Biologolgie

1. Methoden der Gentechnologie im Überblick:
Inhaltsverzeichnis
1.Stempeltechnik (Replica-Plating).................................................................................2
2.Genom-Bibliotheken...................................................................................................3
3.cDNA-Bibliotheken......................................................................................................4
4.Auffinden von DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese.............................................6
5.Sequenzieren von DNA mit der didesoxy-Methode nach Sanger....................................7
6.In-situ-Hybridisierung.................................................................................................9
7.Blot-Techniken.........................................................................................................10
8.ELISA......................................................................................................................11
9.Vervielfältigung von DNA-Sequenzen durch PCR.........................................................12
10.Synthese künstlicher DNA(-Sonden).........................................................................13
11.Genetischer Fingerabdruck......................................................................................14
12.Gendiagnostik........................................................................................................15
13.Gentherapie...........................................................................................................16
14.Grüne Gentechnik...................................................................................................18

2. 1. Stempeltechnik (Replica-Plating)
Die Stempeltechnik („replica plating“) dient dazu, die Mangelmutanten
eines Bakterienstammes zu identifizieren und anschließend isolieren zu
können. Außerdem kann man so auch transfizierte Bakterien isolieren.
Will man die Mangelmutanten einer Bakterienkolonie isolieren, so gibt
man zu einem Flüssigmedium mit Bakterien ein Mutagen hinzu, wie zum
Beispiel Histidin. Nun gibt man dieses Flüssigmedium auf einen
Nährboden, auf die „replica plate“ und lässt die Kolonien dort wachsen.
Mit einem Samtstempel kopiert man die „master plate“ auf die „replica
plate“, auf der kein Histidin vorhanden ist. Die Kolonien, die auf der
„master plate“, jedoch nicht auf der „replica plate“ wachsen sind
Mangelmutanten.
Bei der Selektion von transfizierten Bakterien nutzt man das gleiche
Verfahren. Man hat ein Flüssigmedium mit transfizierten Bakterien, ohne
Plasmid und Bakterien mit Plasmid. Dieses gibt man anschließend auf die
„master plate“ mit Tetracyclin, auf welcher die Bakterien ohne Plasmid
nicht wachsen. Nun überträgt man die Kolonien mit Hilfe der Stempeltechnik auf ein
Medium mit Ampicilin, die „replica plate“. Im Rückschlußverfahren kann man somit die
transfizierten Bakterien herausfinden. Denn an den Stellen, an denen zuvor auf der
„master plate“ Kolonien gewachsen sind, wachsen nun auf Grund der fehlenden Amp-
Resistenz, auf der replica plate nicht mehr.

3. 2. Genom-Bibliotheken
Genbibliotheken
Genbibliotheken sind ein unverzichtbares Werkzeug in der Molekularbiologie. Firmen sind
entstanden, die eine Vielzahl von speziellen Genbibliotheken anbieten von
Mikroorganismen, Pflanzen, Tiere, also von Organismen und bestimmten Organen (z.B.
Leber, Gehirn). Somit entfällt die oftmals schwierige Selbstherstellung. Genbibliotheken
lassen sich auf zwei verschiedenen Arten herstellen (siehe auch Genombibliothek und
cDNA-Bibliothek).
Genom-Bibliothek
Um eine Genom-Bibliothek zu erhalten, muss man zunächst chromosomale DNA aus dem
Gewebe z.B. eines Organes isolieren. Die DNA wird dann mit einem Restriktionsenzym
(ECoRI) zerlegt. Die daraus resultierenden Fragmente repräsentieren das gesamte Genom,
also mit Exons und Introns.
Da die Fragmente beim Übertragen in Bakterien zu schnell von diesen abgebaut und somit
verloren gehen würden, müssen die DNA-Fragmente zuerst in Vektoren eingebaut werden.
Die DNA eines Vektors, z.B. eines Plasmids, wird ebenfalls mit Restriktionsendonuclease
'verdaut' (wiederum ECoRI): Es kommt zu einer Extraktion und einer Spaltung der DNA.
Jetzt passen die DNA-Fragmente in die DNA des Vektors und durch DNA-Ligase wird das
Zucker-Phosphat-Rückgrat wieder kovalent geschlossen.
Diese rekombinanten Vektoren werden nun in die Wirtszelle, Bakterien, eingeschleust
(Transformation). Durch Selektion der transfizierten Bakterien werden die DNA-Fragmente
in den rekombinaten Vektoren in einzelnen Komponente aufgeteilt: Die Bakterien einer
Kolonie beinhalten jeweils ein bestimmtes Genombruchstück, wie ein Buchtitel einer
Bibliothek kann man 'nachschlagen'.
Nachteil dieser Methode ist, dass die Bibliothek sämtliche nichtcodierende DNA-Abschnitte
wie die Introns des Genoms oder repetitive Sequenzen beinhaltet. Somit ist es schwierig,
ein bestimmtes Gen zu finden, ähnlich wie die berühmte „Nadel im Heuhaufen“.

4. 3. cDNA-Bibliotheken
Um eine cDNA-Bibliothek zu erhalten, muss man
zunächst die mRNA aus einem Organ oder
bestimmten Gewebe isolieren. Dieser Vorgang ist
technisch wesentlich anspruchsvoller als die
Gewinnung genomischer DNA. Die so gewonnene
mRNA kann jedoch nicht sofort mit
Restriktionsenzymen verdaut werden. Ein Primer
wird mit dem Poly-A'-Schwanz hybridisiert und stellt
ein freies 3'-OH-Ende bereit. Die reverse
Transkriptase, ein Enzym, welches in Retroviren wie
z.B. HIV enthalten ist, benutzt dieses Ende, um die
Synthese einer einzelsträngigen DNA anhand dieser
mRNA zu katalysieren. Charakteristisch für die
reverse Transkriptase ist nämlich, dass sie
"rücktranskribiert". So erhält man eine
komplementäre DNA, auch cDNA (complementary
DNA/copy DNA) genannt. Nun wird die mRNA mit
Ribonucleasen oder Natronlauge zerstört, bzw.
abgebaut. Nun ist die cDNA-Kette frei. Die DNA-
Polymerase ergänzt nun den DNA-Einzelstrang
mithilfe von kurzen Zufallssequenzen, die als Primer
dienen, zu einem Doppelstrang. Da die
Schnittstellen für die Restriktionsendonuclease nicht
zwingend enthalten sind, werden nun kurze Linker
(Verbindungsstücke), die die
Restriktionsschnittstellen enthalten, durch die DNA-
Ligase angefügt. Die cDNA wird hydrolysiert
(gespaltet), cDNA und Plasmidvektoren werden
enzymatisch zusammengefügt (durch gleiche
Restriktionsschnittstellen). Wie bei der Genom-
Bibliothek werden cDNA und Plasmide nach der
Hybridisierung durch DNA-Ligase geschlossen. So erhält man rekombinante DNA-Moleküle.
Jetzt werden die Plasmide in Bakterien (E.coli) eingeschleust, was man auch als
Transformation bezeichnen kann. Nun wird E.coli auf Nährböden vermehrt und
anschließend werden die Bakterien selektiert, die Fremd-DNA-Stücke enthalten.
→ Ein Vorteil der cDNA-Bibliothek ist, dass sie eine Sammlung von den Genen ist, die
tatsächlich zur Expression kommen, das heißt, dass z.B. keine Introns enthalten sind (bei
mRNA-Spleißen schon entfernt).
Damit kommt es zu einer Verringerung der klonierenden DNA-Menge.
→ Wenn man ein spezielles Gen sucht, bevorzugt man daher die cDNA-Bibliothek
gegenüber der Genom-Bibliothek.
→ Für Genidentifizierung und -charakterisierung unentbehrlich, da RNA allein zu instabil
für die meisten Analysemethoden ist.
→ Ein Nachteil dieser Bibliothek ist jedoch, dass es schwierig ist, sie in ausreichender Güte
herzustellen. Jedoch kann die Polymerasekettenreaktion (PCR) dieses Problem bereits
überwinden.

5. Allgemeine Anwendung/Perspektive
•Erhaltung und Schutz der genetischen Vielfalt
•Medizin (Herstellung Antikörper, Impfstoff)
•Untersuchung des Genaufbaus
•gezielte Mutation des Gens
•Untersuchung der Funktion des Proteins
•Eigenschaften von Proteinen verbessern (Screening)
•Herstellung gentechnisch veränderter Mikroorganismen, Tiere, Pflanzen mit vielfältigen
Anwendungen (Müllbeseitigung, krankheitsresistente Nutzpflanzen und Tiere)
•Diagnose Erbkrankheiten --> Heilung Erbkrankheiten?

6. 4. Auffinden von DNA-Fragmenten durch
Gelelektrophorese
Die Gelelektrophorese ist eine Technik zur Trennung von Markomolekülen nach ihrer
Größe, bzw. Länge. In der Regel wird sie für DNA aber auch für Proteine angewendet.
Das Prinzip beruht darauf, dass sich
geladene Moleküle entlang eines
elektrischen Feldes durch ein Gel
bewegen müssen. Vereinfacht kann man
sich das Gel als schwammartige Struktur
oder dreidimensionales Geflecht
vorstellen, das die Moleküle bei ihrer
Wanderung behindert. Je kleiner ein
Abbildung 1
Molekül, um so leichter kann es durch
die Poren des Gels wandern, um so schneller bewegt es sich vorwärts. Je nachdem, wie
klein die Poren sind, brauchen die Moleküle länger, dafür ist auch die Autrennung feiner.
So kann man mit Agarosegelen (größere Poren) DNA Fragmente grob trennen, mit
Acrylamid Gelen DNA Fragmente bis auf eine Base Längenunterschied.
Abbildung 1 zeigt den Aufbau einer typischen (horizontalen) Gelkammer mit der
Spannungsquelle links. Das Gel liegt in
einer Pufferlösung, die den Widerstand
herabsetzt und das Gel vor Austrocknung
schützt. Am Minuspol liegen die Taschen,
in die die Proben pipettiert werden.
Abbildung zwei zeigt ein Agarosegel mit
eingearbeitetem Fluoreszensfarbstoff,
nachdem die Proben 90 Minuten gelaufen
sind. Nach der Auftrennung werden die
Proben aus dem Gel geschnitten
(„Picking“) oder per Abklatsch („Blotting“)
fixiert.
© S.Blattmann

7. 5. Sequenzieren von DNA mit der didesoxy-Methode nach
Sanger
In vierVersuchsansätzen wird die DNA-
Doppelhelix zunächst durch Hitze
denaturiert und somit entstehen
Einzelstränge, die zur weiteren
Vorgehensweise benötigt werden. Die
Einzelstränge werden am 3' Ende mit
einem Primer markiert. Durch die
Zugabe von DNA-Polymerase wird der
komplementäre Strang synthetisiert.
Danach werden parallel vier
Reaktionen durchgeführt, bei denen
jeweils eines der vier
Kettenabbruchnukleotide
(Didesoxynukleosidtriphosphat, ddATP,
ddCTP, ddGTP, ddTTP) hinzugefügt
wird.
Diesen Nucleotiden fehlt die OH-
Gruppe am 3' Ende wodurch eine
Verbindung des Phosphats und der
Desoxyribose nicht möglich ist.
Dadurch kann keine
Kettenverlängerung des
komplementären Stranges stattinden
und es kommt zufällig zum Abbruch,
wodurch unterschiedlich lange DNA-
Fragmente entstehen, die jeweils mit
dem zugegebenen
Didesoxynucleosidtriphosphat enden.

8. Um die DNA-Fragmente zu analysieren
werden sie mit Hilfe der
Gelelektrophorese getrennt.
Hierbei werden die 4 Versuchsansätze
jeweils auf ein Polyacrylamidgel
gegeben und Spannung angelegt. Die
kurzen DNA-Abschnitte wandern im
Gel schneller und weiter Richtung
Anode (+) als die langen Abschnitte.
Durch diese Methode erhält man den
komplementären DNA-Strang
(ausgehend von der Anode abgelesen)
und somit die gesuchte Basenabfolge
des Einzelstranges.
Anwendungsgebiet:
Die DNA-Sequenzanalyse dient zur Untersuchung von genetischem Material.
Perspektiven:
Heute werden nicht mehr vier Ansätze, sondern nur noch einer benötigt.
Die „Kettenabbruch-Nukleotide“ werden mit unterschiedlichen Fluoreszenz-
Farbstoffen markiert, so können sie in einem Durchlauf von einem Detektor erkannt
werden. Die Abfolge der Farbsignale, die am Detektor erscheinen
(Chromatogramm) geben dann die Sequenzabfolge der Basen des sequenzierten
DNA-Stranges wieder.
Während früher der Primer radioaktiv markiert wurde, wir auch er seit Anfang der
90er Jahre mit Fluoreszenz-Farbstoffen gekennzeichnet.
Erika Hilbold, Maike Schrader, Simone Lehmann

9. 6. In-situ-Hybridisierung
Anwendungsbereich allgemein:
Die In-Situ-Hybritisierung (ISH) ermöglicht das Auffinden
spezifischer DNA Sequenzen in einem Präparat. So wird die ISH
beispielsweise für die Diagnose verwende, wie zB den Nachweis
vom Epstein Barr Virus.
Funktionsweise
•Zuerst brauchen wir eine Sonde aus einer DNA Probe oder
künstlicher DNA, die komplementär zu dem DNA Abschnitt ist,
den wir suchen.
•Ein Fluoreszensfarbstoff (zB mit Haptenen wie Digoxigenin,
Biotin, Dinitrophenol) wird dann an die Sonde gekoppelt, oder sie
wird radioaktiv markiert mithilfe Radioaktiver Nukleotide (zB
Trizium oder Schwefel)
•Die DNA (oder RNA) wird dann bei 95°C denaturiert.
•Die Sonde wird hinzugegeben und die Hybritisierungstemperatur
wird runter gesetzt.
•Die Sonde koppelt sich an die komplementäre Stelle, das Zielgen
•Zielgen ist sichtbar
Svenja Uhrig

10. 7. Blot-Techniken
Southern-Blotting wird dazu verwendet, um in einem Gemisch von DNA- Fragmenten das
Vorhandensein einer bestimmten Sequenz nachzuweisen. Entsprechendes gilt für das
Northern-Blotting für RNA-Sequenzen und das Western-Blotting für Proteine.
Für den Transfer vom Gel auf eine Membran (z.B. Nitrocellulose), das Blotting, stehen
mehrere Verfahren zur Verfügung:
· Kapillar-Blot: Eine Flüssigkeit zieht die DNA mit, meist eine Salzlösung. Diese läuft
von unten über das Gel auf die Membran, da sich darüber saugfähiges Material
befindet. Die DNA bleibt dabei in den Maschen der Membran hängen. Wie der Name
schon sagt, funktioniert der Kapillar-Blot durch die Kapillarkräfte. Es darf allerdings
keine Luft eindringen, da an diesen Stellen kein Transfer der DNA stattfinden kann.
Der Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Flüssigkeit 10 bis 12 Stunden laufen muss
und ein hoher Verbrauch der Salzlösung einhergeht.
· Vakuum-Blot: Die Flüssigkeit wird, ähnlich dem Kapillar-Blot durch die Membran
gezogen, nur dass die Flüssigkeit von einem Vakuum durch Gel und Membran
gezogen wird. Der Vorteil hier gegenüber dem Kapillar-Blot besteht darin, dass er
sparsamer und schneller ist.
· Elektro-Blot: Hierbei wird die negative Ladung der DNA ausgenutzt. Das Gel liegt
nahe der negativ geladenen Kathodenplatte, über der Membran befindet sich die
positiv geladene Anodenplatte. Am besten man verwendet eine Salzlösung, denn
durch sie kann der Strom fließen. Wird nun eine Sannung angelegt, bewegt sich die
DNA Richtung Anode und bleibt in der Membran hängen.
Ramona

11. 8. ELISA
= (enzyme-linked immunosorbent assay, dt. Enzym gekoppelter Immunbindungs)
ELISA gehört im engeren Sinne eigentlich nicht zu den gentechnologischen Verfahrenm,
ist aber ein inzwischen verbreitetes Verfahren, um einzelne Proteine nachweisen zu
können. Dabei nutzt man die Mechanismen des Immunsystems: Wird eine Substanz vom
Immunsystem als fremd erkannt, bildet es "Antikörper", die an das fremde Molekül
andocken und es so markieren.
Diese so genannte Antikörper-Antigen-Reaktion wird für den ELISA-Test genutzt. Soll ein
bestimmtes Protein nachgewiesen werden, müssen die dazu passenden Antikörper
bekannt sein und zuvor mit verschiedenen gentechnischen oder zellbiologischen Verfahren
hergestellt worden sein. Ist dann in einer Probe das gesuchte Protein vorhanden, fischen
es die auf ein Trägermedium aufgebrachten Antikörper heraus. Dabei wird eine von
Enzymen gesteuerte Reaktion ausgelöst, die zu einem sichtbaren Farbniederschlag führt.
Umgekehrt kann man, z.B. beim AIDS-Test, die Platte auch mit dem Antigen (HIV-
Oberflächenmoleküle) beschichten und dann im Serum Antiköper nachweisen.
ELISA-Tests sind heute in der medizinischen Diagnostik weit verbreitet. Speziell Doping-
Kontrollen verwenden sie. Sie werden aber auch in vielen anderen Bereichen genutzt,
wenn einzelne Proteine nachzuweisen sind. Davon zu unterscheiden sind Verfahren, mit
denen DNA oder DNA-Sequenzen nachgewiesen werden können. (Quelle:
http://www.biosicherheit.de/de/lexikon/33.elisa.html)
(Quelle: http://www.doping.chuv.ch/en/lad_home/lad-recherche-developpement/lad-recherche-
developpement-projets-actuels/lad-recherche-developpement-projets-actuels-cera.htm)

12. 9. Vervielfältigung von DNA-Sequenzen durch PCR
Definition: PCR (Polymerase Chain Reaction)
Die Polymerase-Ketten-Reaktion ermöglicht es, Nukleotidsequenzen im Reagenzglas zu
verfielfältigen. Dies ist vor allem dann notwendig, wenn zu geringe Mengen für eine
ausführliche Untersuchung zur Verfügung stehen. Es werden in ständiger Wiederholung 3
Schritte durchgeführt.
•1.Schritt: (Denaturierung)
Erhitzen auf 95° C und damit Auftrennung
des DNA -Doppelstrangs in zwei
Einzelstränge
•2.Schritt:
(Primerhybridisierung)
Abkühlen des Versuchsansatzes auf 50° C
und Anlagerung der Primer an den
Anfängen beider DNA-Einzelstränge.
•3.Schritt:
(Elongation)
Erwärmung auf 72° C und Einleitung der
DNA-Replikation der beiden Einzelstränge
durch eine hitzestabile Taq-Polymerase1
(Enzym)
Diese drei Schritte werden zigfach
wiederholt, bis Milliarden von identischen
Kopien der Nukleotidsequenz vorliegen.
Anwendungsbereiche:
-Untersuchungen an Tatorten
-Vaterschaftstest
-Erkennung von Krankheiten
-Klonierung von Genen
-Mutagenese
-Analyse alter (fossiler) DNA
-Geschlechtsbestimmung
-genetischer Fingerabdruck
-Nachweis von genetisch veränderten Bestandteilen in Lebensmitteln
1 DNA-Polymerase des hitzeliebenden Bakteriums Tthermophilus aquaticus, das in heißen Quellen
vorkommt.

13. 10. Synthese künstlicher DNA(-Sonden)
Künstliche DNA:
Dabei handelt es sich weder um menschliches noch um tierisches Erbmaterial, sondern
um eine synthetische Molekülkette aus den gleichen Bausteinen
Die künstliche DNA wird heute durch
sogenannte DNA-Syntheseautomaten
hergestellt.
Diese Maschinen, die durch Mikroprozessoren
gesteuert weden, können automatisch und
sehr schnell Sequenzen einzelsträngiger DNA
synthetisieren.
1. Gewünschte Sequenz wird in den
Automaten eingegeben
2. Mikroprozessoren sorgen dafür, dass
Nucleotide, Reagenzien und Lösungsmittel für
jeden einzelnen Schritt durch die
Synthesizersäule gepumpt werden
3. In der Syntesizersäule befindet sich
Kieselerde, in Form von feinem Sand;
jedes Kügelchen gibt der an ihr entstehenden
DNA-Kette einen festen Halt.
Beispiel: Sequenz TACG
•man geht von einer Säule aus, an deren
Kügelchen bereits das erste Nucleotid(hier
Thymin)
•fixiert ist und zwar mit dem 3´ Ende
•durch Mikroprozessoren gesteuert werden
Millionen von Molekülen vom nächsten
Nucleotid (hier Adenin) durch die Säule gepumpt
•um eine Bindung zwischen Thymin und Adenin zu erreichen, muss sich das 5´Ende von
Adenin mit dem 3´Ende von Thymin verküpfen
•sobald die Schutzgruppe entfernt wird, kann sich das Cytosin anlagern
•der Vorgang wird bei Guanin wiederholt
----> Durch diese neue moderne Technik können kurze Ketten bis zu etwa 50 Nucleotiden
hergestellt werden. Die fertigen Ketten werden dann aus der Säule gewaschen.
Verwendung künstlicher DNA:
1. Oligonucleotide können zu größeren vollständig synthetischen Genen zusammengebaut
werden(beispielsweise wie beim Insulin).
2. Sie können als DNA-Sonden benutzt werden.
3. Sie werden als Primer für die Polymerase-Kettenreaktion(PCR) und Sequenzierung
benötigt.
4. Die künstlich hergestellte DNA wird in der Kriminologie verwendet, um Verbrecher
besser zu identifizieren und gestohlene Gegenstände können leichter ihren Besitzern
zugeordnet werden

14. 11. Genetischer Fingerabdruck

15. 12. Gendiagnostik
Die Gendiagnostik ist ein jüngerer
Zweig der medizinischen
Diagnostik. Man versucht dabei,
genetisch bedingte Ursachen oder
Veranlagungen zu Krankheiten
bereits lange vor Ausbruch der
eigentlichen Krankheit zu
bestimmen. Hierbei wird zwischen
diagnostischen Tests (zur
Feststellung einer konkreten
Erkrankung) und prädiktiven Tests
(zur Prognose eines
Krankheitsrisikos) unterschieden.
Die Gendiagnostik gehört zur
genetischen Beratung, die es
schon länger gibt. Unter
Gendiagnostik i.e.S. sind die unter
c) genannten Methoden zu
verstehen: Karyogramm eines Menschen
a) Familienanamnese Stammbaumanalyse
b) Lichtmikroskopische Untersuchung der Chromosomen auf Aneuploidien
(Gesamtkaryogramm) oder Chromosomenaberrationen
c) biochemische/ molekulargenetische Methoden:
RFLP (wenn Mutationen des Gens Restriktionsschnittstellen betreffen
verändert sich das Fragmentmuster)
Gensonden (In situ Hybridisierung in Gewebe- oder Zellproben)
Nachweis mit PCR (Da betroffene Gene i.d.R. Bekannt sind, lassen sich
Primer synthetisieren, die jeweils die Enden der Gene markieren. Mittels PCR
kann man dann aus einer Speichel- oder Haarwurzelprobe die Sequenz
vervielfältigen. Die amplifizierte Sequenz wird dann in einem
Sequenzierautomaten analysiert. Das Ergebnis wird dann interpretiert, d.h. mit
Sequenzen verglichen, von denen bekannt ist, dass sie z.B. mit einer Neigung
zu Dickdarmkrebs oder Multipler Sklerose in Verbindung stehen.)
Eingesetzt wird sie vor allem in der PID (Präimplantationsdiagnostik), der
Pränataldiagnostik und bei der genetischen Beratung von Eltern mit Kinderwunsch, in
deren Familien jedoch bekanntermaßen genetische Krankheiten auftreten.
Generell besteht dabei eine Diskrepanz zwischen der Fähigkeit, Gene oder Genvarianten
innerhalb des Erbguts zu finden und zu identifizieren und der Fähigkeit zu therapieren.
Zudem ist die PID in Deutschland verboten, so dass auch dieser Anwendungsbereich
wegfällt.

16. 13. Gentherapie
Definition:
Unter Gentherapie versteht man die gezielte Einführung von Genen mit Hilfe
geeigneter Übertragungsmethoden in Zellen von Kranken mit dem Ziel der
Heilung oder therapeutischen Besserung
engster Begriff = Genkorrektur ( Reparatur eines defekten Genabschnittes in
der Zelle )
oder = Ersatz defekter Gene durch funktionell intakte Kopien ("Genaddition")
oder = die Inaktivierung pathogener Genprodukte ("Anti-Gen-Therapie",
"Antisense-Therapie")
oder = die indirekte Heilung von Krankheiten durch therapeutische Gene.
Keimbahntherapie = Veränderungen der menschlichen Keimbahn
Somatische Gentherapie = Korrektur von Gendefekten in Körperzellen
invivo = Therapie der Zelle im Körper
ex vivo = Therapie durch Zellen, die außerhalb des Körpers verändert wurden (z.B.
Blutstammzellen)
Prinzip der somatischen Gentherapie:
Damit die Gentherapie dauerhaften Erfolg hat, nimmt man Knochenmarkzellen, da die sich
das ganze Leben lang teilen und das neue Allel an all ihre mitotischen Nachkommen
weitergeben.
= Problem: kein Genersatz sondern nur Genaddition, mit begrenzter Genexpression
möglich
Ex vivo:
1. Das gesunde/fehlende Allel in RNA-Form wird in einen Vektor Retrovirus
eingebaut
2. Knochenmarkzellen (könnten aber auch Lymphocyten, etc. sein), die wir zuvor de
Patienten entnommen haben, werden mit dem Retrovirus infiziert
3. Ziel ist es, dass der Retrovirus eine Kopie seines Genoms, in DNA-Form, in das
Genom der Wirtszelle einbaut
4. Daraufhin werden die genetisch-veränderten Zellen dem Patienten wieder ins
Knochenmark injiziert
5. Bei erfolgreicher Gentherapie, würden sich die Zellen ein Leben lang vermehren und
das neue Gen exprimieren
In vivo:
VIRALE VEKTOREN
Einem zuvor abgeschwächtem Virus, wird das gewünschte Genmaterial
eingepflanzt.
Sie dienen als Genfähren und werden dem Patienten direkt injiziert.
(Transduktion)
Vorteil: Hohe Rate von Transduktionsereignissen
Nachteile: Immunreaktion, häufig nicht stabil, zu geringe Expressionsrate,
Krebsrisiko

17. LIPOSOMEN:
DNA wird in kleine Lipidtröpfchen verpackt, die dann auf Schleimhäute (z.B. als
Aerosol-Spray) aufgebracht werden.
Vorteil: Keine Immunantwort, kein bekanntes Krebsrisiko
Nachteil: sehr geringe Transduktionsrate, erreicht nur Schleimhauszellen
Risiken von Gentherapie:
•Erhöhtes Krebsrisiko
•Ungewollte Aktivierung oder Veränderung anderer Gene möglich
•Unabsehbare Risiken
•Ethische Problematik (Eugenie, Evolution)
 Würde des Menschen noch unantastbar ?
 Welche späteren Folgen könnte der Verlust von genetischer Variabilität haben?
Anwendungsbereiche
– monogene Krankheiten (CF, Bluterkrankheit, ADA[Adenosin-Desaminase]-Syndrom,
septische Granulomatose)
– Krebsbekämpfung
– Bekämpfung viraler Infekte
Vektorenproblem:
– gute Erfolge nur exvivo, invivo zu geringe Transfektionsrate, bzw. zu hohe
Risiken bei Versuch der Erreichung einer hohen Rate
– in Vivo v.a. Virale Vektoren, künstliche V und physikalische Methoden
– Virale Vektoren
könne a) eine
Immunantwort
hervorrufen und
b) ist es nicht
sicher, wo im
Genom sie
inserieren.
Häufig sind es
Stellen, die
stark exprimiert
werden.
– Neu: mit homologer Rekombination oder Zinkfinger-Nukleasen

18. 14. Grüne Gentechnik
Ziele: Ertragssteigerung, Verringerung der Produktionskosten durch Resistenz gegen
Insekten/ Würmer/ Pilze/ Viren, Veränderung des Stoffwechsels (Zusammensetzung der
sekundären Pflanzenstoffe, Produktions bestimmter Moleküle, Erhöhung der Produktion
einzelner Stoffe)
Werkzeuge:
–bei Dikotylen (Zweikeimblättrigen, Gemüseplfanzen, Tabak, Obstbäume):
–Plasmide des Agrobakteriums tumefaciens als Vektoren (steuert den Zellzyklus
und Zellstoffwechsel der infizierten Zelle um)
–Mikroinjektion von DNA
–bei Monokotylen (Einkeimblättrige, alle Getreide):
–Partikel-Beschuss
–spontane Aufnahme von DNA nach Behandlung der Zellwand und – membran mit
Enzymen
Transgene Zellen können dann über Kalluskulturen wieder zu vollständigen Pflanzen
herangezogen werden.
Probleme:
•Verändertes Verhalten der Pflanzen im Freiland
•Freisetzung gentechnisch veränderten Erbguts, die nicht rückgängig gemacht werden
kann.
•Nachweisder Gesundheitsverträglichkeit schwierig, Kontrollen erfolgen teilweise nach
Maßgaben der Konzerne (USA)
•Öffentlicher Widerstand