la technologie puce à ADN

1. Les puces à ADN
RÉALISÉ PAR:
SOUILAH YACINE

2. plan
I. Histoire de puces à ADN.
II. Définition et principe
III. Préparation de la cible
IV. Préparation du support
V. Révélation des résultats
VI. Analyse des résultats
VII. Application des puces à ADN

3.  Southern blot, en 1975 a été décrit comme, la première technique de détection des ADN par
hybridation sur un support solide, qui aboutiront à la conception des puces à ADN ou
macroarrays. (ancêtre de puce à ADN.
 Northern blot: (1977 ) les ARNm sont d’abord immobilisés sur une membrane de nitrocellulose, et
un oligonucléotide marqué (radioactivité ou fluorescence), spécifique du gène cible, est ensuite
hybridé sur la membrane. Dans le cas des puces à ADN, il s’agit d’un Northern blot inversé.
 en 1990, des arrays d'ADNc ont été développés et appliqués à l'analyse d'expression en utilisant un
marquage radioactif et des membranes à densité élevée, principalement pour le criblage efficace des
banques
 En 1994, la société D'Affymetrix était formée, en démontrant la capacité d'utiliser cette technologie
pour générer des réseaux d'ADN constitués de 256 de 8 nt différents.
 en 1995, la première description d’une “puce à ADN”, Des mesures d'expression différentielle de
45 gènes d'Arabidopsis thaliana ont été réalisées au moyen d'une hybridation simultanée en deux
couleurs par fluorescence. (Schena et al. (1995) Science 270, 467 - 470).

4.  Puce à ADN

5. Définition
 Les fragments nucléiques déposés sur le support solide sont appelés « sondes »
 les acides nucléiques marqués présents dans l’échantillon sont les « cibles ».
 La technologie des puces à ADN, biopuces, DNA microarray ou “DNA-chips” repose
sur une technologie multidisciplinaire intégrant la biologie, la biotechnologie, la
chimie des acides nucléiques, l’analyse d’images et la bioinformatique.
 Une puce à ADN est constituée de fragments d’ADN immobilisés sur un support
solide selon une disposition ordonnée.
 Le but de puce à ADN était de mesurer chez l’homme l’expression simultanée d’un
grand nombre de gènes, voire de l’ensemble des gènes contenus dans le génome.
 Cette biotechnologie récente permet d'analyser le niveau d'expression des gènes
(transcrits) dans une cellule, un tissu, un organe, un organisme ou encore un mélange
complexe, à un moment donné et dans un état donné par rapport à un échantillon
de référence

6. Principe de la puce à ADN
 Il s’agit d’analyser des profils d’expression génique et à les corréler à des
processus biologiques afin de définir des signatures d’expression.
 La confection des puces à ADN a permis d’étendre ce principe à la
détection simultanée de milliers de séquences en parallèle.
 Une puce comporte quelques centaines à plusieurs dizaines de milliers
d’unités d’hybridation appelées « spots » (de l’anglais « spot » = tache),
 chacune étant constituée d’un dépôt (sondes) de fragments d’ADN ou
d’oligonucléotides correspondant à des sondes de séquences données.
 L’hybridation de la puce avec un échantillon biologique, marqué par un
radioélément ou par une molécule fluorescente,
 permet de détecter et de quantifier l’ensemble des cibles qu’il
contient en une seule expérience

7. Types de Puce à ADN
 La miniaturisation, rendue possible par l’utilisation d’un support solide, de
marqueurs fluorescents et par les progrès de la robotique, permet aujourd’hui de fabriquer des
puces comportant une très haute densité de spots, susceptibles de recouvrir l’intégralité du
génome d’un organisme sur une simple lame de microscope.
 On distingue plusieurs types de puces selon:
 la densité des spots,
 Le mode de fabrication,
 la nature des fragments fixés à la surface,
 les méthodes d’hybridation
 l’objectif du projet
 les macroarrays et microarrays avec un dépôt direct de molécules d’ADN sur
leur support.
 les puces à oligonucléotides avec la synthèse in situ des sondes oligonucléotidiques sur une
surface solide.
 les puces à ADN pour étudier l’expression des gènes.
 les puces à ADN pour étudier la structure des gènes.

8. Les macroarrays ou filtres à haute densité
 Les dépôts (sondes) sont des clones d’ADNc ou des produits de PCR fixés à haute
densité sur une membrane de nylon (8 x 12 cm).
 Le marquage est le plus souvent radioactif
 et le criblage est réalisé en excès de cible,
 on obtient ainsi une mesure de l’abondance relative de chacun des ARNm présent dans
l’échantillon de départ.
 On parle de macroarrays jusqu’à une densité d’environ 25 fragments d’ADN déposés
par cm2.

9. Les microarrays
 Ils permettent la miniaturisation des dépôts d’ADN, ce qui permet de fixer
plusieurs milliers de sondes sur des surfaces égales ou inférieures à celle d’une
lame de microscope standard.
 Elles sont déposées à une densité de 1 000 sondes/cm2 par un robot sur des lames de
verre préalablement traitées chimiquement, soit jusqu’à 12 000 sondes/lame.
 Les sondes sont généralement des ADN double brin de longueur de 200 à 2 000bp
amplifiés par la technique de PCR mais récemment, des oligonucléotides longs (50-70
mers) ont également été greffés sur la puce après leur synthèse.
 Les cibles utilisées sont réalisées par transcription inverse, à partir d’ARN total ou
messager
 utilisant deux fluorochromes différents (Cy3 et Cy5),
 ce qui permet d’hybrider simultanément deux cibles sur une même sonde.
 Les signaux d’hybridation sont analysés grâce à un lecteur capable de discriminer les
deux fluorochromes et de générer deux images dont le niveau de gris représente
l’intensité de la fluorescence lue.

10. Les puces à oligonucléotides
 Elles dérivent à l’origine d’un projet de séquençage par hybridation.
 Les puces les plus couramment utilisées sont les puces de la société Affymetrix.
 Dans ce cas, les sondes sont des oligonucléotides synthétisés in situ par une technique de
photolithographie.
 Dans ce procédé, une lumière dirigée sur des sites spécifiques de la puce active la réaction d’oligo-
synthèse.
 On peut synthétiser jusqu’à 300 000 oligonucléotides représentant 30 000 gènes sur une puce d’une
surface d’environ 1cm2.
 Une puce à ADN destinée à des études d’expression contient pour chaque gène un ensemble
d’oligonucléotides mimant la séquence du gène, souvent choisis dans sa région 3’, réduisant ainsi les
risques d’hybridations croisées avec des séquences homologues de ce gène.
 Des oligonucléotides, dont la séquence varie pour une seule base, sont également ajoutés, ce qui permet
de confirmer que le signal obtenu pour chacun des gènes est bien spécifique.
 On hybride une seule sonde par puce et l’intensité de fluorescence mesurée par un scanner permet une
mesure de l’abondance relative de chacun des ARNm présent dans l’échantillon
biologique étudié.

11. Les puces à ADN pour étudier l’expression des gènes
 Ces puces à ADN, dites «puces transcriptome»,
 permettent d’analyser et de quantifier l’expression des gènes sous forme
d’ARNm qui, après traduction, vont permettre la production des
protéines indispensables au fonctionnement de la cellule normale ou
tumorale.
 Les puces à ADN pour l’étude du transcriptome sont recouvertes de
sondes, constituées de fragments d’ADN de séquence connue, qui vont
s’hybrider de façon spécifique avec les ARN messagers
 de la tumeur ou du tissu normal, pris comme témoin.

12. Les puces à ADN pour étudier la structure des gènes
 Ces puces à ADN, dites puces CGH, pour Comparative Genomic Hybridization,
 permettent d’identifier les altérations de structure
 (en terme de délétion ou amplification) du génome des cellules tumorales par rapport au
génome des cellules normales.
 Les puces CGH sont recouvertes de fragments d’ADN de séquence connue qui vont
s’hybrider de façon spécifique avec les ADN de cellules normales ou les ADN de
cellules tumorales.
 Ces deux ADN sont marqués par des fluorescences différentes.
 Par comparaison entre ces fluorescences on met en évidence des amplifications ou
des délétions de gènes.

13. La fabrication des puces à ADN
 Il existe plusieurs procédés de fabrication.
 Un procédé de fabrication se distingue de par le substrat utilisé et la
nature des étapes mises en œuvre.
 Cependant le principe de base de la conception des biopuces reste le
même.
 En général, toutes les méthodes de fabrication sont composées de trois
phases qui s’effectuent successivement :
1. la fabrication de la puce,
2. la fabrication de la sonde
3. l’hybridation.

14. 1. La fabrication de la puce
 Les brins synthétiques utilisés, ceux dont on connaît la séquence,
s'appellent des sondes.
 Les puces à ADN présentent, par rapport aux méthodes classiques
d'hybridation un avantage majeur : grâce aux techniques de
miniaturisation
 elles permettent l'hybridation simultanée d'un nombre de sondes
considérables sur une surface totale utile inférieure à 1 cm2.

15. 1. La fabrication de la puce
 Les supports sur lesquels sont fixées les sondes se présentent sous la
forme de surfaces planes ou poreuses (percées de puits) composés de
matériaux tels que :
 le verre, matériau peu onéreux, inerte et mécaniquement stable. la petite
plaque de verre, substrat de la puce, est recouverte d'une grille de
Téflon (qui détermine des zones hydrophiles et hydrophobes).
 les polymères comme le polypyrrole.
 le silicium, couramment utilisé pour la fabrication des puces électroniques
à cause de ses propriétés semi-conductrices.
 les métaux, notamment l'or et le platine.
 Quel que soit le support choisi, il est traité pour former un réseau dense
et régulier de microsurfaces et sur chacune de celles-ci est greffée une
sonde d'ADN synthétique.

16. 2. La fixation des sondes
 Il existe deux méthodes : le transfert de brins d'ADN (« off chip synthetis
») ou sa synthèse in situ (« Light directed in situ synthesis »).

17. a) Transfert de brins d’ADN
 La synthèse préalable à la fixation des sondes permet de fixer des sondes
relativement longues, atteignant 40 à 60 bases.
 Le transfert de ces sondes sur la puce peut se faire au moyen de
micropipettes, de micropointes ou par des dispositifs de type jet d'encre.
 Un autre système, c’est l'adressage électrochimique : la puce
est composée d'un support en silicium recouvert, à chaque plot d'une
mini-électrode en or.
Chaque sonde rejoint un plot particulier lorsque les mini-électrodes sont
mises sous tension sélective.
 Les méthodes d'adressage des sondes sont fondamentales : leur
performance, leur capacité à être automatisées et leur coût de
fonctionnement pèseront lourd dans le développement de la technologie
des puces à ADN.

18. b. La synthèse in situ
 Dans ce cas, la construction des sondes se fait par dépôt de couches
successives des quatre bases de l'ADN sur un support en verre.
 C'est un masque, dont la configuration varie à chaque dépôt d'une
couche, qui permet aux bases de s'empiler correctement.
 Avec ce procédé, les sondes comportent au maximum 30 bases.
 Là encore, des sociétés ont mis au point un système qui permet
de déposer sur la grille de téflon de la biopuce, les quatre bases désirées,
grâce à des injecteurs piézo-électriques, selon une technologie qui
s'apparente à une synthèse d'ADN classique.

19. 3. L'hybridation
 Le rôle de chaque sonde est de reconnaître, dans un mélange appliqué à
la surface de la biopuce, une séquence d'ADN.
 Généralement cette séquence est amplifiée par PCR puis marquée par
fluorescence, préparée en solution et mise en contact avec
la biopuce.
 La phase d'hybridation est réalisée dans une sorte d'incubateur (station
fluidique)
 et suivie d'un lavage destiné à débarrasser la puce des cibles nucléiques
non hybridées.

20. L’exploitation des données fabriquées
1. La lecture
 Chaque spot est excité par un laser et on récupère la fluorescence émise
via un photomultiplicateur (PMT) couplé à un microscope confocal.
 On obtient alors deux images dont le niveau de gris représente l'intensité
de la fluorescence lue.
 Si on remplace les niveaux de gris par des niveau de vert pour la
première image et des niveaux de rouge pour la seconde, on obtient en
les superposant une image en fausses couleurs composée de spots allant
du vert (seulement de l'ADN de la première condition fixé) au rouge
(seulement de l'ADN de la seconde condition fixé) en passant par le
jaune (de l'ADN des deux conditions fixé en quantités égales).

21. 2. L’analyse des données
 On a maintenant deux images de la puce à partir desquelles il faut réussir à calculer le nombre de
molécules d'ADN au départ.
 Pour cela, on mesure la quantité de signal dans la longueur d'onde d'émission du fluorochrome vert et
la quantité de signal dans la longueur d'onde d'émission du fluorochrome rouge.
 Puis on normalise ces quantités en fonction de divers paramètres (quantité de levure de départ dans
chaque condition, puissance d'émission de chaque fluorochrome, ...).
 On suppose alors que la quantité d'ADN fluorescent fixée est proportionnelle à la quantité d'ARNm
correspondant dans la cellule de départ et on calcule le ratio
fluorescence rouge / fluorescence verte.
 Si ce ratio est supérieur à 1 (rouge sur l'image en fausses couleurs), le gène est surexprimé dans la
seconde culture,
 si ce ratio est inférieur à 1 (vert sur l'image en fausses couleurs), le gène est sousexprimé dans la seconde
culture.
 On peut visualiser ces différences d'expression grâce à un logiciel développé dans le laboratoire appelé
Arrayplot.
 Il permet d'obtenir à partir de la liste des intensités de chaque point le nuage de points intensité dans le
rouge = f (intensité dans le vert) ou une représentation en camembert où le diamètre du camembert est
proportionnel à l'intensité des spots.

22. Domaine d’application de Puce à ADN
 La puce à ADN a été utilisées avec succès dans plusieurs processus
biologiques variés:
 en cancérologie,
 recherche pharmaceutique,
 génomique,
 diagnostic,
 contrôle agroalimentaire et industriel,
 bioterrorisme,
 microbiologie
 etc.

23. 1. La cancérologie
 L’approche de puce à ADN a permis :
 d’améliorer la classification des tumeurs
 d’étudier les voies d’oncogenèse
 d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques
 de prédire la survie des patients.
 Le nouveau défi qui est lancé aux biologistes est maintenant le transfert
de ces résultats de recherche en oncologie biomédicale
afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer.

24. 2. La génomique
 Dans un premier temps la génomique structurale vise à déterminer la
séquence du génome humain puis,
 dans un deuxième temps, la génomique fonctionnelle donne
une connaissance plus approfondie de la fonction des séquences d’ADN.
 Les chercheurs, ne disposant pas d’outils suffisamment puissants,
espèrent beaucoup en la puce à ADN, car elle constitue
 un suivi des ARNm (analyse fonctionnelle),
 re-séquençage (analyse du polymorphisme),
 permettant d’étudier à grande échelle des séquences déjà connues.
 Les espoirs de cette technique sont très importants, la masse des
données est très grande, aidée aussi de l’exploitation informatique.

25. 3. Le criblage médicamenteux
 Il est courant pour un laboratoire de recherche d’analyser 10 000
molécules par jour.
 L’application des puces à ADN pour ces analyses est un outil précieux
pour la vitesse d’exécution des analyses,
 ce qui permet de découvrir de nouveaux médicaments plus rapidement
et d’en réduire le coût.

26. 4. La pharmaco-génomique
 Ce secteur étudie essentiellement l’expression des gènes et sa relation à
l’efficacité d’un nouveau traitement.
 Le médecin traitant dispose d’une large gamme de médicaments pour traiter
une pathologie, traitement qui s’avère parfois différent pour chaque patient.
 Il est donc important qu’il connaisse le traitement le plus efficace pour ses
patients.
 La pharmaco-génomique devrait pouvoir donner cette information à l’avance
à partir d’un test génomique du patient.
 Les laboratoires du secteur pharmaceutique pourraient mettre au point de
nouveaux médicaments génétiquement optimisés.
 Connaissant les cartes personnalisées du patient, ils peuvent analyser d’une
part l’expression différentielle entre des cellules saines et malades afin de
déceler des gènes cibles, et d’autre part analyser les effets des
molécules à visée thérapeutique sur ces gènes.
 Ce travail ne peut se faire que par l’intermédiaire de la puce à ADN.

27. 5. Le diagnostic clinique
 La puce à ADN a encore un grand rôle à jouer dans une autre application
des polymorphismes et de la détection banalisée de ceux-ci.
 Cela pourrait prévenir les prédispositions qu’a un patient à diverses
maladies génétiques.
 La commercialisation de ces systèmes de petite taille, voire même
portables pourrait être utilisée en hôpital et même par les médecins
traitants.
 On attend que des labo-puces puissent faire en un temps réel et continu
l’analyse de certains signes vitaux afin d’en prescrire immédiatement le
traitement adéquat
 (par exemple le taux de glucose sanguin pour les diabétiques)

28. 6. L’identification et l’expertise médico-légale
 Le but est l’identification humaine dans le cadre d’enquêtes policières ou
judiciaires.
 Les analyses sur le terrain étant très souvent complexes ainsi que la
confidentialité et le respect de la procédure judiciaire assez lourdes, il sera
souhaitable d’avoir sur les lieux d’enquête des systèmes portables
d’analyse de l’ADN.
 L’analyse immédiate sur le terrain permettrait d’affiner la recherche
d’échantillons.
 La puce à ADN a là encore un avenir très prometteur.

29. 7. L’environnement
 Les secteurs de la défense et de l’environnement espèrent aussi aux
diverses applications des puces à ADN,
 notamment pour la détection rapide et à bas coût de substances
organiques, principalement des agents pathogènes dilués dans
l’environnement.

30. 8. Les applications dans le domaine de la guerre
bactériologique ou chimique
 En déterminant par avance les modifications du fonctionnement
génétique des cellules immunitaires occasionnées par des agents
toxiques,
 on peut identifier rapidement les produits chimiques (mercure, dioxine...)
ou bactériologiques (bacille du charbon ou de la diphtérie...) disséminés
par un éventuel agresseur.


31. 9. L’identification d’espèces animales dans
l’alimentation humaine et animale.
 Aujourd’hui, la qualité et la sécurité alimentaire sont garanties grâce à
l’identification des espèces animales dans l’alimentation humaine ou
animale.
 Les industriels de l’industrie agroalimentaire peuvent apporter la preuve
aux consommateurs ou aux instances réglementaires de ce qu’ils ont
dans leur assiette !
 Les techniques actuelles permettent de répondre à cette question :
« Cette espèce est-elle dans mon produit ? »

32. Les puces à ADN comme outils de détection
 Ils sont utilisées pour détecter un produit de PCR et remplacent ainsi la migration sur gel en validant la
spécificité de l’amplification par sa complémentarité avec la sonde.
 Des puces permettant d’identifier les bactéries
présentes dans un échantillon sur la base de l’analyse des
séquences d’ARN ribosomique 16S sont en développement
dans plusieurs institutions.
 L’ADN total est extrait à partir d’un échantillon et l’ensemble
des ADN codant pour les ARN 16S sont amplifiés,
en utilisant des amorces universelles, et hybridés sur des puces portant des sondes spécifiques de l’ARN 16S
des espèces recherchées.
 Cet outil est développé pour la surveillance du bioterrorisme avec un ensemble de sondes spécifiques des
agents pathogènes potentiellement utilisés.
1. Après extraction de l’ADN, les régions codant pour l’ARN ribosomique16S sont amplifiées pour toutes les
bactéries de l’échantillon en utilisant des amorces universelles correspondant à des régions conservées
dans toutes les espèces.
2. La puce porte des oligonucléotides de séquence spécifique de chaque espèce.
3. Après hybridation, la quantification du signal permet de détecter la présence de bactéries des différentes
espèces représentées sur la puce et d’évaluer leurs quantités relatives.

33. Les puces a ADN pour le re-sequencage
 La connaissance de la séquence complète d’un génome est le niveau ultime de typage,
 mais, dans le contexte actuel, le séquençage de chaque isolat n’est pas envisageable.
 Des puces oligonucléotides sont donc développées pour obtenir des informations partielles sur les génomes.
 Il serait possible d’avoir une vision
Globale du génome et de pointer
sur des mutations particulières,
comme celles entraînant
la résistance à un antibiotique
Puce Affymetrix de re-séquençage
portent plusieurs centaines de milliers d’oligonucléotides synthétisés in situ par une technique de photolithographie.
Pour chaque base, quatre oligonucléotides sont synthétisés d’après une séquence de référence avec à la position centrale l’une des quatre
bases, A, C, G ou T.
La comparaison des signaux de fluorescence pour ces quatre oligonucléotides permet de déterminer la séquence à cette position
 Séquençage haut débit peut se faire aussi bien sur l’ADN génomique qu’après rétro-transcription de l’ARN (RNA-Seq) et mesure aussi
la quantité d’acide nucléique de départ

34. Les puces a ADN pour la caracterisation genomique
 Les puces à ADN sont aussi utilisées pour caractériser la partie variable du génome d’un clone.
 Ces puces « biodiversité » portent des sondes correspondant à des gènes qui ne sont pas présents dans
tous les isolats d’une espèce
 Elles sont établies à partir de la comparaison des séquences de plusieurs génomes.
 Par une seule expérience d’hybridation, ces puces permettent d’établir une véritable empreinte digitale
correspondant aux gènes présents ou absents dans un clone.
 les puces à ADN apportent une information fonctionnelle sur la nature des gènes qui différencient deux
isolats
 Ces résultats peuvent être comparés aux données phénotypiques sur les souches, notamment en relation
avec leur virulence.
 Détection de régions chromosomiques spécifiques d’un isolat.
1. L’ADN de la souche à analyser et un ADN de référence
sont marqués par des fluorophores ayant des propriétés
spectrales différentes.
1. La puce à ADN est hybridée avec un mélange
des deux ADN marqués.
1. Après analyse aux deux longueurs d’onde d’émission de fluorescence,
 les sondes absentes de la souche analysée n’émettront que
 pour la longueur d’onde du fluorophore de l’ADN de référence.

35. RECHERCHE DE POLYMORPHISMES
 La recherche de polymorphisme (SNP) peut également se faire par la
technologie des puces à ADN, en utilisant pour les dépôts des
oligonucléotides porteurs ou non du polymorphisme recherché.
 Pour cela, les puces électroniques à ADN sont un outil de choix (15).
 Cette puce, développée par la société Nanogen, est constituée d’une
cartouche contenant 99 sites de dépôt associés chacun à une
microélectrode susceptible de créer un champ électrique.
 L’activation de ce champ électrique sur un site depôt permet de fixer
spécifiquement les oligonucléotides normaux et mutés, puis, lors de
l’expérience, de sélectionner les ADN que l’on souhaite hybrider avec un
dépôt donné.
 Toutes les combinaisons possibles entre sondes et cibles peuvent ainsi
être obtenues.
 Le coût moyen d’un SNP par cette technologie est de l’ordre de 2 euros.

36.  Les biopuces sont donc un outil très intéressant dans de nombreux
domaines, leur intérêt résidant principalement dans le nombre de
données qu’elles peuvent traiter en simultané, fournissant ainsi beaucoup
de résultats pour un temps d’analyse considérablement réduit, et un coût
également moindre

37. Revers de Puce à ADN
 On se rend bien compte des avantages de cette technique. Mais cette
technique peut également être utilisée au détriment des hommes.
 Les assurances discutent déjà, comment on peut exclure des clients de
leurs assurances qui ont des maladies génétiquement irréparables.
 L'homme devient donc entièrement visible à toutes ces organisations - et
ceci à presque tous les égards.
 En plus, à part ces doutes il y a encore un autre problème:
 Il manque (même dans les sociétés riches) de moyens financiers pour que la
majorité des populations puissent jouir des effets positifs de
cette technique.