Das Dokument untersucht die Rolle des acs-Gens, das für die Acetyl-CoA-Synthetase verantwortlich ist, und die Wechselwirkungen zwischen den Proteinen IHF und CRP an den Promotoren P1, P2 und P2a, wobei P2 der bedeutendste ist. Die Aktivierung des Promotors erfolgt bei Kohlenstoffmangel durch Bindung von CRP und IHF, die die RNA-Polymerase rekrutieren, um die Transkription zu starten. Verschiedene Mutationen in den aktiven Regionen von CRP beeinflussen die Transkriptionsrate, wobei das Dokument verschiedene Methoden zur Analyse der Protein-DNA-Interaktionen beschreibt.

1. The multiple roles of CRP at the complex acs promoter depend on activation region 2 and IHF Bianca Sclavi et al. Molecular Microbiology , 65 , 425–440

2. 1: Was/Wofür ist das acs -Gen? acs steht für Acetyl-CoA-Synthetase. Acetyl-CoA-Synthetase kommt in allen Organismen vor. Hier wurde E. coli untersucht. Acetyl-CoA-Synthetase ist eine Ligase, die die Synthese von Acetyl-CoA aus Acetat und Coenzym A katalysiert. Acetat kann somit als Kohlenstoffquelle genutzt werden und im Citratzyklus oder in der Biosynthese verwendet werden. Wird benötigt, wenn Kohlenstoffmangel herrscht, da andere C-Quellen zur Neige gehen.

3. 3: acs auf der DNA P1, P2 & P2A sind Promotoren P2 ist der bedeutendste von ihnen IHF = Integration Host Factor acs hat 3 Bindestellen für IHF CRP = cAMP Receptor Protein acs hat 2 Bindestellen für CRP

4. 4: Was macht IHF & CRP? IHF ist ein Nucleoid-Protein. Das bedeutet, es verändert die Form der DNA, Bsp. bei der Kondensation zu Chromatin. CRP bindet an cAMP, wodurch dieser CRP-cAMP-Komplex an die DNA binden kann. Anschließend kann die RNA-Polymerase rekrutiert werden.

5. 3: acs auf der DNA P1, P2 & P2A sind Promotoren P2 ist der bedeutendste von ihnen IHF = Integration Host Factor acs hat 3 Bindestellen für IHF CRP = cAMP Receptor Protein acs hat 2 Bindestellen für CRP

6. 3a: Klassen von Promotoren Klasse 1 Promotor: - Transkriptionsfaktor (hier: CRP) bindet bei Position -60 oder höher - Kontakt zwischen Transkriptionsfaktor & α-CTD Klasse 2 Promotor: - Transkriptionsfaktor überlappt mit der -35 Region - Kontakt zwischenTranskriptions- faktor & α-NTD, σ-Untereinheit und manchmal α-CTD Klasse 3 Promotor: - Klasse 1/Klasse 1 oder Klasse 1/Klasse 2 Verknüpfung

7. 5: Bisherige Bewertung der verschiedenen Domänen von acs Ist sowohl die IHF III- und die CRP II-Stelle besetzt, stoppt die Transkription, da diese Kontakte die RNA-Polymerase fest binden. CRP I muss besetzt sein, damit der Promotor P2 genutzt werden kann. Um die höchste Transkriptionsrate zu erreichen, muss auch CRP II besetzt sein. IHF I und IHF II wirken dieser Überstabilisierung entgegen.

8. 5a: Verwendete DNA-Bruchstücke & Mutanten

9. 6: Beitrag von IHF bei der Transkription

10. 7: Beitrag von CRP bei der Transkription

11. 8: Aktive Regionen von CRP Varianten: 1+ 2+ 3° = WT 1+ 2- 3° 1+ 2+ 3+ 1+ 2- 3+ 1- 2+ 3° 1- 2- 3° 1- 2+ 3+ 1- 2- 3+ AR1 & AR2 sind natürlich AR3 ist künstlich

12. 9: Auswirkungen dieser Mutanten auf die Transkriptionsrate mutierte AR1-Region: keine Promotoraktivität, unabhängig von den weiteren Mutationen

13. Footprinting Assay 1. DNA-Ende markieren 2. Protein zugeben 3. Partialverdau der DNA 4. Protein entfernen 5. Gelelektrophorese - Footprints (Lücken): von Protein geschützte Bereiche - Hypersensitive Sites (Banden): von Protein freigelegte Bereiche

14. 10: Charakterisierung der Proteinbindung durch DNase I Footprinting Assay

15. 11: Vorstellung von Potassium (= Kaliumpermanganat) Footprinting Analysis - DNA & Proteine inkubieren - KMnO4 zugeben - Proteine & KMnO4 entfernen - Primer Extension - Gelelektrophorese Banden: Einzelsträngiger Bereich der DNA

16. 12: Charakterisierung der Proteinbindung mit Kaliumpermanganat-Footprinting Analysis

21. Zusammenfassende Gedanken zum acs-Promotor - Regulierung durch Protein-DNA Interaktionen & durch Protein-Protein Interaktionen ==>diverse Signale können miteinbezogen werden - CRP, IHF & FIS stellen die wichtigsten Regulatoren dar - TOC (transcription open complex) wird de-/über-/stabilisiert - Aktivierung wenn C-Quellen aufgebraucht, um acetate & coA zu Acetyl-CoA zu katalysieren und dieses im Citratzyklus verwerten zu können - DNA-Kondensation führt zur inhibition der TOCs und somit von - DNA-Kondensation führt zur inhibition der TOCs und somit von Acetyl-CoA synthetase