Spurenanalytik2010 knopp1

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Spurenanalytik2010 knopp1

  1. 1. Institut für Wasserchemie und Lehrstuhl für Analytische Chemie •www.ws.chemie.tu-muenchen.de
  2. 2. Mykotoxine – die Gifte der Schimmelpilze
  3. 3. Spurenanalytische Techniken: Bioanalytik I Dietmar Knopp Lehrstuhl für Analytische Chemie, Institut für Wasserchemie und Chemische Balneologie Technische Universität München Marchioninistr. 17 D-81377 München Dietmar.Knopp@ch.tum.de http://www.ws.chemie.tu-muenchen.de/groups/bioanalytic.html
  4. 4. Was ist "Bioanalytik"? Nicht eindeutig definiert! • Definition 1: Analytik in biologischen Matrices (Bsp. Pharmakokinetik)
  5. 5. Was ist "Bioanalytik"? Nicht eindeutig definiert! • Definition 1: Analytik in biologischen Matrices (Bsp. Pharmakokinetik) • Definition 2: Bioindikation und Biotests (Suborganismische und organismische Tests)
  6. 6. DEFINITION 2 a) Bioindikation Biologisches Verfahren zur qualitativen und quantitativen Ermittlung von anthropogenen und natürlichen Umwelteinflüssen mit geeigneten Indikatororganismen (integrierende Anzeige).
  7. 7. a) Bioindikation Flechten (Indikator für Luftverschmutzung) Bartflechten, Alpen immissiongeschädigt Mosaik aus Gesteinsflechten, Alpen
  8. 8. b) Biotests (suborganismische und organismische Tests) Zielorganismen aus verschiedenen Biotopbereichen: • Fische • Kleinkrebse (Daphnien) • Mikroorganismen (Ps. putida, Vibrio fischeri) Daphnien Goldorfe Vornehmlich für die Gewässer- und Einleiterkontrolle (Konzentrationsreihen suspekter Abwasser- und Wasserproben; Integration der Wirkung des „Chemikaliencocktails“); ja/nein-Antwort (akut toxische Wirkung)
  9. 9. Was ist "Bioanalytik"? Nicht eindeutig definiert! • Definition 1: Analytik in biologischen Matrices (Bsp. Pharmakokinetik) • Definition 2: Biotests (Suborganismische und organismische Tests) • Definition 3: Analytik von Biomolekülen (Analytische Methoden in den Biowissenschaften)
  10. 10. DEFINITION 3 Analytik von Biomolekülen (Analytische Methoden in den Biowissenschaften)
  11. 11. Was ist "Bioanalytik"? Nicht eindeutig definiert! • Definition 1: Analytik in biologischen Matrices (Bsp. Pharmakokinetik) • Definition 2: Biotests (Suborganismische und organismische Tests) • Definition 3: Analytik von Biomolekülen (Analytische Methoden in den Biowissenschaften) • Definition 4: Analytik mit Hilfe von Biomolekülen (Biochemische und molekularbiologische Analysenverfahren)
  12. 12. DEFINITION 4 Analytik mit Hilfe von Biomolekülen (Biochemische und molekularbiologische Analysenverfahren) Reaktionen auf molekularer Ebene (molekulare Erkennung und daraus resultierende hohe Spezifität) Proteine: - Enzym-Substrat-Wechselwirkung (Enzymologie) - Antigen-Antikörper Wechselwirkung (Immunologie) Nukleinsäuren: Gensonden-Techniken Übergeordnet: Biosensoren
  13. 13. Themen 1. Analytik von Biomolekülen 1.1. Kohlenhydrate 1.2. Nukleinsäuren 1.3. Aminosäuren, Peptide, Proteine 2. Analytik mit Biomolekülen 2.1. Immunologische Methoden (Immuntests) (- Immunsystem, Antikörper, Herstellung von anti-Hapten Antikörpern, - Immunoassays, Matrix-Interferenzen, Validierung, Schnelltests - Immunaffinitätschromatographie, Sorbentien, Immobilisierung, Elution) 2.2. Microarrays/Blots
  14. 14. Literatur
  15. 15. 1. Analytik von Biomolekülen 1.1. Kohlenhydrate
  16. 16. Kohlenhydrate • C, H, O • Aldehyde oder Ketone • Mono-, Di, Oligo- und Polysaccharide • Energiespeicherung, strukturelle Komponenten, Signal- und Informationsträger • Bestandteile der Erbsubstanz
  17. 17. Nachweismethoden (Hydrolyse der Kohlenhydrate) • Colorimetrie • Chromatographie (DC, HPLC, GC) • Isoelektrische Fokussierung (IEF) • NMR
  18. 18. 1. Analytik von Biomolekülen 1.2. Nukleinsäuren
  19. 19. Nukleobasen A C U G T
  20. 20. Nukleoside / Nukleotide / DNA, RNA
  21. 21. Gesamt DNA Vorbehandlung: DNA aus Probe isolieren (präzipitieren); anschließend Depurinierung (Spaltung der N-glykosidischen Bindung von Purinbasen und Desoxyribose); anschließend Umsetzung mit Reaktionsprodukt Colorimetrisch • Diaminobenzoesäure-Methode (420 nm) • Diphenylamin (595 nm)
  22. 22. Gesamt DNA Fluoreszenz
  23. 23. 1. Analytik von Biomolekülen 1.3. Aminosäuren / Peptide / Proteine
  24. 24. Proteinogene (kanonische) Aminosäuren
  25. 25. Radiomarkierung von Proteinen
  26. 26. Protein-Tests I
  27. 27. Protein-Tests II
  28. 28. Aminosäure-Analyse: Spaltung v. Proteinen • Saure Hydrolyse (6 N HCl, 24 h, 110 °C), häufigste Methode Verluste bei Serin, Threonin, Methionin, Cystein, Tryptophan, Asparagin, Glutamin • Alkalische Hydrolyse (4 M BaOH, NaOH oder LiOH), selten Bessere Tryptophanausbeute • Enzymatische Hydrolyse (mehrere Enzyme notwendig), selten Asparagin, Glutamin, sulfatierte oder phosphorylierte Aminosäuren
  29. 29. Aminosäure-Analyse: Derivatisierung
  30. 30. Aminosäure-Analyse: Ninhydrin-Reaktion
  31. 31. Ionenaustausch-Chromatographie + Nachsäulenderivatisierung (Ninhydrin)
  32. 32. RP-Chromatographie + Vorsäulenderivatisierung (OPA)
  33. 33. Andere Vorsäulenderivatisierungen (PITC und FMOC)
  34. 34. Chirale Aminosäureanalyse
  35. 35. Peptidanalytik I Standardmethode: HPLC (RP-18/C18-Phase), Acetonitril/Wasser/Trifluoressigsäure (0.1%), Gradientenelution, UV-Detektion (ca. 220 nm) bzw. Photodiodenarray (PDA)
  36. 36. Peptidanalytik II Weitere Methoden: • LC-MS • LC-MS/MS • Immunoassays

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