1) El documento describe un estudio sobre las β-glucosidasas producidas por el hongo Talaromyces amestolkiae. 2) Se han purificado y caracterizado tres β-glucosidasas, siendo BGL-2 y BGL-3 dímeros y BGL-1 un monómero. 3) Las β-glucosidasas muestran actividad óptima a pH 4-7 y temperaturas entre 50-60°C, y son estables en un rango de pH 4-7 a 50°C.
Frankel, Hermann. - Poesía y filosofía de la Grecia arcaica [ocr] [1993].pdf
Estudio de las B-glucosidasas del complejo celulolítico de Talaromyces amestolkiae. Aplicaciones biotecnológicas.
1. Estudio de lasEstudio de las ββ-glucosidasas-glucosidasas
del complejo celulolítico dedel complejo celulolítico de
Talaromyces amestolkiaeTalaromyces amestolkiae::
Caracterización y aplicacionesCaracterización y aplicaciones
biotecnológicasbiotecnológicas
||Jesús Gil MuñozJesús Gil Muñoz
||DirectoresDirectores
Mª Jesús Martínez HernándezMª Jesús Martínez Hernández
Laura I. de Eugenio MartínezLaura I. de Eugenio Martínez
Jorge Barriuso MaicasJorge Barriuso Maicas
3. Evaluación del
potencial para
aplicaciones
industriales
Purificación y
caracterización de
las BGL secretadas
Estudio de su
capacidad para
producir celulasas
y optimización de
la producción
Identificación
molecular y
morfológica del
hongo seleccionado
Screening y selección
de
hongos celulolíticos
Expresión
heteróloga y
cristalización de
las BGL
Previamente Tesis Doctoral Futuro
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
4. Salvado de trigo
Paja de trigo
Salvado de
avena
Slurry ácido de
paja de trigo
Celulosa
microcristalina
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
Matraz 250 mL
50 mL Medio Mandels
+ Fuente C, 1% (p/v)
5. 2. Se han purificado y caracterizado tres BGLpurificado y caracterizado tres BGL.
BGL-1 y BGL-2 son monómeros, mientras que
BGL-3 es una proteína dímero funcionalBGL-3 es una proteína dímero funcional. BGL-2
y BGL-3 presentaron por SDS-PAGE una masa
molecular similar (~100 kDa), sin embargo, la de
BGL-1 fue menor (~60 kDa). El pI de las enzimas
se situó entre 5,6-7,2, siendo BGL-2 la del pI más
ácido, seguida de BGL-1 y BGL-3. Todas ellas
son glicoproteínas, probablemente conglicoproteínas, probablemente con
enlaces O-glicosídicosenlaces O-glicosídicos. Los mayores valores de
actividad se encontraron a pH 4 y entre 50-60
ºC y son estables en un rango de pH 4-7 y a 50
ºC.
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
7. Energía a través de
alimentos y el Sol
como fuente de calor
Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
8. Energía a través de
alimentos y el Sol
como fuente de calor
El descubrimiento
del fuego propició el
uso de la madera
como combustible
Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
9. Energía a través de
alimentos y el Sol
como fuente de calor
El descubrimiento
del fuego propició el
uso de la madera
como combustible
Madera para la
mayoría de las
actividades diarias:
calefacción, cocina,
cerámica, metales…
Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
10. Energía a través de
alimentos y el Sol
como fuente de calor
El descubrimiento
del fuego propició el
uso de la madera
como combustible
Madera para la
mayoría de las
actividades diarias:
calefacción, cocina,
cerámica, metales…
Con la Revolución
Industrial comenzó el
uso masivo de
combustibles fósiles
Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
11. Las emisiones de
CO2 provocan el
calentamiento global
Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
Energía a través de
alimentos y el Sol
como fuente de calor
El descubrimiento
del fuego propició el
uso de la madera
como combustible
Madera para la
mayoría de las
actividades diarias:
calefacción, cocina,
cerámica, metales…
Con la Revolución
Industrial comenzó el
uso masivo de
combustibles fósiles
12. Biomasa vegetal
para la producción
de biocombustibles
Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
Las emisiones de
CO2 provocan el
calentamiento global
Energía a través de
alimentos y el Sol
como fuente de calor
El descubrimiento
del fuego propició el
uso de la madera
como combustible
Madera para la
mayoría de las
actividades diarias:
calefacción, cocina,
cerámica, metales…
Con la Revolución
Industrial comenzó el
uso masivo de
combustibles fósiles
13. 2G
Cultivos energéticos
Paja de trigo
1G
Caña de azúcar
Grano de maíz
Biomasa
lignocelulósica
Sacarosa
Almidón
Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
14. Célula
vegetal
Celulosa
Hemicelulosa
LigninaRatanakhanokchai et al., 2013 |
Chandel y Singh, 2011 |
Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas
Tabla 1.1. Porcentaje en peso seco de la composición de la pared celular de
diferentes fuentes lignocelulósicas (Chandel y Singh, 2011).
Fuente lignocelulósica Celulosa Hemicelulosas Lignina
Maderas
duras
Abedul 40,0 23,0 21,0
Sauce 37,0 23,0 21,0
Álamo 51,0 29,0 16,0
Maderas
blandas
Picea 43,0 26,0 29,0
Pino 46,4 8,8 29,4
Residuos
agrícolas
Paja de trigo 38,2 21,2 23,4
Rastrojo de maíz 37,5 22,4 17,6
Cultivos
energéticos
Miscanthus giganteus 40,0 18,0 25,0
Panicum virgatum 31,0 20,4 17,6
Tabla 1.1. Porcentaje en peso seco de la composición de la pared celular de
diferentes fuentes lignocelulósicas (Chandel y Singh, 2011).
Fuente lignocelulósica Celulosa Hemicelulosas Lignina
Maderas
duras
Abedul 40,0 23,0 21,0
Sauce 37,0 23,0 21,0
Álamo 51,0 29,0 16,0
Maderas
blandas
Picea 43,0 26,0 29,0
Pino 46,4 8,8 29,4
Residuos
agrícolas
Paja de trigo 38,2 21,2 23,4
Rastrojo de maíz 37,5 22,4 17,6
Cultivos
energéticos
Miscanthus giganteus 40,0 18,0 25,0
Panicum virgatum 31,0 20,4 17,6
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
16. Compuesto orgánico más
abundante en la Tierra
Homopolisacárido lineal
de glucosa
Enlaces glucosídicos β-1,4
Puentes de hidrógeno
intra- e intermoleculares
Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas
Celulosa
| Xi et al., 2013
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
Región
cristalina
Región
amorfa
Región
amorfa
17. Introducción
ácido
base
ácido base
Glicosil-enzimabase
9-10 Å
5-6 Å
Davies y Henrissat, 1995 |
Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas
Mecanismo de inversión
Mecanismo de retención
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
Residuos catalíticos:
Asp (D) y/o Glu (E)
Residuos catalíticos:
Asp (D) y/o Glu (E)
19. Glu-OR + BGL [Glu - BGL ] Glu-OH + BGL
H2O Hidrólisis
↑
ROH
Glu-OR´ + BGL
R´OH
Síntesis:
Transglicosilación
Alquilglicósidos Celooligosacáridos
Introducción
Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas
Reacciones de las BGL
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
20. • Trichoderma
T. reesei, T. longibrachiatum, T. harzianum…
Bajos niveles de BGL
Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas
• Penicillium
P. purpurogenum, P. funiculosum, P. echinulatum…
Altos niveles de BGL
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
RUT-C30
RUT-C30
21. Muestras de cereal,
suelo y material vegetal
en descomposición
80 hongos
celulolíticos
4 hongos
alta producción
celulasas
Placas agar-PASC
| Jurado et al., 2007
Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
22. 80 hongos
celulolíticos
4 hongos
alta producción
celulasas
Muestras de cereal,
suelo y material vegetal
en descomposición
| Jurado et al., 2007
Placas agar-PASC
Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
23. Evaluación del
potencial para
aplicaciones
industriales
Purificación y
caracterización de
las BGL secretadas
Estudio de su
capacidad para
producir celulasas
y optimización de
la producción
Identificación
molecular y
morfológica del
hongo seleccionado
Screening y selección
de
hongos celulolíticos
Expresión
heteróloga y
cristalización de
las BGL
Previamente Tesis Doctoral Futuro
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
24. ¿Cepa IJFM A795?
100 % homología:
-Penicillium rubrum CBS 263.93
-Penicillium purpurogenum var.
rubrisclerotium CBS 274.95
Análisis molecular
RPB1 | Bt2
ITS:
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
Internal
Transcribed
Spacer
Internal
Transcribed
Spacer
Subunidad
mayor de la
ARNpol II
Subunidad
mayor de la
ARNpol II β-tubulina 2
β-tubulina 2
25. Análisis morfológico
macroscópico
IJFM A795
CBS 263.93
CBS 274.95
CYA MEA YES
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
7 días
26-28ºC, oscuridad
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
Muestras de
cereal
Lavado
broncoalveolar
Escultura de
piedra
Talaromyces sp.
26. IJFM A795
CBS 263.93
CBS 274.95
Conidióforos
Conidios
Estípite
Rama
Métula
Fiálide
Conidios
Penicillium > Biverticillium
Análisis morfológico
microscópico
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
SSF, paja de trigo
7 días, 28ºC + SEM
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
27. Samson et al., 2011 |
| Yilmaz et al., 2012
Penicillium > Biverticillium => Talaromyces
Delimitación género Talaromyces
Penicillium rubrum CBS 263.93
Talaromyces amestolkiae
CBS 263.93
***
Penicillium purpurogenum var.
rubrisclerotium CBS 274.95
Talaromyces amestolkiae
CBS 274.95
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
28. Clado 2B
Clado 2A
Clado 1
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
IJFM A795
Talaromyces amestolkiae
IJFM A795
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
Regiones
ITS
Regiones
ITS
Primera vez que se
describe como
celulolítico.
Primera vez que se
describe como
celulolítico.
29. Evaluación del
potencial para
aplicaciones
industriales
Purificación y
caracterización de
las BGL secretadas
Estudio de su
capacidad para
producir celulasas
y optimización de
la producción
Identificación
molecular y
morfológica del
hongo seleccionado
Screening y selección
de
hongos celulolíticos
Expresión
heteróloga y
cristalización de
las BGL
Previamente Tesis Doctoral Futuro
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
30. T. amestolkiae
IJFM A795
Matraz 250 mL
50 mL Medio Mandels
+ Avicel, 1% (p/v)
T. amestolkiae
CBS 263.93
T. amestolkiae
CBS 274.95
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
BGL: 1,9 U/mL
7 días
BGL: 1,9 U/mL
7 días
31. Salvado de trigo
Paja de trigo
Salvado de
avena
Slurry ácido de
paja de trigo
Celulosa
microcristalina
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
BGL: 1,9 U/mL
7 días
BGL: 1,9 U/mL
7 días
Matraz 250 mL
50 mL Medio Mandels
+ Fuente C, 1% (p/v)
32. Matraz 250 mL
50 mL de medio
Medio Mandels +
Avicel, 1% (p/v)
Matraz 1 L
100 mL de medio
Fermentador 1,5 L
1,3 L de medio
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
BGL: 1,9 U/mL
7 días
BGL: 1,9 U/mL
7 días
BGL: 2,1 U/mL
5 días
BGL: 2,1 U/mL
5 días
BGL: 3,8 U/mL
4 días
BGL: 3,8 U/mL
4 días
·12 cepas de Penicillium
BGL: 0,97 – 2,45 U/mL
·T. reesei RUT-C30
BGL: 0,3 U/mL
| Krogh et al., 2004
·12 cepas de Penicillium
BGL: 0,97 – 2,45 U/mL
·T. reesei RUT-C30
BGL: 0,3 U/mL
| Krogh et al., 2004
·P. verruculosum
| Solov’eva et al., 2005
·P. verruculosum
| Solov’eva et al., 2005
33. Evaluación del
potencial para
aplicaciones
industriales
Purificación y
caracterización de
las BGL secretadas
Estudio de su
capacidad para
producir celulasas
y optimización de
la producción
Identificación
molecular y
morfológica del
hongo seleccionado
Screening y selección
de
hongos celulolíticos
Expresión
heteróloga y
cristalización de
las BGL
Previamente Tesis Doctoral Futuro
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
42. BGL-1
BGL-2
BGL-3
GlucotoleranciaTermoestabilidad
Ki=3,12 mM
Ki=0,09 mM
Ki=0,18 mM
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
BGL-1, la más
glucotolerante.
BGL-1, la más
glucotolerante.
43. pNPG
Celobiosa
BGL-2 > BGL-3 > BGL-1
Tabla 3.6. Parámetros cinéticos de las BGL de T.
amestolkiae.
Km
(mM)
Vmax
(U/mg)
kcat
(s-1
)
kcat/Km
(s-1
mM-1
)
pNPG
BGL-1 1,57 ± 0,07 86,9 ± 5,5 90,7 57,8
BGL-2 0,09 ± 0,01 17,4 ± 2,1 28,2 313,3
BGL-3 0,29 ± 0,03 62,1 ± 3,8 221,5 763,8
Celobiosa
BGL-1 2,24 ± 0,20 125,0 ± 4,9 130,4 58,2
BGL-2 0,73 ± 0,03 43,1 ± 1,7 69,8 95,6
BGL-3 1,48 ± 0,06 81,9 ± 2,9 292,1 197,4
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
Aplicable en los pasos
finales de la hidrólisis de
la celulosa.
| Bhatia et al., 2005
| Parry et al., 2001
Aplicable en los pasos
finales de la hidrólisis de
la celulosa.
| Bhatia et al., 2005
| Parry et al., 2001
La presencia del pNP facilita la
ruptura del enlace.
La presencia del pNP facilita la
ruptura del enlace.
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
P. verruculosum: 4,6 s-1
mM-1
| Chun et al., 1991
JMB19063: 190 s-1
mM-1
| McAndrew et al., 2013
Stachybotris sp.: 818 s-1
mM-1
| Amaouri et al., 2006
P. verruculosum: 4,6 s-1
mM-1
| Chun et al., 1991
JMB19063: 190 s-1
mM-1
| McAndrew et al., 2013
Stachybotris sp.: 818 s-1
mM-1
| Amaouri et al., 2006
44. Glu-OR + BGL [Glu - BGL ] Glu-OH + BGL
H2O Hidrólisis
↑
ROH
Glu-OR´ + BGL
R´OH
Síntesis:
Transglicosilación
Alquilglicósidos Celooligosacáridos
Introducción
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados
Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas
Reacciones de las BGL
Reacciones
regioselectivas y
estereoespecíficas.
Reacciones
regioselectivas y
estereoespecíficas.
45. Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
pNP-G + R-OH
BGL-1, BGL-2 o BGL-3
pNP-OH + R-G
MeG
EtG
PrG
BuG
R: Me
R: Et
R: Pr
R: Bu
BGL-1 BGL-2 BGL-3
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
Gran potencial
como surfactante.
Gran potencial
como surfactante.
Precursor de un compuesto
usado en la terapia contra
el SIDA.
Precursor de un compuesto
usado en la terapia contra
el SIDA.
Geranilglucósido
(T. citrinoviride):
| Chandra et al., 2003
Geranilglucósido
(T. citrinoviride):
| Chandra et al., 2003
46. Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
BGL-1, BGL-2 o BGL-3
n
BGL-1, BGL-2 o BGL-3
<n >nHidrólisis Transglicosilación
n=10
Celodecaosa
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
Prebióticos en la
industria alimentaria.
Prebióticos en la
industria alimentaria.
Cuanto mayor es el
sustrato de partida,
mayor es el producto
de transglicosilación.
Cuanto mayor es el
sustrato de partida,
mayor es el producto
de transglicosilación.
50. Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
BGL-2
65% identidad con:
•4I8D y 3ZYZ
H. jecorina (= T. reesei)
| Karkehabadi et al., 2014
66% identidad con:
•4IIB
A. aculeatus
| Suzuki et al., 2013
BGL-3
FnIII
C-terminal
N-terminal
D232 | E444
5,2 Å - retención
D254 | E484
5,3 Å - retención
Termoestabilidad
de las enzimas.
| Suzuki et al., 2013
| Pozzo et al., 2010
Termoestabilidad
de las enzimas.
| Suzuki et al., 2013
| Pozzo et al., 2010
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
51. BGL-2
65% identidad con:
PDB: 4I8D y 3ZYZ
H. jecorina (= T. reesei)
| Karkehabadi et al., 2014
Dominio
catalítico
Conector
Dominio de
unión a celulosa
(CBD)
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
71% identidad con:
PDB: 1CBH
H. jecorina (= T. reesei)
| Kraulis et al., 1989
Solo se conoce una BGL
de P. chrysosporium con
un CBD en su secuencia.
| Lymar et al., 1995
Solo se conoce una BGL
de P. chrysosporium con
un CBD en su secuencia.
| Lymar et al., 1995
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
52. Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
BGL-1 BGL-2 BGL-3
62,6 kDa
Termoestabilidad
50ºC
Más glucotolerante
Transglicosilación:
Alquilglicósidos y
celodecaosa
GH1
97,2 kDa
Termoestabilidad
50-60ºC
Hidrólisis
celooligosacáridos
Transglicosilación:
Alquilglicósidos y
celodecaosa
GH3
101,7 kDa
Termoestabilidad
50-60ºC
Mayor kcat/Km
Transglicosilación:
Alquilglicósidos y
celooctaosa
GH3
53. Evaluación del
potencial para
aplicaciones
industriales
Purificación y
caracterización de
las BGL secretadas
Estudio de su
capacidad para
producir celulasas
y optimización de
la producción
Identificación
molecular y
morfológica del
hongo seleccionado
Screening y selección
de
hongos celulolíticos
Expresión
heteróloga y
cristalización de
las BGL
Previamente Tesis Doctoral Futuro
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
54. Talarozyme
T. amestolkiae
NS 50010
A. niger
Paja de trigo
Slurry ácido de
paja de trigo
~80 g/L glucosa
Steam explosion
ácida
Avi: 19,7 U/mL
EG: 24,1 U/mL
BGL: 93,2 U/mL
Avi: 16,8 U/mL
EG: 25,6 U/mL
BGL: 198,5 U/mL
Celluclast 1.5L
T. reesei
Avi: 89,4 U/mL
EG: 157,9 U/mL
BGL: 7,6 U/mL
Avi: 357,6 U/mL
EG: 915,0 U/mL
BGL: 10,9 U/mL
Ultraflo L
T. reesei / T. longibrachiatum
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
55. Talarozyme
T. amestolkiae
NS 50010
A. niger
Paja de trigo
Slurry ácido de
paja de trigo
~80 g/L glucosa
Steam explosion
ácida
Avi: 0,11 U/mL
EG: 0,13 U/mL
BGL: 0,5 U/mL
Avi: 0,04 U/mL
EG: 0,06 U/mL
BGL: 0,5 U/mL
Celluclast 1.5L
T. reesei
Avi: 5,88 U/mL
EG: 10,39 U/mL
BGL: 0,5 U/mL
Avi: 16,40 U/mL
EG: 41,97 U/mL
BGL: 0,5 U/mL
Ultraflo L
T. reesei / T. longibrachiatum
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
56. Talarozyme
T. amestolkiae
NS 50010
A. niger
Paja de trigo
Slurry ácido de
paja de trigo
~80 g/L glucosa
Steam explosion
ácida
Avi: 0,11 U/mL
EG: 0,13 U/mL
BGL: 0,5 U/mL
Avi: 0,04 U/mL
EG: 0,06 U/mL
BGL: 0,5 U/mL
Celluclast 1.5L
T. reesei
Avi: 5,88 U/mL
EG: 10,39 U/mL
BGL: 0,5 U/mL
Avi: 16,40 U/mL
EG: 41,97 U/mL
BGL: 0,5 U/mL
Ultraflo L
T. reesei / T. longibrachiatum
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
·Multifect CX 10L (T. reesei) + P. funiculosum + T.
harzianum
97% sacarificación de bagazo de caña de azúcar.
| Maeda et al., 2011
·Celluclast 1.5L (T. reesei) + P. funicuosum
98% sacarificación de paja de cebada.
| Rosgaard et al., 2006
·Multifect CX 10L (T. reesei) + P. funiculosum + T.
harzianum
97% sacarificación de bagazo de caña de azúcar.
| Maeda et al., 2011
·Celluclast 1.5L (T. reesei) + P. funicuosum
98% sacarificación de paja de cebada.
| Rosgaard et al., 2006
La actividad BGL
suplementada es
esencial.
La actividad BGL
suplementada es
esencial.
40%
70%
Participación de
enzimas no
celulolíticas.
Participación de
enzimas no
celulolíticas.
57. Electroforesis 2D
CBH | GH7
CBH | GH6
EG | GH74
BGL-2
BGL-3
3 pH 10
kDa
250
150
100
75
50
37
25
20
15
10
Proteína identificada
Proteína NO identificada
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
7 días: Avicel 1% (p/v)
12 proteínas identificadas
NCBInr
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
Perfil similar a otros
ascomicetos cultivado con
sustratos celulósicos.
| Guais et al., 2008
| Oda et al., 2006
| Medina et al., 2005
Perfil similar a otros
ascomicetos cultivado con
sustratos celulósicos.
| Guais et al., 2008
| Oda et al., 2006
| Medina et al., 2005
58. Análisis masivo de péptidos
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
Base de datos
euKaryotic
Orthologous
Groups
Base de datos
euKaryotic
Orthologous
Groups
C) Producción
y conversión
de energía
C) Producción
y conversión
de energía
E) Metabolismo
y transporte de
aminoácidos
E) Metabolismo
y transporte de
aminoácidos
G) Metabolismo
y transporte de
carbohidratos
G) Metabolismo
y transporte de
carbohidratos
O) Modificaciones
postraduccionales
O) Modificaciones
postraduccionales
R) Función
general
R) Función
general
Glicosil Hidrolasas
nanoLC-MS/MS
· Avicel: >120 proteínas
· Slurry: >600 proteínas
JGI | UniProt
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
59. Análisis masivo de péptidos
Identificación
hongo
Producción
celulasas
Purificación y
caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma
nanoLC-MS/MS
· Avicel: >120 proteínas
· Slurry: >600 proteínas
JGI | UniProt
P. echinulatum
| Ribeiro et al., 2012
T. reesei
| Jun et al., 2011
P. echinulatum
| Ribeiro et al., 2012
T. reesei
| Jun et al., 2011
Xilano
Swolleninas
Penicillium
| Jun et al., 2011
Aspergillus
| Chen et al., 2010
Trichoderma
| Brotman et al., 2008
Swolleninas
Penicillium
| Jun et al., 2011
Aspergillus
| Chen et al., 2010
Trichoderma
| Brotman et al., 2008
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
Al menos, tres
BGL más.
Al menos, tres
BGL más.
El repertorio enzimático de T.
amestolkiae posee potencial a
la hora de formular cócteles
para una sacarificación eficiente
de la biomasa lignocelulósica.
El repertorio enzimático de T.
amestolkiae posee potencial a
la hora de formular cócteles
para una sacarificación eficiente
de la biomasa lignocelulósica.
60. 1. La especie fúngica estudiada en este trabajo se
identificó en base a su morfología y al análisis de
las secuencias de marcadores genéticos, tales
como las regiones ITS, RPB1 y Bt2. Se trata de unauna
cepa decepa de Talaromyces amestolkiaeTalaromyces amestolkiae, siendo la, siendo la
primera vez que se describe como productoraprimera vez que se describe como productora
de celulasasde celulasas.
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
61. 2. Se han purificado y caracterizado tres BGLpurificado y caracterizado tres BGL.
BGL-1 y BGL-2 son monómeros, mientras que
BGL-3 es una proteína dímero funcionalBGL-3 es una proteína dímero funcional. BGL-2
y BGL-3 presentaron por SDS-PAGE una masa
molecular similar (~100 kDa), sin embargo, la de
BGL-1 fue menor (~60 kDa). El pI de las enzimas
se situó entre 5,6-7,2, siendo BGL-2 la del pI más
ácido, seguida de BGL-1 y BGL-3. Todas ellas
son glicoproteínas, probablemente conglicoproteínas, probablemente con
enlaces O-glicosídicosenlaces O-glicosídicos. Los mayores valores de
actividad se encontraron a pH 4 y entre 50-60
ºC y son estables en un rango de pH 4-7 y a 50
ºC.
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
62. 3. Los estudios cinéticos revelaron que las tres BGL
de T. amestolkiae mostraron mayor afinidad
por el sustrato pNPG que por celobiosa.
Debido a su naturaleza dimérica, la enzima
BGL-3 fue la que presentó los mayores valoresBGL-3 fue la que presentó los mayores valores
de eficacia catalíticade eficacia catalítica sobre ambos sustratos,
seguido de BGL-2 y BGL-1. Ninguna de ellas fue
activa frente a la celulosa, sin embargo, todas
pudieron hidrolizar celooligosacáridos de
diferentes longitudes, sugiriendo que las treslas tres
enzimas son importantes en los pasos finales deenzimas son importantes en los pasos finales de
la hidrólisis del polisacárido hasta glucosala hidrólisis del polisacárido hasta glucosa.
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
63. 4. Las enzimas BGL-1, BGL-2 y BGL-3 deBGL-1, BGL-2 y BGL-3 de T.T.
amestolkiaeamestolkiae mostraron actividad demostraron actividad de
transglicosilacióntransglicosilación, siendo capaces de transferir
la molécula de glucosa desde el pNPG a los
alcoholes alifáticos MeOH, EtOH, PrOH y BuOH
para formar los alquilglicósidos
correspondientes. Además, estas enzimas
pueden unir celooligosacáridos pequeños para
formar otros de mayor tamaño, siendo lasiendo la
celodecaosa el de mayor grado decelodecaosa el de mayor grado de
polimerización detectadopolimerización detectado.
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
64. 5. Las secuencias de los genes bgl-1bgl-1,, bgl-2bgl-2 yy bgl-bgl-
33 dede T. amestolkiaeT. amestolkiae presentan una altapresentan una alta
homología (> 80 %) con las de las BGL dehomología (> 80 %) con las de las BGL de
especies deespecies de PenicilliumPenicillium yy TalaromycesTalaromyces muy
próximas filogenéticamente. La comparación
de estas secuencias permitió predecir el marco
de lectura de estas proteínas, cuyo análisis
reveló que BGL-1 pertenece a la familia GH1,BGL-1 pertenece a la familia GH1,
mientras que BGL-2 y BGL-3 son miembros demientras que BGL-2 y BGL-3 son miembros de
la familia GH3la familia GH3.
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
65. 6. Se construyeron modelos estructurales de BGL-modelos estructurales de BGL-
2 y BGL-3 de2 y BGL-3 de T. amestolkiaeT. amestolkiae, en base a su
identidad (~ 65%) con las BGL de H. jecorina y
A. aculeatus, respectivamente, de las cuales
existen estructuras cristalizadas. Las enzimas
presentan los dominios descritos en otras BGL
fúngicas, destacando la presencia de undestacando la presencia de un
dominio de unión a celulosa en BGL-2dominio de unión a celulosa en BGL-2.
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
66. 7. El crudo enzimático de T. amestolkiae, usado
solo o como suplemento de otros crudos
comerciales, resultó ser eficaz cuando seresultó ser eficaz cuando se
aplicó en la sacarificación deaplicó en la sacarificación de slurryslurry ácido deácido de
paja de trigopaja de trigo. En este estudio, junto con el
análisis del secretoma del hongo, se puso de
manifiesto que las BGL de T. amestolkiae, así
como otras proteínas presentes en el crudo,
podrían ser de interés para aplicacionespodrían ser de interés para aplicaciones
biotecnológicas basadas en la degradaciónbiotecnológicas basadas en la degradación
de la biomasa lignocelulósicade la biomasa lignocelulósica.
Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión