Anne Langenbach: “Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischen Belastung von humanen mesenchymalen Stammzellen”

Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischen
Belastung von humanen mesenchymalen Stammzellen

Masterarbeit von Anne Langenbach
Medizinische Biotechnologie
Eingereicht am 17.01.2012 an der
Medizinischen Fakultät der Universität Rostock

Gutachter: Prof. Joachim Rychly
Zweitgutachter: Dr. Petra Müller

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1
Einleitung .................................................................................................... 4

1.1
Mesenchymale Stammzellen .................................................................... 4

1.1.1
Allgemeiner Überblick....................................................................... 4

1.1.2
Vorkommen ..................................................................................... 5

1.1.3
Charakterisierung ............................................................................. 6

1.1.4
Therapeutischer Einsatz ..................................................................... 7

1.2
Zytoskelett ............................................................................................. 8

1.3
Aktin..................................................................................................... 9

1.4
Vinculin............................................................................................... 11

1.5
Fokaladhäsion und Integrine .................................................................. 11

1.6
Mechanotransduktion ........................................................................... 13

1.7
Inhibitoren ........................................................................................... 14

1.7.1
Latrunculin A .................................................................................. 14

1.7.2
Jasplakinolid .................................................................................. 15

1.7.3
Cytochalasin D .............................................................................. 15

2
Zielstellung ................................................................................................ 16

3
Material und Methoden .............................................................................. 17

3.1
Chemikalien ........................................................................................ 17

3.2
Verbrauchsmaterialien .......................................................................... 18

3.3
Geräte ................................................................................................ 18

3.4
Software ............................................................................................. 18

3.5
Antikörper ........................................................................................... 19

3.6
Kits ..................................................................................................... 19

1

Inhaltsverzeichnis

3.7
Zellen ................................................................................................. 19

3.8
Medien für die Zellkultur ....................................................................... 20

3.9
Zellbiologische Methoden ..................................................................... 20

3.9.1
Isolation von hMSZ ......................................................................... 20

3.9.2
Zellen einfrieren und auftauen .......................................................... 21

3.9.3
Mediumwechsel ............................................................................. 21

3.9.4
Zellpassagen ................................................................................. 21

3.9.5
Zellaussaat .................................................................................... 22

3.9.6
Verwendung der Inhibitoren ............................................................ 22

3.9.7
Lichtmikroskopie ............................................................................. 23

3.9.8
Kolorimetrische Assays .................................................................... 23

3.9.9
Immunfluoreszenzfärbung ................................................................ 25

3.9.10
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie ........................................... 25

3.10
Proteinbiochemische Methoden ........................................................... 26

3.10.1
Zelllyse und Probenvorbereitung .................................................... 26

3.10.2
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)........................... 27

3.10.3
Western Blot und Immundetektion .................................................. 28

3.11
Bio-Plex-Assay ................................................................................... 29

3.12
Mechanische Stimulation .................................................................... 30

3.12.1
Aussaat ...................................................................................... 30

3.12.2
Vorbereitung der Mikrobeads ....................................................... 30

3.12.3
Mechanischer Reiz ...................................................................... 30

3.13
Statistik und Auswertung .................................................................... 31

4
Ergebnisse................................................................................................. 32

4.1
Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie ............................................ 32

4.2
Einfluss der Inhibitoren auf das Aktinzytoskelett von hMSZ ......................... 34

2

Inhaltsverzeichnis

4.3
Einfluss der Inhibitoren auf die Stoffwechselaktivität und die Proliferation von
hMSZ 36

4.4
Einfluss der Inhibitoren auf Signalproteine ............................................... 39

5
Diskussion ................................................................................................. 46

6
Zusammenfassung ...................................................................................... 51

7
Literatur ..................................................................................................... 52

8
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................... 59

9
Tabellenverzeichnis .................................................................................... 60

10
Abbildungsverzeichnis ............................................................................. 61

12
Erklärung ............................................................................................... 62

3

1.1 Mesenchymale Stammzellen 1 Einleitung

1 Einleitung

1.1 Mesenchymale Stammzellen

1.1.1 Allgemeiner Überblick

Mesenchymale Stammzellen, die auch als multipotente mesenchymale Stromazellen
(MSZ) bezeichnet werden (Horwitz et al., 2005), zählen zu den adulten Stammzellen.
Sie spielen im menschlichen Organismus eine wichtige Rolle bei
Regenerationsprozessen und haben die Aufgabe, Zellen, die durch Alterung, Trauma
oder Krankheit zu Grunde gehen, im Gewebeverband, ersetzen (Caplan und
Goldberg, 1999; Caplan, 2009). Adulte Stammzellen sind undifferenzierte Zellen, die
durch klonale Expansion zur ständigen Selbsterneuerung fähig sind (Pittenger et al.,
1999). Unter Einfluss von spezifischen Stimulatoren, wie beispielsweise spezieller
Wachstumsfaktoren, differenzieren sie in spezialisierte Zellen aus (Bianco und Robey
2001). MSZ differenzieren abhängig von der Art der Stimulation in unterschiedliche
Richtungen. So sind sie in der Lage Osteoblasten, Chondrozyten oder Adipozyten zu
bilden (Pittenger et al., 1999). Entgegen früherer Annahmen ist das
Differenzierungspotential von MSZ jedoch nicht auf Zelllinien des Mesoderms
beschränkt. Es konnte gezeigt werden, dass MSZ in vitro unter anderem zu Zellen mit
neuronalen (Sanchez-Ramos et al., 2000), hepatischen (Weng et al., 2003) und
myokardialen Charakteristika (Toma et al., 2002) differenziert werden können. Durch
diese Erkenntnisse hat sich das Spektrum der möglichen medizinischen
Anwendungsbereiche enorm vergrößert. Obwohl die Richtung der Differenzierung in
vitro beeinflusst werden kann, erhält man lediglich gemischte Zellkulturen, welche in
ihren biochemischen und biomechanischen Eigenschaften nicht vollständig dem
Zielgewebe entsprechen (Tuan, 2006).

4


1.1.2 Vorkommen

MSZ kommen neben den hämatopoetischen Stammzellen (HSZ), einer zweiten
Population von adulten Stammzellen, überwiegend im Knochenmark vor (Friedenstein
et al., 1974; Da Silva Meirelles et al., 2008). Dort machen sie 0,001 bis 0,01 % aller
kernhaltigen Zellen aus (Pittenger et al., 1999). Lokalisiert sind die MSZ innerhalb des
Knochenmarks in sogenannten Stammzellnischen. Darunter versteht man eine
Mikroumgebung innerhalb eines Organismus, welche die MSZ umgibt und
Voraussetzung für ihre Existenz ist (Watt und Hogan, 2000; Fuchs et al., 2004).
Gebildet wird die Stammzellnische aus einer Vielfalt komplexer Signale. Zu diesen
zählen lösliche, intrinsische Faktoren, die von den MSZ selbst sezerniert werden, Zell-
Zell-Kontakte und Signale der extrazellulären Matrix (EZM), die sowohl chemischer als
auch mechanischer Natur sein können (Scadden, 2006; Discher et al., 2009; Guilak
et al., 2009). Auf diese Weise bewirkt sie den Ausgleich zwischen Selbsterneuerungs-
und Differenzierungspotential der MSZ und somit die Aufrechterhaltung der
Funktionalität und des Phänotyps.

Zusätzlich konnten MSZ aus einer Vielzahl anderer Gewebe isoliert werden, wie zum
Beispiel dem Fettgewebe (Zuk et al., 2002), der Skelettmuskulatur (Williams et al.,
1999), der Lunge (Fan et al., 2005), der Leber (Campagnoli et al., 2001), der
Kopfhaut (Shih et al., 2005), der Plazenta (In’t Anker et al., 2004) und aus diversen
fetalen Geweben (In’t Anker et al., 2003). Auch wurden MSZ im peripheren Blut
(Kuznetsov et al., 2001), im Nabelschnurblut (Sarugaser et al., 2005) und im
Fruchtwasser (De Coppi et al., 2007) nachgewiesen. Alle diese MSZ weisen
untereinander trotz unterschiedlicher Herkunft große phänotypische Ähnlichkeit auf.
Auf Grund der spindelförmigen Morphologie ähnelt ihr Erscheinungstyp dem der
Fibroblasten.

Das gebräuchlichste Verfahren zur Isolation von MSZ stellt die
Dichtegradientenzentrifugation von Knochenmarkaspiraten dar (Pittenger et al., 1999).
Auf Grund ihrer Eigenschaft auf Plastikoberflächen zu adhärieren, können sie nach
Aufbringen auf Kulturschalen von nicht adhärenten HSZs getrennt werden (Le Blanc
und Pittenger, 2005).

5


1.1.3 Charakterisierung

Die direkte Identifizierung und Charakterisierung von Zellen als MSZ gestaltet sich
schwierig. Das liegt daran, dass sie mitunter in sehr geringer Anzahl vorkommen und
es außerdem keinen spezifischen Oberflächenmarker gibt, mit welchem MSZ eindeutig
identifiziert werden können. Aus diesem Grund werden sie durch ihre spindelförmige
Morphologie und Adhäsionsvermögen auf Plastikoberflächen charakterisiert. Weiterhin
sind sie durch ihr enormes Vermögen zur klonalen Expansion in vitro (Gregory et al.,
2005), die Fähigkeit der Differenzierung in osteogene, adipogene und chondrogene
Richtung und einer Kombination verschiedener Oberflächenmarker charakterisiert.
Trotz der Heterogenität unter MSZ verschiedener Herkunft und Funktion weisen die
meisten von ihnen eine Reihe von Oberflächenproteinen wie CD29, CD44, CD73,
CD105, CD106, CD166, stro-1, und HLA- ABC auf. Die Oberflächenmarker CD34,
CD14 und CD45 werden dagegen von keiner MSZ exprimiert. Häufig werden
Kombinationen aus diesen Positiv- und Negativmarkern genutzt, um MSZ zu
identifizieren und zu isolieren (Kolf et al., 2007).

Zusammenfassend hat die International Society for Cellular Therapy (ISCT) folgende
Minimalkriterien zur Definition von MSZ aufgestellt (Dominici et al., 2006).

• MSZ adhärieren unter standardisierten Kulturbedingungen auf Plastikoberflächen
• MSZ sind positiv für die Expression der Oberflächenmarker CD105, CD73 und CD90 und
negativ für die Expression der Oberflächenmarker CD45, CD34, CD14 oder CD11b,
CD79 oder CD19 und HLA-DR.
• MSZ besitzen osteogenes, adipogenes und chondrogenes Differenzierungspotential in vitro.

6


1.1.4 Therapeutischer Einsatz

Auf Grund ihrer spezifischen Eigenschaften, wie dem extensiven Proliferationspotential
und der Fähigkeit in verschiedene Zelltypen zu differenzieren, sind MSZ ein
vielversprechendes Werkzeug in der regenerativen Medizin. MSZ sind vergleichsweise
einfach aus unterschiedlichen Geweben zu isolieren und in vitro bis zur 500fachen
Menge zu expandieren (Gregory et al., 2005). Diese Zellen können anschließend
genutzt werden, um die Regeneration von beschädigtem Gewebe zu fördern (Caplan,
2009). Zur Geweberegeneration tragen zum einen Differenzierungsprozesse und
daraus resultierende Ersatzzellen und zum anderen die Sekretion trophischer Faktoren
bei (Caplan und Dennis, 2006). Diese trophischen Faktoren sind von MSZ sezernierte
lösliche Moleküle, wie Wachstumsfaktoren, Zytokine und Adhäsionsmoleküle, die
entscheidenden Einfluss auf die Regeneration des umliegenden, verletzten Gewebes
haben (Caplan, 2009).

Es konnte gezeigt werden, dass systemisch applizierte MSZ fähig sind in Gewebe und
Organe einzuwandern und sich in diesen über lange Zeiträume stabil anzusiedeln
(Devine und Hoffman, 2000). Auch wurde im Tiermodel beobachtet, dass MSZ auf
diese Weise direkt in verletztes Gewebe von Knochenbrüchen oder Herzinfarkten
migrieren können (Shake et al., 2002). Es bieten sich außerdem viele Möglichkeiten
im Bereich des Tissue Engineering. Es können beispielsweise Gewebekonstrukte
hergestellt werden, in denen in vitro expandierte MSZ enthalten sind. Diese können
dann in einen Patienten eingesetzt werden (Wakitani et al., 1994; Young et al.,
1998).

Da MSZ auch eine immunsuppressive Wirkung haben, besteht die Möglichkeit sie
während der Transplantation von HSZ einzusetzen, um die Gefahr von
Abstoßungsreaktionen zu reduzieren. Außerdem ist es möglich sich diese
immunsuppressiven Eigenschaften bei der Therapie der Graft-versus-Host-Reaktion zu
Nutze zu machen (Le Blanc et al., 2003). Die Kombination aus
Differenzierungspotential und immunsuppressiven Effekten machen MSZ zu idealen
Kandidaten für Zelltransplantationstherapien.

7

1.2 Zytoskelett 1 Einleitung

Ein weiterer Einsatzbereich für die medizinische Verwendung von MSZ ist die
Gentherapie. Genetisch modifizierte MSZ, in welche z. B. therapeutische Gene
transduziert wurden, bieten ein enormes therapeutisches Potential (Prockop et al.,
2003; Niyibizi et al., 2004).

1.2 Zytoskelett

Das Zytoskelett ist ein intrazelluläres Filamentsystem, bestehend aus zahlreichen Faser-
und Regulationsproteinen. Es ist maßgeblich für die Form einer Zelle verantwortlich und
nimmt außerdem Schlüsselpositionen in Bewegungs- und Transportprozessen, sowie in
Zellteilung und Differenzierung ein (Disanza et al., 2005; Lauffenburger und Horwitz,
1996; Welch und Mullins, 2002).

Es besteht hauptsächlich aus drei Fasertypen, den Aktinfilamenten, den Mikrotubuli und
den Intermediärfilamenten. Bei allen dreien handelt es sich um Polymere, die sich in
Netzwerken organisieren. Da sie ständigen Auf- und Abbauprozessen unterlegen sind,
bilden sie dynamische, anpassungsfähige Strukturen aus. Solche Umstrukturierungen
finden meist als Reaktion auf äußere Krafteinwirkungen statt. Die Unterschiede
zwischen den drei Fasertypen liegen in der Polarität, der Steifigkeit, der
Zusammensetzungsdynamik und dem Vorhandensein von Motorproteinen.

Mikrotubuli sind die steifsten der drei Filamenttypen. Sie bilden komplexe, zylindrische
Strukturen, die sich aus α- und β-Tubulin-Heterodimeren zusammensetzen (Bieling et al.,
2007). Aktinfilamente sind flexible, hoch dynamische Mikrofilamente von geringerer
Steifigkeit als Mikrotubuli (dos Remedios et al., 2003). Aktinfilamente sind genau wie
Mikrotubuli polarisierte Polymere, da sie aus asymmetrischen Monomeren
zusammengesetzt sind. Beide Filamenttypen haben spezielle Motorproteine, die unter
ATP-Hydrolyse der Bewegungserzeugung dienen. Sowohl Aktin als auch Mikrotubuli
können durch Polymerisierung bzw. Depolymerisierung Kräfte generieren, die zur
Veränderung der Zellform führen.

Intermediärfilamente weisen die geringste Steifigkeit auf. Ihre Hauptaufgabe besteht
darin das Zytoskelett gegenüber mechanischen Belastungen zu stabilisieren, wobei sie
8

1.3 Aktin 1 Einleitung

Zugkräften effektiver standhalten als Druckbelastung. Im Gegensatz zu Mikrotubuli und
Aktinfilamenten sind die Intermediärfilamente nicht polarisiert, binden keine
Motorproteine und leisten keinen direkten Beitrag zu Bewegungsprozessen (Wiche,
1998).

Neben den Polymeren, die die Netzwerkarchitektur des Zytoskeletts bilden, gibt es
noch eine Vielzahl regulatorischer Proteine, die an diese andocken und diese
kontrollieren. Solche Regulatorproteine werden in verschiedene Klassen unterteilt. Es
gibt sogenannte Nukleationspromotoren, durch welche die Filamentbildung initialisiert
wird. Durch Polymerasen wird das Wachstum der Filamente beschleunigt.
Cappingproteine dagegen führen zum Abbruch des Filamentwachstums. Zusätzlich
gibt es depolymerisierende und abbauende Faktoren. Stabilisiert wird die
Filamentstruktur durch quervernetzende Faktoren und andere Stabilisierungsproteine
(Fletcher und Mullins, 2010).

1.3 Aktin

Die ATPase Aktin ist ein universales Protein, das in allen bekannten Organismen
vorkommt. Es ist eines der am häufigsten in eukaryotischen Zellen vertretenen Proteine
(Dominguez, 2009). Aktin ist ein funktionell vielfältiges Protein. Es ist beteiligt an
zahlreichen Prozessen, unter anderem im Zusammenhang mit Zellmotilität, Zellteilung,
Transportvorgängen, Signaltransduktion und Zellmorphologie. Lokalisiert ist Aktin
sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma. Erstmals wurde Aktin 1859 von Kühne,
einem Physiologen aus Heidelberg, in Muskelzellen von Säugetieren identifiziert
(Kühne, 1859). In den folgenden Jahren wurden viele weitere Isoformen und
Homologe in verschiedensten Zellen, Geweben und letztlich auch in Prokaryoten
identifiziert und charakterisiert. Diese Tatsache lässt auf große funktionelle Vielfalt
dieses Proteins schließen.

Aktin kommt in zwei unterschiedlichen Formen vor: globulär und filamentös. Fibriläres
Aktin (F-Aktin) wird unter physiologischen Bedingungen in einer reversiblen
Polymerisationsreaktion aus globulären Aktinmonomeren (G-Aktin) gebildet (Pantaloni
et al., 2001). Bei G-Aktin handelt es sich um ein Protein, das aus einer einzelnen
9

1.3 Aktin 1 Einleitung

Peptidkette, bestehend aus 275 Aminosäureresten, aufgebaut ist. Es ist ein kleines,
kompakt gefaltetes Protein mit einer Molekülmasse von 43 kDa. G-Aktin besteht aus
zwei etwa gleich großen Hauptdomänen, die sich wiederum in jeweils zwei
Subdomänen unterteilen. Insgesamt setzt sich die Molekülstruktur also aus vier
verschiedenen Domänen zusammen (Schüler, 2001; Aguda et al., 2005). Zwischen
den beiden Hauptdomänen befindet sich eine Spalte. Diese enthält eine Bindungstasche
für kleine Moleküle, wie z. B. Adenosintriphosphat oder Phalloidin. Insgesamt sind heute

mehr als 150 Proteine bekannt, die eine spezifische Bindungsstelle für Aktin besitzen
(dos Remedios et al., 2003). Auf Grund von Interaktionen mit dieser Vielzahl an
unterschiedlichen Liganden ist es möglich, dass ein kleines, kompakt gefaltetes Protein
wie G-Aktin in so vielen physiologischen Prozessen beteiligt ist. Die Bindung eines
Liganden resultiert in einer Änderung der Konformation im Aktinmolekül. Da die
Aktinisoformen in den diversen Geweben unterschiedliche Affinitäten zu gleichen
Liganden aufweisen, können gleiche Liganden abhängig vom Gewebe verschiedene
Reaktionen hervorrufen. Das ist ein Punkt, der die funktionelle Vielfältigkeit von Aktin
erklären kann. Zusätzlich können Aktinmoleküle einer Reihe von posttranslationalen
Modifikationen wie Phosphorylierung, Acetylierung oder Ubiquitinierung unterzogen
werden. Da Aktinmonomere asymmetrisch geformte Proteine sind, besitzen auch
Aktinfilamente strukturelle und kinetische Polarität, d. h. beide Enden weisen

unterschiedliche biochemische Eigenschaften auf. Es gibt ein schnell wachsendes (+)-
Ende und ein langsam wachsendes (-)-Ende (Welch und Mullins, 2002). Ein effektives
Filamentwachstum findet nur am (+)-Ende statt. Ein Faktor, der dieses polarisierte
Wachstum bedingt ist Profilin, ein reichlich vorhandenes Protein, welches
Aktinmonomere bindet und somit deren Assoziation mit dem (-)-Ende verhindert.
Voraussetzung für das Filamentwachstum sind folglich freie (+)-Enden. Diese können
auf drei unterschiedliche Arten generiert werden. Die ersten beiden sind entweder das
Abspalten sogenannter Cappingmoleküle oder das Aufbrechen bereits vorhandener
Filamente. Die dritte Möglichkeit ist die De novo Synthese von F-Aktin aus monomerem
Aktin. Die spontane Polymerisation von G-Aktin zu Filamenten ist allerdings eine sehr
langsame Reaktion, die zusätzlich durch G-Aktin bindende Proteine inhibiert wird.
Damit die Polymerisation überhaupt ablaufen kann, werden sogenannte

10

1.4 Vinculin 1 Einleitung

Nukleationskerne, die aus Dimeren oder Trimeren von G-Aktin bestehen, benötigt. Da
die Bildung solcher Kerne eine thermodynamisch ungünstige Reaktion darstellt, müssen
diese durch Nukleationsfaktoren wie dem Arp2/3-Komplex und dessen Aktivatoren
initialisiert und stabilisiert werden (Disanza et al., 2005). Als Reaktion auf äußere und
innere Einflüsse unterliegt das räumlich und zeitlich eng regulierte Aktinzytoskelett
ständigen Auf-, Ab- und Umbauprozessen. Infolgedessen ist es sehr anpassungsfähig
und besitzt eine hohe Variabilität.

1.4 Vinculin

Vinculin ist ein hochkonserviertes Strukturprotein des Zytoskeletts, das in nahezu allen
tierischen Zellen vorkommt. Als wichtiger struktureller Bestandteil von Zell-Zell- und Zell-
Matrix-Verbindungen bindet Vinculin zytoplasmatische Proteinkomplexe, welche
Mikrofilamente in der Zellmembran verankern (Ziegler et al., 2006). Aufgebaut ist es
aus 1066 Aminosäureresten und besitzt ein Molekulargewicht von 117 kDa. Das
Vinculinmolekül besteht aus einer globulären Kopf- und einer Schwanzdomäne. Beide
Domänen besitzen Bindungsstellen für andere Proteine. So binden an der Kopfdomäne
z. B. Talin und α-Aktinin und an der Schwanzdomäne finden sich Bindungsstellen für
Paxillin, diverse Lipide und F-Aktin (Goldmann und Ingber, 2002). Kopf- und
Schwanzdomäne sind in der Lage einander zu binden und auf diese Weise
Bindungsstellen für verschiedene Liganden zu blockieren. Die Talinbindungsstelle spielt
eine besondere Rolle bei der Aktivierung der Integrine und der Zusammensetzung der
Fokalkontakte, indem sie für die Verknüpfung der β-Integrine mit dem Aktinzytoskelett
zuständig ist (Critchley, 2000; Johnson und Craig, 1994).

1.5 Fokaladhäsion und Integrine

Die zelluläre Adhäsion hat grundlegende Bedeutung für vielzellige Organismen. Sie
sorgt durch mechanische Verknüpfung von Zellen untereinander und mit der EZM für
den Zusammenhalt von Geweben und verleiht diesen so Stabilität und Zugfestigkeit.
Die Vermittlung der Adhäsion erfolgt über spezialisierte Bereiche der Zellmembran, die

11

1.5 Fokaladhäsion und Integrine 1 Einleitung

Fokalkontakte, welche das Zytoskelett über Transmembranproteine mit extrazellulären
Strukturen verbinden.

Fokalkontakte wurden Anfang der 70er Jahre erstmals von Abercrombie in
Fibroblasten entdeckt und als adhäsive Membranbereiche mit Kontakt zum
umliegenden Substrat beschrieben (Abercrombie und Dunn, 1975). Es handelt sich um
multimolekulare Verankerungsstrukturen, die aus mehr als 100 verschiedenen Proteinen
zusammengesetzt sind. Durch diese ist das Aktinzytoskelett mechanisch an die EZM
gekoppelt. Zentraler Bestandteil der Fokaladhäsionen sind Integrine, EZM-bindende
Oberflächenrezeptoren, die in Clustern organisiert und über Adapterproteine wie z. B.
Vinculin und Talin intrazellulär mit den Aktinfilamenten verbunden sind (Horwitz et al.,
1986).

Somit besitzen Integrine als Oberflächenrezeptoren zentrale Funktion bei der Adhäsion
und den damit verbundenen Prozessen. Bei den Integrinrezeptoren handelt es sich um
heterodimere Transmembranproteine, die aus zwei nichtkovalent gebundenen
Untereinheiten, der α- und der β-Kette, bestehen. Zurzeit sind 18 verschiedene α- und
acht β-Ketten bekannt, die durch Dimerisierung 22 unterschiedliche αβ-Heterodimere
bilden können, die zur Integrinfamilie zusammengefasst werden. Jedes der Integrine
bindet an spezifische Liganden. Diese können zum einen Proteine der EZM wie z. B.
Kollagen, Fibrinogen, Fibronektin oder Laminin oder zum anderen
Oberflächenrezeptoren benachbarter Zellen sein. Integrine induzieren nach der
Bindung eines extrazellulären Liganden Signalkaskaden im Zellinneren. Auf Grund der
Integrine, einer Vielzahl assoziierter Kinasen und anderen Signalproteinen sind
Fokalkontakte nicht nur passive, mechanische Verbindungsstrukturen, sondern auch
intensiv an intrazellulären Signaltransduktionswegen beteiligt. Die Art der
Signalweiterleitung ist bidirektional, d. h. sie kann sowohl von außen nach innen
(Outside-In), als auch von innen nach außen (Inside-Out) erfolgen. Auf Grund der
Rezeptoreigenschaften der Fokalkontakte ist es einer Zelle möglich Parameter aus ihrer
Umgebung, wie die Beschaffenheit der Matrix oder den Adhäsionsstatus, zu messen
und ihr Verhalten den Gegebenheiten anzupassen. So können beispielsweise
Differenzierung, Migration, Bewegung, aber auch andere Signal- oder
12

1.6 Mechanotransduktion 1 Einleitung

Stoffwechselwege an die äußeren Bedingungen angepasst werden. Im Vergleich dazu
reagiert die Zelle bei der Inside-Out-Signalweiterleitung auf intrazelluläre Signale, was
in den meisten Fällen zu Konformationsänderungen in extrazellulären Domänen führt
und somit in einer veränderten Affinität zu Liganden resultiert.

1.6 Mechanotransduktion

Integrine sind Rezeptoren, die mechanische Reize in die Zelle übertragen. Dieser
Prozess der Mechanotransduktion beinhaltet die Umwandlung äußerer physikalischer
Kräfte in intrazelluläre biochemische Signale, die dann zu einer adäquaten Zellantwort
führen. Es wird angenommen, dass ein Mechanismus der Mechanotransduktion auf
Konformationsänderungen der Proteine des fokalen Adhäsionskomplexes durch
Zugkräfte beruht. In diesem Zuge werden Bindungsstellen freigelegt, an welche
Liganden binden können, wodurch es dann zur Auslösung intrazellulärer
Signalkaskaden kommt (del Rio et al., 2009). Mechanische Interaktionen von Zellen
mit der umliegenden Matrix sind bidirektional und haben große Bedeutung für die
Regulation vieler zellulärer Prozesse. Die Integrine als transmembrane Rezeptoren sind
für die Mechanorezeption und –transduktion besonders gut geeignet, da sie das
Aktinzytoskelett über assoziierte Proteine direkt an die EZM koppeln. Zugkräfte, die auf
die EZM wirken, können folglich über Integrine auf das Zytoskelett übertragen und in
biochemische Signale umgewandelt werden. Die Zellen sind ihrerseits ebenfalls in der
Lage Kräfte auf umliegende Matrixproteine auszuüben und deren Umorganisierung zu
bewirken (Guilak et al., 2009). Die Elastizität des umliegenden Substrates, welche auf
die Richtung der Differenzierung Einfluss hat, kann von MSZs wahrgenommen werden
(Engler et al., 2006; Winer et al., 2009). Die Zellen reagieren mit einer Veränderung
ihrer Zellform. Das hat wiederum starke Veränderungen der Organisation des
Aktinzytoskeletts zur Folge (Zajac und Discher, 2008). Es konnte bereits gezeigt
werden, dass Zugkräfte an Integrinrezeptoren von Osteoblasten zu einer Anhäufung
von Proteinen der fokalen Adhäsionskomplexe in der unmittelbaren Umgebung des
gereizten Integrins führen. Außerdem kommt es zur Aktivierung der fokalen
Adhäsionskinase (FAK). Dies bewirkt dann weiterhin die Aktivierung von MAP-Kinasen

13

1.7 Inhibitoren 1 Einleitung

z. B. der extrazellulär regulierten Kinasen (ERK) 1 und 2 (Rychly et al., 1998; Schmidt
et al., 1998; Pommerenke et al., 2002).

1.7 Inhibitoren

Das Aktinzytoskelett ist in eine Vielzahl zellulärer Prozesse involviert. Es sind einige
Substanzen bekannt, die diese Prozesse beeinflussen, indem sie die intrazelluläre
Organisation der Aktinfilamente (F-Aktin) verändern und das Aktinzytoskelett damit
häufig zerstören. Solche Substanzen kommen in der zellbiologischen Forschung oft
zum Einsatz. Die destruktiven Wirkmechanismen solcher Substanzen sind sehr
unterschiedlich. So wird z.B. durch Cytochalasine die Elongation von F-Aktin verhindert
(Brown und Spudich, 1979). Latrunculine binden G-Aktin (Coué et al., 1987).
Jasplakinolide führen dagegen durch übersteigerte Polymerisation von F-Aktinen zur
Verfestigung des Zytoskeletts (Yarmola et al., 2000).

1.7.1 Latrunculin A

Latrunculin A ist ein marines Toxin, das von verschiedenen, im Roten Meer
vorkommenden Schwammarten, z. B. Latrunculia magnifica, gebildet wird. Chemisch
handelt es sich um ein bioaktives, makrozyklisches 2-Thiazolidinon mit der
Summenformel C22H31NO5S und einem Molekulargewicht von 421,6 Dalton.
Latrunculin A ist in der Lage G-Aktin mit moderater Affinität zu binden (Andavan und
Lemmens-Gruber, 2010). Diese Bindung erfolgt im stöchiometrischen Verhältnis 1:1
und führt zur Ausbildung stabiler Komplexe aus G-Aktin und Latrunculin A (Spector et
al., 1989). Auf diese Weise inhibiert Latrunculin A die Polymerisierung von G-Aktin zu
F-Aktin sowohl in vitro (Morton et al., 2000; Coué et al., 1987), als auch in vivo
(Spector et al., 1983). Infolge dessen wird die Organisation intrazellulärer
Mikrofilamente blockiert und das Zytoskelett innerhalb kurzer Zeit zerstört.
Latrunculin A beeinträchtigt folglich physiologische Prozesse, die durch Mikrofilamente
reguliert werden. Zu diesen zählen Prozesse der frühen Embryonalentwicklung, der
Fertilisation und der Phagozytose von Immunkomplexen (Ayscough et al., 1997).

14

1.7 Inhibitoren 1 Einleitung

1.7.2 Jasplakinolid

Auch bei Jasplakinolid handelt es sich um ein marines Toxin. Es ist ein aus dem
Meerschwamm Jaspis johnstoni stammendes makrozyklisches Peptid mit einem
Molekulargewicht von 709,7 Dalton und der Summenformel C36H45BrN4O6.
Jasplakinolid besetzt am Aktinmolekül die gleiche Bindungsstelle wie Phalloidin. Es
fördert die Polymerisierung von F-Aktin und führt zur Verfestigung des Zytoskeletts,
indem es durch sogenannte unkontrollierte Nukleation neue Polymerisationsstellen
induziert. Es kommt anstelle von Filamenten zur Bildung von großen Aktinaggregaten
(Scott et al., 1988). Durch diese Stabilisierung können Aktinstressfasern nicht mehr
umgebaut werden, wodurch die Integrität des Zytoskeletts gestört wird (Posey und
Bierer, 1999).

1.7.3 Cytochalasin D

Cytochalasin D ist ein Mykotoxin, das von verschiedenen Pilzen wie z.  B. Zygosporium
mansonii oder Helminththosporium dematiodideum gebildet wird. Auch Cytochalasin
D ist ein makrozyklisches Peptid. Es hat die Summenformel C30H37NO8 und ein
Molekulargewicht von 507,6 Dalton. Cytochalasin D inhibiert die Polymerisation von
Aktin in vitro, indem es mit sehr hoher Affinität an die schnell wachsenden Enden
(‚barbed ends’) von Aktinfilamenten bindet und so die Addition weiterer Monomere
verhindert (Casella et al., 1981; Goddette und Frieden, 1986). Die Bildung und die
Verteilung der Mikrofilamente im Zytoplasma werden folglich durch Cytochalasin D
inhibiert. Außerdem besitzt Cytochalasin D eine antibiotische bzw. antitumorigene
Wirkung und führt zur Erhöhung des intrazellulären Kalziumlevels.

15

2 Zielstellung

2 Zielstellung

Mit dieser Arbeit wird das Ziel verfolgt die Rolle des Aktinzytoskeletts für die
Übertragung mechanischer Kräfte im Zusammenhang mit der funktionellen Steuerung
von mesenchymalen Stammzellen näher zu analysieren. Zu diesem Zweck werden
Integrinrezeptoren mit Hilfe von Magnetpartikeln mechanisch stimuliert. Zusätzlich soll
das Aktinzytoskelett unter dem Einfluss der mechanischen Kräfte mit
depolymerisierenden und polymersierenden Substanzen beeinflusst werden. Die
Beurteilung der Effekte einer solchen Behandlung auf die Signaltransduktion wird über
die Bestimmung der Aktivierung der Signalmoleküle ERK und AKT erfolgen.

16

3.1 Chemikalien 3 Material und Methoden

3 Material und Methoden

3.1 Chemikalien

Die im Folgenden aufgelisteten Chemikalien wurden verwendet.

• Acrylamid (40 %) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)
• Ammoniumperoxodisulfat (Merck, Darmstadt)
• Antibiotische-antimykotische Lösung (AB/AM) (Invitrogen, Karlsruhe)
• Coomassie-Lösung (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)
• Cryo-SFM (Promocell, Heidelberg)
• Cytochalasin D (CytoD) (Calbiochem, Merck, Darmstadt)
• Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (Invitrogen, Karlsruhe)
• Essigsäure (J.T. Baker, Phillipsburg NJ)
• Fetales Kälberserum (PAN-Biotech, Aidenbach)
• Fluoroshield (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)
• Glycin (Carl Roth, Karlruhe)
• Isopropanol (J.T. Baker, Phillipsburg NJ)
• Jasplakinolide (Jasp) (Calbiochem, Merck, Darmstadt)
• Kristall-Violett (Fluka, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)
• Ladepuffer (Laemmli, 1970)
• Latrunculin A (LatA) (Calbiochem, Merck, Darmstadt)
• Methanol (Carl Roth, Karlruhe)
• Milchpulver (Carl Roth, Karlruhe)
• Natriumclorid (Carl Roth, Karlruhe)
• Paraformaldehyd (PFA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)
• Phalloidin, Fluorescein Isothiocyanat (FITC) markiert (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)
• Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) (Invitrogen, Karlsruhe)
• Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) (Serva, Heidelberg)
• Tetramethylethylendiamin (TEMED) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)
• Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) (Carl Roth, Karlruhe)
• Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)
• Trypsin/EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)
• Tween20 (GE Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien)

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3.2 Verbrauchsmaterialien 3 Material und Methoden

3.2 Verbrauchsmaterialien

Die im Folgenden aufgelisteten Verbrauchsmaterialien wurden verwendet.

• Costar® 96-Well EIA/RIA Stripwell™ Plate (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)
• Criterion Stain Free Gel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)
• Deckgläser (Menzel GmbH, Braunschweig)
• Dynabeads® M-280 Schaf anti-Maus IgG (Dynal, Hamburg)
• Filterpapier (Whatman, GE Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien)
• Low Protein Binding Tubes (Sarstedt, Nümbrecht)
• Mikrotiterplatten (Greiner Bio-One, Frickenhausen)
• Objektträger (Engelbrecht GmbH, Edermünder)
• Pastikwaren (Greiner Bio-One, Frickenhausen)
• PVDF-Membranen (Roche, Basel)
• Zellkulturflaschen (Greiner Bio-One, Frickenhausen)

3.3 Geräte

Die im Folgenden aufgelisteten Geräte wurden benutzt.

• Anlage zur Erzeugung eines inhomogenen Magnetfeldes für die mechanische Stimulation
• Anthos Reader (Anthos, Krefeld)
• Axiovert 40 C (Zeiss, Jena)
• CASY® Cell Counter (OLS, Bremen)
• Leica TCS SP2 (Leica, Heidelberg)
• Molecular Imager Gel Doc XR System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)
• Qubit® 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Karlsruhe)

3.4 Software

Die im Folgenden aufgelistete Software wurde verwendet.

• AxioVision (Zeiss, Jena)
• Image Lab (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)
• LAS AF Lite (Leica, Heidelberg)

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3.5 Antikörper 3 Material und Methoden

• Leica Confocal Software (Leica, Heidelberg)
• Microsoft Excel 2010 (Microsoft, Redmond, USA)
• Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)
• The GIMP (The GIMP Team)

3.5 Antikörper

Die im Folgenden aufgelisteten Antikörper wurden verwendet.

• β1-Integrin Maus-Antikörper (Beckman Coulter, Fullerton, CA)
• Kaninchen anti-Maus IgG-Cy3 (Dianova, Hamburg)
• p44/42 MAPK (ERK 1/2) Kaninchen-Antikörper, polyklonal (Cell Signaling, Boston, MA)
• Schwein anti-Maus IgG/HRP, polyklonal (Dako, Hamburg)
• Schwein anti-Kaninchen IgG/HRP, polyklonal (Dako, Hamburg)
• Vinculin Maus-Antikörper, monoklonal, Clone hVIN-1 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)

3.6 Kits

Die im Folgenden aufgelisteten Kits wurden verwendet.

• Bio-PlexTM cell lysis Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)
• Bio-PlexTM Phospho-AKT (S473) Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)
• CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, Madison,
WI, USA)
• Qubit® Protein Assay Kit (Invitrogen, Karlsruhe)
• SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce, Rockford, USA)

3.7 Zellen

Alle zellbiologischen Untersuchungen wurden mit humanen mesenchymalen
Stammzellen aus dem Knochenmark (hMSZ) durchgeführt. Als Quelle dienten zum
einen Zellen aus dem Knochenmark von Patienten, die während einer medianen
Sternotomie entnommen wurden, zum anderen kommerzielle hMSZ (Lonza, Basel).

19

3.8 Medien für die Zellkultur 3 Material und Methoden

3.8 Medien für die Zellkultur

Als Expansionsmedium wurde Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) verwendet,
welchem vor dem Gebrauch fetales Kälberserum (FKS) bis zu einer Endkonzentration
von 10 % bzw. 0,5 % und antibiotische-antimykotische Lösung (AB/AM) bis zu einer

Endkonzentration von 1 % steril hinzugegeben wurde.

Als Medium zur Kryokonservierung der hMSZ wurde Cryo-SFM verwendet.

3.9 Zellbiologische Methoden

Die Isolierung und Kultivierung der Zellen wurden unter sterilen Bedingungen unter
einer Sicherheitswerkbank durchgeführt. Alle Inkubationsschritte erfolgten unter
standardisierten Bedingungen bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit in einem
Brutschrank.

3.9.1 Isolation von hMSZ

Die hMSZ wurden aus Knochenmark gewonnen, das Patienten während einer
medianen Sternotomie entnommen wurde (Klinik für Herzchirurgie, Universität
Rostock). Dieses Knochenmark (ca. 6 ml) wurde zur Antikoagulation 1:2 mit PBS/EDTA

verdünnt, sodass das Gesamtvolumen 12 ml betrug. Zur Isolation der mononukleären
Zellen wurde eine Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Dafür wurden in ein
Falconröhrchen 12 ml Pancoll vorgelegt. Pancoll enthält Ficoll 400, ein stark
verzweigtes Zuckerpolymer aus Saccharose und Epichlorhydrin.

Das vorgelegte Pancoll wurde mit dem verdünnten Knochenmark überschichtet und für
30 min bei 1 800 rpm und Raumtemperatur in einem Swingout-Rotor zentrifugiert.

Nach der Zentrifugation wurde der dabei entstandene, weiße Lymphozytenring
abgenommen und in Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) gewaschen. Die Zellen
wurden anschließend in 5 ml DMEM aufgenommen und in T 25 Kulturflaschen

kultiviert. Nach 24 h wurden die nicht-adhärenten Zellen durch Spülen des Zellrasens

20

3.9 Zellbiologische Methoden 3 Material und Methoden

mit HBSS entfernt. Die weitere Kultivierung erfolgte, bis die Zellen zu 80 % konfluent
waren. Danach wurden sie entweder gesplittet oder für weitere Versuche ausgesät.

3.9.2 Zellen einfrieren und auftauen

Damit hMSZ eingefroren werden konnten, wurden diese zuvor mit Hilfe von
Trypsin/EDTA vom Boden der Kulturflasche abgelöst und bei 1 200 rpm für 5 min
sedimentiert. Das entstandene Zellpellet wurde in DMSO-haltigem Medium, Cryo-SFM,
resuspendiert und anschließend in Kryoröhrchen überführt. Bis zur weiteren
Verwendung wurden die Zellen in der Gasphase flüssigen Stickstoffs gelagert.

Um kryokonservierte Zellen erneut in Kultur zu nehmen, wurden diese in DMEM
aufgenommen. Um das zytotoxische DMSO zu entfernen, wurde die Zellsuspension
pelletiert und der Überstand dekantiert. Das Zellpellet wurde in frischem DMEM
resuspendiert und auf Zellkulturflaschen verteilt. Die Kultivierung erfolgte unter
standardisierten Bedingungen im Brutschrank. Nach einem Tag wurden die nicht
adhärenten Zellen entfernt, indem das Medium gewechselt und die Kultivierung
fortgesetzt wurde.

3.9.3 Mediumwechsel

Der Verbrauch von Nährstoffen im Medium ist unter anderem abhängig von der
Stoffwechselaktivität und der Anzahl der Zellen - er geht einher mit einem Absinken des
pH-Wertes. Dieser äußert sich in einem Farbumschlag des Mediums. Um ein
konstantes Milieu und gleiche Bedingungen für die Zellen zu gewährleisten, wurde das
Medium alle zwei bis drei Tage gewechselt.

3.9.4 Zellpassagen

Im Laufe der Kultivierung bildeten die Zellen einen konfluenten Zellrasen aus. Durch die
Konfluenz kommt es einerseits zur Kontakthemmung, wodurch die weitere
Zellproliferation inhibiert wird, andererseits besteht die Gefahr, dass sich der Zellrasen
vom Flaschenboden ablöst, wodurch Zellen verloren gehen. Um nach Erreichen der

21


Konfluenz die weitere Zellvermehrung zu gewährleisten, wurden die Zellen gesplittet.
Hierfür wurden die Zellen nach zweimaligem Waschen mit PBS durch Inkubation mit
Trypsin/EDTA vom Flaschenboden abgelöst und in DMEM resuspendiert.
Anschließend wurde die Zellsuspension in neue Kulturflaschen überführt und die
Kultivierung entsprechend fortgesetzt.

3.9.5 Zellaussaat

Für die folgenden Versuche war die Aussaat definierter Zellzahlen notwendig. Hierfür
wurden die konfluenten Zellen mittels Trypsin/EDTA vom Boden der Kulturflaschen
abgelöst und in Medium resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen bei 1 200 rpm

für 5 min pelletiert und in einer definierten Menge Medium aufgenommen. Die

Bestimmung der Zellzahl wurde mit Hilfe des CASY® Cell Counter vorgenommen. Die
für die folgenden Versuche jeweils benötigten Zellkonzentrationen wurden durch
Verdünnung der Zellsuspension mit Medium eingestellt. Die Zellsuspension wurde dann
in die jeweiligen Kulturgefäße mit einer Dichte von 6 000 Zellen pro cm² ausgesät und

für mindestens 24 h inkubiert.

3.9.6 Verwendung der Inhibitoren

Die Inhibitoren Cytochalasin D, Jasplakinolide und Latrunculin A sollten in
Konzentrationen eingesetzt werden, welche die Funktionen des Aktinzytoskeletts
hemmen, aber die Zellvitalität nicht beeinträchtigen. Da jede der drei Substanzen in
DMSO gelöst vorlag, wurde DMSO-haltiges DMEM mit einer Endkonzentration von
0,1 % für alle Experimente als Vehikelkontrolle mitgeführt. Auf diese Weise wurde
sichergestellt, dass beobachtete Effekte allein auf die Inhibitoren und nicht auf ihr
Lösungsmittel zurückzuführen sind. Um herauszufinden, welche
Inhibitorkonzentrationen für die weiteren Experimente geeignet waren, wurden die
Zellen zunächst unter verschiedenen Konzentrationen kultiviert. Zu diesem Zweck
wurde das Zellkulturmedium mit unterschiedlichen Mengen der inhibitorischen
Substanzen versetzt und die Zellen darin suspendiert. Nach 30-minütiger

22


Vorinkubation der Zellen in Suspension, wurden diese in die für die jeweiligen
Versuche benötigten Kulturgefäße ausgesät.

3.9.7 Lichtmikroskopie

Bei der lichtmikroskopischen Betrachtung der Zellen handelt es sich um einen
morphologischen Assay zur Beurteilung der Zellform, der Adhäsion und der Vitalität.
Zu diesem Zweck wurden 20 000 Zellen pro cm² in Petrischalen (d=3,5 cm) ausgesät

und unter verschiedenen Inhibitorkonzentrationen für 24 h inkubiert. Dann wurden die
Zellen im Kulturmedium im Durchlicht lichtmikroskopisch betrachtet und morphologisch
beurteilt. Auffälligkeiten bezüglich Zellform und Zellzahl wurden dokumentiert.

3.9.8 Kolorimetrische Assays

Die kolorimetrischen Assays unter dem Einfluss der Inhibitoren wurden in
Mikrotiterplatten im 96-Well-Format jeweils als Triplettansatz durchgeführt. Dafür
wurden in jedes Well 7 000 Zellen ausgesät und diese dann für 24 h inkubiert.

MTS-Test

Um Rückschlüsse auf die metabolische Aktivität der Zellen unter verschiedenen
Konzentrationen der Inhibitoren zu ziehen, wurde der MTS-Test (Cory et al., 1991)
durchgeführt. Dafür wurde der CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation
Assay verwendet. Hierbei handelt sich um einen kolorimetrischen Test, der auf der
Aktivität zellulärer Dehydrogenasen basiert, die in metabolisch aktiven Zellen
vorliegen. Der Test enthält 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-
sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), ein gelbes, wasserlösliches Tetrazoliumsalz. Dieses
wird durch enzymatische Reduktion in ein oranges Formazan umgewandelt. Dieses
Formazan liegt dann gelöst im Kulturmedium vor und kann durch
Absorptionsmessungen bei einer Wellenlänge von 490 nm quantifiziert werden. Die
Menge des gemessenen Formazans ist proportional zur Stoffwechselaktivität aller
lebenden Zellen in der Kultur.

23


Nach der 24-stündigen Inkubation wurde das Medium aus allen Wells entfernt. In
jedes Well wurden dann jeweils 100 µl frisches DMEM und 20 µl MTS-Reagenz
gegeben. Drei weitere Kontroll-Wells wurden ausschließlich mit DMEM/MTS-Gemisch
gefüllt, um als Leerwert mitgeführt zu werden. Nach einstündiger Inkubation der Zellen
mit dem MTS-Reagenz wurden je 100 µl des Überstandes für die Absorptionsmessung

in eine neue Miktrotiterplatte überführt. Die photometrische Bestimmung der Absorption
wurde mit dem Anthos-Reader bei einer Wellenlänge von 490 nm durchgeführt.

Kristallviolett-Test

Der Kristallviolett-Test wurde im direkten Anschluss an den MTS-Test auf derselben
Mikrotiterplatte durchgeführt. Um die Ergebnisse des MTS-Tests auf die Zellzahl zu
relativieren, wurde der Kristallviolett-Test zur Bestimmung der Anzahl der Zellen
durchgeführt. Hierbei handelt es sich ebenfalls um einen kolorimetrischen Assay, bei
dem über Kristallviolett die DNA angefärbt wird. Durch Solubilisation des Zellrasens ist
es dann möglich, den aufgenommenen Farbstoffs photometrisch zu quantifizieren. Die
gemessene Absorption bei 570 nm ist proportional zur Menge aller adhärenten Zellen
der Kultur.

Alle Wells inklusive der drei Leerwerte wurden zu Beginn zweimal mit PBS gespült.
Anschließend wurden die Zellen für 10 min bei Raumtemperatur mit Isopropanol fixiert

und dann dreimal mit Tween/PBS (0,05 %) gewaschen und permeabilisiert. Zur

Färbung wurden die Zellen dann mit Kristallviolett (0,1 %) bedeckt und für 20 min auf

dem Schüttler inkubiert, damit der Farbstoff optimal in den Zellinnenraum penetrieren
konnte. Im Anschluss wurden die Zellen mehrmals mit destilliertem Wasser gespült, bis
das Kristallviolett vollständig aus dem Überstand entfernt war. Der gefärbte Zellrasen
wurde dann durch Zugabe von Essigsäure (33 %) für 15 min unter Schütteln

solubilisiert. Danach wurden je 70 µl des Überstandes für die Absorptionsmessung in
neue Wells transferiert. Die photometrische Bestimmung der Absorption wurde mit dem
Anthos-Reader bei einer Wellenlänge von 570 nm durchgeführt.

24


3.9.9 Immunfluoreszenzfärbung

Die Immunfluoreszenzfärbung wurde genutzt, um die Art und das Ausmaß des
Zytoskelettumbaus bei hMSZ durch verschiedene Konzentrationen der Substanzen
Cytochalasin D, Latrunculin A und Jasplakinolid zu charakterisieren. Dafür wurden die
Zellen zum einen mit FITC markiertem Phalloidin (1:100) gegen F-Aktin und zum
anderen mit Anti-Vinculin-Antikörpern (1:100) und Cy3-konjugierten
Sekundärantikörpern (1:200) angefärbt.

Die Aussaat der Zellen für die Immunfärbung erfolgte auf Deckgläsern mit einem
Durchmesser von 12 mm. Auf jedes Deckglas wurden ca. 20 000 Zellen ausgesät, die

dann für 24 h inkubiert wurden, damit die Zellen adhärieren konnten. Nach Ende der
Inkubationszeit wurde das Medium abgenommen und die Zellen vorsichtig mit PBS
gewaschen. Zur anschließenden Fixierung wurden die Zellen mit Paraformaldehyd
(PFA) (4 %) überschichtet und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem

Waschen des Zellrasens mit PBS wurden die Zellen für 10 min mit Triton X-100 (0,1 %)

permeabilisiert, damit die folgenden Antikörper an die entsprechenden intrazellulären
Strukturen binden können. Die Inkubation mit den unterschiedlichen Antikörpern
erfolgte nacheinander für jeweils 30 min, bei Raumtemperatur, im Dunkeln. Um nicht
gebundene Antikörper zu entfernen, wurden die Deckgläser nach jedem
Inkubationsschritt mehrfach mit PBS gespült. Vor dem Einbetten der Präparate wurden
diese abschließend mit destilliertem Wasser gespült, um Kristallisationen zu vermeiden.
Zum Einbetten wurde Fluoroshield, ein kommerzielles, aushärtendes Einbettmedium,
verwendet. Die fertigen Präparate wurden lichtgeschützt bei 4 °C gelagert.

3.9.10 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) wurde zur Auswertung der
Immunfluoreszenzfärbungen genutzt. Sie ermöglicht die Aufnahme hochauflösender
Bilder durch punktweises Abrastern von Präparaten mit einem fokussierten Laserstrahl.
Die Fluoreszenz, die durch das Laserlicht hervorgerufen wird, kann entsprechend
punktweise detektiert werden. Informationen über das gesamte Präparat erhält man,

25

3.10 Proteinbiochemische Methoden 3 Material und Methoden

indem der Laserstrahl über die Probe bewegt wird und die emittierte Fluoreszenz vom
jeweiligen Probenort pixelweise detektiert wird. Das konfokale LSM unterscheidet sich
maßgeblich vom gewöhnlichen Lichtmikroskop durch eine konfokale Blende. Diese
befindet sich in der Zwischenbildebene. Am Detektor trifft also nur das Licht auf,
welches diese Blende passiert hat. Der Grad der Konfokalität variiert folglich mit dem
Blendendurchmesser. Je kleiner dieser ist, desto mehr Signale unter- und oberhalb der
Fokusebene werden ausgeblendet. Das konfokale LSM ermöglicht auf diese Weise die
Aufnahme dünner optischer Schnitte aus einem Präparat. Durch digitale Überlagerung
mehrerer solcher Schnitte können sogar dreidimensionale Bilder rekonstruiert werden.

Für Aufnahmen im Rahmen dieser Arbeit wurde das Leica TCS SP2 benutzt, welches
unter anderem einen Argon-Ionen-Laser und einen Helium-Neon-Laser besitzt. Der
Argon-Ionen-Laser emittiert Licht der Wellenlänge 488 nm und wurde zur Anregung

von FITC (λex 495 nm; λem 520 nm), welches an Phalloiden gekoppelt war,

verwendet. Die Cy3-gekoppelten Antikörper (λex 550 nm; λem 570 nm) wurden mit

Licht der Wellenlänge 543 nm durch den Helium-Neon-Laser angeregt. Die

Auswertung der Daten erfolgte mit der Leica Confocal Software und LAS AF Lite.

3.10 Proteinbiochemische Methoden

3.10.1 Zelllyse und Probenvorbereitung

Die Lyse der adhärenten Zellen erfolgte 30 min nach der mechanischen Stimulation.

Sie wurde mit dem Bio-PlexTM Cell Lysis Kit nach Angaben des Herstellers durchgeführt.
Die Zelllysate wurden für mindestens 24 h bei -20 °C gelagert.

Für die Bestimmung der Proteinmenge wurden die Lysate aufgetaut und bei 4 °C und

4 500 x g für 20 min herunterzentrifugiert. Die Überstände wurden in neue Röhrchen
überführt. Die Proteinbestimmung wurde mit dem Qubit® Protein Assay Kit nach
Herstellerprotokoll durchgeführt. Die extrahierten Proteine wurden in Proteinladepuffer
nach Laemmli (1970) aufgenommen. Der Proteinladepuffer enthielt ein

26


Reduktionsmittel. Um die Proteine vollständig zu denaturieren wurden sie für 5 min auf

95 °C erhitzt.

3.10.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die SDS-PAGE wurde zunächst genutzt um die Gleichmäßigkeit des Proteinauftrags mit
Hilfe der Coomassie-Färbung zu bestätigen. Zu diesem Zweck wurden gleiche
Proteinmengen auf ein 10 %iges Polyacrylamid-Gel aufgetragen. Die Auftrennung der
Proteine nach ihrem Molekulargewicht wurde in einer vertikalen Proteingelkammer, die
mit Laufpuffer gefüllt war, bei 180 V durchgeführt. Nach Beenden der Elektrophorese
wurde das Gel aus der Kammer entfernt und für mehrere Stunden mit Coomassie
gefärbt. Die Entfärbung des Gels erfolgte über Nacht. Anhand der Intensität und
Komplexität der Banden konnte der Probenauftrag beurteilt werden.

Um die Proteine weiter im Western Blot zu verwenden, wurde eine weitere SDS-PAGE
durchgeführt. Hierfür wurde das Criterion Precast Gel System verwendet.

Tabelle 1 Zusammensetzung des Sammelgelpuffers (pH 6,8)
Tris 0,5M 6,06  g
SDS 138  mM 0,4  g
H2 O 100  ml

Tabelle 2 Zusammensetzung des Trenngelpuffers
Tris 1,5  M 36,33  g
SDS 10 Mm 0,8  g
H2 O 200  ml

Tabelle 3 Zusammensetzung des Trenngels
H2 O 10,9  ml
Acrylamid (40  %) 5,5  ml
Trenngelpuffer 5,5  ml
TEMED 20  µl
APS (10  %) 300  µl

Tabelle 4 Zusammensetzung des Sammelgels
H2 O 10,2  ml
Acrylamid (40  %) 2  ml
Sammelgelpuffer 4,2  ml

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TEMED 20  µl
APS (10  %) 200  µl

Tabelle 5 Zusammensetzung des Laufpuffers
H2 O 5  l
Tris 45,45  g
Glycin 211,5  g
SDS 15  g

3.10.3 Western Blot und Immundetektion

Der Western Blot wurde als Tank-Blot-Verfahren durchgeführt. Nach der Elektrophorese
wurden die ungefärbten Gele in Transferpuffer bei 370 mA für 1 h auf Membranen aus
Polyvinylidenfluorid (PVDF) transferiert. Im Anschluss wurden die noch freien
Proteinbindungsstellen der Membran mit Proteinen abgesättigt, indem die Membran für
1 h in 5 %iger Blockierungsmilch inkubiert wurde. Die PVDF-Membranen wurden über

Nacht bei 4 °C mit dem Primärantikörper inkubiert. Dieser war im Verhältnis 1:1000
in Blockierungsmilch verdünnt. Danach wurden ungebundene Antikörper durch drei
zehnminütige Waschschritte in Waschpuffer entfernt. Die Inkubation mit dem
Peroxidase gekoppeltem Sekundärantikörper erfolgte für 1 h bei Raumtemperatur.

Dieser lag in einer Verdünnung 1:10 000 in Blockierungsmilch vor. Ungebundene
Antikörper wurden wieder in mehreren Waschschritten entfernt. Danach erfolgte die
Detektion mittels Chemilumineszenz mit dem SuperSignal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate. Hierzu wurde die Membran mit der nach Protokoll hergestellten
Detektionslösung in einer lichtdurchlässigen Folie inkubiert. Die Aufnahme des
Chemilumineszenzsignals erfolgte mit dem Molecular Imager Gel Doc XR System. Die
densitometrische Auswertung wurde mit Quantity One® 1-D Analysis und Image Lab™
vorgenommen.

Tabelle 6 Zusammensetzung des Transferpuffers
Transferpuffer
H2 O 4  l
Tris (25  mM) 9  g
Glycin (190  mM) 43,5  g
Methanol (10  %) 300  ml

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3.11 Bio-Plex-Assay 3 Material und Methoden

Tabelle 7 Zusammensetzung des Waschpuffers
Waschpuffer (10fach)
H2 O 4  l
NaCl 350  g
Tris 48,4  g
Tween20 20  ml
mit H2O auf 5  l auffüllen
mit HCl (37  %) auf pH  7,4 einstellen

3.11 Bio-Plex-Assay

Das Bio-Plex-Verfahren ist eine von der Firma Bio-Rad Laboratories etablierte Methode.
Sie dient der Detektion von Proteinexpressionen und Phosphorylierungen in Zelllysaten
und wird im Format von 96-Well-Mikrotiterplatten durchgeführt. Das Bio-Plex-Verfahren
basiert auf Beads, die in verschiedenen Spektralfarben fluoreszieren. Diese Beads sind
mit Antikörpern gegen verschiedene Zielproteine gekoppelt. Jedem Protein ist hierbei
eine bestimmte Fluoreszenz zugeordnet. Auf diese Weise ist es möglich, verschiedene
Proteine in derselben Probe gleichzeitig differenziert nachzuweisen. Des Weiteren
erfolgt die Detektion über die Bindung eines biotinylierten Sekundärantikörpers, der
gegen ein anderes Epitop des Zielproteins gerichtet ist. An diesen sekundären
Antikörper bindet ein fluoreszierender Streptavidin-Reporter. Der entstandene Komplex
aus Beads, Zielprotein, Antikörpern und Reporter kann mit dem Bio-Plex Array Reader
detektiert werden. Das geschieht über zwei Laser, einen roten und einen grünen. Der
rote Laser ist für die Identifizierung der Proteine über die Farbe der Beads zuständig
und der grüne misst über die Intensität des Reporter Signals die Menge des
gebundenen Zielproteins.

Für diesen Versuch wurde der Bio-PlexTM Phospho-AKT (S473) Assay verwendet. Zuerst
wurden die Beads in die Wells der Multititerplatte gegeben und gewaschen. Im
zweiten Schritt wurden die Zelllysate, die mit dem Bio-PlexTM Cell Lysis Kit vorbereitet
wurden, zu den Beads gegeben und über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurde
die Platte gewaschen, die Biotin-gekoppelten Sekundärantikörper zu den Proben
gegeben und der Ansatz für 30 min inkubiert. Nach erneutem Waschen der Platte
wurde der fluoreszierende Streptavidin-Reporter hinzugefügt und für 10 min inkubiert.
29

3.12 Mechanische Stimulation 3 Material und Methoden

Abschließend wurde die Assay-Platte noch gespült und die Proben in Assay-Puffer
resuspendiert, um dann mit dem Bio-Plex Array Reader gemessen zu werden.

3.12 Mechanische Stimulation

3.12.1 Aussaat

Die mechanische Stimulation der hMSZ wurde in Mikrotiterplatten im 96-Well-Format
(Costar® 96-Well EIA/RIA Stripwell™ Plate) durchgeführt. Pro Well wurden zwischen
7 000 und 9 000 Zellen ausgesät. Die Zellen wurden 24 h vor mechanischer
Stimulation in serumreduziertem Medium bei 0,5 % FKS kultiviert.

3.12.2 Vorbereitung der Mikrobeads

Um die Integrinrezeptoren mechanisch zu reizen, wurden paramagnetische
Mikrobeads mit Antikörpern gegen die β1-Untereinheit der Integrine beschichtet. Die
Beads haben eine Größe von 2,8 µm und sind mit Schaf anti-Maus Antikörpern

beschichtet. Diese Beads wurden dann mit 1 µg Maus anti-β1-Integrin Antikörpern
schüttelnd für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurden die Beads mit PBS
gewaschen und in DMEM resuspendiert. Die präparierten Beads wurden dann auf die
ausgesäten Zellen gegeben und für 30 min inkubiert. 5 bis 10 Mikrobeads binden
durchschnittlich an β1-Integrin-Untereinheiten an der apikalen Seite einer Zelle.

3.12.3 Mechanischer Reiz

Zur Ausübung der mechanischen Stimulation wurde eine spezielle magnetische Anlage
verwendet. Diese Anlage besteht aus Spulen mit einem Eisenkern und zwei
unterschiedlich geformten Polen, zwischen denen das inhomogene Magnetfeld erzeugt
wird. Der Abstand beider Pole voneinander beträgt 1 cm. Die durchschnittliche Stärke

des erzeugten Magnetfeldes liegt bei 0,015 T (Pommerenke et al., 1996).

30

3.13 Statistik und Auswertung 3 Material und Methoden

Die Kulturwells wurden einzeln zwischen den beiden Polen positioniert. Die Zugkräfte
wurden über die an die Rezeptoren gekoppelten Mikrobeads auf die Zellen ausgeübt.
Sie wirkten in horizontaler Ebene, das heißt parallel zur apikalen Seite der Zellen. Die
Kräfte, die auf einen einzelnen Bead wirken, betragen 2 x 10-10 N. Dadurch, dass jede
Zelle mit einer unterschiedlichen Anzahl Beads, die unterschiedlich lokalisiert waren,
beladen war, variierte die ausgeübte mechanische Belastung von Zelle zu Zelle. Bei
dem für 15 min applizierten Reiz handelte es sich um eine zyklische, mechanische

Belastung mit der Frequenz von 1 Hz. Zum Vergleich wurden Zellen jeweils nur mit
Mikrobeads beladen oder dem Magnetfeld ausgesetzt.

3.13 Statistik und Auswertung

Jeder experimentelle Ansatz wurde insgesamt dreimal, jeweils mit Zellen
unterschiedlicher Präparationen, durchgeführt. Die Auswertung der Messwerte erfolgte
mit Microsoft Excel 2010. Von allen Messwerten für die Absorption wurde der
Leerwert subtrahiert. Um eine Aussage über die spezifische metabolische Aktivität der
Zellen treffen zu können, musste der Quotient aus den Werten des MTS- und des
Kristallviolett-Tests gebildet werden. Anschließend wurden die arithmetischen
Mittelwerte gebildet und die Standardabweichungen bestimmt. Die Ergebnisse wurden
dann auf die entsprechenden Kontrollwerte normiert. Zur weiteren Analyse wurde der
ungepaarte t-Test durchgeführt. Als minimales Signifikanzniveau wurde eine
Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 festgelegt. Für Tendenzen wurde eine

Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,1 angenommen.

Die Auswertung der densitometrischen Daten aus der Western Blot-Analyse und der
Messwerte des Bio-Plex-Assays erfolgte mit Microsoft Excel 2010. Für die Analyse
wurde der ungepaarte t-Test durchgeführt. Als minimales Signifikanzniveau wurde eine
Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 festgelegt. Für Tendenzen wurde eine

Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,1 angenommen. Es wurden der arithmetische
Mittelwert sowie die Standardabweichung angegeben. Wobei die Mittelwerte zuvor
auf die entsprechenden Kontrollen normiert wurden.

31

4.1 Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie 4 Ergebnisse

4 Ergebnisse

4.1 Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie

Um den Einfluss der Substanzen Cytochalasin D, Jasplakinolid und Latrunculin A auf
strukturelle und funktionelle Zellparameter untersuchen zu können, mussten zuvor
geeignete Konzentrationen für deren Einsatz bestimmt werden. Es sollten
Konzentrationen verwendet werden, welche die Zellen in ihrer Vitalität nicht
beeinträchtigen. Zu diesem Zweck wurden hMSZ jeweils mit unterschiedlichen
Konzentrationen der Inhibitoren für 24 h inkubiert, um anschließend lichtmikroskopisch
auf morphologische Veränderungen untersucht zu werden.

Die Kontrollzellen in Abbildung 1A zeigen den für hMSZ typischen, Fibroblast
ähnlichen Erscheinungstyp. Die Zellen sind schlank, langgestreckt und weisen keine
Fortsätze auf. Ein sehr ähnliches morphologisches Erscheinungsbild haben die Zellen,
die als Vehikelkontrolle unter Zusatz von 0,1 % DMSO kultiviert wurden

(Abbildung 1B). Diese Zellen sind ebenfalls spindelförmig, schlank und überwiegend
bipolar. Sie weisen kaum morphologische Unterschiede zu den Kontrollzellen auf.
HMSZ, die mit 0,5 µM Cytochalasin D kultiviert wurden (Abbildung 1C), sind in ihrer
Zellform stark verändert. Die Zellen sind nicht mehr länglich sondern rundlich, einige
weisen kleine, kurze Fortsätze auf. Ein Teil der Zellen ist bereits abgekugelt. Zellen die
mit Jasplakinolid der Konzentration 0,01 µM (Abbildung 1D) kultiviert wurden, zeigen
dagegen nur geringfügige morphologische Veränderungen. Sie sind länglich, ähnlich
wie die Kontrollzellen. Im Vergleich sind sie jedoch etwas bereiter und weisen häufig
Verzweigungen auf. Zellen, die für 24 h mit 0,1 µM Jasplakinolid behandelt wurden,

waren größtenteils abgerundet (Abbildung 1E). Nach 24 h Inkubation mit 0,01 µM

Latrunculin A weisen die Zellen keine wesentlichen Veränderungen in ihrer
Morphologie gegenüber den Kontrollzellen auf (Abbildung 1F). Beim Zehnfachen
dieser Konzentration von Latrunculin A sind die Zellen breiter und zeigen einige

Verzweigungen (Abbildung 1G). Ein Teil der Zellen ist bei dieser Konzentration bereits
32

4.1 Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie 4 Ergebnisse

abgerundet. Abbildung 1H zeigt, dass die meisten Zellen bei einer Konzentration von

0,5 µM Latrunculin A abgerundet sind. Nur vereinzelt sind noch stark verzweigte hMSZ

zu sehen.
Kontrolle

A: EM B: DMSO
CytoD

C: 0,5 µM
Jasp

D: 0,01 µM E: 0,1 µM
LatA

F: 0,01 µM G: 0,1 µM H: 0,5 µM

Abbildung 1 Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie von hMSZ
Lichtmikroskopische Aufnahmen von hMSZ nach 24 h Inkubation mit Cytochalasin D (CytoD) (C), Jasplakinolid

(Jasp) (D, E) und Latrunculin A (LatA) (F, G und H), Kontrolle (EM): ohne Inhibitoren (A), Vehikelkontrolle (DMSO):
ohne Inhibitoren, mit DMSO (B)

33

4.2 Einfluss der Inhibitoren auf das Aktinzytoskelett von hMSZ 4 Ergebnisse

4.2 Einfluss der Inhibitoren auf das Aktinzytoskelett von hMSZ

Um Aussagen über den Einfluss der Inhibitoren auf das Aktinzytoskelett treffen zu
können, wurden die Zellen mit Phalloidin-FITC für F-Aktin und einem Antikörper gegen
Vinculin angefärbt und unter dem Konfokalmikroskop analysiert. Abbildung 2 zeigt die
konfokalmikroskopischen Aufnahmen von hMSZ, die für 24  h mit den inhibitoischen
Substanzen Cytochalasin D, Jasplakinolid und Latrunculin A kultiviert wurden.

Bei den Kontrollzellen sind die Aktinfilamente gleichmäßig im Zytoplasma verteilt
(Abbildung 2A bis 2C), sie zeigen ein intaktes, charakteristisches Aktinzytokelett. Die
Aktinfilamente sind gleichmäßig im Zytoplasma verteilt. Die feinen Fasern sind linear
und verlaufen in gleichgerichteten Bündeln entlang der Zellen. Die Aktinfilamentbündel
enden an Vinculinen. Dort sind Aktin und Vinculin kolokalisiert. Die Vinculine sind
gleichmäßig in der Zelle verteilt.

Die Zellen der Vehikelkontrolle (Abbildung 2D bis 2F) zeigen ebenfalls ein typisches
Aktinzytoskelett, in welchem die Aktinbündel weitgehend parallel entlang der Zelle
verlaufen. An den Enden der Aktinbündel sind die Vinculine lokalisiert, diese sind
auffallend lang und überwiegend randständig gelegen.

Nach 24 h Inkubation mit 0,5 µM Cytochalasin D (Abbildung 2G bis 22I) ist das
Aktinzytoskelett weitgehend zerstört. F-Aktin ist fragmentiert und gleichmäßig im
gesamten Zytoplasma verteilt, filamentöse Strukturen sind nur noch vereinzelt zu
erkennen. An den Enden der unzerstörten Aktinfilamente ist auch in diesem Fall
Vinculin lokalisiert. Der Großteil der Vinculine ist jedoch nicht mit Aktin gekoppelt und
ist diffus im gesamten Zytoplasma verteilt. Randständige Vinculine zeigen überwiegend
kurze, längliche, feine Strukturen, während die übrigen fragmentiert und ohne klare
Struktur sind.

34

4.2 Einfluss der Inhibitoren auf das Aktinzytoskelett von hMSZ 4 Ergebnisse

EM A B C

D E F
DMSO

G H I
CytoD 0,5 µM

J K L
Jasp 0,01 µM

M N O
LatA 0,01 µM

P Q R
LatA 0,1 µM

Abbildung 2 Einfluss der Inhibitoren auf das Zytoskelett von hMSZ
Konfokale fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von hMSZ nach Inkubation mit 0,5  µM Cytochalasin  D (G, H und
I), 0,01  µM Jasplakinolid (J, K und L) und 0,01  µM (M, N und O) bzw. 0,1  µM Latrunculin  A (P, Q und R), Kontrolle
(A, B und C): ohne Inhibitoren; Vehikelkontrolle (D, E und F): ohne Inhibitoren, mit DMSO; F-Aktin (grün) und
Vinculin (rot).

35

4.3 Einfluss der Inhibitoren auf die Stoffwechselaktivität und die Proliferation von hMSZ 4 Ergebnisse

In Zellen, die mit 0,01 µM Jasplakinolid (Abbildung 2J bis 2L) inkubiert wurden, sind
die Aktinfilamente verdickt und ungleichmäßig im Zytoplasma verteilt. Die F-Aktin-
Aggregate sind um den Zellkern herum lokalisiert, von dort aus verlaufen sie
strahlenförmig, in stärkeren Bündeln zu den kleinen Fortsätzen, die sich am Zellrand
ausgebildet haben. Dort enden die Aktinbündel in Vinculinen, welche hauptsächlich
randständig lokalisiert sind und in den Fortsätzen gehäuft vorliegen.

Die Abbildungen 2M bis 2R zeigen Zellen, die mit Latrunculin A kultiviert wurden. Bei

einer Konzentration von 0,01 µM Latrunculin A (Abbildung 2M bis 2O) sind die F-
Aktinfilamente leicht gewellt und wirken teilweise verklebt. Die Vinculine, die mit den
Aktinfilamentenden kolokalisiert sind, befinden sich größtenteils am Rand der Zelle. Bei
einer Konzentration von 0,1 µM Latrunculin A (Abbildung 2P bis 2R) sind die
Aktinfilamente stärker gewellt und unregelmäßig im Zytoplasma verteilt, sodass dass
Aktinzytoskelett vereinzelt Löcher zum Zellrand hin aufweist, die Vinculine sind hier
vermehrt im Zentrum der Zelle lokalisiert.

4.3 Einfluss der Inhibitoren auf die Stoffwechselaktivität und die
Proliferation von hMSZ

Um die Stoffwechselaktivität und das Proliferationsvermögen der hMSZ unter dem
Einfluss der drei unterschiedlichen Inhibitoren bestimmen zu können, wurden die Zellen
nach 24-stündiger Inkubation mittels MTS-Test basierend auf zellulären
Dehydrogenaseaktivitäten kolorimetrisch analysiert. Der Kristallviolett-Test diente als
weiterer kolorimetrischer Test zur Bestimmung des Proliferationsvermögens bzw. der
Zahl der lebenden Zellen. Der Farbstoff Kristallviolett färbt die DNS adhärenter Zellen
an.

Die Resultate beider Assays sind in Abbildung 3 dargestellt. Die Werte der
Kontrollzellen sind jeweils auf 100 Prozent gesetzt und dienen als Referenzwerte, alle
anderen Messwerte sind auf diese Referenzwerte normiert.

Die Ergebnisse der Analyse der metabolischen Aktivität, die nach Inkubation mit den
Inhibitoren erhalten wurden, sind in Abbildung 3A dargestellt. Die Absorptionswerte
36


die unter Einfluss von DMSO erhalten wurden, dienen als Vehikelkontrolle und
unterscheiden sich nicht signifikant vom Referenzwert. Die Analysenwerte der Zellen,
die unter 0,5 µM Cytochalasin D, 0,01 µM bzw. 0,1 µM Latrunculin A und 0,01 µM
Jasplakinolid erhalten wurden, zeigen keine signifikanten Unterschiede zu denen der
Kontrollzellen. Zellen, die mit 1,0 µm Latrunculin A und 0,1 µM Jasplakinolid inkubiert

wurden, weisen um 50 Prozent signifikant reduzierte Stoffwechselaktivitäten auf. Beim
Wert für 1,0 µM Jasplakinolid ist keine Standardabweichung angegeben, da es sich
um eine Einzelmessung handelt. Dieser Wert ist deshalb eher als Trend zu betrachten.

Abbildung 3B zeigt die Resultate der Analyse des Proliferationsvermögens. Die
Messwerte der Vehikelkontrolle unterscheiden sich unwesentlich vom Kontrollwert. Die
Analysewerte der Zellen, die unter 0,5 µM Cytocalasin D, 0,01 µM bzw. 0,1 µM

Latrunculin A und 0,01 µM Jasplakinolid erhalten wurden, zeigen ebenfalls keine
signifikanten Unterschiede zu denen der Kontrollzellen. Bei einer Konzentration von
1,0 µM Latrunculin A ist die Proliferation signifikant um mehr als die Hälfte verringert.
Die Verwendung von 0,1 µM Jasplakinolid zeigt ein signifikantes Absinken der
Proliferation gegenüber der Vehikelkontrolle auf um 20 Prozent. Beim Wert für 1,0 µM

Latrunculin A ist keine Standardabweichung angegeben, da es sich um eine
Einzelmessung handelt. Dieser Wert ist deshalb eher als Trend zu betrachten.

Um eine Aussage über die Intensität der Stoffwechselaktivität pro Zelle treffen zu
können, wurde der Quotient aus den Absorbtionswerten des MTS- und des
Kristallviolett-Tests gebildet. Das Ergebnis ist in Abbildung 3C dargestellt. Der Wert der
Kontrolle ist auch hier auf 100 Prozent gesetzt worden, wobei die übrigen Werte auf
diesen normiert sind. Keiner der Werte zeigt einen signifikanten Unterschied zur
Kontrolle, was darauf schließen lässt, dass die Zellen durch die Inhibitoren eine
verminderte Proliferation aufweisen. Die Stoffwechselaktivität der einzelnen Zelle unter
den Inhibitoren bleibt dagegen weitgehend unbeeinflusst.

37


A 200
**
rel. Absorption bei 490 nm in %

**

100

0
EM DMSO 0,5 µM 0,01 µM 0,1 µm 1 µM 0,01 µM 0,1 µM 1 µM

Kontrolle CytoD LatA Jasp

B 200
rel. Absorption bei 570 nm in %

**
100 **

0


C 300
rel. met. Aktivität pro Zelle in %

200

100

0

Abbildung 3 Einfluss der Inhibitoren auf die metabolische Aktivität und die Proliferation von hMSZ
A: MTS-Test (metabolische Aktivität) und B: Kristallviolett-Test (Proliferation) nach 24 h Inkubation mit unterschiedlichen
Konzentrationen der Inhibitoren Cytochalasin D (CytoD), Jasplakinolid (Jasp) und Latrunculin A (LatA), Kontrolle: ohne Inhibitoren
(EM) bzw. mit DMSO; C: Quotient MTS/KV (metabolische Aktivität pro Zelle); Alle Werte wurden auf die Kontrolle normiert,
dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung, eckige Klammern zeigen signifikante Unterschiede (**p ≤ 0,05; n=3).

38

4.4 Einfluss der Inhibitoren auf Signalproteine 4 Ergebnisse

4.4 Einfluss der Inhibitoren auf Signalproteine

Um den Einfluss der Inhibitoren Cytochalasin D, Jasplakinolid und Latrunculin A auf die
Aktivierung der Signalproteine ERK und AKT in Zellen nach mechanischer Stimulation
der β1-Integrin-Untereinheit zu untersuchen, wurde das Western Blot Verfahren bzw.
der Bio-Plex Assay durchgeführt. Alle Zelllysate wurden zum einen auf die Expression
von ERK1/2 und Phospho-ERK1/2 und zum anderen auf die Expression von AKT und
Phospho-AKT untersucht.

Um auszuschließen, dass DMSO, als Lösungsmittel der Inhibitoren, einen Einfluss auf
die Aktivierung der Signalproteine ERK und AKT ausübt, wurden Zellen, die in reinem
EM mechanisch stimuliert wurden, mit Zellen, die in DMSO-haltigem Erhaltungsmedium
mechanisch stimuliert wurden, miteinander verglichen (Abbildung 4). Die Western Blot
Analyse von Phospho-ERK1/2 (Abbildung 4A) zeigt deutlich intensivere Banden
sowohl bei mechanisch stimulierten Kontrollzellen in Erhaltungsmedium als auch bei
denen der Vehikelkontrolle mit DMSO. Clustern der Integrinrezeptoren durch
Inkubation mit den Beads induzierte bereits eine Aktivierung von ERK1/2 im Vergleich
zu Kontrollzellen. Die Aktivierung ist aber geringer als nach mechanischer Belastung
der Integrine durch Zugkräfte. Die densitometrische Auswertung der Western Blot
Analyse (Abbildung 4B) konnte diese Aussagen durch objekte Messswerte bestätigen
und signifikante Unterschiede zwischen Clustern der Rezeptoren und mechanischer
Belastung nachweisen. In beiden Fällen war der Effekt gegenüber den Kontrollzellen
signifikant erhöht.

Die Werte der Vehikelkontrolle zeigen keine signifikanten Unterschiede zu den
entsprechenden Werten der Kontrollzellen in reinem EM. Die Ergebnisse der Bio-Plex
Analyse für die Phosphorylierung von AKT (Abbildung 4C) zeigen ein ähnliches Bild.
Die geclusterten und die mechanisch stimulierten Zellen zeigen beide eine signifikant
erhöhte Signalintensität im Vergleich zur Kontrolle. Die Intensitäten der entsprechenden
Proben, die in reinem EM und unter DMSO erhalten wurden, zeigen keine
signifikanten Unterschiede zueinander. Auf Grund dieser Ergebnisse werden alle

39


Werte der folgenden Untersuchungen mit den Inhibitoren auf die Resultate bezogen,
die unter Behandlung mit DMSO erhalten wurden.

Um herauszufinden, welchen Einfluss die Inhibitoren auf die Phosphorylierung von ERK
und AKT nach mechanischer Stimulation haben, wurde Zellen 24 h vor und auch
während der mechanischen Stimulation mit den entsprechenden Inhibitoren inkubiert.

Nach Behandlung mit 0,5 µM Cytochalasin D ist im Western Blot (Abbildung 5A) die

Aktivierung von ERK sowohl durch Clustern der Integrine als auch nach mechanischer
Stimulation deutlich zu sehen. Dieses Ergebnis wird durch die densitometrische
Auswertung (Abbildung 5B) bestätigt.

Im Falle von AKT (Abbildung 5C) konnte ebenfalls eine Aktivierung nach Clustern der
Integrine gezeigt werden. Für mechanisch stimulierte Zellen dagegen war diese
Aktivierung unter dem Einfluss von Cytochalasin D gehemmt.

40


A

B 2100 **
**
1800
phERK
1500
Intensität in %

1200 **
EM
900 DMSO 0,1 %

600

300

0
K Cl MF Reiz

C
600

**
500

phAKT
400
**
Intensität in %

EM
300
DMSO 0,1 %
200

100

0
K Cl MF Reiz

Abbildung 4 Einfluss mechanischer Stimulation auf die Phosphorylierung von ERK und AKT in hMSZ
A: Western Blot Analyse der Phosphorylierung von ERK1/2, die dargestellten Blots sind repräsentative Beispiele aus neun
unabhängigen Experimenten. B: Densitometrische Auswertung der Western Blot Analyse der Phosphorylierung von ERK1/2.
C: Quantitative Analyse (Bio-Plex) der Phosphorylierung von AKT. Kontrolle: ohne Inhibitoren (EM) bzw. mit DMSO;
K: unbehandelte Kontrolle, Cl: mit Beads geclustert, MF: Magnetfeld, Reiz: mechanische Stimulation. (B, C) Dargestellt sind
Mittelwert und Standardabweichung, alle Werte wurden auf die Kontrolle in EM normiert, eckige Klammern zeigen signifikante
Unterschiede (* p ≤ 0,1; **p ≤ 0,05; n=9).

41


A

B
700
*

600 *
phERK
500
Intensität in %

400
DMSO 0,1 %
300 CytoD 0,5 µM

200

100

0
K Cl MF Reiz

C
700

*
600

phAKT
500
Intensität in %

400
DMSO 0,1 %
300 ** CytoD 0,5 µM

200

100

0
K Cl MF Reiz

Abbildung 5 Einfluss mechanischer Stimulation auf die Phosphorylierung von ERK und AKT in hMSZ nach
Inkubation mit Cytochalasin D
A: Western Blot Analyse der Phosphorylierung von ERK1/2, die dargestellten Blots sind repräsentative Beispiele aus drei
C: Bio-Plex Analyse der Phosphorylierung von AKT. K: unbehandelte Kontrolle, Cl: mit Beads geclustert, MF: Magnetfeld, Reiz:
mechanische Stimulation. (B, C) Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung, alle Werte wurden auf die Kontrolle in EM
normiert, eckige Klammern zeigen signifikante Unterschiede (* p ≤ 0,1; **p ≤ 0,05; n=3).

42


Die Analyse der Zellen, die mit 0,01 µM Jasplakinolid behandelt wurden, zeigen im
Western Blot eine verstärkte Phosphorylierung von ERK nach Clustern und mechanische
Stimulation (Abbildung 6A). Durch die densitometrische Analyse wird dieses Ergebnis
bestätigt (Abbildung 6B). Für Phospho-AKT konnte ein ähnliches Ergebnis gezeigt
werden(Abbildung 6C). In Anwesenheit von Jasplakinolid bleibt die Aktivierung von
AKT durch mechanische Reize am β1-Integrin unverändert.

Die Resultate der mechanischen Stimulation unter dem Einfluss von 0,1 µM
Latrunculin  A zeigen im Western Blot, dass die Aktivierung von ERK unter Einfluss des
mechanischen Reizes durch Latrunculin  A komplett gehemmt wird. Weder durch
Clustern noch durch mechanisches Ziehen an Integrinen wird Phospho-ERK exprimiert
(Abbildung 7A). Die densitometrische Auswertung bestätigt das Ergebnis und zeigt,
dass die Expression von Phospho-ERK bei mechanischer Reizung unter dem Einfluss
von Latruculin A gehemmt ist (Abbildung 7B). Unter dem Einfluss von Latrunculin  A ist
die Aktivierung von AKT infolge eines mechanischen Integrinreizes völlig blockiert
(Abbildung 7C). Es ist im Vergleich zu den unbehandelten Zellen kein Anstieg der
Signalintensität für geclusterte und mechanisch stimulierte Zellen mit Latrunculin  A zu
sehen.

43


A

B 800 **

700
phERK
600
Intensität in %

500

DMSO 0,1 %
400
Jasp 0,01 µM
300

200

100

0
K Cl MF Reiz

C 700
*

600

phAKT
500
Intensität in %

400
DMSO 0,1 %
*
300 Jasp 0,01 µM

200

100

0
K Cl MF Reiz

Inkubation mit Jasplakinolid
C: Quantitative Analyse (Bio-Plex) der Phosphorylierung von AKT. K: unbehandelte Kontrolle, Cl: mit Beads geclustert,
MF: Magnetfeld, Reiz: mechanische Stimulation. (B, C) Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung, alle Werte wurden
auf die Kontrolle in EM normiert, eckige Klammern zeigen signifikante Unterschiede (* p ≤ 0,1; **p ≤ 0,05; n=3).

44


A

B 700
**

600

phERK
500
*
Intensität in %

400
DMSO
300 LatA 0,1 µM

200

100

0
K Cl MF Reiz

C 700

**
600

phAKT
500
Intensität in %

400
DMSO 0,1 %
**
300 LatA 0,1 µM

200

100

0
K Cl MF Reiz

Inkubation mit Latrunculin A
C: Quantitative Analyse (Bio-Plex) der Phosphorylierung von AKT. K: unbehandelte Kontrolle, Cl: mit Beads geclustert,
MF: Magnetfeld, Reiz: mechanische Stimulation. (B, C) Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung, alle Werte wurden
auf die Kontrolle in EM normiert, eckige Klammern zeigen signifikante Unterschiede (* p ≤ 0,1; **p ≤ 0,05; n=3).

45

5 Diskussion

5 Diskussion

Ziel der Untersuchungen war es die Beteiligung des Aktinzytoskeletts bei mechanischer
Belastung und daraus resultierenden Signaltransduktionswegen zu beurteilen. Zu
diesem Zweck wurde das Aktinzytoskelett im Zuge der mechanischen Belastung mit
inhibitorischen Substanzen behandelt, welche gezielt Polymerisierungs- oder
Depolymerisierungsprozesse durch unterschiedliche Mechanismen beeinflussen.

Dafür wurden zu Beginn die spezifischen Effekte der Inhibitoren auf die Morphologie
und das Aktinzytoskelett untersucht. Cytochalasin D als destabilisierende und
depolymerisierende Substanz bewirkte die vollständige Zerstörung des
Aktinzytoskeletts in unseren Untersuchungen. Intakte Aktinfilamente sind gemeinsam mit
Integrinen für eine optimale Zelladhäsion notwendig. Angesichts dieser Tatsache ist
davon auszugehen, dass auf Grund der Zerstörung der Aktinfasern durch
Cytochalasin D die Adhäsionsstärke der Zellen zum Substrat abnimmt und sich die

Zellen folglich leicht vom Untergrund ablösen könnten. Wie wir nachweisen konnten,
veränderte sich nach Gabe von Cytochalasin D die Form der Zellen grundlegend, die
Zellen sind rundlich. Bestätigt werden solche morphologischen Veränderungen auch
durch andere Studien. Neuhuber et al. (2004) konnte zeigen, dass MSZ unter Zugabe
von Cytochalasin D eine Neuronen ähnliche Morphologie ausbilden. Auch wurde

beschrieben, dass sich die Zellform von Osteoblasten und Fibroblasten nach
Behandlung mit Cytochalasin D abrundet und dabei die Höhe der Zellen zunimmt

(Charras und Horton, 2002; Ujihara et al., 2008). Zellfunktionen wie z. B.
Adhäsionsstärke, Differenzierung und Proliferation stehen in engem Zusammenhang
mit der Zellform (Chen et al., 1997; Roskelley et al., 1994). Das lässt darauf
schließen, dass Cytochalasin D durch seine morphologischen Effekte möglicherweise

verschiedene zelluläre Prozesse beeinflussen kann. So beschrieben beispielsweise
McBeath et al. (2004) einen Zusammenhang zwischen Zellform und
Differenzierungsrichtung. Durch die Form der Zelle wirken über das Zytoskelett
mechanische Kräfte auf die Zelle. Diese mechanische Spannung ist umso größer, je

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Anne Langenbach: “Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischen Belastung von humanen mesenchymalen Stammzellen”

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