1. Área de Biotecnología de la
Reproducción Animal
Facultad de Veterinaria
2011
Área Biotecnología de la Reproducción – Departamento de Reproducción Animal

4.  1989: primeros terneros nacidos por FIV en
Latinoamérica… (amplia difusión)

6. Pronúcleos masculino y femenino

7. Día Etapas
Semana Preparación del laboratorio Desinfección de superficies;
previa al esterilización de materiales; preparación
trabajo de soluciones stock
0 Colecta de ovarios Transporte en solución salina a 37ºC
Aspiración de los COC (Complejos Medio de aspiración: Solución m-PBS
ovocito cúmulus) (Buffer Fosfato Salino modificado: D-PBS
(+) + SFb + Atb)
Recuperación y clasificación de los Bajo lupa estereoscópica
COC
Maduración In Vitro Medio de maduración: TCM-199 + SFb +
LFb + Atb
1 Capacitación del semen y dilución Medio BO de capacitación y lavado de
semen; medio BO de dilución de semen
(ajuste a concentración deseada)
Fecundación In Vitro Gotas en placas de Petri pequeñas
Desarrollo In Vitro Medio de desarrollo: CR1aa
3 Clivaje Evaluación de división celular a las 48 hs
4 - 10 Evaluación de desarrollo y cambio Cada 48 horas
de medio

8.  De animales muertos: material de matadero o
hembras recién muertas
 Aspiración del líquido folicular (folículos de 2 a 8 mm
de diámetro)
 Desmenuzamiento del ovario (slicing)
 De hembras vivas
 OPU, aspiración con aguja guiada por ultrasonografía
 Aspiración con aguja y endoscopía
 Laparotomía (usada sólo en casos especiales)

9. Folículo
primordial
Folículo Folículo Folículo
Folículo
Secundario Terciario de Graaf
primario
Túnica
albugínea
Epitelio
Corpus
germinal
albicans
Folículo
atrésico
Hilio
Cuerpo Células
lúteo intersticiales

10. P PM S T T PO
P PM S T
PO

11.  m-PBS: Buffer Fosfato Salino modificado
 Consiste en:
 D-PBS (+) – solución stock
 Penicilina – Estreptomicina
 SFb (suero fetal bovino)
COMPOSICIÓN DEL MEDIO PBS:
NaCl 8,00 g/l
KCl 0,20 g/l
KH2PO4 0,20 g/l
Na2HPO4 1,15 g/l
MgCl26H2O 0,10 g/l
CaCl2 0,10 g/l

17. Calidad Características a evaluar
A Bueno Completamente rodeado por más de 3 capas de
células del cúmulus y citoplasma homogéneo
B Regular Rodeado parcialmente por células del cúmulus
C Malo Desnudo y citoplasma irregular
D Degenerado Rodeado por fibrina (con aspecto de tela de araña)
(Liebfried L and First N L, 1979; Sato E y col, 1990)

19.  Medio de maduración: M-TCM-199
(TCM-199 de maduración)
 Consiste en:
 TCM-199 (solución stock)
 Penicilina – Estretomicina
 SFb (suero fetal bovino)
 LFb (licor folicular bovino)
LFb: se obtiene de folículos preovulatorios, de más de 8 mm de diámetro, y se
transfiere a tubos de centrifuga. Se centrifuga a 800 G (2.500 rpm) durante 30
minutos. Se decanta. El liquido sobrenadante se inactiva en baño Maria a 56 ºC
durante 30 minutos; se fracciona en tubos pequeños o crioviales y se almacena
congelado.

20. m-PBS m-PBS M-TCM-199 M-TCM-199
GOTAS DE
MADURACIÓN
M-TCM-199
CUBIERTAS CON
ACEITE
MINERAL
22 hs
cultivo
Caja de Petri numerada con gotas de maduración,
cubiertas con aceite mineral (3 gotas de 100 µ)

22.  Preparación citoplasmática
 Preparación nuclear
 Retoma la meiosis. Desde Profase I (estado de
latencia, Dictioteno), se detiene nuevamente en la
Metafase II.
 Formación del primer cuerpo polar
 Expansión de las células del cúmulus

23. Ovocito Primario  Profase de la Meiosis I
(pausa = dictioteno)
Maduración citoplasmática y nuclear
Ovocito Secundario  Metafase de la Meiosis II
Fertilización
Completa la Meiosis

24. Ovocitos inmaduros
•OVOCITOS MADUROS
•Expansión de células del
cúmulus
• 1º cuerpo polar
• Metafase II

26.  La capacitación permite:
 Adquirir hipermotilidad para avanzar por el mucus
oviductal
 Penetrar el cúmulus
 Prepararse para la reacción acrosómica
 Bioquímica de la capacitación:
 Aumento del pH
 Aumento de la permeabilidad al calcio
 Fusión de membranas
 Interacciones con glucosaminoglicanos
 Cambio en la relación colesterol/fosfolíidos

27.  Ornitina-decarboxilasa
 Fosfolipasa A
 Fosfolipasa C
 L-Fucosidasa
 -Galactosidasa
 -Glucoronidasa
 Hialuronidasa
 Peptil-peptidasa
 -N-acetilhexosaminidasa
 Acrosina
 Arilaminidasa
 Colagenasa
 Proacrosina
 Neuroaminidasa
 Estearasas
 Fosfatasas

30. COMPOSICIÓN DE SOLUCIÓN BÁSICA BO (Bracket and Oliphant):
Solución A
NaCl 2,1546 g Solución B
KCl 0,0987 g NaHCO3 1,2937 g
Na2PO42H2O 0,0420 g Rojo Fenol 20 µl
MgCl26H2O 0,03485 g Agua ultrapura hasta 100 ml
CaCl22H2O 0,1085 g
Rojo Fenol (0,5%) 50 µl La solución B se burbujea con CO2
Agua ultrapura hasta 500 ml
COMPOSICIÓN DEL MEDIO BO:
Solución A 76 ml
Piruvato de Sodio 0,01375 g
Penicilina 10.000 UI
Estreptomicina 10 mg
Solución B 24 ml

31.  Lavado de semen
 BO + Cafeína + Heparina
 Lavado de ovocitos
 BO + BSA (albúmina de suero bovino) (10 mg/ml)
 Dilución de semen
 BO + BSA (20 mg/ml)

32.  Platina caliente (35 ºC) y Baño María (35 ºC)
 Descongelación de la pajuela de semen:
 10 seg. a temp. ambiente
 30 seg. a baño María (35 ºC)
 Colocar el semen en tubo de centrífuga (gota en portaobjetos -sobre la platina-
para evaluación)
 Se agregan 6 ml de sol BO de lavado de semen
 Centrifugar a 500 G (2000 rpm, dependiendo del diámetro de la centrífuga), 5
min.
 Aspirar sobrenadante
 Nuevamente se agregan 6 ml de sol BO de lavado de semen
 Centrifugar a 500, 5 min.
 Aspirar sobrenadante
 Diluir el pellet en sol. BO de dilución de semen
Vol i x [ i ] = Vol f
[f]

33. PREPARACIÓN DEL SEMEN
Remover la capa superior Agregar 6 ml de BO de
lavado de semen y re-
centrifugar a 500 G, 5 min.
6 ml sol BO
de lavado
de semen
Luego de 2 lavados
Semen retirar sobrenadante
(0,5 ml) y dejar pellet
Capa espermática
Cámara de Neubauer (calcular concentración)

34. DILUCIÓN DE SEMEN Y
PREPARACIÓN DE GOTAS DE INSEMINACIÓN
Gotas de inseminación
100 µl de espermios en BO
cubiertas con aceite mineral
Agregar BO
de dilución
de semen
(Vol.
calculado)
FECUNDACIÓN
Vol i x [ i ] = Vol f
[f] Incubación 5 h

35. 1
C 2
1
2
3 3
4
Incubación 5 h
5% CO2
38 ºC

36. BO 40 ml + BSA 400 mg
Lavado
Al medio de inseminación
(BO) en las gotas de semen
Lavado cubierto por aceite mineral
BO + BSA
BO + BSA
5 hs
cultivo

37. FECUNDACIÓN

38. TCM 199 + 5 % SFb + ANTIBIÓTICOS
cultivo
Lavado
Lavado
Al medio de cultivo
BO (TCM-199) cubierto
por aceite mineral
TCM-199
TCM-199

40. 1 célula 2 células 4 células
16 células
día 0-1 día 2 día 2-3 1 célula día 4-5
día 0-1
8 células 16 células Mórula temprana Mórula
2 células compacta
día 2-4 día 4-5 día 5-6
día 2 día 6-7
Mórula compacta Blastocisto temprano Blastocisto Blastocisto
4 células temprano
día 6-7 día 7 día 7-8
día 2-3 día 7
8 células Blastocisto
Blastocisto Blastocisto Blastocisto
día 2-4 día 7-8
expandido eclosionando eclosionado
día 8-9 día 9 día 10

44. ¿POR QUÉ?
¿PARA QUÉ?
¿CON QUÉ?

45. Fertrilización In
Vitro en Bovinos
Área de Biotecnología de la
Reproducción Animal
Facultad de Veterinaria
2011
 Yael Filipiak
 Clara Larocca