkeit, auch das Vorhandensein gestresster Zellen zu detektieren (Mossel und Ratto 1970, Schmidt-Lorenz und Spillmann 1988). Im nächsten Schritt erfolgt die selektive Anreicherung der Enterobacteriaceen aus Lebensmitteln innerhalb von ein bis zwei Tagen in Mossel-Bouillon (Mossel et al. 1963, Mossel und Martin 1964), einem Medium entsprechend der Eiprodukte- Verordnung (Anonymus 1975) und der European Pharmacopeia II. Durch Brillantgrün und Ochsengalle in der Mossel-Bouillon wird die unerwünschte Begleitflora weitgehend gehemmt, während das Wachstum aller Entreobacteriaceen durch den Glucose-Gehalt begünstigt wird. Die starke Pufferung des Nährmediums verhindert das Absinken des pH-Wertes und eine dadurch bedingte Wachstumshemmung der Kultur. Für die selektive Vereinzelung der Enterobacteriaceen im nächsten Schritt wird ein Oberflächenausstrich auf Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Glucose-Agar (VRBD-Agar) durchgeführt und mindestens einen Tag anaerob bebrütet. Agarplatten, auf denen nach einem Tag keine Kolonien gewachsen sind, werden ein bis zwei weitere Tage inkubiert, um die Abwesenheit von Enterobacteriaceae sicher zu stellen. Die Bebrütung unter anaeroben Bedingungen ist für das Wachstum der fakultativ anaeroben Enterobacteriaceen nicht notwendig, dient aber der Wachstumshemmung obligat aerober Keime in der Begleitflora, wie zum Beispiel Pseudomonaden. Aus dem ursprünglichen MacCONKEY-Agar (MacConkey 1905), einem Selektivmedium zur Isolierung von Salmonellen, Shigellen und coliformen Bakterien, entwickelten Mossel et al. (1962) VRBD-Agar für den Nachweis von Enterobacteriaceae. Sie ersetzten zunächst, dem Vorschlag von Henriksen (1955) folgend, die Laktose im MacCONKEY-Agar durch Mannitol, danach durch Glucose und schlugen für das Medium die Bezeichnung MacCONKEY-Glucose-Agar vor. Im Gegensatz zu Laktose und Mannitol wird Glucose von sämtlichen Enterobacteriaceen unter Säurebildung abgebaut. Kristallviolett und Gallensalze im VRBD-Agar hemmen weitgehend die Begleitflora. Säurebildung aus Glucose wird durch einen Farbumschlag der Kolonien nach Rot, eventuelle Ausfällung von Gallensäuren durch Bildung eines hellen Präzipitathofs um die positiven Kolonien angezeigt. Mit dieser Versuchsdurchführung sind alle Bakterien der Familie Enterobacteriacaea erfassbar. Der Auslesenährboden ist jedoch für sie nicht absolut spezifisch, da auch einige mitwachsende Begleitkeime, wie Aeromonas spp., die gleiche Reaktion zeigen können.
  28. 28. I Einleitung 18 Ist eine ausreichende Identifizierung der Kolonien nicht möglich, müssen entsprechende Keime biochemisch ausdifferenziert werden. Die Durchführung erfolgt zum Beispiel unter Anwendung von API® 20E, einem System zur Enterobacteriaceae- Diagnostik der Firma bioMérieux, oder auch mittels Cytochromoxidasetest. Enterobacteriaceen sind Oxidase-negativ. Zur Überprüfung der Oxidaseaktivität können Teststreifen mit Farbstoffindikator verwendet werden. Der Oxidasetest ist unzuverlässig, wenn er direkt auf den VRBD-Platten oder direkt mit Material von Kolonien, die auf VRBD-Agar gewachsen sind, durchgeführt wird. Die zu untersuchende Kolonie sollte vor dem Test auf ein Universalnährmedium überimpft und bebrütet werden (Baumgart 2006). Es sind kohlenhydratfreie Medien für die Subkultivierung zu wählen, da der Oxidasetest auf kohlenhydrathaltigen Nährböden wegen Säuerung des Mediums falsch negative Reaktionen zeigen kann (Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch). Der klassische mikrobiologische Nachweis von Enterobacteriaceae leistet nur eine eingeschränkte Spezifität. Bedingt durch eine hohe Begleitflora kann auch die Sensitivität des Verfahrens wesentlich verringert werden, wenn überwachsende Begleitkeime das Wachstum der Enterobacteriaceen hemmen. In diesem Fall kann es zu falsch negativen Ergebnissen in mikrobiologischen Untersuchungen kommen. 2.2 Molekularbiologischer Bakterien-Nachweis mittels PCR Der mikrobiologische Nachweis von Bakterien und anderen Mikroorganismen in Lebensmitteln basiert auf der Gesamtheit eines Organismus und seiner physiologischen Merkmale. Neben diesem konventionellen phänotypischen Nachweis wurden in den vergangenen Jahren vermehrt molekularbiologische Methoden für den genotypischen Nachweis bakterieller Kontaminationen durch Detektion spezifischer Nukleinsäuren entwickelt. Im Vergleich zu klassischen Verfahren handelt es sich hierbei um schnellere Methoden, deren Durchführung nicht vom Wachstumsstadium der Mikrorganismen oder Umwelteinflüssen abhängig ist. Es werden auch molekularbiologische mit mikrobiologischen Methoden kombiniert, indem vor der Detektion eine kulturelle Anreicherung erfolgt (Blackburn 1993, Olsen et al. 1995, Feng 1997). Neben der Anwendung im klinischen und ökologischen Bereich wird ebenso im Lebensmittelsektor der Nachweis bakterieller DNA- und RNA-Moleküle heute weit verbreitet durchgeführt. Die Detektion diverser enterobakterieller Spezies erfolgt bereits über den Nachweis ihrer DNA (Feng 2001). Als besonders geeignet werden häufig DNA-Sequenzen der für ribosomale RNA kodierenden Gene bevorzugt, die universell und vielfach in der
  29. 29. I Einleitung 19 Zelle vorhanden sind (Ward et al. 1990, Wilson et al. 1990). Die hohe Spezifität und Sensitivität dieser Nachweisverfahren sowie ein großes Potential zur Automatisierbarkeit sind entscheidende Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden, die innerhalb der letzten zwei Jahrzehnte eine intensive Forschung vorangetrieben haben. Für den Nachweis von Bakterien in Lebensmitteln stehen heute molekularbiologische Verfahren im Vordergrund (Mozola 2006, Seo et al. 2006). Das sensitivste und am häufigsten eingesetzte Verfahren zur Detektion von Nukleinsäuren ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Selbst geringste Mengen vorhandener DNA-Moleküle werden mit dieser Methode durch wiederholte selektive Vervielfältigung nachweisbar amplifiziert. Kornberg und seine Mitarbeiter entdeckten 1955 das zelluläre Enzym DNA-Polymerase als Katalysator der DNA-Replikation und führten Versuche zur Synthese viraler DNA mittels DNA-Polymerase durch (Goulian und Kornberg 1967, Mullis 1990). Anfang der 1970er Jahre postulierten Panet und Khorana (1974) aufgrund ihrer Forschung zur DNA-Replikation die Möglichkeit, dass sich dieser Prozess auch in mehreren Zyklen wiederholen ließe. Das Verfahren der PCR als vielfache Amplifikation doppelsträngiger DNA in vitro mittels DNA- Polymerase wurde schließlich 1983 von Mullis et al. (1986) begründet. Wesentlich vereinfacht wurde die Durchführung der PCR, als man die aus Escherichia coli isolierte DNA-Polymerase durch die thermostabile Taq Polymerase aus Thermus aquaticus ersetzte (Saiki et al. 1988). Das Prinzip der PCR basiert auf der enzymatischen Amplifikation eines DNA- Bereichs, der von zwei Oligonukleotiden (Primer) flankiert wird, die jeweils am Ende der zu amplifizierenden DNA-Sequenz komplementär binden. Die zyklisch verlaufende Reaktion wird in einem so genannten Cycler durchgeführt und besteht in der Regel aus drei Phasen mit unterschiedlichen Temperaturen. In der ersten Phase werden die Wasserstoffbrückenbindungen der doppelsträngigen DNA durch Temperaturerhöhung aufgebrochen, um sie in Einzelstränge zu trennen (Denaturierung). In der nächsten Phase wird die Temperatur abgesenkt und es kommt unter Bildung von Basenpaaren zur Hybridisierung der Primer an die komplementären Sequenzen der DNA (Annealing). Eine stabile Bindung der Primer ist Voraussetzung für die Initiation der Polymerisation. In der dritten Phase wird die Temperatur wieder erhöht, unspezifisch angelagerte Primer werden denaturiert. Die DNA-Polymerase katalysiert nun, ausgehend vom 3’-Ende der gebundenen Primer, den selektiven Einbau freier Nukleotide aus dem Reaktionsansatz komplementär zur DNA-Matrize (Elongation). Jedes neu synthetisierte DNA-Fragment dient dann als Matrize für den nächsten PCR-Zyklus. Durch beliebiges Wiederholen dieses drei- Phasen-Zyklus lässt sich mit jedem Durchgang die Anzahl der Zielmoleküle verdoppeln, solange ausreichend Primer und Nukleotide für die DNA-Amplifikation
  30. 30. I Einleitung 20 zur Verfügung stehen. Nach 20 Zyklen entstehen auf diese Weise von einem einzigen DNA-Doppelstrang theoretisch etwa eine Million Kopien. Damit können durch Anwendung der PCR geringste Ausgangsmengen, bis hin zu nur einem einzigen Molekül, vorhandener DNA detektiert werden. Der Nachweis der entstandenen DNA-Amplifikate kann mit Durchführung einer Gelelektrophorese erfolgen. Aufgrund ihrer negativ geladenen Phosphatgruppen lässt sich DNA im Agarosegel durch Anlegen elektrischer Spannung ihrer Größe nach auftrennen. Während der Elektrophorese wird neben den zu untersuchenden Proben ein Molekulargewichtsstandard mitgeführt. Die Visualisierung der DNA erfolgt mit interkalierenden Fluoreszenz-Farbstoffen wie Ethidiumbromid unter UV-Licht. Im Vergleich mit den Banden des Standards oder einer parallel durchgeführten konkurrierenden PCR (kompetitive PCR) mit bekannter DNA-Ausgangsmenge werden Größe und Menge der in der PCR amplifizierten DNA abgeschätzt. Eine bedeutende Weiterentwicklung dieser Anwendungen mit wesentlich reduziertem Zeitaufwand ist die Durchführung einer Real-Time-PCR (Higuchi et al. 1992). Bei diesem Verfahren finden Reaktion und Detektion der Amplifikate im selben Reaktionsansatz statt. Während der Amplifikation binden unspezifische fluoreszierende Farbstoffe wie SYBR® Green I oder sequenzspezifische, mit fluoreszierendem Farbstoff modifizierte Moleküle (Sonden) komplementärer Sequenz an die DNA und werden gleichzeitig detektiert. Die entstehende DNA wird in Echtzeit als in der Intensität steigendes Fluoreszenzsignal, in Relation zur Ausgangsmenge, ermittelt und online dokumentiert. Eine Möglichkeit zur spezifischen Detektion von Amplifikaten ist die Durchführung der Real-Time-PCR mit HybProbes (Hybridisierungssonden) der Firma Roche. HybProbes sind Oligonukleotide, die nebeneinander mit einem mittleren Bereich der Template-DNA zwischen den Bindungsstellen der Primer hybridisieren. Sie tragen an den benachbarten Enden zwei Fluorophore, die über Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) miteinander interagieren können. Dabei überträgt der kurzwelligere Farbstoff Fluorescein, der mittels blauem Licht angeregt wird, seine Energie strahlungslos an den langwelligeren Farbstoff LCRed. Dieser gibt nach Anregung ein höher welliges rotes Licht ab, das detektiert wird. Das Signal kommt also nur zustande, wenn beide Sonden in räumlicher Nähe binden. Die Signalfluoreszenz ist proportional zur Menge der vorliegenden Zielsequenz. Die Reaktion wird in einem LightCycler® durchgeführt und mit entsprechender Software zeitgleich dokumentiert. Der Eintritt der Amplifikation in die exponentielle Phase wird als „Crossing Point“ dargestellt. Der Schmelzpunkt der Sonden lässt sich durch eine Schmelzkurvenanalyse ermitteln, indem nach der PCR die Temperatur unter stetiger Messung der Fluoreszenz erhöht wird. Mit steigender Temperatur nimmt die
  31. 31. I Einleitung 21 Fluoreszenz ab. Die gemessene Schmelztemperatur Tm ist der Wert, bei dem gebundene und abgeschmolzene Hybridisierungssonden miteinander im Gleichgewicht stehen. Differente Tm-Werte stehen demnach für unterschiedlich starke Bindungen zwischen verschiedenen Amplifikaten und Sonden. Eine hohe Sequenzübereinstimmung führt zu einer stabileren Bindung und damit zu einem höheren Tm-Wert. 2.2.1 Aspekte der PCR Die PCR ist eine hoch sensible Technik, deren Effizienz von diversen Faktoren beeinflusst wird. Mögliche Ursachen für eine Inhibition der PCR wurden mit unzureichender Zelllyse zur Extraktion der DNA, Degradieren der Nukleinsäuren oder Blockieren der Polymerase-Aktivität beschrieben (Wilson 1997). Das Zyklusprofil der PCR, die Reaktionskomponenten sowie deren Konzentration, die Qualität der nachzuweisenden DNA, die Beschaffenheit der Probenmatrix und die ausgewählten Primer sind entscheidene Faktoren für die Durchführung der Reaktion. Alle Komponenten müssen jeweils für einen optimalen Ablauf der PCR angepasst werden, um einen möglichst sensitiven und spezifischen Nachweis zu ermöglichen (Rossen et al. 1992). Eine stabile Bindung der Primer an die zu amplifizierende DNA ist Voraussetzung für die Spezifität des Systems. Die Primersequenz sollte demnach eine hohe komplementäre Übereinstimmung mit der Ziel-DNA aufweisen, um die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Bindung an anderen DNA-Abschnitten zu verringern. Nicht spezifische Primer reduzieren, wenn sie in der PCR verlängert werden, nicht nur die Anzahl der Primer, die für die Amplifikation der Ziel-DNA zur Verfügung stehen, sondern begünstigen auch die Entstehung von Artefakten sowie falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen (Kwok et al. 1990, Newton und Graham 1994). Durch Erhöhung der Annealingtemperatur lässt sich die Stringenz der PCR erhöhen und die Wahrscheinlichkeit der Entstehung von „primer-template mismatches“ reduzierern (Bej et al. 1990). Auch das Vorhandensein großer Mengen unspezifischer DNA kann die Spezifität herabsetzen und zu falsch negativen Resultaten führen (Abbott et al. 1988, Rossen et al. 1992). Derartige Beeinträchtigungen können entstehen, wenn Bakterien taxonomischer Gruppen, die mit dem PCR-System nicht nachgewiesen werden sollen, im Überschuss gegenüber den nachzuweisenden Bakterien in der Probe vorhanden sind. In Lebensmitteln können Polysaccharide, Fette und Proteine zur Inhibition der PCR führen und erfordern mitunter eine Purifikation der DNA über Silikasäulen vor Durchführung der Reaktion. In vielen Fällen können Inhibitionen der
  32. 32. I Einleitung 22 PCR durch Zugabe unterstützender Reagenzien verringert werden. Die DNA- Präparation kann unter Zugabe des Ionenaustauschers Chelex® 100 durchgeführt werden, um die Zelllyse zu begünstigen und die Degradierung der DNA in Gegenwart von Metallionen bei hohen Temperaturen zu verhindern (Walsh et al. 1991, de Lamballerie et al. 1992). Als besonders wirkungsvoller Zusatz der PCR hat sich Rinderserumalbumin (BSA) erwiesen, durch das Inhibitoren gebunden werden und die Anlagerung der DNA-Polymerase an die DNA stabilisiert wird. Es wurde gezeigt, dass sowohl Substanzen mit phenolischen Gruppen, als auch Lipide und Anionen durch BSA gebunden werden (Kreader 1996, Forbes und Hicks 1996). Die inhibitorische Wirkung auf DNA-Polymerasen durch Proteinasen in Milch konnte durch Zugabe von BSA unterbunden werden (Powell et al. 1994, Abu Al-Soud und Rådström 2000). Um durch Inhibition bedingte falsch negative Ergebnisse zu vermeiden, empfiehlt es sich, als Indikator für die Effizienz der Reaktion, in jedem PCR-Ansatz eine Interne Amplifikationskontrolle (IAK) mitzuführen (Ursi et al. 1992, Ballagi-Pordany und Belak 1996). Dabei handelt es sich um eine Kontroll-DNA, die in einer definierten Menge der PCR-Reaktion zugegeben und zeitgleich mit der zu detektierenden DNA kopiert wird. Entsteht in der PCR kein spezifisches Amplifikat der gesuchten DNA, kann durch die Amplifikation der Kontroll-DNA die grundsätzliche Funktionalität der Reaktion belegt werden. Ein falsch negatives Ergebnis kann somit ausgeschlossen werden. Idealerweise werden die zu detektierende DNA und die Kontroll-DNA von Primern mit derselben Sequenz amplifiziert, so dass sie in einer kompetitiven PCR um das gleiche Primerpaaar konkurrieren (Rosenstraus et al. 1998, Courtney et al. 1999). Bei Anwendung einer Real-Time-PCR mit markierten Sonden lassen sich die Amplifikate der nachzuweisenden DNA und der Kontroll-DNA unterscheidbar detektieren, wenn die jeweiligen Sonden mit Farbstoffen verschiedener Emmissionsfluoreszenz modifiziert wurden (Elenitoba-Johnson et al. 2001). Mit der besonders hohen Sensitivität der PCR geht eine große Anfälligkeit für Kontaminationen einher. Bei allen Schritten der praktischen Durchführung einer diagnostischen PCR müssen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationen und daraus resultierenden falsch positiven Ergebnissen angewendet werden. Kwok und Higuchi (1989) beschreiben die strikte räumliche Trennung aller Arbeitsschritte. Arbeiten mit Nukleinsäuren, wie die Probenaufarbeitung, werden von denen ohne Nukleinsäuren, wie die Herstellung von Reaktionslösungen, in getrennten Laboren durchgeführt. Alle Reagenzien sollten in möglichst geringe Mengen aliquotiert werden. Erst unmittelbar vor dem Start der Reaktion wird die DNA zum Ansatz gegeben. Sämtliche Materialien und Arbeitsräume sollten, soweit möglich, zur Dekontamination mit UV-Licht bestrahlt werden (Sarkar und Sommer 1993).
  33. 33. I Einleitung 23 Besonders leicht kann es durch die Anwesenheit von Amplifikaten vorangegangener PCR-Reaktionen zu Kreuzkontaminationen kommen. Um diese Kontaminationen zu vermeiden, kann ein enzymatischer Verdau vorhandener Amplifikate im Reaktionsansatz mit Uracil-DNA-N-Glycosylase (UNG) erfolgen. Durch den UNG- Verdau werden Amplifikate vorangegangener PCR-Reaktionen gespalten und dienen der DNA-Polymerase nicht mehr als Matrize. Voraussetzung ist, dass in jeder PCR dTTP durch dUTP ersetzt wird, wodurch es während der DNA-Synthese zum Einbau von Uracil statt Thymin kommt. UNG hydrolysiert selektiv Uracil-glycosidische Bindungen, während sie gegenüber nativer thyminhaltiger DNA inaktiv ist (Longo et al. 1990, Rys und Persing 1993). Durch Anwendung der PCR wird sowohl von lebenden als auch von toten Bakterienzellen die DNA nachgewiesen. Ein positives Signal sagt also nichts über die Lebensfähigkeit der Zielorganismen aus. Ist in der Probe ausschließlich DNA toter Zellen vorhanden, kann dies zu einem falsch positiven Ergebnis führen. Die Möglichkeit, tote Bakterienzellen nachzuweisen, kann aber auch zu wichtigen Informationen über den hygienischen Zustand der Untersuchungsprobe führen. Im Gegensatz zu klassischen mikrobiologischen Kultivierungsmethoden werden durch Anwendung der PCR auch Bakterien im „viable but nonculturable“ Stadium nachgewiesen. Ein der Umgebung angepasster Zustand in Stresssituationen durch Nährstoffmangel, niedrige Temperaturen oder ähnliches, in dem sich auch Bakterien befinden können, von denen eine erhebliche gesundheitliche Gefährdung ausgeht, sobald sie günstigere Lebensbedingungen vorfinden (Roszak und Colwell 1987, McKay 1992, Makino et al. 2000). Für Gattungen der Familie Enterobacteriaceae, wie Escherichia (Xu et al. 1982), Salmonella (Roszak et al. 1984) und Shigella (Colwell et al. 1985, Rahman et al. 1996), wurde dieses Phänomen beschrieben. Byrd et al. (1991), die den Zustand auch für Klebsiella pneumoniae und Enterobacter aerogenes beschreiben, warnen davor, dass eine Detektion der Bakterien allein mit kulturellen Methoden nicht gewährleistet ist. Selbst nach dem Pasteurisieren können sich in Milch noch Escherichia coli im „viable but nonculturable“ Stadium befinden (Binderova und Rysanek 1999, Gunasekera et al. 2002). Entwicklung und Fortschritt der PCR-Technologie ermöglichen im Bereich der Lebensmittelhygiene und -überwachung den genotypischen Nachweis bakterieller Kontaminationen durch Detektion spezifischer Nukleinsäuren. Vergleichende Untersuchungen konventioneller mikrobiologischer Verfahren zum Nachweis lebensmittelassoziierter Bakterien mit denen der PCR belegen deutlich die höhere Nachweisrate der PCR (Swaminathan und Feng 1994, Allmann et al 1995). Während herkömmliche Methoden in ihrer Durchführung sehr zeitaufwändig und arbeitsintensiv sind, werden PCR-Techniken als schnelle und zuverlässige
  34. 34. I Einleitung 24 Alternative mit hoher Spezifität meist bevorzugt und kontinuierlich weiterentwickelt (Hill 1996, Naravaneni und Jamil 2005). Für den Nachweis von Bakterien in Lebensmitteln entwickelte PCR-Systeme müssen auf ihre Tauglichkeit im Vergleich zu konventionellen Methoden geprüft und mit Lebensmitteln validiert werden. Wenn jedoch Standardprotokolle und Validierungen nicht gegeben sind und die Qualität von PCR-Reagenzien und Geräten unbeständig ist, kann keine Weitergabe entwickelter PCR-Nachweismethoden vom Forschungslabor zum diagnostischen Routinelabor des Anwenders erfolgen. Von Seiten der Lebensmittelindustrie wird aber ein offiziell zugelassener Standard verlangt. Um dieser Situation gerecht zu werden, begründete die Kommission der Europäischen Union 1999 das Forschungsvorhaben „Food-PCR“, ein Projekt zur Validierung und Standardisierung diagnostischer PCR-Methoden für den Nachweis pathogener Bakterien in Lebensmitteln (Malorny et al. 2003). In der Bundesrepublik Deutschland ist das Deutsche Institut für Normung (DIN) in Zusammenarbeit mit dem Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) für die Standardisierung molekularbiologischer Methoden wie der PCR verantwortlich. Auf internationaler Ebene werden diese Aufgaben vom Europäischen Komitee für Normung (CEN) und von der Internationalen Organisation für Standardisierung (ISO) übernommen. 2.3 Zielsetzung der Arbeit Im Rahmen dieser Arbeit soll ein molekularbiologisches System für die Detektion von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae entwickelt werden. Der spezifische Indikatornachweis soll mittels Real-Time-PCR erfolgen und für die Untersuchung von Lebensmitteln auf das Vorhandensein von Enterobacteriaceen anwendbar sein. Für die Durchführung sind folgende Arbeitsschritte geplant: • Ermitteln geeigneter DNA-Sequenzen innerhalb des für ribosomale RNA (rRNA) kodierenden Bereichs von Enterobacteriaceae-Spezies und Generieren von Oligonukleotiden als Primer und Sonden für die PCR. Hierfür werden die entsprechenden DNA-Sequenzen verschiedener Enterobacteriaceae-Stämme sowie anderer, nicht nachzuweisender Eubakterien-Stämme im Alignment vergleichend dargestellt. Anhand der Daten werden mögliche Primer- und Sondensequenzen abgeleitet. • Entwicklung eines Real-Time-PCR-Systems. Die generierten Primer und Sonden, alle weiteren PCR-Komponenten und entsprechende Zyklusprofile werden in der PCR getestet. Mit dem Ziel, möglichst viele lebensmittelrelevante
  35. 35. I Einleitung 25 Enterobacteriaceae-Spezies mit hoher Sensitivität zu amplifizieren, aber andere Eubakterien nicht zu erfassen, werden die Komponenten und Reaktionsbedingungen entsprechend modifiziert und optimiert. • Etablierung eines Verfahrens zur Dekontamination rekombinanter DNA- Polymerasen, falls es zur Amplifikation von Enzymkontaminationen kommt. Da rekombinante Polymerasen in Escherichia coli synthetisiert werden und über eine ausgeprägte Affinität gegenüber DNA verfügen, können sich Spuren amplifizierbarer Nukleinsäuren in der Polymerase und dem Lagerpuffer befinden. Diese würden durch das zu entwickelnde Enterobacteriaceae-Nachweissystem in der PCR amplifiziert werden und könnten zu falsch positiven Ergebnissen führen. In diesem Fall muss eine zuverlässige Dekontamination der eingesetzten DNA- Polymerasen erreicht werden. • Überprüfung der Spezifität des entwickelten Systems, indem die Nachweisbarkeit der lebensmittelrelevanten Enterobacteriaceae getestet wird (Inklusivität). Ebenso werden diverse Spezies anderer Bakterientaxa, die mit dem System nicht erfasst werden sollen, in der Real-Time-PCR überprüft (Exklusivität). • Entwicklung einer Internen Amplifikationskontrolle mit spezifischer Sonde für die Überprüfung der Negativ-Ergebnisse. Durch Coamplifikation von Kontroll-DNA und Probe, idealerweise durchgeführt als kompetitive PCR mit den gleichen Primern, werden falsch negative Ergebnisse ausgeschlossen. • Nachweis der Sensitivität des Detektionssystems. Definierte Zellzahlen verschiedener Enterobacteriaceen sowie deren quantifizierte genomische DNA werden hinsichtlich ihrer Nachweisgrenzen getestet. • Vergleichende Überprüfung des PCR-Systems, insbesondere unter dem Aspekt einer schnellen, spezifischen und sensitiven Detektion, gegenüber klassischen mikrobiologischen Tests auf Abwesenheit beziehungsweise Anwesenheit von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln. Zu diesem Zweck werden von identischem Ausgangsmaterial diverser Lebensmittelproben Anreicherungen durchgeführt und auf das Vorhandensein von Enterobacteriaceae sowohl durch Ösenausstrich auf Selektiv-Agar als auch durch Amplifikation ihrer DNA mit dem entwickelten Real- Time-PCR-System überprüft.
  36. 36. II Material und Methoden 26 II MATERIAL UND METHODEN 1 MATERIAL 1.1 Bakterienstämme Tab. 2.1: Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitäts- und Sensitivitätstests Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm 1 Budvicia aquatica DSM 5075 35 Kluyvera cryocrescens DSM 4588 2 Buttiauxella agrestis DSM 4586 36 Leclercia adecarboxylata DSM 5077 3 Cedecea davisae DSM 4568 37 Moellerella wisconsensis DSM 5076 4 Citrobacter amalonaticus DSM 4593 38 Morganella morganii DSM 30164 5 Citrobacter braakii DSM 30040 39 Pantoea agglomerans BCD 2151 6 Citrobacter diversus BCD 5366 40 Pantoea ananatis DSM 30070 7 Citrobacter freundii BCD 5893 41 Pantoea dispersa DSM 30073 8 Citrobacter koseri DSM 4595 42 Photorhabdus luminescens DSM 3368 9 Edwardsiella tarda DSM 30052 43 Plesiomonas shigelloides DSM 8224 10 Enterobacter aerogenes DSM 30053 44 Proteus mirabilis DSM 788 11 Enterobacter agglomerans BCD 8600 45 Proteus vulgaris BCD 915 12 Enterobacter amnigenus DSM 4486 46 Providencia alcalifaciens DSM 30120 13 Enterobacter cloacae ssp. cloacae DSM 30054 47 Providencia rettgeri DSM 1131 14 Enterobacter gergoviae BCD 511 48 Providencia stuartii DSM 4539 15 Enterobacter intermedius DSM 45481 49 Rahnella aquatilis DSM 4594 16 Enterobacter sakazakii DSM 4485 50 Raoultella planticola DSM 4617 17 Enterobacter sakazakii ATCC 51329 51 Raoultella terrigena DSM 2687 18 Erwinia carotovora DSM 30168 52 Salmonella Abony DSM 4224 19 Erwinia chrysanthemi DSM 4610 53 Salmonella Senftenberg BCD 6173 20 Erwinia mallotivora DSM 4565 54 Salmonella Typhimurium BCD 14285 21 Escherichia blattae NCTC 12127 55 Serratia ficaria DSM 4569 22 Escherichia coli DSM 30083 56 Serratia grimesii DSM 30063 23 Escherichia coli DSM 1576 57 Serratia liquefaciens BCD 676
  37. 37. II Material und Methoden 27 Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm 24 Escherichia coli EHEC BCD 7856 58 Serratia marcescens DSM 1636 25 Escherichia hermanii DSM 4560 59 Serratia plymuthica DSM 49 26 Escherichia hermanii BCD 8467 60 Serratia proteamaculans BCD 8916 27 Escherichia vulneris DSM 4564 61 Serratia rubidaea DSM 4480 28 Ewingella americana DSM 4580 62 Shigella boydii DSM 7532 29 Hafnia alvei DSM 30163 63 Shigella sonnei BCD 4301 30 Klebsiella oxytoca DSM 5175 64 Xenorhabdus beddingii DSM 4764 31 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 65 Yersinia enterocolitica ssp. enterocolitica DSM 4780 32 Klebsiella pneumoniae ssp. pneumoniae DSM 2026 66 Yersinia pseudotuberculosis DSM 8992 33 Klebsiella terrigena DSM 2687 67 Yokenella regensburgei DSM 5079 34 Kluyvera ascorbata DSM 4611 Tab. 2.2: Nicht-Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitätstests Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm 1 Acetobacter aceti DSM 3508 26 Gluconobacter oxydans DSM 7145 2 Achromobacter spec. BCD 1193 27 Haemophilus influenzae DSM 4690 3 Acinetobacter baumanii BCD 10388 28 Helicobacter pylori DSM 4867 4 Acinetobacter calcoaceticus BCD 1209 29 Listeria monocytogenes ATCC 19118 5 Aeromonas caviae DSM 7323 30 Megasphaera cerevisiae DSM 20462 6 Aeromonas enteropelogenes DSM 6394 31 Moraxella catarrhalis DSM 9143 7 Aeromonas hydrophila ssp. anaerogenes DSM 30188 32 Pasteurella pneumotropica BCD 2891 8 Aeromonas hydrophila ssp. hydrophila DSM 6173 33 Photobacterium phosphoreum BCD 5162 9 Aeromonas media DSM 4881 34 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 10 Aeromonas sobria ATCC 43979 35 Pseudomonas aeruginosa DSM 1128 11 Alcaligenes spec. DSM 2625 36 Pseudomonas stutzeri DSM 5190 12 Bacillus cereus BCD 8832 37 Psychrobacter immobilis DSM 7229 13 Brevundimonas vesicularis DSM 7226 38 Ralstonia pickettii DSM 6297 14 Burkholderia cepacia DSM 7288 39 Sphingobacterium multivorum DSM 6175 15 Burkholderia cepacia BCD 3134 40 Sphingomonas paucimobilis DSM 1098
  38. 38. II Material und Methoden 28 Nr. Spezies Stamm Nr. Spezies Stamm 16 Campylobacter fetus DSM 5361 41 Staphylococcus aureus DSM 20231 17 Campylobacter jejuni BCD 15108 42 Vibrio alginolyticus DSM 2171 18 Chromobacterium violaceum DSM 30191 43 Vibrio fischeri DSM 5075 19 Clostridium perfringens BCD 8799 44 Vibrio fluvialis ATCC 33809 20 Clostridium tyrobutyricum DSM 663 45 Vibrio harveyi DSM 6904 21 Comamonas acidovorans DSM 39 46 Vibrio parahaemolyticus DSM 10027 22 Comamonas testosteroni DSM 1622 47 Vibrio proteolyticus DSM 30189 23 Enterococcus faecalis DSM 20478 48 Vibrio vulnificus DSM 10143 24 Flavobacterium resinovorum DSM 7478 49 Xanthomonas maltophila BCD 4273 25 Flavobacterium spec. BCD 2539 50 Zymomonas mobilis BCD 5724 Escherichia coli-Stamm für die Transformation XL1-blue: recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rk- mk+), supE44, relA1, lac, [F´ proAB, lacIq Z∆M15 Tn10 (Tetr )] (Fa. Stratagene, Kat. Nr. #200236). 1.2 Nährmedien Alle Nährmedien wurden, soweit nicht anders angegeben, 15 min bei 121 °C autoklaviert. CASO-Bouillon (Merck Kat. Nr. 1.05459) 17,0 g/l Pepton aus Casein 3,0 g/l Pepton aus Sojamehl 2,5 g/l D(+)-Glukose 5,0 g/l NaCl 2,5 g/l K2HPO4 pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C CASO-Agar (Merck Kat. Nr. 1.05458) 15,0 g/l Pepton aus Casein 5,0 g/l Pepton aus Sojamehl 5,0 g/l NaCl 15,0 g/l Agar-Agar pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C
  39. 39. II Material und Methoden 29 1.3 Reagenzien Zur Herstellung der Lösungen und Puffer wurden ausschließlich Chemikalien des Reinheitsgrades p. a. verwendet, welche von den Firmen Merck, Roche Diagnostics und Sigma bezogen wurden. LB-Medium (Sambrook et al. 1989) 10,0 g/l Bacto Trypton 5,0 g/l Hefeextrakt 5,0 g/l NaCl 15,0 g/l Agar-Agar (Zusatz optional) pH 7,0 ± 0,2 bei 25 °C Supplement (zur Analyse nach Transformation) 100 µg/ml Ampicillin 80 µg/ml X-Gal 0,5 mM IPTG Meerwasser-Bouillon 10,0 g/l Fleischextrakt 10,0 g/l Pepton 21,1 g/l NaCl 0,58 g/l KCl 1,2 g/l CaCl2 · 2 H2O 3,6 g/l MgCl2 · 6 H2O 0,08 g/l NaHCO3 2,63 g/l MgSO4 · 7 H2O pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C SOC-Medium (Sambrook et al. 1989) 20,0 g/l Bacto Trypton 5,0 g/l Hefeextrakt 0,5 g/l NaCl Vor Gebrauch zugeben: 10 mM MgCl2, sterilfiltriert 10 mM MgSO4, sterilfiltriert 20 mM Glucose, sterilfiltriert pH 7,0 ± 0,2 bei 25 °C MOSSEL-Bouillon (Merck Kat. Nr. 1.05394) 10,0 g/l Peptone 5,0 g/l D(+)-Glukose 20,0 g/l Ochsengalle, getrocknet 0,015 g/l Brillantgrün 8,0 g/l Na2HPO4 2,0 g/l KH2PO4 pH 7,2 ± 0,2 bei 25 °C Schonend autoklavieren, 5 min bei 121 °C. VRBD-Agar nach MOSSEL (Merck Kat. Nr. 1.10275) 7,0 g/l Pepton aus Fleisch 3,0 g/l Hefeextrakt 5,0 g/l NaCl 10,0 g/l D(+)-Glukose 1,5 g/l Gallesalzmischung 0,03 g/l Neutralrot 0,002 g/l Kristallviolett 13,0 g/l Agar-Agar pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C Unter ständigem Rühren kochen bis zum vollständigen Lösen, nicht autoklavieren. 1x TE-Puffer 1x TBE-Puffer 10 mM Tris-HCl 90 mM Tris-Borat 1 mM EDTA 2 mM EDTA pH 8,0 pH 8,3
  40. 40. II Material und Methoden 30 api® 20 E (Fa. bioMérieux, Kat. Nr. 20100) Anaerotest® (Fa. Merck, Kat. Nr. 1.15112.0001) Anaerocult® A (Fa. Merck, Kat. Nr. 1.13829.0001) Oxidase Teststreifen (Fa. Biotest, Kat. Nr. 934260) DNA-Längenstandards DNA-Längenstandard VI (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 11062590001) Größe in bp: 2176, 1766, 1230, 1033, 653, 517, 453, 394, 298, 234, 220, 154. DNA-Längenstandard 1 kb (Fa. Applichem, Kat. Nr. A5207) Größe in bp: 10.000, 8.000, 6.000, 5.000, 4.000, 3.000 x 2, 2.500, 2.000, 1.500, 1.000 x 2, 750, 500, 250. DNA-Längenstandard 100 bp (Fa. Applichem, Kat. Nr. A5191) Größe in bp: 1000, 900, 800, 700, 600, 500 x 2, 400, 300, 200, 100. HSTE-Puffer 1x PBS-Puffer 10 mM Tris-HCl 137 mM NaCl 0,5 mM EDTA 2,7 mM KCl 0,01 g/l Heringssperma-DNA 4,3 mM Na2HPO4 1,4 mM KH2PO4 pH 7,3 Ladepuffer für Agarosegele 0,25 % (w/w) Bromphenolblau 0,25 % (w/w) Xylencyanol FF 30,0 % (w/w) Glycerin
  41. 41. II Material und Methoden 31 1.4 Enzyme Alle Enzyme wurden mit den dazugehörigen 10x Reaktionspuffern eingesetzt. Taq-DNA-Polymerasen Perpetual Taq DNA Polymerase mit monoklonalem anti-Taq Antikörper (Fa. Roboklon GmbH, Kat. Nr. E2700-01) HotStarTaq™ DNA Polymerase (Kit, Fa. Qiagen, Kat. Nr. 203203) FastStart Taq DNA Polymerase (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 12158264001) Taq DNA Polymerase (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 11146165001) LightCycler® -FastStart DNA Master Hybridization Probes (Kit, Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 03003248001) Restriktionsendonukleasen Aci I (Fa. New England BioLabs® Inc., Kat. Nr. R0551S) HpyCH4 IV, Isoschizomer: Mae II (Fa. New England BioLabs® Inc., Kat. Nr. R0619S) Mse I (Fa. New England BioLabs® Inc., Kat. Nr. R0525S) Desoxyribonuklease DNase I (Kit, Fa. Sigma, Kat. Nr. AMP-D1) Uracil-DNA-Glycosylase LightCycler® Uracil-DNA-Glycosylase (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 3 539 806)
  42. 42. II Material und Methoden 32 1.5 Reaktionskits QIAquick Gel Extraction Kit (Fa. QIAGEN, Kat. Nr. 28704) QIAprep Spin Miniprep Kit (Fa. QIAGEN, Kat. Nr. 27104) High Pure PCR Template Preparation Kit (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 11796828001) ShortPrep foodproof II Kit (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 03358062001) pGEM® -T Vector System I (Fa. Promega, Kat. Nr. A3600) PicoGreen® dsDNA Quantitation Kit (Fa. Invitrogen, Kat. Nr. P-7589) 1.6 Primer und Sonden Die Synthese der eingesetzten Primer erfolgte durch die Firma MWG Biotech. Die mit LCRed 640 beziehungsweise LCRed 705 am 5’-Ende oder Fluorescein am 3’- Ende markierten Sonden wurden von der Metabion GmbH synthetisiert. Die Buchstaben R, K, V und H stehen für Basengemische: R = A + G, K = G + T, V = A + G + C, H = A + C + T. Tab. 2.3: Generierte Primer und Sonden mit Bindungsstellen innerhalb des DNA- Bereichs für 23S rRNA – Spacer – 5S rRNA im ribosomalen Operon Name Länge/Markierung Zielregion Funktion fw 1.1 20 mer 23S-Gen forward-Primer fw 1.2 20 mer 23S-Gen forward-Primer fw 1.3 20 mer 23S-Gen forward-Primer fw 1.4 20 mer 23S-Gen forward-Primer fw 1 II.1 18 mer 23S-Gen forward-Primer fw 1 II.2 18 mer 23S-Gen forward-Primer fw 1 II.3 18 mer 23S-Gen forward-Primer fw 2.1 23 mer 23S-Gen forward-Primer fw 2.2 23 mer 23S-Gen forward-Primer
  43. 43. II Material und Methoden 33 Name Länge/Markierung Zielregion Funktion fw 3.1 17 mer 5S-Gen forward-Primer fw 3.2 17 mer 5S-Gen forward-Primer fw 4.1 21 mer 23S-Gen forward-Primer fw 4.2 21 mer 23S-Gen forward-Primer fw 5.1 26 mer 23S-Gen forward-Primer fw 6.1 20 mer 23S-Gen forward-Primer fw 7.1 26 mer 23S-Gen forward-Primer fw 8.1 17 mer 23S-Gen forward-Primer fw 9.1 21 mer 23S-Gen forward-Primer fw 9.2 22 mer 23S-Gen forward-Primer rev 1.1 27 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 1.2 27 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 1.3 26 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 1.4 25 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 1.5 24 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 1.6 25 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 1.7 25 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 1.8 25 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 2.1 18 mer 5S-Gen reverse-Primer rev 3.1 18 mer 5S-Gen reverse-Primer rev 3 II .1 17 mer 5S-Gen reverse-Primer rev 4.1 23 mer 23S-Gen-Spacer reverse-Primer rev 4.2 24 mer 23S-Gen-Spacer reverse-Primer rev 5.1 25 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 6.1 18 mer Spacer-5S-Gen reverse-Primer rev 7.1 17 mer 5S-Gen reverse-Primer rev 8.1 16 mer 5S-Gen reverse-Primer rev 9.1 25 mer 23S-Gen reverse-Primer rev 10.1 26 mer 23S-Gen-Spacer reverse-Primer rev 10.2 26 mer 23S-Gen-Spacer reverse-Primer
  44. 44. II Material und Methoden 34 Name Länge/Markierung Zielregion Funktion Flu 1 33 mer - 3' Fluorescein 23S-Gen Sonde Red 1 LCRed 640 - 30 mer - Phosphat 23S-Gen Sonde HzFlu 31 mer - 3' Fluorescein 23S-Gen Sonde HzRed LCRed 640 - 32 mer - Phosphat 23S-Gen Sonde Tab. 2.4: Generierte Primer und Sonde für die Konstruktion und Detektion der Internen Amplifikationskontrolle Name Länge/Markierung Zielregion Funktion IAKrev 45 mer 23S-Gen reverse-Primer IAKfw 49 mer 23S-Gen forward-Primer IAKRed LCRed 705 - 28 mer - Phosphat 23S-Gen Sonde Primer der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH zur Amplifikation der 23S-5S-DNA fw23S, forward: 5’ – GGT ACG CGA GCT GGG TTT AGA ACG – 3’ rev5S, reverse: 5’ – GGC RRT KHC CTA CTC TCV C – 3’ Etablierte Primer zur Amplifikation der 16S-DNA (Barry et al. 1990) 41F, forward: 5’ – GCT CAG ATT GAA CGC TGG CG – 3’ 1066R, reverse: 5’ – ACA TTT CAC AAC ACG AGC TG – 3’ Primer für die Sequenzierung durch Firma GATC Biotech AG M13-FP, forward: 5’ – TGT AAA ACG ACG GCC AGT – 3’ M13-RP, reverse: 5’ – CAG GAA ACA GCT ATG ACC – 3’
  45. 45. II Material und Methoden 35 1.7 Lebensmittelproben Tab. 2.5: Tiefgefrorene Lebensmittel Nr. Produkt Nr. Produkt 1 Kinder-Eis Piraten Mix, Krokodil 26 Himbeer-Käse-Sahnetorte 2 Eismann Minis/Riegel Mix, Karamell 27 Tiramisu-Eisriegel 3 Butter-Tee-Gebäck, helle Teigmischprobe 28 Suppengemüse 4 Grünkohl 29 Gemüse-Reispfanne 5 Porree/Lauch 30 Kräutermischung mit Bärlauch 6 Buntes Gartengemüse 31 Petersilie 7 Asia Pfanne Bombay 32 Schnittlauch 8 Pangasiusfilet 33 Knoblauch-Würfel 9 Lachsforelle Ammerländer Art 34 Kaiserschmarrn, Vanillesoße 10 Garnelen in Knusperteig 35 Garnelensnack 11 Fleischtopf Toscana 36 Schollenfilet 12 Lammmedaillons 37 Wiener Würstchen 13 Gnocci 38 Original Thüringer Rostbratwurst 14 Westfälischer Grünkohl mit Räucherwurst 39 Cevapcici 15 Blätterteigkörbchen Schinken Käse 40 Donuts 16 Blumenkohl-Broccoli-Gratinos 41 Bunte Tortenmischung, Nuss-Sahne 17 Marinierte Gänsekeulen 42 Hähnchenkeule 18 Ente Classic 43 Hähnchenbrustfilet paniert 19 Marinierte Entenpfanne 44 Reibekuchen 20 Markklößchen 45 Suppenklößchen 21 Kartoffelgratin 46 Donauwelle 22 Tex Mex Box, Mozzarella Sticks 47 Herzoginkartoffeln 23 Bratapfelplunder 48 Lachstulpe, Lachs und Gemüse 24 Pizza Schinken Champignon 49 Hähnchenbrustfilet unpaniert 25 Mini Sahnewindbeutel 50 Eddy's Fisch, Seefisch
  46. 46. II Material und Methoden 36 Tab. 2.6: Säuglingsnahrung und Volleipulver Nr. Produkt Hersteller/Vertrieb 1 Milasan Milchbrei Früchte, nach dem 4. Monat Milasan GmbH 2 Getreidebrei BIO 3-Korn, milchfrei, nach EG-Öko- Verordnung, ab dem 6. Monat Milupa GmbH 3 Milasan Milchbrei Grieß, nach dem 4. Monat Milasan GmbH 4 BEBA Sensitive Spezialnahrung, diätetisches Lebensmittel, von Geburt an Nestlé Deutschland AG 5 Milumil 1, Dauermilch, von Geburt an Milupa GmbH 6 Alete Anfangsmilchnahrung PRE, von Geburt an Nestlé Nutriton GmbH 7 Alete Hypoallergene Anfangsnahrung H.A.1, von Geburt an Nestlé Nutriton GmbH 8 Folgemilch 3, prebiotisch, ab dem 8. Monat Humana GmbH 9 Aptamil Pre Säuglingsmilchnahrung, von Geburt an Milupa GmbH 10 Babydream Milchbrei Grieß, nach dem 4. Monat Rossmann GmbH 11 BEBA Start Anfangsmilchnahrung Pre, von Geburt an Nestlé Deutschland AG 12 HiPP Bio-Anfangsmilch, von Geburt an HiPP GmbH & Co. Vertrieb KG 13 HiPP Folgemilch 3, ab dem 8. Monat HiPP GmbH & Co. Vertrieb KG 14 Babydream Folgemilch 2, nach dem 4. Monat Rossmann GmbH 15 Bebivita, Baby-Aktiv Folgemilch, ab dem 8. Monat Bebivita GmbH 16 Humana Anfangsmilch PRE, von Geburt an Humana GmbH 17 Pre Milasan Säuglings-Milchnahrung, von Geburt an Milasan GmbH 18 Milasan 2 Folgemilch, nach dem 4. Monat Milasan GmbH 19 Alete Abendmilchbrei Banane mit Milchreis, ab dem 8. Monat Nestlé Nutriton GmbH 20 Bebivita Abendmilchbrei Grieß-Vanille, nach dem 4. Monat Bebivita GmbH 21 Milasan BIO Milchgrießbrei m. Vanille, nach EG-Öko- Verordnung, nach 4. Monat Milasan GmbH 22 Volleipulver Sanovo Eiprodukte GmbH & Co KG 1.8 Software Apilab Version V 4.0 api® 20 E (Fa. bioMérieux) Vector NTI® Suite Version 7.1 (Fa. InforMax® , Inc.) MeltCalcPro Version 2.06 (Fa. MeltCalc© Software GbR)
  47. 47. II Material und Methoden 37 Chromas Version 1.45, Copyright© 1996-1998 Conor McCarthy, School of Health Science, Griffith University, Gold Coast Campus, Southport, Queensland, Australia LightCycler® Software Version 3.5 (Fa. Roche Molecular Systems, Inc.) LightCycler® Software Version 4.0 (Fa. Roche Molecular Systems, Inc.) 2 METHODEN 2.1 Anzucht von Mikroorganismen Die meisten Mikroorganismen wurden in CASO-Bouillon angezogen, Vibrio-Arten in Meerwasser-Bouillon (Kap. II 1.2). Die Kultivierungsbedingungen entsprachen der jeweiligen Spezies. In der Regel erfolgte die Anzucht aerob für ein bis zwei Tage bei 30 °C bis 37 °C. 2.2 Quantifizierung von Bakterienzellen Die Quantifizierung der Bakterienzellen erfolgte in einer Thomakammer mit 400 Kleinquadraten und einer Tiefe von 0,1 mm unter dem Mikroskop. Es wurden pro Quantifizierung vier Großquadrate à 16 Kleinquadrate in einer Diagonale ausgezählt. Die Zahl der Zellen pro ml (N) wurde nach der Formel N = (Zahl der Zellen pro Großquadrat · 106 ) / 4 berechnet. Jede Zählung wurde einmal mit neu gefüllter Kammer wiederholt. Durch Ausplattieren und Inkubation auf CASO-Agar (Kap. II 1.2) wurde die Lebendkeimzahl überprüft. 2.3 DNA-Extraktion Für die DNA-Extraktion wurde 1 ml einer Bakterienzellkultur für 5 min in einer Tischzentrifuge (Eppendorf 5415C) bei 10.000 x g sedimentiert. Je nach benötigtem Reinheitsgrad wurde die DNA nach verschiedenen Verfahren extrahiert und direkt weiterverwendet oder bei –20 °C gelagert.
  48. 48. II Material und Methoden 38 2.3.1 DNA-Präparation mit enzymatischem Zellaufschluss Präparation und Reinigung der Bakterien-DNA über Silikasäulen erfolgte mit dem High Pure PCR Template Preparation Kit (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 1796828). Zusätzlich wurden phosphatgepufferte Saline (PBS, Kap. II 1.3), Lysozym (Fa. Sigma, Kt. Nr. L6876), RNase A (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 109142), Isopropylalkohol abs. und Tris EDTA-Puffer (TE, Kap. II 1.3) verwendet. Die sedimentierten Bakterienzellen wurden in 200 µl PBS resuspendiert. Für die Zelllyse und den RNA-Verdau erfolgte eine Inkubation mit je 10 µl Lysozym (10 mg/ml in Tris-HCl, pH 8,0) und RNase A (10 mg/ml) bei 37 °C für 20 min. Der Proteinverdau wurde mit 40 µl Proteinase K (20 mg/ml) in 200 µl Bindungspuffer bei 72 °C für 10 min durchgeführt. Nach Zugabe von 100 µl Isopropylalkohol abs. wurde die DNA auf der Säule entsprechend den Anweisungen des Kit-Herstellers gereinigt. Die Elution der DNA erfolgte mit 100 µl TE-Puffer. 2.3.2 DNA-Extraktion ShortPrep Die Aufarbeitung der genomischen DNA erfolgte mit dem ShortPrep foodproof II Kit (Fa. Roche Diagnostics, Kat. Nr. 03358062001) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Nach Inkubation bei 95 °C für 5 min, 2 sek vortexen und 1 min Zentrifugation bei 13.000 x g befindet sich die Bakterien-DNA im Überstand des Resuspensionspuffers. 2.4 DNA-Quantifizierung Die Quantifizierung präparierter DNA (Kap. II 2.3.1) erfolgte photometrisch oder im LightCycler® . Die Menge von Amplifikationsprodukten der PCR wurde durch Visualisierung im Geldokumentationsgerät ermittelt. 2.4.1 DNA-Quantifizierung im Photometer Die DNA wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm mit dem Gene Quant II Photometer (Fa. Pharmacia) quantifiziert. Bei dieser Wellenlänge entspricht eine optische Dichte (OD) von 1 einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml. Eine mögliche Verunreinigung durch Proteine wurde durch die OD280nm ermittelt. Der Quotient aus OD260nm/ OD280nm für reine DNA sollte bei 1,8 bis 1,9 liegen (Sambrook et al.1989).
  49. 49. II Material und Methoden 39 2.4.2 DNA-Quantifizierung im LightCycler® Die Quantifizierung der DNA im LightCycler® 2.0 Instrument erfolgte mit dem Programm „Nucleic Acid Quantification“ der LightCycler® Software Version 4.0 unter Verwendung des PicoGreen® dsDNA Quantitation Kit (Fa. Invitrogen, Kap. II 1.5) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Die Fluoreszenz des in DNA interkalierenden Farbstoffs PicoGreen® wurde bei 530 nm gemessen. Die Zunahme der Fluoreszenzintensität ist über einen DNA-Konzentrationsbereich von 25 pg/ml bis 1 µg/ml linear und wurde über eine Standardgerade bestimmt. Als Standard diente der PicoGreen® Lambda-DNA-Standard (100 µg/ml) aus dem Kit. 2.4.3 Quantifizierung von Amplifikaten Die Quantifizierung von Amplifikationsprodukten erfolgte nach deren Auftrennung im Agarosegel (Kap. II 2.2.7). Die mit Ethidiumbromid markierten DNA-Banden wurden unter UV-Licht visualisiert, mit dem Geldokumentationssystem E.A.S.Y. Win32 (Fa. Herolab) dokumentiert und mit der integrierten Software ausgewertet. Die Quantifizierung erfolgte durch Vergleich der Lichtemissionsintensitäten der Amplifikatbanden mit den Banden des mitgeführten DNA- Molekulargewichtsstandard. 2.5 Endonukleasenverdau 2.5.1 Restriktionsverdau Der Restriktionsverdau von DNA erfolgte mit der entsprechenden Restriktionsendonuklease (Kap. II 1.4) und dem dazugehörigen 10x Reaktionspuffer in einem Gesamtvolumen von 20 bis 150 µl und bei der für das Enzym geeigneten Reaktionstemperatur. Die Reaktion wurde in 1 bis 3 h oder über Nacht durchgeführt. Gestoppt wurde die Restriktion durch Zugabe von 5 mM EDTA oder Hitzeinaktivierung des Enzyms bei 65 °C für 20 min. 2.5.2 DNase I-Verdau Der DNA-Verdau wurde mit DNase I (Kap. II 1.4) und dazugehörigem 10x Reaktionspuffer in einem Gesamtvolumen von 20 bis 200 µl bei 24 °C oder 37 °C in 1 bis 6 h katalysiert. Das Enzym wurde durch Zugabe von 5 mM EDTA und Inkubation bei 70 °C für 10 min denaturiert.

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