Cours Yvon Gervaise 5è année Ingénieurs ENSCR Méthodes d'isolement et de séparation des molécules biologiques le 30 janvier 2014. Techniques et processus d'analyses Champs d'application Nouveaux enjeux: Applications en agro-industries et en chimie verte

1. RENNES / ENSCR– 30 janvier 2014
Conférence Yvon Gervaise à destination des
Ingénieurs 5è année ENSCR
Méthodes d’isolement & de séparation de
molécules biologiques
-Techniques et processus d’analyses
-Champ d’application et nouveaux enjeux
M. Yvon Gervaise
Expert de justice
Directeur SGS Multilab Rouen

2. SOMMAIRE
Méthodes d’isolement & de séparation de molécules
biologiques
•
Champ d’application et nouveaux enjeux
•
Intérêt
•
Aspects industriels
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2

3. SOMMAIRE PREMIÈRE PARTIE
Champ d’application : Chimie moléculaire des produits
naturels
•
•
•
Alimentation profils nutritionnels – nutrition santé
Actifs végétaux en chimie fine, en cosmétique et
pharmaceutique
– Cas des polyphénols et des antioxydants naturels
Chimie verte, cas du biofuel
Intérêt
•
•
Réglementation : allégation
Technologique valorisation agro ressources
Aspect méthodologique, techniques analytiques.
Méthodes d’extraction
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3

4. DÉTERMINANTS DE LA QUALITÉ ET DE LA
SÉCURITÉ ALIMENTAIRE ET LEUR
ÉVALUATION
Déterminants : facteurs
de qualité et de sécurité
alimentaire aujourd’hui
Ces facteurs dépendent :
Évolution des exigences
Évolution des tendances
Évolution des filières
Dynamique des
évènements
• Recherche de valeur
ajoutée
•
•
•
•
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Évaluation :
Expertise produit / expertise analytique
conjonction
• Prise en compte des
caractéristiques du produit et de
l’analyte
• Pertinence des critères analysés
• Performance analytique
• Protocoles analytiques répondant
aux exigences règlementaires
• Maîtrise de nouvelles techniques et
appareils
• Méthode validée et accréditée
• Stratégie analytique répondant aux
attentes du client
4

5. DÉTERMINATION DE LA QUALITÉ ET DE LA
SÉCURITÉ DANS LA FILIÈRE AGRICOLE ET
ALIMENTAIRE
-> QU’EST-CE QUI LES DÉFINIT?
Déterminant exposition <-> VTR, (Valeur Toxicologique de
Référence)
Déterminant apport
<-> VNR (Valeur Nutritionnelle de
Référence)
Déterminant technologique
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<-> VT ( Valeur Technologique)
5

6. ALIMENTATION PROFILS NUTRITIONNELS
NUTRITION SANTÉ
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13. DE L’ANALYSE DU NUTRIMENT AU PROFIL
NUTRITIONNEL
Dosage mono et di-saccharide par chromatographie
liquide
Dosage Amidon méthode enzymatique
Dosage des fibres
Dosage des FOS
Étiquetage pour 100g de produit :
• Glucides dont
– Sucres (g)
– Polyols (g)
– Amidon (g)
Classification structurale des principaux glucides
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14. CLASSIFICATION STRUCTURALE PROPOSÉE
DES PRINCIPAUX GLUCIDES (Rapport AFSSA)
Classe (DP)
Sucres (1-2)
Sous-groupe
Principaux composés
Malto-oligosaccharides
Maltodextrines
Raffinose, satchyose, verbascose, ajugose
(αgalactosides),
fructo-oligosaccharides, galactooligosaccharides
Amidon
Amylose, amylopectine, amidons modifiés
Polysaccharides non
amylacés
Cellulose, hémicelluloses (ex: galactanes,
Arabinoxylanes), pectines, inuline, hydrocolloïdes
(ex:guar)
De type monosaccharidique
Sorbitol, mannitol, xylitol, érythritol
De type disaccharidique
Isomalt, lactitol, maltitol
De type oligosaccharidique
Sirops de maltitol, hydrolysats d’amidon hydrogénés
De type polysaccharidique
Glucides hydrogénés
(polyols)
Saccharose, lactose, tréhalose, maltose, isomaltulose
Autres oligosaccharides
Polysaccharides (>9)
Glucose, galactose, fructose, tagatose
Disaccharides
Oligosaccharides (3-9)
Monosaccharides
Polydextrose
Source: Gray,2003
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15. MÉTHODE DE DOSAGE DES SUCRES
Textes de référence
• Méthode AOAC 982.14 : Glucose, Fructose, Sucrose, and
Maltose in Preweetened Céréals ; Liquid Chromatographic
méthod (1993).
• Méthode AOAC 980.13 : Fructose, Glucose, Lactose, Maltose
in Milk Chocolate Liquid Chromatographic méthod (1993)
Méthode : HPLC réfractométrie/ HPIC ampérométrique
Objet et domaine d’application (Notre méthode a été testée
sur des matrices diverses) :
•
•
•
•
Pâtes, Biscuits, Céréales
Confiture
Produits laitiers
Substituts de repas
Le domaine d'application est étendue aux matrices des essais
inter laboratoires.
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16. DOSAGE DU SUCRE : EXEMPLE DE
CHROMATOGRAMME
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17. DOSAGE DU SUCRE : EXEMPLE DE
CHROMATOGRAMME - 2
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18. DOSAGE DES POLYOLS : EXEMPLE DE
CHROMATOGRAMME
Dosage :
chromatographie
ionique
Détection :
ampérométrie
pulsée
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19. DOSAGE DES FOS : EXEMPLE DE
CHROMATOGRAMME
Dosage :
chromatographie
ionique
Détection :
ampérométrie
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20. ANALYSE DES FIBRES
Méthode de référence AOAC 985.29
Principe du protocole de dosage des fibres en 7 étapes
1.
Séché
2.
Dégraissé si > 3% Matières grasses
3.
Gelatinisé avec α amylase
4.
Hydrolyse enzymatique avec protéase (élimine les protéines)
5.
Hydrolyse enzymatique avec amyloglucosidase (élimine l’amidon)
6.
Précipitation des fibres par l’éthanol
7.
Filtration sur fritté avec séchage-pesage
a) Partie aliquote : détermination protéine restante
b) Partie aliquote : détermination matière minérale (cendres)
Formule de calcul simplifiée des fibres alimentaires
Fibres alimentaires = Masse de résidus – Masse (protéines + cendres) issus du résidu
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21. PROFIL LIPIDIQUE
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22. PROFIL LIPIDIQUE : GÉNÉRALITÉS
Les acides gras saturés (AGS)
•
•
•
Pas de doubles liaisons
Rôle énergétique
On les trouve dans les viandes, charcuterie, produits
laitiers gras
Les acides gras monoinsaturés (AGMI)
•
Une seule double liaison on les trouve dans les
huiles d’olives, de colza tendance à diminuer le taux
de cholestérol
Les acides gras polyinsaturés (AGPI)
•
Plusieurs doubles liaisons possibles -> tendance à
diminuer le taux de cholestérol
Les acides gras trans
•
Géométrie de la double liaison est « trans » dans la
nature, la géométrie trans est peu fréquente.
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Les acides gras
sont des
molécules
organiques
composées d’une
chaîne carbonée,
terminée par une
fonction
carboxylique.
Certains acides
gras sont produits
par notre
organisme,
d’autres doivent
être apportés par
l’alimentation.
Il existe 4 grandes
familles d’acides
gras :
22

23. PROFIL LIPIDIQUE : LES ACIDES GRAS OMÉGA-3
Ce sont des acides gras polyinsaturés dont la double liaison
la plus proche du CH3 terminal est portée par le 3ème carbone.
Ce sont des acides gras essentiels.
Principaux oméga-3 :
Seul oméga-3 dit
« essentiel »
Oméga-3 qui
peuvent être
synthétisés par
l’organisme ou
apporter par
certains aliments
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24. PROFIL LIPIDIQUE : LES ACIDES GRAS OMÉGA-3
Huile
de noix
Saumon
Épinard
% ANC en Oméga3
60 % en ALA
Source d’oméga-3
- Huile de lin, huile de noix,
huile de colza
riche en ALA
800 % en
DHA
10 % en ALA
- Poissons gras
riche en EPA et DHA
- Légumes verts, salades,
cheval, gibier, …
ANC : Apports Nutritionnels Conseillés en Oméga 3
2g / jour pour ALA et 120 mg / jour pour DHA
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25. PROFIL LIPIDIQUE : LES ACIDES GRAS OMÉGA-6
Ce sont des acides gras polyinsaturés dont la double liaison
la plus proche du CH3 terminal est portée par le 6ème carbone.
Ce sont des acides gras essentiels.
Principaux oméga-6 :
Acide linoléique (AL)
C18 : 2 ω6
Seul acide gras essentiel
Acide arachidonique (AA) : C20 : 4 ω6
Acide γ-linolénique (AGL) : C18 : 3 ω6
Acide dihomo-γ-linolénique (ADGL) : C20 : 3 ω6
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Ces acides gras
peuvent être
synthétisés par
l’organisme
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26. PROFIL LIPIDIQUE : LES ACIDES GRAS OMÉGA-6
Source d’oméga-6
Teneur en g / 100 g
Huile de tournesol
50 à 70
Margarine au tournesol
30 à 50
Graisse de poulet
10 à 30
Œuf entier
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1 à10
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27. PROFIL LIPIDIQUE : LES ACIDES GRAS SATURÉS
ET TRANS
Les acides gras trans
Ce sont des acides gras insaturés possédant une ou
plusieurs insaturations.
Les 2 hydrogènes sont de part et d’autre du plan
de la liaison
Leur géométrie « trans » est peu fréquente dans la
nature. Ils sont essentiellement issus de techniques
industrielles comme :
- Hydrogénation catalytique
- traitements thermiques (pour les huiles)
Cependant, on peut tout de même en retrouver dans
quelques aliments comme la viande de bœuf ou les
produits laitiers (biohydrogénation ruminale).
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28. PROFIL LIPIDIQUE : LES ACIDES GRAS SATURÉS
ET TRANS
Exemple de rôle néfaste de ces acides gras
Quelques sociétés ont décidé de modifier, depuis le 1er mai
2007, la composition de leurs huiles de fritures de manière à
diminuer la présence de ces acides gras saturés et trans.
Nouvelle huile de
friture
Ancienne huile de
friture
Taux d’acides gras
trans
- de 2 %
12 %
Taux d’acides gras
saturés
- de 10 %
15 %
Leur nouvelle huile est un mélange d’huile de colza oléique,
d’huile de tournesol oléique et d’huile de colza (25/65/10).
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29. PROFIL LIPIDIQUE : DOSAGE
Dosage de la matière grasse :
• Arrêté du 08/09/1977, du 05/02/1980, NF ISO
8262-3, Weilbull,…
– Hydrolyse acide à chaud
– Extraction soxhlet de la matière grasse à
l’aide d’un solvant.
Profil lipidique : Détermination en acide gras
saturés, mono insaturés, polyinsaturés, oméga 3,
oméga 6, EPA, DHA et acides gras Trans.
• Méthodes :
ISO 5508 – ISO 5509 – ISO 15304
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30. PROFIL LIPIDIQUE : LES ACIDES GRAS
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31. PROFIL LIPIDIQUE : LES ACIDES GRAS TRANS
Extrait d’un
biscuit
Extrait d’un
produit laitier
C18:1 11 trans n-7 :
Acide Vaccénique
Présence
d’acides gras
trans naturels:
C18:2 conj 9c11t :
Acide Ruménique
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32. PROFIL LIPIDIQUE : DOSAGE DES STÉROLS
Textes de référence
Méthode NF EN ISO 12228 : Détermination de la teneur en stérols individuels
et totaux
Principe :
• Saponification d’une prise d’essai par une solution
éthanolique d’hydroxyde de potassium à ébullition sous
reflux.
• Isolement de l’insaponifiable par extraction en phase
solide sur une colonne d’oxyde d’aluminium.
• Séparation de la fraction stérolique de l’insaponifiable par
chromatographie sur couche mince.
• Détermination de la composition qualitative et
quantitative de la fraction stérolique par chromatographie
en phase gazeuse, en utilisant un étalon interne.
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33. PROFIL LIPIDIQUE : LES STÉROLS
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34. EXEMPLE DE BULLETIN D’ANALYSE “PROFILS
LIPIDIQUES”
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35. PROFIL SPÉCIFIQUE
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36. VITAMINES : GÉNÉRALITÉS
Deux familles :
•
Hydrosolubles :
B1 : Thiamine
B2 : Riboflavine
B3 (PP) : Niacine
B5 : Ac Pantothénique
B6 : Pyridoxine
B8 (H) : Biotine
B9 : Ac Folique
B12 : Cobalamine
C : Ac Ascorbique
•
Liposolubles
A : Rétinol
E : Alpha tocophérol
D3 : Cholécaliciférol
K 1 : Phylloquinone
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37. VITAMINES : DOSAGE DE LA B12
Vitamine B12 est extraite au tampon phosphate au bain à 37° puis
C
au bain à 100° en présence d’enzymes (α-amylase et pepsine)
C
Méthode : HPLC
UV (méthode
interne)
Objet et domaine
d’application (Notre
↓
L’extrait est ensuite purifié et concentré lors d’un passage sur
des colonnes d’immuno-affinité spécifiques à la vitamine B12
méthode a été testée sur des
matrices diverses ):
•
•
•
•
Pâtes, Biscuits,
Céréales
Produits laitiers
Compléments
alimentaires
….
L’extrait obtenu est dosé en HPLC/phase inverse avec détection UV à 361 nm
Vitamine B12 ▲
Impuretés ■
Gel contenant des anticorps monoclonaux ●
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38. VITAMINES : DOSAGE DE LA B12
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39. VITAMINES : DOSAGE DE LA D3
Méthode : NF EN 12821 (HPLC UV)
Objet et domaine d’application (Notre méthode a été testée
sur des matrices diverses ):
• Pâtes, Biscuits, Céréales
• Produits laitiers
• Huiles
• Compléments alimentaires, Substituts de repas
Principe :
• Saponification de la vitamine D par une solution de
potasse éthanolique suivie d’une extraction à l’éther de
pétrole.
• Purification en chromatographie liquide en phase
normale pour isoler le vitamine D
• Dosage de la vitamine D par chromatographie liquide
en phase inverse avec détection UV
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40. VITAMINES : DOSAGE DE LA D3
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41. DOSAGE DES VITAMINES A et E DANS LES
PRODUITS AGROALIMENTAIRES
Texte de Référence
Vitamine A : NF EN 12823-1 (janvier 2001) ou V03-130-1 (partie 1)
Vitamine E : NF EN 12822 (janvier 2001) ou V03-132
Méthodes
• Dosage de la vitamine A (tout-trans-rétinol et du 13-cis-rétinol)
en HPLC dans les produits alimentaires
• Dosage de la vitamine E (alpha, béta, gamma et deltatocophérols) en HPLC dans les produits alimentaires
Applications
• Corps Gras : Margarines, huiles, beurres…
• Produits laitiers
E lé m e n t
d osé
V it a m in e
A
V it a m in e
E
C o lo n n e
E lu a n t
D é b it
T em ps de
l’ in je c t io n
V o lu m e
in je c t é
A d so ro s p h e re S I
5 µm
(2 5 0 × 4 ,6 m m )
Is o o c t a n e
9 9 /1
p r o p a n o l-2
1
m L / m in
25 à 30
m in u t e s
1 0 0 µL
D é t e c t io n
UV 32 5nm
F lu o Ex
2 9 5 nm et
Em 3 2 6 n m
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42. DOSAGE DE LA VITAMINE C
Texte de référence :
Projet CGD4UMA-C24-/ Détermination of vitamin C in foodstuffs by HPLC
Mark.A -volume 52 , N°
1,1987-Journal of Food Science-53."Détermination of
Ascorbic Acid, Erythorbic Acid,and Uric Acid in Cured Meats by HPLC"
Ann. Fals. Exp. Chim. – Juillet-Août-Septembre 1997 – N°
940 pp217-233.
"Application de la chromatographie en phase liquide haute performance à la détermination
de l'acide L-ascorbique et de la vitamine C totale dans les aliments. Etude interlaboratoire"
Norme NF EN 14130 (décembre 2003) "Produits alimentaires : dosage de la
vitamine C par chromatographie liquide haute performance".
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43. DOSAGE DE LA VITAMINE C
Applications
• Jus de fruits, barres céréalières, biscuits, produits laitiers,
légumes
Principe de la méthode
• Cette méthode permet le dosage de la vitamine C (forme
réduite et oxydée). Résultat exprimé en mg/100 g.
• L’acide L-ascorbique est extrait des produits à l’aide de l'acide
métaphosphorique à 2 % afin d’être analyser. La teneur en
acide L-ascorbique est déterminée par HPLC à une longueur
d’onde d’absorption de 254 nm.
• Afin d’obtenir la teneur en vitamine C totale, on effectue une
étape de réduction à l’aide de la L-cystéine sur l’acide Ldéhydroascorbique.
Acide L-déhydroascorbique + L-cystéine
acide L-ascorbique + L-cystine
• Cette réaction se fait à un pH neutre, d'où l'ajout d'une base
(dans le cas présent le Na3PO4) ; puis ensuite on ramène à
un pH acide par ajout d'acide métaphosphorique.
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44. DOSAGE DE LA VITAMINE C : EXEMPLE DE
CHROMATOGRAMME D’UNE COMPOTE
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45. VITAMINES : ALLÉGATIONS
VITAMINES
AJR
Vitamine A
800 µg
Vitamine D
5 µg
Vitamine E
10 mg
Vitamine K
100 µg
Vitamine C
60 mg
Vitamine B1
1,4 mg
Vitamine B2
1,6 mg
Vitamine B3
18 mg
Vitamine B5
6 mg
Vitamine B6
2 mg
Vitamine B8
150 µg
Vitamine B9
200 µg
Vitamine B12
Règlement CE n°1924/2006 du 20 Décembre 2006
1 µg
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Sources de vitamines :
Si le produit contient plus de 15 %
des AJR pour les solides.
Si le produit contient plus de 7,5
% des AJR pour les liquides.
Riche en vitamines :
Si le produit contient plus de 30 %
des AJR pour les solides.
Si le produit contient plus de 15 %
des AJR pour les liquides.
45

46. ACTIFS VÉGÉTAUX EN CHIMIE FINE, EN
COSMÉTIQUE ET PHARMACEUTIQUE
Cas des polyphénols et des antioxydants naturels
Dosage des polyphénols totaux
Quantification des fractions actives de polyphénols
stratégie analytique
exemples concrets
retour d’expérience
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47. DOSAGE DES POLYPHÉNOLS TOTAUX
Principe
Développement de la méthode et optimisation de
la mise en œuvre
Choix des conditions de méthodes optimisées
• extraction
• réaction avec le réactif
• courbe de calibration
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48. MISE EN OEUVRE DE LA MÉTHODE FOLIN
CIOCALTEU
Extraction par des alcools :
stratégie des extractions
Paramètre :
solvant (éthanol, méthanol dilués dans l’eau)
température
temps
en fonction de la matrice :
chocolat, thé vert, vigne rouge, complément alimentaire, graine de soja
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49. choix des conditions de méthodes optimisées
extraction
réaction avec le réactif
dosage spectrophotométrique (à 765 nm)
courbe de calibration
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50. Absorbance
courbe d'étalonnage
1,4
1,2
1
y = 0,0123x
R2 = 0,9978
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
20
40
60
80
100
120
concentration (ppm)
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50

51. EXPRESSION DES RÉSULTATS :
RÉSULTATS DES ESSAIS RÉALISÉS SUR LES
DIFFÉRENTES MATRICES À 20°C
Échantillons
Chocolat 1848 86%
1
2
Thé vert
1
2
Gélules Juvamine
1
2
Cocktail de fruits
rouges
1
2
Poids de la
prise d’essai
(g)
Absorbance
Concentration en
polyphénols
(mg/g)
1,03407
1,03804
0,112
0,107
18,2033
17,3242
1,05605
1,04778
0,276
0,291
219,6229
233,3866
0,079
0,08
(mg/2comprimés)
13,2773
13,4454
0,248
0,239
(mg/L GAE)
1042,0168
1004,2017
2 comprimés
2 comprimés
Dilution 1/50
Dilution 1/50
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51

52. QUANTIFICATION DE LA FRACTION ACTIVE DES
POLYPHÉNOLS
Progrès récents en analyses :
3 exemples :
- en fonction de la matrice :
thés, extrait de raisin, chocolat, graine de soja
- en fonction polyphénols quantifiés :
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52

53. Polyphénols
Acides phénoliques
Flavonoïdes
Tanins
Lignanes
Saponines
Phytostérols/ Phytostanols
Resvératrol
Matairésinol
Glycosides
triterpéniques
Campestérol
Stigmastérol
O
OH
HO
O
CH3CO
OH
O
OH
OH
O
OH
O
OMe
OH
O
H
CH2OH HO
HO
OH
Matairésinol
HO
OH
CH2 OH
O
OH
OH
HO
COOH
Acide gallique
O
OH
O
OH
CH2 OAc
COOH
HO
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
Stilbènes
Polymères de
flavonoïdes
Dérivés acide benzoïque
Ex: acide gallique
Dérivés acide cinnamique
Ex: acide caféique
Saponine de soja
OH
Tanin condensé
HO
OH
Campestérol
Trans- resveratrol
Flavones
Isoflavones
Dihydroflavonols
Apigénine
Chrysine
Lutoléine
HO
Flavonols
Kaempferol
Myricétine
Quercétine
Génistéine
Daidzéine
Génistine
Daidzine
Dihydroquercétine
HO
O
Flavanones Anthocyanidines
Naringénine
Hespérétine
Taxifoline
Flavanols
Cyanidine
Péonidine
Catéchine
Epicatéchine
OH
OH
O
HO
OH
O
HO
OH
OH O
Chrysine
O
OH
OH
Génistéine
OH
OH
OH
HO
HO
O
OH
OH
OH
O
Quercétine
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
OH
O
Dihydroquercétine
OH
OH
O
OH
OH
Naringénine
HO
O
O
O
OH
Catéchine
+
OH
OH
Cyanidine
53

54. EXEMPLE 1 DE PROTOCOLE D’EXTRACTION ET DE
QUANTIFICATION DES ISOFLAVONES (TECHNIQUE DE WANG
ET MURPHY)
Échantillon
(à l’abri de la lumière directe)
Peser m = 200 mg
Acétonitrile 10 ml
+ HCI 0,1 M (2 ml)
+ H20 (5 ml)
Extraction durant 2 heures par agitation
Filtration
Quantification
des
isoflavones
grâce à la
gamme
d’étalonnage
Injection en HPLC de 10
l
détection à 260 nm
Eluant : eau à 0,1 %
d’acide acétique
Eluant : acétonitrile
à 0,1 % d’acide acétique
Evaporation du filtrat
au rotavapor
Reprise du résidu sec dans
10 ml méthane 80 %
Filtration sur membrane de
0,45 m
Les différentes formes de ces composés sont additionnées afin de déterminer la
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
quantité totale en isoflavones dans l’échantillon
54

55. Isoflavones
daidzéine
génistéine
daidzine
génistine
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
55

56. EXEMPLE 2 : CAS DU THÉ VERT ET DU
CHOCOLAT
EpiGalloCathéchineGallate (EGCG) :
prépondérant dans le thé vert
Catéchine et épicatéchine :
prépondérant dans le chocolat
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
56

57. Dégraissage :
Broyage de l’échantillon
- prendre une prise d’essai (5g)
- ajouter 50ml d’éther de pétrole
- mélanger pendant 30 mn et
centrifuger
- éliminer le surnageant et sécher
peser mg d’échantillon
ajouter 2 / 3 de solution
d’extraction
injecter dans l’HPLC
filtrer sur Millex
laisser refroidir et
compléter avec de
la solution
d’extraction
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
passer aux ultra-son
pendant 15 mn
passer les fioles au bain marie à
60 °C pdt 30 mn en agitant
57

58. Catéchines
Epicatéchines
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – Euroforum30/01/2014
ENSCR – - Polyphénols, le 12/10/04
58

59. EXEMPLE 3 : LES PHYTOSTÉROLS
Structures
Définition : hydrocarbures
polycycliques se trouvant dans
la fraction lipidique des plantes
campesterol
HO
Sources :
stigmastérol
HO
huiles végétales
noix
légumineuses
légumes
HO
sitostérol
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
59

60. Extraction
purification sur CCM
dérivation
dosage CPG / FID
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
60

61. PROGRÈS RÉCENT DES ÉVOLUTIONS
DE TECHNIQUES ANALYTIQUES
suivant des méthodes séparatives :
- HPLC
- GC / MS / MS
différents types de détection :
- barrettes de diode
- UV
- MS / MS
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
61

62. LE DOSAGE DES POLYPHÉNOLS EST UN CAS
PARTICULIER
Des antioxydants naturels :
- les caroténoïdes (Bétacarotène =
provitamine A, lycopène)
- les tocophérols (vitamine E)
- la vitamine C
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
62

63. AUTRES ANTIOXYDANTS NATURELS
Les tocophérols ou vitamine E
CH3
CH3
HO
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
C’est un antioxydant liposoluble que l’on trouve, entre autres, à
l’état naturel dans la sauge et le romarin, l’huile de germe de
blé, d’olive, de tournesol, de carthame.
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
63

64. AUTRES ANTIOXYDANTS NATURELS
Les caroténoïdes : bétacarotène, lycopène, lutéine
(pigments)
CH3
CH3
CH3
CH3
H3C
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
ß
carotène
CH3
CH3
H3C
CH3
CH3
lycopène
CH3
CH3
CH3
Ce sont des antioxydants liposolubles que l’on retrouve dans des
légumes comme les carottes, le brocoli, la tomate, la citrouille...
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64

65. AUTRES ANTIOXYDANTS NATURELS
Les anthocyanes :
• pigments qui donnent une coloration rouge-violet à bleu
• principalement présent dans les baies et les fruits rouges
(cassis,
myrtilles, raisin noir)
Les tanins condensés :
• ce sont des substances phénoliques ayant des propriétés de
fixation aux protéines
• principalement présents dans le vin et le thé où les tanins
condensés
sont essentiellement formés à partir de monomères telle que la
catéchine
Les oligo-éléments tels que le zinc et le sélénium
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65

66. AUTRES POLYPHÉNOLS
Les flavonoïdes représentent un groupe de
polyphénols complexes dont la structure comprend
deux noyaux aromatiques et un hétérocycle oxygéné
Les principales sources naturelles sont la fraise, le thé noir
et vert, les épinards, le raisin noir...
Les 4 oxo-flavonoïdes sont :
• les flavonols
• les citroflavonoïdes
• les isoflavones
Ce sont des pigments de couleur jaune variable, très
abondants
dans les légumes feuilles, ou le soja pour les isoflavones
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66

67. AUTRES ANTIOXYDANTS : PRINCIPALES
SOURCES
Vitamine C
Agrume, kiwi, fraise, papaye, melon, brocoli, chou de
Bruxelles, chou-fleur
Vitamine E
Germe de blé, noix, graines et huiles végétales tirées de ces
aliments, également olive et tournesol
Bétacarotène
Soja, baies et fruits rouges, thé, vin
Sélénium
Céréales, viandes, volailles et poissons
Zinc
Foie, viandes, légumineuses, produits laitiers, noix et graines
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67

68. LYCOPÈNE : MÉTHODE D’ANALYSE
Peser m = 20 g
Échantillon
(à l’abri de la lumière directe)
Saponification de
l’échantillon pour
1 solution de potasse
éthandique
Extraction du lycopène par l’éther de pétrole (3 fois)
Evaporation de l’éther de pétrole et reprise du
résidu dans la phase mobile
(CH3CN / MeOH / THF 55 : 35 : 10)
Calcul de la teneur en lycopène
par comparaison d’une gamme
étalon injectée dans les mêmes
conditions
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
Injection en HPLC / visible (
= 473nm)
Traitement des données
68

69. Lycopene
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69

70. LE DOSAGE DES POLYPHÉNOLS EST UN CAS
PARTICULIER
L’analyse permet de déterminer des teneurs en polyphénols de
l’ordre de 0,1 %
Pour la quantification, nécessité d’un étalon de référence
Exemple :
OPC (Oligomère Procyanidolique), difficulté d’obtenir CRM
(Certified Reference Material)
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70

71. VITAMINE E
Peser m = 20 mg
Échantillon
Calcul de la
teneur en
Vitamine E par
comparaison
avec une
gamme étalon
injectée dans
les mêmes
conditions
Saponification de
l’échantillon par 1
solution de potasse
éthalonique
Extraction de la vitamine E par l’éther de pétrole
Evaporation de l’éther de
pétrole et reprise dans un
volume précis d’héxane
Traitement
des
données
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
Injection en HPLC phase normale avec
détection fluorimétrie, phase mobile :
triméthylpentane / isopropanol 99/1
71

72. DES SOURCES PLUS OU MOINS RICHES EN
POLYPHÉNOLS
Les polyphénols sont les antioxydants les plus abondants.
L’Homme en ingère avec ses aliments environ 1g / jour.
Vin rouge (1 verre)
100 – 400 mg (Catéchine et dérivés)
Oignon (100g frais)
100 – 2 000 mg (Quercétine)
Jus d’orange (1 verre)
100 – 2 000 mg (Hespérétine, naringénine)
Tomate (100g frais)
85 – 130 mg
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Café (1 tasse)
100 - 300mg
Thé (1 tasse)
150 – 200 mg
(Gallate d’épigallocatéchine EGCG)
72

73. DES SOURCES PLUS OU MOINS RICHES EN
POLYPHÉNOLS
Baies (100 g frais)
50 - 1 200 mg
Les polyphénols sont les antioxydants les plus abondants.
L’Homme en ingère avec ses aliments environ 1g / jour.
Pomme (frais)
30 - 300 mg (Acide chlorogénique)
Légumes secs (100g secs)
30 - 1 700 mg
Bière (1 verre) 20 - 30 mg
Source: L. Bravo [Nutr. Rev. 1998, 56: 317- 33]
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Vin blanc (1 verre)
20 – 30 mg ( Resvératrol)
73

74. CONCLUSION SUR LES POLYPHÉNOLS
Posséder un protocole d’extraction adapté à l’antioxydant
recherché. Celui-ci doit être soluble dans le solvant
d’extraction (ex : Bêtacarotène soluble dans l’éther)
Prendre en compte les propriétés de l’antioxydant : la
plupart sont photosensibles, il faut donc travailler à l’abri de
la lumière directe
Posséder les solutions de référence adéquates (étalons)
Déterminer la détection adéquate (UV, visible, fluorimétrie)
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74

75. CONCLUSION SUR LES POLYPHÉNOLS
Polyphénols : teneurs et allégations
Riches en catéchine, source de polyphénols, ils ne sont
pourtant pas encore autorisés à ce jour
L’analyse quantitative permet des progrès dans ce sens.
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75

76. CONCLUSION PREMIÈRE PARTIE
Une nouvelle ère s’ouvre, la chimie des produits naturels.
Caractérisation des produits (subtances profiling, fractions lipidiques,
glucidiques …>
Vers la chimie verte est un défi pour l’innovation et pour notre
environnement.
Ce défi se présente aujourd’hui aux ingénieurs chimistes.
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
76

77. TWITTER ANTICIPER LES ÉVOLUTIONS
STRATÉGIE D’INTERACTION ET DE
CODÉVELOPPEMENT
Évolution technique / marché
Normes
Veille scientifique, analytique, et
produit - procédé
Veille normative
Réglement
Veille réglementaire
-> Nouvel outil : twitter
•
@expertscience
http://twitter.com/expertscience
– Information en temps réel (1600 comptes
officiels)
– Laboratoire SGS Multilab partenaire capable
d’assurer une veille scientifique, technique,
réglementaire
– Monde connecté, interaction
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77

78. DEUXIÈME PARTIE
Méthodes d’isolement & de séparation
de molécules biologiques
- Champ d’application et nouveaux enjeux
- Intérêt
- Aspects industriels
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
78

79. CHIMIE DURABLE
Contexte de ce cours : 2 enjeux
•
•
Chimie durable (Sus Chem : Sustainable Chemistry)
Chimie du végétal : enjeux et perspectives
1) Valorisation agro-ressource
2) Valorisation agro-alimentaire
–
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
Biochimie, allégation, système 4S (Satisfaction,
Santé, Sécurité, Service)
79

80. CHIMIE DURABLE
Chimie verte : définition
•
Chimie du végétal
– 50 % principe de la
chimie verte
chimie verte
–
–
–
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
Recours aux ressources
renouvelables
Réduire l’empreinte carbone
Mise au point de procédés
économes (enzymes, levures)
80

81. CHIMIE DU VÉGÉTAL ET LEVIERS
D’INNOVATION
Recherche et développement
• Polymère de performance
– Huile de ricin – Arkema polyamide
La règlementation qui restreint l’utilisation de certaines
substances
• L’isosorbide de Roquette dérivé de l’amidon et qui remplace
certains phtalates
• Les mousses de polyuréthane pour les automobiles plus
« verte »
La demande de marchés sensibles pour les produits issus du
végétal
• Soins : Europerlan de Cognis, cire qui donne un aspect nacrant
aux shampoing et gels douches
• Hôpitaux et crèche : revêtement de sols biosourcés
• Agronomie : guar modifié pour les traitements phytosanitaires
de précision
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
81

82. PORTEFEUILLE MOLÉCULAIRE / LES
FORMULES DE BASE
Tout un portefeuille d’innovation se développent, stimulé par
la nécessité de réduire la dépendance au pétrole et par les
exigences de développement durable.
LES FAMILLES DE BASE
Les amidons
et dérivés
- Sucres
- Alcools
- Polyols
- Poudres
Les lipides et
dérivés
- Triglycérides
- Glycérol
- Esters
- Acides
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
Les protéines et
dérivés
- Formes
variées
- Acides aminés
-…
La chimie du bois
- Lignine
- Cellulose
- Colophane
- Essence de
térébenthine
- Terpènes
- Résines
82

83. DES RESSOURCES COMPLÉMENTAIRES,
RENOUVELABLES
BIOMASSE
- Huiles
- Amidon
- Lignine
- Cellulose
- Protéine
- Résines…
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
- Alcools
- Acides gras
- Fibres
- Polymères
- Acide succinique
- PLA
- Ac Acétique
- Polyols
- Isosorbide
- Terpènes
- Flavonoïdes
- EMC
83

84. UN EXEMPLE DE MOLÉCULE PLATEFORME :
L’ACIDE SUCCINIQUE
Plastiques
biosourcés
Produits
pharmaceutiques
Solvants
Plastifiants
Exhausteurs
de goût
Agents de surface
et pigments
Polyuréthane
Métallisation
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
Pyrrolidones
1,4 BDO/THF
Produits anti-gel
84

85. DÉTERMINATION DU CONTENU BIOSOURCÉ
PRINCIPE POUR LES PRODUITS DE SYNTHÈSE
Test C14
Enregistrement
échantillonage
(ASTM 6866)
Contenu en
carbone
biosourcé
Déposant
Déclaration
produit et info
process
Analyse
élémentaire
Composition
élémentaire
Vérification
certification
Laboratoire
Certificateur
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
Contenu
biosourcé
85

86. AGRO-INDUSTRIE, UN PROCESSUS GENERIQUE
Intrants
AGRO-RESSOURCES
Produits finis
AGRO-RESSOURCES
Transformation
CO-PRODUITS
AGRO-RESSOURCES
Agro-ressources = Matières premières d’origine végétale ou
animale
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
86

87. BIOETHANOL
Eau
Drêches
DDGS
Huile
Blé
Pomme
de terre
In
Maïs
(53%)
out
Broyage
humide
Amidon
In
Sucres
Betterave
sucrière
Canne
à sucre
Isobutylen
Biomasse
In
out
Bioethanol
Fermentation
anaérobie
In
Réactions
biochimiques
Out
ETBE
Ether éthyle
tertiobutyle
In
Addition
15% max
out
Extraction
Eau
CO2
Bioethanol/ biomethanol
addition à 5%
Biocarburant
Pellets
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
87

88. CHIMIE VERTE, CAS DU BIODIESEL
Qu’est-ce que le biodiesel?
• Ce biocarburant est obtenu à partir d‘huile végétale
ou animale, transformée par un procédé chimique
appelé transestérification faisant réagir cette huile
avec un alcool (méthanol ou éthanol).
• Les proportions approximatives pour la réaction
sont :
10 litres d'huiles + 1 litre d'alcool --> 10 litres de
biodiesel et 1 litre de glycérine.
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
88

89. BIODIESEL : ORIGINE DE LA MATIÈRE
PREMIÈRE ET STRUCTURE MOLÉCULAIRE
Le biodiesel peut être fabriqué à
partir :
• D’huiles végétales telles que l’huile de
tournesol, le canola (une variante du colza),
• D’huiles de graines de coton, huile de palme,
etc…
• Les huiles de friture déjà utilisées dans des
restaurants
• Les corps gras animaux tels que le saindoux
• Les huiles usées qui se retrouvent à la
surface des eaux en station d’épuration
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
89

90. STRUCTURE MOLÉCULAIRE DU PRODUIT
D’ORIGINE NATURELLE
Toutes les huiles végétales et animales consistent
principalement de molécules de glycérine comme
indiqué dans le schéma ci-dessous :
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
90

91. FORMATION DU BIODIESEL
Cette réaction de transestérification consiste en la réaction
d’un alcool et des esters gras pour former des esters de
cet alcool et de la glycérine. La réaction chimique avec le
méthanol est présentée schématiquement ci-dessous :
Schéma de la formation du Biodiesel
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
91

92. DIFFÉRENTS TYPES DE BIODIESEL
Les propriétés du biodiesel
sont déterminées par la
proportion de chaque corps
gras utilisés pour produire les
esters d’alcool.
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
92

93. COMPOSITION DE DIFFÉRENTES HUILES ET
CORPS GRAS
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
93

94. STRUCTURE DES COMPOSÉS NATURELS
D’ORIGINE
Les corps gras sont identifiés par deux nombres : le premier
indique la quantité d’atomes de carbone présents et le second est
le nombre de liens doubles présents dans la chaîne.
Les noms courants des corps gras présentés dans le tableau en
page suivante sont :
•
•
•
•
•
•
•
•
14:0 Acide myristique (ou acide tétradécanoïque)
16:0 Acide Palmitique (ou acide hexadécanoïque)
18:0 Acide Stéarique (ou acide octadécanoïque)
18:1 Acide oléïque
18:2 Acide linoléïque
18:3 Acide octadécatriénoïque
20:0 Acide arachidique (acide eicosanoïque)
22:1 Acide érucique
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
94

95. EXEMPLE DE CHROMATOGRAMME SUR UN
ESTER
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
95

96. CHIMIE VERTE ET SPÉCIFICATION TECHNIQUE
DU BIODIESEL
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
96

97. EXEMPLE DE CHROMATOGRAMME SUR UN
ESTER
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
97

98. EXEMPLE DE CHROMATOGRAMME SUR UN
ESTER ÉTHYLIQUE
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
98

99. EXEMPLE DE CHROMATOGRAMME SUR UN
ESTER ÉTHYLIQUE
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
99

100. BIODIESEL
Solvants
NaOH
Méthanol
Bioéthanol
Colza
Tournesol
In
Pomme
out
Huile
Broyage
Extraction
In
out
Biodiesel
In
Addition
out
Transestérification
Soja
Tourteaux
Huile
brute
Huile
raffinée
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
Glycerol
Biocarburant
100

101. BIODIESEL
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
101

102. BIODIESEL
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
102

103. CHIMIE VERTE – CHIMIE DU VEGETAL
Définition :
« Ensemble des principes et techniques permettant de réduire
ou éliminer l'usage ou la formation de substances
dangereuses et/ou toxiques dans la conception, la production
et l'utilisation des produits chimiques »
Eco-conception appliquée au domaine de la chimie
industrielle (carburants, plastiques, cosmétiques, additifs…)
Cycle de vie des matériaux/produits
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
103

104. AVANTAGES ENVIRONNEMENTAUX
Ressources fossiles et
Réchauffement
climatique
• Réduction/
suppression des
prélèvements de
pétrole et minéraux
• Réduction des
émissions de GES
• Process plus sobres
en énergie
Ecosystèmes et
biodiversité
Préservation de la
Santé humaine
Valorisation des
déchets et co-produits
• Limitation des
pollutions
• Mat.1ères et additifs
non toxiques
• Transformation des
déchets en ressources
(eau, air, sol)
• Non écotoxicité en
fin de vie
(lixiviats, résidus de
biodégradation)
• Moindre
dégradation des
écosystèmes lors
de l’extraction des
MP
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
(SVHC, perturbateurs
endocriniens, vPvB, …
• Non toxicité à l’usage
et dans le temps
• Économie de matières
1ères
• Pas de compétition
avec les cultures
vivrières
104

105. BIO-PLASTIQUES ET BIO-COMPOSITES
4 catégories d’agro-ressources
Amidon
Huiles
végétales
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
Sucre
Lignocellulose
Synthèse
des bioplastiques
105

106. EXEMPLE DU POLYAMIDE 11 - RILSAN®
NH2
Acide amino-11 undécanoïque
Graines de ricin
85% acide ricinoléique
PA 11
20/90% bio-sourcé
52% bio-sourcé
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100% bio-sourcé
106

107. EXEMPLE DU BIOMAX® PTT 1100
Amidon
1,3 bio-propanediol
Maïs
Acide téréphtalique
Pétrole
37% bio-sourcé
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
107

108. EXEMPLE DU BIO-PET
mélasse
(co-produit de canne à sucre)
mono
éthylène
glycol (MEG)
22,5% bioPET (biosourcé)
52,5% PET
(primaire)
pétrole
Acide
téréphtalique
25% r-PET
(secondaire)
Plastique recyclé
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
108

109. EXEMPLE DU COMPOSITE LINTEX®
Lin technique
Fibres de lin Longues
Pétrole
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Résine PP
ou résine Epoxy
Nautisme (Kayak…)
Fibres non tissées + résine PE
Fiber Shell® EcoFiber
50% fibres tissées + résine PA
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110. Le Carbone 14 :
un traceur
Période radioactive du 14C :
5730 ans
Émetteur β
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
Source:110
http://earthsci.org/

111. LE CYCLE DU CARBONE 14
• Piégeage du 14CO2 par les organismes
vivants
• A la mort de ces organismes,
désintégration du 14C en 14N
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
Source:111
http://earthsci.org/

112. LA NORME ASTM-D6866
Méthode
Méthode A:
Piégeage CO2 puis LSC
(Liquid Scintillation
Counting)
Méthode B:
AMS (Accelerator Mass
Spectrometry) + IRMS
(Isotope Ratio Mass
Spectrometry)
Méthode C:
Synthèse de benzène
puis LSC (Liquid
Scintillation Counting)
© SGS Multilab Rouen, Yvon Gervaise – ENSCR – 30/01/2014
Appareillage
Méthode de calcul
- Oxidizer
Comparaison au 14C SRM
acide oxalique, traité
comme un échantillon
- Compteur
scintillation liquide
- Oxidizer
- AMS
- IRMS
- Unité de synthèse de
benzène
- Compteur
scintillation liquide
Mesure des ratios 14C/ 12C
et 13C/ 12C et
comparaison aux ratios
14C/ 12C et 13C/ 12C de
matériaux de référence
Comparaison au 14C SRM
acide oxalique, traité
comme un échantillon
112

113. PRINCIPE DE L’ANALYSE
3- émission d’un
e- (particule β )
lors de la
désintégration du
14C en 14N
2- formation de
12CO et 14CO
2
2
1- combustion
de l’échantillon :
4- comptage du
nombre d’e- émis
par scintillation
liquide
C + O2 → CO2
Source : www.signonsandiego.com
Principe de la scintillation liquide
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113

114. Nombre de désintégrations par min. et
par g. de carbone
PRINCIPE DU CALCUL
13,44
Origine
végétale
10,08
calcul du pourcentage de
carbone d’origine biosourcée
d’après la courbe de
décroissance radioactive
(// datation au 14C)
50% CO2
biomasse
6,72
25% CO2
biomasse
12,5% CO2
biomasse
3,36
T
0,00
0
5730
2T
11460
Origine
chimique
3T
17190
22920
28650
34380
40110
temps (années)
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115. MESURE DU 14C :
EXEMPLE DE RÉSULTAT &
INTERPRÉTATION
74% du CO2 produit pendant la combustion est
d’origine biologique, 26% est d’origine fossile
74% du carbone total de l’échantillon est
d’origine biologique et 26% d’origine fossile
26%
Fossil
74%
Biomass
L’incinération de l’échantillon (~ déchet)
produit :
26% de CO2 créé
74% de CO2 bioressourçable
D’origine biologique ≠
biodégradable
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Indique la proportion
de carbone d’origine
biologique et d’origine
pétrochimique
115

116. PERFORMANCE DANS L’ANALYSE ET DE L’EXPERTISE
ENJEUX ET VALEUR AJOUTÉE POUR NOS CLIENTS
Information et
exigence du
consommateur
Cahier des
charges client
Tendance chimie verte
Actifs végétaux
Innovation
Recherche
Votre
produit
Votre
matière
première
Produit
Procédé
Tendance
environnementale
écolabel
Exigence
particulière
nouveau règlement
cosmétique/
pesticides
Conformité :
. Réglementaire
. REACh
Relation Produit/santé/environnement
Exemple perturbateur endocrinien
Prise en compte
globale ACV, GES,
GHS
Surveillance matière
première, impact
réglementaire REACh
Valeur
d’usage
Sécurité des
ingrédients
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Valorisation du produit et
sous-produit - filière
Additifs
116

117. Merci de votre attention
« Demain est moins à découvrir qu’à inventer »
Gaston Berger, philosophe
Yvon GERVAISE
yvon.gervaise@sgs.com
@expertscience : http://twitter.com/expertscience
www.sgsgroup.fr
Directeur, SGS Multilab Rouen
65 rue Ettore Bugatti - BP 90014 - 76801 Saint Etienne du Rouvray
t 02 35 07 91 80 f 02 35 07 91 25
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