ImageJチュートリアル

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ImageJ によるバイオ画像解析
チュートリアル
2014/6/20
(ver.1.0)
0

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目次
1. イントロダクション
2. デジタル画像の基本
3. カラー画像の基礎と画像合成
4. 形の解析: 二値化，粒子解析，繊維解析
5. 動きの解析
補遺: ImageJ の主なメニュー項目の紹介
1

1. イントロダクション

ImageJ の基本画面
← メニューバー
← ツールバー
← ステータスバー
← 画像ウインドウ
http://rsb.info.nih.gov/ij/docs/tools.html
ツールバー
赤い三角形の付く
アイコンは右クリック
で機能切り替え可．
赤い線: 頻用するもの．
青い線: selection (ROI)．
← 画像タイトル
画像情報(サイズ等)
タバコBY-2 液胞膜

メニュー操作に関して:
File - Open… File から Open… を選択する．
ショートカット操作に関して:
t Windows : t キー．
Mac : コマンド + t キー．
Shift + c Windows : Shift を押しながら c キー．
Mac : コマンドと Shift を押しながら c キー．
※コマンド一覧は Plugins - Shortcuts - Control Panel… でツリー形式，
Plugins - Shortcuts - Create Shortcut の Command 欄でプルダウン形式で確認できる．
※メニューの一部は ij.jar 内の IJ_Props.txt を編集することでカスタマイズ可能．
JARはZIP形式として展開できる．
メニューを完全に変更したい場合は ImageJ.java をいじる．
※ ショートカットの一覧表示や追加は Plugins - Shortcuts メニューから可能．
一部のショートカットはソース中に埋め込まれている ( t とか < とか) ．
ImageJ の基本画面

2. デジタル画像の基本

←画像情報: 159x153 pixels; 8-bit; 24K
画素と画素数
(3200%) ：拡大・縮小率
画像ウインドウ左上に青い枠が表示されている場合，
ウインドウに画像全域が収まっていない．
現在表示されている部位が，画像全域のどこに相当する
かを示している．
159
153
画素, pixel (picture element)
+ キーで拡大
- キーで縮小

座標系と画素と輝度
←画像情報: 159x153 pixels; 8-bit; 24K
y
x
(x,y) = (0, 0)
輝度 35
(3, 0)
輝度30
(3, 2)
輝度 21
ImageJ では左上を原点(0, 0)とし，右に X 軸，下にY軸が伸びる．
各画素には輝度 (強度，intensity．明度 brightness とも言う)
が割り当てられている．
※ 「0 から数えること」「左上が原点であること」に注意．

座標系と画素と輝度
y
(x,y) = (0, 0)
輝度 35
(3, 0)
輝度30
(3, 2)
輝度 21
x
Excel で開いた例
表示を縮小
159列
159
153
153行
File - Save As - Text Image…

PowerPoint 等での強拡大に注意
PowerPoint や Photoshop 等で補間を
ともなう"強拡大"をするとデジタル的
な解像度や分解能と関係なく擬似的
にズームしたようになるが，解像度や
分解能が上がる訳ではない．
データ解釈を誤らないよう注意．
PowerPoint
で拡大
補間なし
補間あり

Brightness & Contrast による表示状態の変更 ( Shift + c キー)
スライドバーを動かすことによる調整は，表示上の"明るさ"を
変えているに過ぎない．→ 輝度は変化しない．
8-bit 画像の場合は Apply ボタンを押すことによって，その時の
表示範囲が0～255にスケールされる．→ 輝度が変化する．
真っ白
真っ黒

輝度ヒストグラム ( h キー )
h
位置情報を無視した上で，全画素について
輝度の分布を可視化したもの．
輝度の基本的な統計量(最小，最大，平均，
標準偏差等)も表示されている．

輝度のタイプ
(0, 0)
輝度 35
(3, 0)
輝度30
(3, 2)
輝度 21
8-bit: 0～255 の整数(integer)
32-bit: 浮動小数点数(float)
実数の近似値．±3.4*1038 の
範囲で7桁位の精度．
グレイスケール画像, 濃淡画像
輝度のデータ型．
ビット深度(bit depth), bits per pixel,
量子化ビット数等とも呼称．
カラー画像
≠白黒画像
8-bit Color: 使わない．
RGB Color: 赤緑青の3チャネルを
重ねることによるカラー表現．
各チャネルのデータ型は8-bit，
16-bit, 32-bit のいずれかで，
チャネル間では統一されている．

輝度のビット深度
32-bit: 浮動小数点数(float)
実数の近似値．±3.4*1038 の
範囲で7桁位の精度．
グレイスケール画像, 濃淡画像
≠白黒画像
原画像のビット深度はカメラによって異なり，8～16 bits/pixel が主．
12 bits/pixel (212 , 0～4095) や 14 bits/pixel (214 , 0～16383)の
カメラで得た画像は 16 bits/pixel の画像フォーマットとして扱う
(大は小を兼ねる)．
輝度には必ずノイズが混じるので，深度が大きい方が一概に
高性能というわけではない．
画像処理的には内部で 32-bit (float) を用いることも多い
(小数やマイナスの値が扱えるので) ．
輝度
位置(pixel)8 bits/pixel
28 ＝256 段階
0
255

画像情報の修正 (ビット深度, スケール情報)
ビット深度: Image - Type - …
スケール情報: Analyze - Set Scale…

3.カラー画像の基礎と画像合成

輝度 (5, 70, 134)
輝度 (179, 39, 4)
カラー画像 (RGB画像の場合) は
Red, Green, Blueの輝度のバラン
スにより色が表現される．
輝度 (111, 111, 13)
Red Green Blue
Image – Color – Split channels
カラー画像の基礎

画像合成
Image – Color – Merge channels…

画像合成の注意点
伝わるデザイン
http://tsutawarudesign.web.fc2.com/index.html
細胞工学色覚の多様性と色覚バリアフリーなプレゼンテーション
http://www.nig.ac.jp/color/barrierfree/barrierfree3-4.html

画像合成の注意点
画像合成は
MagentaとGreenの
使用が推奨されることが
多い．
MagentaとGreen
は
グレースケールで
示しても良い

4.形の解析: 二値化，粒子解析，繊維解析

手作業でのROI設定を介した形状解析：長さ
線分や曲線をマウスで引き t キーで ROI Manager に登録, を繰返す．
ROI Manager の「Show All」をチェックしておくと見やすい．
Measure ボタンで登録済の ROI 全部をまとめて測定．
角度や長さ(画素単位)が得られる． Excel等でμmに変換し，統計処理．
Excel 等にペースト or
テキストファイルに保存して
R スクリプトで統計処理等.
t
ROI: region of interest，関心領域，注目領域

手作業でのROI設定を介した形状解析：面積
or
測定項目は Analyze - Set Measurements... で決定．
「測定対象領域をマウスで指定し，
t キーで ROI Manager に登録」を繰返す．
Measure ボタンで測定．
t

二値化による領域抽出 ( Shift + t キー)
or
蛍光像の場合，「高い輝度の領域」が「測定対象領域」の
場合が多い．閾値となる輝度を決め，二値画像(白黒画像)
に変換することで，領域抽出(領域分割， segment)ができる．
ではどのように閾値を決めればいいのか?
グレイスケール画像
(濃淡画像)
二値画像
(白黒画像)

人間の目視による閾値決定
作業者の感覚が頼り．
同じ人が作業しても，
閾値が同じになるとは
限らない(部屋やモニタ
の明るさの影響など)．

Threshold ウインドウでは，
人間による閾値決定だけでなく
自動閾値決定もできる．
右図のように，
複数のアルゴリズムから選択する．
いずれも輝度ヒストグラムをもとに
「ある明るさ」を閾値として
背景と背景(解析対象)を分ける．
画像自体と解析対象に関する
輝度分布の性質によって，
適切なアルゴリズムは異なる．
自動閾値決定

二値化を介した粒子解析の例
二値画像
グレイスケール画像
Analyze -
Analyze Particles…

二値化を介した繊維構造の解析例
共焦点画像バンドパスフィルタ
による繊維等の強調
二値化像細線化像
短径 / 長径
短径
長径
気孔開閉の指標
気孔に対する
アクチン繊維の角度
アクチン繊維の配向の指標
気孔
q
気孔
q
気孔
この場合，
短径 / 長径＝0.47
この場合，
アクチン繊維の角度＝54.3°
灰色: 気孔領域
黒色: アクチン繊維
シロイヌナズナ気孔
アクチン繊維

バンドパスフィルタ
Process - FFT - Bandpass Filter...
注目している物を，おおよその大きさを指定することで
強調する処理．ノイズや細胞形状の影響を抑制する．
細胞表層微小管のプラス端
輝度プロファイル(左図の黄色い線)

5.動きの解析

スタック画像
時系列画像(動画像，動画，XYT)
や，焦点面を変えて撮影した連続
画像(立体画像，XYZ)はともに
スタック画像として操作できるが，
ZとTの区別が無いことに注意．
スタック画像を構成する2次元画像
をスライスとかフレームと呼ぶ．
ステータスバーの z=2 は
「Z座標の値が2」を示す
(0から数えている． 0-origin) ．
画像情報欄の 3/10 は
「全10枚中3枚目」を示す
(1から数えている．1-origin)．
表示中のスライスを変更
再生 (速度設定: Image - Stacks - Tools - Animation Options...)
タバコ培養細胞
微小管プラス端

動き解析のための粒子追跡
輝度投影
(疑似色)
1スライス目 10スライス目
平均速度:
(pixel/slice) T: スライス数
T－1

補遺: ImageJ の主なメニュー項目の紹介

File メニュー: ファイルの読み込み・書き込み等
New: 新規作成．
System Clipboard で他アプリから画像の
読み込みができる．
Open...: 画像ファイル等を開く．
Import: 各種フォーマットの
画像ファイル等を開く．
Close: 画像ウインドウを閉じる．
Save: 画像ウインドウの内容をファイルに
保存する．
※ Save しない限り，ファイルは書き
変わらない．
Quit: ImageJ を終了する．

Edit メニュー: 画像の切り貼り，描画
Undo: 直前の作業の取消し．
1ステップ限定かつ
一部のみ対応．
Cut, Copy, Paste:
画像の切り貼り．
対象は画像全域かROI ．
Copy to System:
他アプリへのコピー．
Clear, Fill, Draw: 単色描画．
実際の色は
Color Pickerで色は設定．
Selection: ROI の制御．
(Selection = ROI)
Add To Manager:
複数のROI を管理．

Image メニュー: 種別，色，スタック，変形，複製等，色々
Type: 輝度タイプの変換．
8-bit, 16-bit, 32-bit, RGB color...
Adjust: 表示上の明るさの調整や二値化等．
Color: グレイスケール画像とカラー画像の
変換等．
Stacks: 時系列画像(動画像)，立体画像の
処理．輝度投影，スライス一覧(montage)
の作成等．
Crop: ROI 部分の切り出し．
Duplicate: 画像ウインドウの複製．
Rename: 画像ウインドウのタイトル変更．
Scale: 画像解像度の変更．つまり画像サイズ
の拡大・縮小．
※表示の拡大・縮小と混同しないよう注意．

Process メニュー: 基礎的な画像処理(フィルタ等)
Find Edges: 輪郭強調．
Binary: 2値画像(白黒画像)処理．
Math: 加減乗除等による
各画素の輝度変更．
Filters: ノイズ抑制等のフィルタ．
Image Calculator:
画像と画像の間
の演算．
加減乗除等．

Analyze メニュー: 測定やグラフ関係
Measure: ROI 部分の諸パラメタの測定．
Analyze Particles...: 粒子解析．
Set Measurements...: 'Measure' で測定する
パラメタの選択．
Set Scale...: 1画素が何 mm かを設定する．
Histogram: 輝度ヒストグラムの表示．
Plot Profile: 輝度プロファイルの表示．
他のメニュー
Plugins: プラグイン，マクロ，ショートカット
キー設定等．
Window: 画像ウインドウ，ログウインドウ等
の一覧や並び換え．
Help:ブラウザにウェブ上のマニュアルを
表示する等．

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