Tiga kalimat ringkasan dokumen tersebut adalah:
Dokumen tersebut menjelaskan proses ekstraksi DNA dari buah stroberi melalui isolasi DNA, elektroforesis DNA, dan hasil pengamatan dari proses tersebut berupa larutan bening dan gumpalan DNA stroberi.
1. Ekstrasi Dna (Isolasi dan Elektroforesis DNA) Pada Buah Strowberry (Fragaria
virginiana)
Ihwan Fauzi Saputra
Prodi Pendidikan Biologi, Fakultas Tarbiyah dan Keguruan, UIN Raden Fatah Palembang
Jl. Prof. DR. Zainal Abidin Fikri Km 3,5 Palembang
Email: Ihwanfauzi98@gmail.com
Abstract
The development of science and technology are very advanced in this time gave the big influence in the
advancement of science one of which is the science of genetics, by using technology we can extract DNA by
means of DNA isolation, DNA electrophoresis, and PCR. Penrcobaan this time aims to determine how or the
process of DNA extraction with isolation of DNA, and using electrophoresis and PCR. On this DNA extraction
experiment using fruit extracts strowberry and the results obtained clear solution and clot in the tube. The blob is
the DNA of strawberries network. For the isolation of DNA from plant tissue, needed some specific chemical
compounds. Such compounds include extraction buffer which serves to lyse the cell membrane, the SDS 20%.
Whereas, in carrying out DNA electrophoresis, required TAE Buffer 10 x (400mm Tris acetate, 10 mM EDTA
pH 8), Agarose, Loading Buffer, DNA Marker, and ethidium bromide which will color the DNA.
Keywords: DNA extraction, DNA isolation, electrophoresis, fruit strowberry.
Abstrak
Perkembangan ilmu pengetahuan dan tekhnologi yang sangat maju pada saat ini telah meberikan andil
yang cukup besar dalam kemajuan ilmu pengetahuan/ sains salah satunya adalah ilmu Genetika, dengan
menggunakan tekhnologi kita dapat mengekstraksi DNA dengan cara isolasi DNA, Elektroforesis DNA, dan PCR.
Penrcobaan kali ini bertujuan untukmengetahui bagaimana cara atau proses ektraksi DNA dengan car menisolasi,
dan menggunakan cara elektroforesis dan PCR. Pada percoban ektraksi DNA ini mengunakan ektrak buah
Strowberry dan didapatkan hasil larutan bening dan gumpalan di dalam tabung. Gumpalan tersebut merupakan
DNA dari jaringan buah strawberry. Untuk melakukan isolasi DNA dari jaringan tumbuhan, diperlukan beberapa
senyawa kimia tertentu.Senyawa-senyawa tersebut diantaranya bufferekstraksi yang berfungsi untuk melisiskan
membran sel, SDS 20%. Sedangkan, dalam melaksanakan elektroforesis DNA, diperlukan Buffer TAE 10 x
(400mM Tris asetat, 10 mM EDTA pH 8), Agarose, Loading Buffer, DNA Marker, dan Etidium Bromida yang
akan mewarnai DNA.
Kata Kunci : Ekstraksi DNA, Isolasi DNA, Elektroforesis, buah Strowberry.
PENDAHULUAN
Dewasa ini telah banyak dilakukan isolasi
DNA yang bertujuan untuk mengembangkan ilmu
pengetahuan terutama dalam ilmu Genetika. Isolasi
DNA telah banyak dilakukan dan dikembangkan di
dunia ilmiah karena teknologi- teknologi modern
telah menjamah ilmu genetika. Isolasi DNA ini
dapat dilakukan dengan cara dan bahan sederhana,
hingga dengan teknologi modern. Mengenai hal ini,
pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari
berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah,
daun, daging buah, kalus, akar batang, daging dan
sisik ikan. Namun, penggunaan tumbuhan sebagai
sumber lebih banyak dilakukan dalam pengisolasian
DNA dewasa ini. Pengisolasian DNA pada sumber
dilakukan terutama untuk pengenalan DNA secara
lebih jelas karena dari isolasi ini DNA dapat terpisah
dari kumpulannya, yaitu kromosom. Setelah
dilakukan isolasi, biasanya DNA akan
dielektroforesis.
Elektroforesis dilakukan untuk
memisahkan, mengidentifikasi, mengkarekterisasi
dan purifikasi dari molekul DNA/RNA.
Elektroforesis merupakan cara pengamatan DNA
dengan bantuan sinar Ultra violet. Cara pemisahan
dengan elektroforesis ini merupakan alat pendukung
yang sangat pokok dalam teknologi DNA
rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik
untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda
molekul DNA. Elektroforesis digunakan untuk
pengamatan DNA dalam penampakan
flouresensinya.
Berdasarkan hal-hal tersebut diatas dan tak
lepas dari tujuan peningkatan khazanah ilmu
pengetahuan terutama dalam bidang ilmu Genetika,
maka kami mengadakan praktikum isolasi hingga
elektroforesis DNA.
PROSEDUR KERJA
Percobaan ekstraksi DNA ini dilaksanakan
pada hari Selasa 27 Januari 2015, Pukul 08.00-12.00
WIB, di Laboratorium Genetika Fakultas Sains dan
Tekhnologi, Universitas Islam Negeri (UIN)
Maulana Malik Ibrahim Malang.
2. Alat dan Bahan
Pada praktikum ini alat yang digunakan
adalah: Gelas ukur 25 m, Panci/ waterbath,
Penyaring santan, sendok, Pipet tetes , Tube 2 ml,
dan Sentrifuge.
Sedangkan bahan yang digunakam adalah
Metil Spiritus, Buah Sroberi dan Pisang, Handsoap
atau Detergaen (yang mengandung SDS, NaCl
(garam), Gelas bening/ Beaker Glass, Pisau, dan
Timbangan.
A. Isolasi DNA
1) Siapkan spiritus dalam es/ freezer sampai
sangat dingin
2) Kupas buah dan potong kecil, kemudian
dimasukan kedalam beaker glass 250 ml
3) Campurkan 2 gram garam, 5 ml cairan
pencuci dan 50 ml air menjadi satu
kedalam beaker glass 500 ml, aduk dengan
sendok makan hingga menyatu/ homogen
(15 menit)
4) Masukan larutan garam dan cairan pencuci
piring tersebut kedalam beaker glass 250
ml yang berisi potongan buah, biarkan
selama 15 menit
5) Letakan beaker glass 250 ml yang berisi
larutan garam, pencuci piring dan buah
tersebut ke waterbath selama 15 menit
6) Saring campuran larutan tersebut kedalam
beaker glass 25 ml isi sepertiga saja
7) Lakukan dengan hati-hati, tuangkan
spiritusyang telah didinginkan tadi melalui
belakang sendok teh sehingga sepiritus
membentuk lapisan berwarna ungu diatas
lapisan hijau, hentikan pengisian ketika
ketinggian mencapai 2/5 gelas, kemudin
amati
8) Anda akan melihat lapisan putih yang
terbentuk antara lapisan hijau dan ungu,
itulah DNA, kumpulkan DNA dengan
ujung pipet tetes dan hisaplah DNA dari
gelas, atau bisa menggunakan mikroopipet
1 ml dengan menghisap pada lapisan putih
itu, dan masukan tube 1,5 ml
9) Purifikasi dengan menambahkan alkohol
70 % sebnyak 1 ml, kemudian sentrifuge
dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5
menit, buang supernatan dan ulangi
sebnayak 2 kali.
10) Rehidrasi pelet DNA dengan 200 mikroolit
rehydrasi slutin kit/ buffer TE, dan simpan
pada suhu dingin.
B. Elektroforesis
1) Pembuatan gel agarosa
a) Tentukan konsentrasi atau prosentasi
agarosa yang dibutuhkan dan hal ini
tergantung dari ukuran fragmen DNA yang
dianalisis. Presentasi gel agarosa yang
direkomendasikan adalah sebagai berikut:
0,5 % agarosa untuk fragmen DNA
Berukuran 1.000-30.000 pb
0,7 % agarosa untuk fragmen DNA
Berukuran 800-12.000 pb
1,5 % agarosa untuk fragmen DNA
Berukuran 200-3.000 pb
2,0 % agarosa untuk fragmen DNA
Berukuran 50-2.000 pb
b) Temptkan agarosa yang telah ditimbang
kedalam erlenmeyer dan isi dengan
sejumlah larutan 1x buffer TAE, kemudian
kocok sampai merata
c) Panaskan dalam microwave atau hotplate
sampai mendidih dan larutkan agarosa kira-
kira sampai 60o C
d) Setelah itu larutan dituang kedalam cetakan
dan pasang sisir,tunggu kurang lebih dai 30
menit atau sampai gel mengeras, lepaskan
sisir secara perlahan-lahan dan gel agarosa
siap digunakan untuk elektroforsis.
2) Proses Elektroforesis
a) Letakan cetakan yang berisisi gel agarosa
didalam bak elektroforesis dan tuang
larutan 1x buffer TAE kedalam bak
tersebut hingga sekitar 1 mm diatas
permukaan gel
b) Ambil sampel dengan mikropipet sekitar 8
µl. Letakan sampel diatas parafilm atau
plastic cling wrap dan tambahan loading
dye buffer sebanyak 2 µl kemudian
gunakan mikropipet untuk mencampur
hingga rata. Ambil larutan tersebut dengan
mikropipet dan masukan kedalam sumur
pada gel agarosa.
c) Setelah sempel dimasukan dalam sumur,
tutup bak elektroforesis dan hubungkan
aparatus listrik (hati-hati tegangan listrik
cukup tinggi). Setelah itu proses
elektroforesis siap dijalakan
d) Lamanya elektroforesis tergantung
presentase gel agarose, tegangan arus
listrik, dan ukuran molekul DNA. Sebagai
gambaran proses elektroforsis untuk
tegangan listrik 100 volt. Ukuran fragmen
DNA yang dianalisis 50-2000 pasang basa
maka proses elektroforesis memerlukan
waktu sekitar 30 menit
e) Setelah proses elektroforesis selesai,
matikan arus listrik dan ambil cetakan
berisi gel dengn menggunakan sarung
tangan.
3) Pewarnaan dan pengamatan
a) Letakan gel pada wadah yang berisi larutan
etidium bromida. Direndam selama 15
menit. (hati-hati karena etidium bromida
bersifat karsinogenik).
b) Gel yang telah direndam dipindahkan
kedalam “Gel Doc” atau UV
3. transiluminator dan jika pita/band molekul
DNA keliatan terang maka ambil
dokumentasikan melalui komputer yang
terinstal dengan “Gel Doc” atau
menggunakan kamera Palaroid jika
menngunakn UV transiluminator.
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Hasil
No Gambar Urutan Proses Isolasi DNA Foto Hasil Pengamatan
1
Isolasi DNA buah strawberry
0,1 mL
Warna larutan merah pekat
(merah darah)
Strawberry pekat larutannyah,
belum terbentuk endapan,
butiran kasar masih tersebar di
sekitar larutan.
2
Setelah diinkubasi dalam
penangas air suhu 60˚C selama
20 menit
Warna larutan merah muda
Belum terlihat adanya endapan,
hanya butiran halus yang
tersuspensi.
3
Setelah disimpan dalam wadah
es selama 10 menit
Warna larutan >> merah pucat
Tidak ada endapan
4. 4
Setelah di sentrifuge dengan
kecepatan 14000 rpm selama
10 menit
Warna larutan pink pudar
Terbentuk endapan
5
Setelah sentrifuge kedua
dengan kecepatan 14000rpm
selama 10 menit.
Warna larutan pink pudar
Warna larutan bening dan tidak
ada endapan
6
Setelah ditambahkan alkohol
00% sebanyak 2x volume
total sampel.
Larutan bening
DNA
1. Pembahasan Isolasi DNA
Isolasi DNA pada dasarnya dapat
dilakukan dengan merusak dinding dan membrane
sel dan juga membrane inti. Berdasarkan hasil
pengamatan, larutan yang berisi strawberry dan
buffer berwarna merah sesuai dengan warna buah
strawberry. Penambahan buffer ekstraksi ini
berfungsi untuk melisiskan membran sel. Dan
penambahan SDS 20% bertujuan untuk melisiskan
dinding sel dan mendenaturasi protein sehingga
DNA pada jaringan buah strawberry dapat diisolasi.
Larutan dalam tabung tersebut dihomogenkan
dengan menggunakan vorteks.
Kemudian diinkubasi sehingga
menghasilkan perubahan warna larutan.
Penginkubasian sampel dalam waterbath bersuhu
65oC selama 20 menit ini dilakukan untuk
mengoptimalikan kerja buffer ekstrak. Langkah
selanjutnya adalah penambahan Potassium asetat
yang bertujuan untuk membentuk senyawa
kompleks CTAB-Potassium asetat-protein-debris
sel. Yang kemudian dilanjutkan dengan sentrifugasi
yang bertujuan untuk memisahkan debris dan
komponen sel lain yang menjadi pengotor dengan
DNA. Proses ini menghasilkan larutan dengan dua
fasa,yakni fasa atas dan endapan.Kemudian,setelah
fasa atas di ambil dan dipindahkan ke dalam tabung
5. baru, ditambahkan Phenol:Chloroform:Isola myl
Alkohol (PCI) yang dilakukan untuk mengekstraksi
DNA dari kontaminan. Fenol merupakan pelarut
organik yang dapat melarutkan protein, lipid dan
molekul lain seperti polisakarida, yang diharapkan
akan didapatkan supernatan yang berisi DNA bebas
kontaminan. Kloroform berfungsi sebagai
pendenaturasi protein,tetapi DNA dan RNA tidak
terdenaturasi karena tidak larut didalam pelarut
organik seperti kloroform.
Kemudian dilakukan penambahan alkohol
sebagai presipitasi DNA setelah dilakukan
sentrifugasi dan pemindahan fasa. Penambahan
alkohol ini berfungsisebagaipenghilang kloroform.
Sebab apabila kloroform masih berada di dalam
sampel maka dikhawatirkan akan menghambat kerja
enzim-enzim restriksi atau enzim lain yang
digunakan untuk analisis molekuler. Dihasilkanlah
larutan bening dan gumpalan di dalam tabung.
Gumpalan tersebut merupakan DNA dari jaringan
buah strawberry.
2. Pembahasan Elektroforesis DNA
Pada praktikum elektroforesis ini, sampel
diambil dari sampel molekul DNA yang telah
dilarutkan dalam TE sebanyak 30 mikroliter dan
telah disimpan pada suhu 4˚C selama 24 jam. Lalu
penambahan Loading dye ke dalam sampel dengan
perbandingan 5 bagian sampel DNA dan 2 bagian
loading dye.
Dalam proses elektroforesis, sampel
molekul DNA ditempatkan ke dalam sumur (well)
pada gel yang ditempatkan di dalam larutan
penyangga,kemudian dialirkan listrik dengan kutub
yang terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Molekul-
molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam
matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai
dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah
pergerakan adalah menuju elektroda positif,
disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka
gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar
laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya
berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti
natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk
menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus.
Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen
(misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk
membuat protein tersebut berbentuk linear dan
bermuatan negatif pada sisi luarnya sehingga pada
saat dielektroforesis akan menuju ke kutub positif
secara seragam. Setelah proses elektroforesis
selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar
molekul sampel yang telah terpisah dapat dideteksi.
Dalam praktikum ini kami menggunakan Etidium
bromida sebagai zat pewarnanya,. Etium bromida
akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA
dan akan memberikan warna orange fluoresance
yang dapat dilihat di bawah sinar ultraviolet.
Ketika dilihat di bawah sinar ultraviolet
akan terlihat pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane)
yang berbeda pada gel; satu lajur merupakan arah
pergerakan sampel dari sumur gel. Pita-pita yang
berjarak sama dari sumur gel pada akhir
elektroforesis mengandung molekul-molekul yang
bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan
kecepatan yang sama, yang berarti bahwa molekul-
molekul tersebut berukuran sama. Penanda (marker)
yang merupakan campuran molekul dengan ukuran
berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan
ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-
elektroforesis penanda tersebut pada lajur di gel
yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur
marker tersebut dapat dibandingkan dengan pita
sampel untukmenentukan ukurannya.Jarak pita dari
sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma
ukuran molekul. Dalam Hasil pengamatan terlihat
bahwa terdapat fragmen DNA yang terlihat terurai
dan tidak terurai. Semakin sedikit DNA yang terurai,
maka semakin baik hasil elektroforesis DNA nya.
Elektroforesis adalah teknik pemisahan
komponen atau molekul bermuatan berdasarkan
perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan
listrik. Teknik ini dapat digunakan dengan
memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan
negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif
dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri
arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang
berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan
bergerak dari kutub negatif ke kutub positif.
Elektroforesis ter bagi atas dua yaitu:
Elektroforesis kertas yaitu jenis
elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase
diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai
fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks.
Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi
konsentrasi sepanjang sistem pemisahan.
Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada
muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang,
tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit,
kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat
terlarut.
Elektroforesis gel yaitu elektroforesis yang
menggunakan gel sebagai fase diam untuk
memisahkan molekul-molekul. Awalnya
elektoforesis geldilakukan dengan medium gel kanji
(sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul
yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian
elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan
agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.
KESIMPULAN
Untuk melakukan isolasi DNA dari
jaringan tumbuhan, diperlukan beberapa senyawa
kimia tertentu. Senyawa-senyawa tersebut
diantaranya buffer ekstraksi yang berfungsi untuk
6. melisiskan membran sel, SDS 20% yang berfungsi
untuk melisiskan dinding sel dan mendenaturasi
protein, Potassium asetat yang bertujuan untuk
membentuk senyawa kompleks CTAB-Potassium
asetat-protein-debris sel, Phenol:
Chloroform:Isolamyl Alkohol (PCI) yang berfungsi
untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan, Fenol
yang berfungsi untukmendapatkan supernatan yang
berisi DNA bebas kontaminan, Kloroform yang
berfungsi sebagai pendenaturasi protein kecuali
DNA dan RNA, dan alkohol yang berfungsisebagai
penghilang kloroform.
Sedangkan, dalam melaksanakan
elektroforesis DNA, diperlukan Buffer TAE 10 x
(400mM Tris asetat,10 mM EDTA pH 8), Agarose,
Loading Buffer, DNA Marker, dan Etidium
Bromida yang akan mewarnai DNA.
DAFTAR PUSTAKA
Albert, B., 1994. Biologi MolekulerSel Edisi
Kedua.PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Asris., 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat
Isolasi DNA.http://asris07. Student.ipb.ac.id.
Diakses pada tanggal 17 Maret 2015, pada pukul
23.00 WIB.
Elrod, S., 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga.
Jakarta.
Kirsman, 2010.Isolasi DNA Buah.
http://kirsman83.weebl..com. Diakses pada tanggal
17 Maret 2015, pada pukul 23.00 WIB.
Rachmat, 2012. Isolasi DNA.
http://rachmatyusuf.blogspot.com.Diakses
pada tanggal17 Maret 2015, pada pukul 23.00
WIB.
Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah
Mada. Yogyakarta.
Dwidjoseputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi.
Jakarta: Djambatan.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa
Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda dan
USESE Foundation.
Tohib, 2012. Macam Metode Isolasi DNA.
http://www.tohib.web.id. Diakses pada tangga17
Maret 2015, pada pukul 23.00 WIB.