Determinacion de proteinas mediante el metodo de kjeldahl nutricion

"AÑO DE LA PROMOCIÓN DE LA INDUSTRIA RESPONSABLE Y DEL COMPROMISO CLIMÁTICO"
“DETERMINACION DE PROTEINAS MEDIANTE EL METODO DE KJELDAHL”
CURSO: Nutricion y planificacion.
CICLO: VI
DOCENTE: ING. CASTILLO BENITEZ Darwin.
INTEGRANTES:
 MEJIA ROCHA Johann Luigi.
 MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela.
 VEGA VIERA, Jhonas Abner.
FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
NUEVO CHIMBOTE - PERÚ

COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE
PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES
MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner, MEJIA ROCHA Johann Luigi. Página 2
I. INTRODUCCIÓN El contenido total de proteínas en los alimentos está conformado por una mezcla compleja de proteínas. Estas existen en una combinación con carbohidratos o lípidos, que puede ser física o química. Actualmente todos los métodos para determinar el contenido proteico total de los alimentos son de naturaleza empírica. Un método absoluto es el aislamiento y pesado directo de la proteína pero dicho método se utiliza sólo a veces en investigaciones bioquímicas debido a que es dificultoso y poco práctico En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el método más usado en la actualidad para el análisis de proteínas (método Kjeldahl) mediante la determinación del nitrógeno orgánico. En esta técnica se digieren las proteínas y otros componentes orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. El nitrógeno orgánico total se convierte mediante esta digestión en sulfato de amonio. La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente. El destilado se recoge en una solución de ácido bórico. Los aniones del borato así formado se titulan con HCl (o H2SO4) estandarizado para determinar el nitrógeno contenido en la muestra. El resultado del análisis es una buena aproximación del contenido de proteína cruda del alimento ya que el nitrógeno también proviene de componentes no proteicos. El método Kjeldahl ha sufrido varias modificaciones. Originalmente se utilizó permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidación (digestión), sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se descartó. En 1885 Wilforth encontró que se podía acelerar la digestión utilizando ácido sulfúrico y añadiendo un catalizador. Gunning en 1889 propuso añadir sulfato de potasio que eleva el punto de ebullición del ácido sulfúrico utilizado en la digestión para disminuir el tiempo de la reacción. En la actualidad se utiliza principalmente Sulfato de Cobre penta hidratrado CuSO4.5H2O como catalizador.

II. OBJETIVOS
 Comprender los fundamentos del método Kjeldahl para la determinación del contenido en proteína de un alimento.
 Conocer el procedimiento experimental del análisis de proteínas por el método de Kjeldahl, recogiendo el nitrógeno sobre ácido bórico y valorándolo con una disolución de ácido clorhídrico o sulfúrico.
III. FUNDAMENTOS DEL MÉTODO Y ETAPAS
El método Kjeldahl mide el contenido en nitrógeno de una muestra. El contenido en proteína se puede calcular seguidamente, presuponiendo una proporción entre la proteína y el nitrógeno para el alimento específico que está siendo analizando, tal y como explicaremos más adelante.
Este método puede ser dividido, básicamente en 3 etapas: digestión o mineralización, destilación y valoración. El procedimiento a seguir es diferente en función de si en la etapa de destilación el nitrógeno liberado es recogido sobre una disolución de ácido bórico o sobre un exceso conocido de ácido clorhídrico o sulfúrico patrón. Ello condicionará la forma de realizar la siguiente etapa de valoración, así como los reactivos empleados. En este artículo docente se explica el primer procedimiento, cuando el nitrógeno se atrapa sobre ácido bórico.
PROTEINA

(a) Etapa de digestión: un tratamiento con ácido sulfúrico concentrado, en presencia de un catalizador y ebullición convierte el nitrógeno orgánico en ión amonio, según la ecuación 1.
Catalizadores/ calor
Procedimiento: Se introducen de 1 a 5 g de muestra un tubo de mineralización y se ponen 3 g de catalizador que suele estar constituido por una mezcla de sales de cobre, óxido de titanio o/y óxido de selenio. De forma habitual se utiliza como catalizador una mezcla de K2SO4 : CuSO4 : Se (10:1:0,1 en peso). Después se adicionan 10 mL de H2SO4 concentrado y 5 mL de H2O2. Posteriormente se digiere a 420 ºC durante un tiempo que depende de la cantidad y tipo de muestra. Se sabe que la digestión ha terminado porque la disolución adquiere un color verde esmeralda característico.
En esta etapa, el nitrógeno proteico es transformado en sulfato de amonio por acción del ácido sulfúrico en caliente. En la actualidad, para llevar a cabo este proceso se utilizan digestores automáticos que son capaces de digerir un número determinado de muestras al mismo tiempo (imagen 1). Imagen 1. Unidad de digestión.
LA DIGESTIÓN SE REALIZA EN TRES PASOS
1. En función del contenido de agua de la muestra, empezar la digestión evaporando agua a 150ºC entre 15 y 30 minutos.
2. Realizar un segundo paso entre 270 y 300ºC con una duración de entre 15 y 30 minutos con el fin de reducir la producción de humos blancos.
3. Continuar la digestión a 400ºC entre 60 y 90 minutos.

Control Visual: El resultado es un líquido transparente nítido con coloración azul claro, verde o amarillo dependiendo del catalizador utilizado. No deben quedar restos negros adheridos a la pared de tubo.
(b) Etapa de destilación (imagen 2): se alcaliniza la muestra digerida y el nitrógeno se desprende en forma de amoniaco (ecuación 2). El amoniaco destilado se recoge sobre un exceso desconocido de ácido bórico (ecuación 3).
Procedimiento: Después de enfriar se adicionan al tubo de digestión 50 mL de agua destilada, se pone en el soporte del destilador y se adiciona una cantidad suficiente de hidróxido sódico 10 N, en cantidad suficiente (50 mL aprox.) para alcalinizar fuertemente el medio y así desplazar el amoniaco de las sales amónicas. El amoniaco liberado es arrastrado por el vapor de agua inyectado en el contenido del tubo durante la destilación, y se recoge sobre una disolución de ácido bórico (al 4 % p/v).

(c) Etapa de valoración:
La cuantificación del nitrógeno amoniacal se realiza por medio de una volumetría ácido-base del ión borato formato, empleando ácido clorhídrico o sulfúrico y como indicador una disolución alcohólica de una mezcla de rojo de metilo y azul de metileno (ecuación 4). Los equivalentes de ácido consumidos corresponden a los equivalentes de amoniaco destilados.
IV. RECUPERACIÓN DEL AMONÍACO
Una posible fuente de variación en este método es la pérdida del gas amoníaco o una falla en atrapar el amoníaco en el ácido bórico. Esto puede ocurrir en diferentes pasos del proceso. Una técnica para buscar la recuperación del amoníaco consiste en destilar cantidades conocidas de amoníaco líquido y titularlo con HCl. Se obtendrá otra vez el color púrpura en el ácido bórico.
Mientras se digieren las muestras, se puede destilar una solución de sulfato de amonio. Añada 5, 10 ó 15 ml (mediante una pipeta) de solución de sulfato de amonio a la cámara de ebullición de la unidad destiladora. Enjuáguela después con agua destilada y, si es posible, desionizada. Coloque inmediatamente la punta de la unidad destiladora en 10 ml de ácido bórico + indicador. Colecte aproximadamente 20 ml. de destilado. Titule la muestra con el HCl estandarizado, registre los ml. de HCl empleados y calcule el peso del nitrógeno en el (NH4)2SO4.
V. FUNDAMENTO
El método se basa en la destrucción de la materia orgánica con ácido sulfúrico concentrado, formándose sulfato de amonio que en exceso de hidróxido de sodio libera amoníaco, el que se destila recibiéndolo en:
a) Ácido sulfúrico donde se forma sulfato de amonio y el exceso de ácido es valorado con hidróxido de sodio en presencia de rojo de metilo, o
b) Ácido bórico formándose borato de amonio el que se valora con ácido clorhídrico.

VI. APLICACIONES Desde 1883 en que John Kjeldahl presentó sus trabajos, su método ha ganado una gran aceptación y se aplica en una amplia variedad de trabajos para los análisis de alimentos, bebidas, piensos, grano, carnes, aguas residuales, suelos para cultivos y otros. Hoy por hoy es el método más usado para el análisis de proteínas y se efectúa mediante la determinación de nitrógeno orgánico. Esto es así porque los diferentes tipos de proteínas coinciden todas ellas en una proporción similar de dicho nitrógeno orgánico. En la mayoría de los casos de utiliza el factor de cálculo siguiente:
Contenido de proteínas = Contenido de nitrógeno orgánico x 6.25
En esta técnica se digieren las proteínas y otros compuestos orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. El nitrógeno orgánico total se convierte en sulfato de amonio mediante la digestión. La mezcla resultante se neutraliza con una base y se destila. El destilado se recoge en una solución de ácido bórico. Los aniones de borato así formado se titulan con HCL estandarizado para determinar el nitrógeno contenido en la muestra.
En general, el método Kjeldahl tiene la ventaja de poderse ejecutar mediante equipos no muy sofisticados y puede ser realizado por técnicos poco experimentados.
VII. MATERIALES Y METODOS
- Materiales
o Distintas muestras
- Reactivos
o Ácido sulfúrico concentrado
o Hidróxido de Sodio al 40%
o Ácido bórico al 4%
o Ácido clorhídrico 0.2 N
- Catalizadores
o Sulfato de potasio anhidro. 3 gr
o Sulfato de Cobre (II) pentahidratado CuSO4,5H2O 3.5 gr
- Indicador
o Naranja de Metilo

- Equipos
o Equipo de Kjeldahl de digestión y destilación
o Balón para Kjeldahl
o Balanza analítica
o Espátula
o Probeta de 100, 200 ml
o Erlenmeyer de 250 ml
o Vidrio de reloj
METODO: JKELDAHL
o Factores para los diferentes tipos de alimentos
o Avena, cebada y centeno 5.83
o Arroz 5.95
o Trigo, harina refinada 5.70
o Trigo, grano entero 5.83
o Almendras 5.18
o Soya 5.71
o Leche y sus productos 6.40
o Otros (carne, Huevos, maíz) 6.25
o Gelatina 5.55
Factores de conversión de nitrógeno en proteínas
ALIMENTO
FACTOR DE CONVERSIÓN Harina de trigo refinada y derivados 5,70
Trigo completo
5,83 Avena, cebada, centeno 5,83
Arroz pilado
5,95 Almendras 5,18
Nueces del Brasil
5,46 Maní (con y sin película) 5,46
Frijol soya y derivados
5,71 Coco, castañas y otras oleaginosas 5,30
Leche y derivados
6,38 Gelatina 5,55
Otros
6,25
Fuente (Jones DB.Factors for converting percentages of nitrogen in foods and feeds into percentages of proteins.(Circular N.º 183) Washington DC: United States Department of Agricultura; 1941. [Acceso: diciembre de 2007])

PROCEDIMIENTOS
0.5-2 gr de Muestra
Balon Kjeldahl
Digestor Kjeldahl 419 ºC
Enfriar 80 ºC
Encender equipo
Vaso Erlenmeyer 250 ml
Balon Kjeldahl
Destilador
Neutralizar (color marron o negro)
Destilar 150 ml a 250 ml
25 ml de H2SO4
15 gr de K2SO4
5 gr de CuSO45H20
25 ml de H3BO3
50 ml de H2O

DIGESTIÓN
1. Pese exactamente 1-2g de muestra con exactitud de 0.1 gramos sobre un trozo de papel libre de amoniaco (papel glacine o similar) luego colocar la muestra dentro del balón de digestión Kjeldahl (evitar que se quede muestra adherida al cuello del balón).
2. Agregar 15 gr de sulfato de potasio, 5 gramos de sulfato de cobre y 25 ml de ácido sulfúrico concentrado.
Titular HCl 0.2 N
Nitrogeno (%) = ( 푯푪풍풎풍풙 푵푯푪풍 푾풎풖풆풔풕풓풂 풙 ퟎ.ퟎퟏퟒ)x100
Proteina (%) = Nitrogeno x Factor
5 gotas
Naranja de Metileno
Muestra
K2SO4
CuSO45H20
H2SO4

3. Colocar el balón en el aparato de digestión y calentar la mezcla de digestión a temperatura baja hasta que cese la formación de espuma. Aumentar progresivamente la temperatura de la hornilla (no permita que escape acido del balón por exceso de calor puesto que se pueden producir perdidas de nitrógeno por volatilización de las sales de amonio).
4. La digestión terminará cuando el color de la muestra sea verde-turquesa transparente (son partículas visibles de muestra). Y luego continúe calentando durante 1h y 30 mint. La digestión demora aprox. 2h. Retirar los balones del equipo y dejar enfriar.
5. Agregar a cada balón 50 ml de agua destilada con mucho cuidado

DESTILACIÓN
1. Preparar un matraz de 500 ml, que contenga 50 ml de ácido bórico al 4% (sobre el cual se va a recoger el NH3 destilado) y 3 a 4 gotas del indicador, y colocarlo a la salida del refrigerante cuidando que el extremo de la pipeta colectora quede sumergida en la solución. Abrir la llave del agua de refrigeración del destilador.
2. Adicionar 1 gramo aproximadamente de perlas de vidrio al balón que contiene la muestra digerida, luego agregar cuidadosamente 70 a 75 ml de Na OH al 33% por las paredes del balón de manera que las dos capas no se mezclen. En seguida se conecta el matraz al pico del aparato de destilación. Se calienta el líquido alcalino pasando vapor, hasta que hierva durante 20 min, al comienzo se calienta poco a poco para reducir la espuma.
3. El volumen recogido de destilado deberá ser de por lo menos 150 ml.

TITULACIÓN
1. El ácido bórico remanente del destilado se titula con solución de HCl 0.1 N valorada, hasta el cambio de color.
2. Titule la muestra con 0.1N de HCl. Un color violeta indica el punto final de la titulación. Compárese este color con el del blanco. Cada equivalente del HCl usado corresponde a un equivalente de NH3 o a un equivalente de N en la muestra original. El peso del N en mg está dado por miliequivalentes del ácido X 14 (el peso equivalente del N).

FUENTES DE ERROR
Las principales fuentes de error son:
En el proceso de digestión:
1) La inclusión de nitrógeno no proteico (aunque la cantidad de este nitrógeno suele ser despreciable comparada con la del nitrógeno proteico);
2) La pérdida de nitrógeno durante la digestión. El exceso de sulfato de sodio o potasio que se añade al ácido para elevar el punto de ebullición, puede producir una descomposición por calor y por lo tanto pérdida de nitrógeno. Por otro lado, el exceso de catalizador (de cobre generalmente) también puede producir pérdidas de nitrógeno.
3) La digestión incompleta de la muestra. Generalmente debida a falta de tiempo de reacción o falta de ácido sulfúrico.
Durante la destilación:
1) Neutralización incompleta de la mezcla digerida. Es necesario añadir suficiente NaOH para neutralizar el exceso de ácido sulfúrico resultante de la digestión así como transformar todo el amonio formado en la digestión en amoníaco.
2) Perdida de amoníaco por fugas en el circuito de destilación.
3) Perdida de amoniaco por refrigeración insuficiente en el condensador.
CALCULAMOS:
De la valoración se puede calcular el número de equivalentes de nitrógeno recogidos, y con éste dato se obtiene el porcentaje de nitrógeno en la muestra.
Dónde:
o V= volumen de ácido clorhídrico empleado en la titulación, en ml
o N= normalidad de ácido clorhídrico.
o m= masa de la muestra en gramos
o 0.014= Miliequivalente del Nitrógeno.
Para calcular el porcentaje de proteína basta con multiplicar por un factor de conversión el % de nitrógeno calculado. El contenido de nitrógeno en diferentes proteínas es aproximadamente 16% por lo que multiplicando el por ciento del nitrógeno obtenido por el factor 6.25 se obtiene la cantidad de proteínas presentes en los alimentos. Sin embargo la relación nitrógeno-proteínas varía en forma trascendente.

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풓풐풕풆 풏풂풔 ퟔ.ퟎퟓퟕ Nota: El factor para los alimentos son distintos, y están separados según el origen de estos mismos. Pero la bibliografía nos indica que para el cálculo estándar en este caso debemos trabajar con 6.25
VIII. DISCUSÍONES
- La calidad de una proteína alimenticia, en términos nutritivos, solo puede establecerse realmente mediante ensayos de la alimentación (Madl, 1993; Suarez et al., 2006), pero hoy se sabe lo suficiente con respecto a la digestión de las proteínas y a los efectos de las técnicas de procesados como para poder realizar experimentalmente bastante precisos. Para ello, es necesario conocer tanto el contenido proteínico total del alimento como la composición aminoacidica de su proteína (Madl, 1993).
- Como alternativa a la determinación del nitrógeno orgánico por combustión de la muestra, y tras algunas intentos fallidos, el Danes Johan Gustav Christoffer Thorsager Kjeldahl (1849-1900) público en 1893 un método basado en la conversión del nitrógeno en amoniaco por vía de humedad (Kirk,2002)

- La determinación de nitrógeno total por el método Kjeldahl aun hoy en dia es uno de los métodos mas utilizados en el análisis químico (Souza et al., 200; Moller, 2005). Aceptado por la A.O.A.C (1984). No requiere de un equipo sofisticado y se adapta con facilidad a los análisis de rutina de gran número de muestras.
- El método Kjeldahl (o alguno de sus modificaciones), es el método patrón para determinar la proteina contenida en cereales, carnes y otros materiales biológicos (Matissek et al., 1996).
- En los cálculos realizados al quererse determinar el porcentaje de N en los alimentos, el uso del factor proteico de los alimentos, no se ha encontrado un valor exactamente para el alimento analizado en el práctica, por tanto el % N es un valor aproximado. (http://www.grupo- selecta.com/notasdeaplicaciones/analisis-alimentarios-y-de-aguas- nutritional-and-water-analysis/determinacion-de-proteinas-por-el-metodo- de-kjeldahl-kjeldahl-method-for-protein-determination/)
- Durante el proceso se estiman perdidas de N una de ellas es durante la digestión; el exceso de sulfato de potasio que se añade al ácido para elevar el punto de ebullición, puede producir una descomposición por calor y por lo tanto pérdida de nitrógeno. Por otro lado, el exceso de catalizador (de cobre generalmente) también puede producir pérdidas de nitrógeno.
- En el trabajo de rutina se determina mucho más frecuentemente la proteína total que las proteínas o aminoácidos individuales. En general, el procedimiento de referencia Kjeldahl determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto las no proteínas como las proteínas verdaderas (Aurand et al, 1987).
- Con respecto al método: Absorción a 280 nm. La mayoría de las proteínas muestran una absorción a 280 nm., la cual se atribuye al grupo fenólico de la tirosina y al grupo indólico del triptofano. La cuantificación de proteínas basada en la absorción en la región de UV, tiene la ventaja de que no es necesario utilizar reactivos y la muestra no se daña o destruye durante la

determinación. Se toma en cuenta la absorción del disolvente, ya que este puede absorber en la misma región. Este método sufre interferencias de compuestos que contengan anillos de purina y pirimida. Se realiza una comparación con una proteína estándar, de la que se debe conocer su composición. (Nollet, 1996)
- Método de Biuret El método comprende un ensayo colorimétrico de un paso donde se cuantifica la formación de un complejo estable entre proteínas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta característico, que se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da por la coordinación de un átomo de cobre con cuatro átomos de nitrógeno. El complejo se basa en la desprotonación de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los átomos de oxígeno y de nitrógeno del péptido. Después de la adición del reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una coloración de Biuret estable; es necesario considerar la posible influencia de aminoácidos libres que forman buffer en configuración tris y amoniaco. (Nollet, 1996).
- Método de Lowry El método de Lowry et al, 1951 combina la reacción de Biuret con la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu (ácidos fosfomolíbdico y fosfotúngstico) por la oxidación de tirosina, triptofano, cisteína, cistina de las cadenas polipeptídicas (Nielsen, 1988). El proceso de óxido-reducción se acompaña de la formación de un color azul característico. Los quelatos de cobre en la estructura del péptido facilitan la transferencia de electrones de los grupos funcionales amino al cromóforo ácido. Este método es útil para determinar pequeñas cantidades de proteína en una disolución. El desarrollo de color es dependiente en gran cantidad del pH, que se debe mantener entre 10 y 10.5. (Nollet, 1996).
- Método turbidimétrico La turbidez producida cuando una proteína se mezcla con alguno de los precipitantes comunes (ácido tricloroacético 3- 10%, ácido sulfosalicílico y ferrocianuro de potasio en ácido acético) para proteínas en bajas concentraciones se puede utilizar como un índice de la

concentración de proteínas. Las técnicas turbidimétricas son rápidas y convenientes, sin embargo las principales desventajas que presentan es que las proteínas difieren en la velocidad de precipitación así como no permiten diferenciar entre proteínas y compuestos insolubles en ácidos tales como ácidos nucleicos. (Layne, 1957).
- Unión de colorantes. Controlando el pH y la fuerza iónica del medio los grupos funcionales ácidos y básicos de las proteínas pueden interactuar con grupos orgánicos de carga opuesta. Al realizarse la unión se presenta coloración o bien un cambio de ésta. Comúnmente se usan colorantes sulfonados los cuales reaccionan a pH ácido con el grupo ε-amino de la lisina y el grupo guanidina de la arginina, el imidazol de la histidina y un número limitado de α-amino terminales. (Nollet, 1996).
- Extracción de proteínas. (Método de Osborne y Mendel). El método se fundamenta en la relación estructura-solubilidad de las proteínas. Por ejemplo, se sabe que la zeína que es soluble en un alcohol fuerte o en disoluciones alcalinas diluidas, pero es insoluble en agua o en soluciones neutras inorgánicas. Las glutelinas por ejemplo es insoluble en agua, en soluciones salinas y en alcohol, y bastante soluble en sosa y potasa. Es importante notar que la mayoría de nitrógeno proveniente de proteínas es soluble en alcohol y en disoluciones alcalinas. Las globulinas, albúminas y prolinas son solubles en disoluciones alcalinas diluidas. (Osborne, 1914).
- Capacidad de gelificación Cuando las proteínas desnaturalizadas se agregan para formar una red proteica ordenada, al proceso se le denomina gelificación. La gelificación es una propiedad funcional muy importante de algunas proteínas, se utiliza, no sólo para formar geles sólidos viscoelásticos, sino también para mejorar la absorción de agua, los efectos espesantes, la fijación de partículas (adhesión) y pata estabilizar emulsiones y espumas. Los mecanismos y las interacciones responsables de la formación de las redes tridimensionales proteicas son el despliegue y se desnaturaliza antes de la interacción y agregación ordenada proteína- proteína. La formación de las redes proteicas se considera el resultado de

un balance entre las interacciones proteína-proteína y proteína-disolvente (agua) y entre las fuerzas atractivas y repulsivas entre cadenas polipeptídicas adyacentes. Entre las fuerzas atractivas implicadas se encuentran las interacciones hidrofóbicas (potenciadas por las temperaturas elevadas) electrostáticas (como los puentes de calcio (II) y otros cationes divalentes), los puentes de hidrógeno (potenciados por el enfriamiento) y los enlaces disulfuro. (Fennema, 1993)
IX. CONCLUCIONES
o La determinación de proteína por el método de Kjeldahl, representa una técnica analítica muy común, podemos decir que es un método dispendioso y demorado, mientras que con el uso del equipo automatizado hay mayor sensibilidad, más exactitud, menos tiempo y podemos tener un control de vapores más precisos, el método constata de tres fases de desarrollo las cuales son correspondientes a una digestión de la materia orgánica, destilación del amoniaco, una adsorción y titulación, en la cual se agregó ácido bórico (50ml) al 4%.
o El método de Kjeldahl está basado en la combustión húmeda de la muestra, calentándola con ácido sulfúrico concentrado en presencia de catalizadores metálicos y de otro tipo para efectuar la reducción del nitrógeno orgánico de la muestra a amoníaco, el cual es retenido en solución como sulfato de amonio. La solución de digestión se hace alcalina y se destila o se arrastra con vapor para liberar el amoníaco que es atrapado y titulado. De este modo podemos obtener el porcentaje de nitrógeno en la muestra de la harina de chochoca fue de 1.406461% y la harina de arveja fue 1.199923 % y como proteína se reporta de la harina de chochoca un 8.7903% y de arveja un 6.83956%; al realizar la prueba y obtener los datos se obtuvo que la medida de los valores encontrados no difería significativamente del valor real; sin embargo se debió rechazar por medio de un aprueba un valor pudo estar sujeto a errores que afectaron de manera significativa los resultados; en este método constituyen fuentes de error: La inclusión de nitrógeno no

proteico como parte de la proteína; la pérdida de nitrógeno durante la digestión, la digestión incompleta de la muestra.
X. BIBLIOGRAFIA o Química cuantitativa, Glenn H. Brown,Eugene M. Sallee, Reverte, 1967 o Jones DB. Factors for converting percentages of nitrogen in foods and feeds into percentages of proteins. (Circular N.º 183) Washington DC: United States Department of Agricultura; 1941. [Acceso: diciembre de 2007]
o Adrian, J.; Potus, J.; Poiffait, A.; Dauvillier, P.: “Análisis nutricional de los alimentos”, Ed. Acribia, 2000, pág. 41-43
o Revista RECITEIA Vol 1 No.1- Gerardo Alimentos Balanceados, 2001
o http://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/16338/Determinaci%C3%B3n%20de%20proteinas.pdf?sequence=1
o http://www.fao.org/docrep/010/ah833s/ah833s17.htm
o http://www.ispch.cl/lab_amb/met_analitico/doc/ambiente%20pdf/ Proteina.pdf
o http://www.grupo-selecta.com/notasdeaplicaciones/analisis- alimentarios-y-de-aguas-nutritional-and-water- analysis/determinacion-de-proteinas-por-el-metodo-de-kjeldahl- kjeldahl-method-for-protein-determination/
o https://powerpoint.office.live.com/p/PowerPointView.aspx?FBsrc= http%3A%2F%2Fwww.facebook.com%2Fattachments%2Fdoc_preview.php%3Fmid%3Dmid.1410821258747%253A6973845e0cc35e8390%26id%3D0c5c7df73a20c061f8382f03aef36adb%26metadata& access_token=100002840725576%3AAQABrfQ6qOUp253C&title=notasproteinas2
o http://www.aliciacrocco.com.ar/2014/04/tabla-de-composicion- quimica-legumbres-secas/
o http://composicionnutricional.com/alimentos/MAIZ-CHOCHOCA-4

o http://www.grupo-selecta.com/notasdeaplicaciones/sin- categoria/metodo-kjeldahl/
o docencia.izt.uam.mx/lyanez/analisis/practicas/KJELDAHL.rtf+&cd= 5&hl=es&ct=clnk&gl=pe
o FENNEMA O.; Química de alimentos; Acribia, segunda edición; España 1993.
o NOLLET, L. M. L (Ed).; Handbook of Food Analysis; M. Dekker, Nueva York 1996.
o LAYNE E. 1957. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins. Methods in Enzimology, 3:447-454
o OSBORNE T. B; Mendel L. B. 1914. Nutritive properties of proteins of the maize kernel. Journal of Biological Chemistry 18, 1 (1914)
I. INTRODUCCION
La extracción es una de las operaciones básicas del laboratorio. Se define como la acción de separar con un líquido una fracción específica de una muestra, dejando el resto lo más íntegro posible.
Se pueden realizar desde los tres estados de la materia, y se llaman de la siguiente manera:
1) Extracción sólido – líquido;
2) extracción líquido – líquido y
3) extracción gas – líquido.
La primera es la más utilizada y es sobre la que trata este escrito de la extracción con el equipo Soxhlet. Como ejemplo se pueden citar todas las obtenciones de principios activos de los tejidos vegetales. La segunda tiene usos especialmente en química analítica cuando se

extrae el producto de una reacción efectuada en fase líquida con un solvente específico para separar uno o algunos de los componentes. Por último un ejemplo de la tercera, gas – líquido, que ordinariamente se llama ‘lavado de gases’, es el burbujeo por una fase líquida de un gas que se quiere lavar o purificar. Ante la pregunta de la necesidad de usar un aparato bastante complejo y costoso para extraer un sólido con un solvente, algo que pareciera tan sencillo de hacer agregando el solvente a la muestra y luego filtrar y listo, hay que contestar lo siguiente. El proceso de extracción de la mayoría de las sustancias tiene muy baja eficiencia, es decir una vez que se agrega el solvente, lo que está en contacto íntimo con lo extraíble se satura enseguida, por lo que hay que filtrar y volver a tratar con solvente fresco.
Eso implica gran cantidad y mucha manipulación del solvente aparte de la atención personalizada que la operación requiere. Como muchas veces lo que se quiere recuperar es el extracto y no la muestra extraída, habrá que evaporar todo el solvente para recuperarlo. Por otro lado estas tareas debieran realizarse en una campana espaciosa dado que los solventes se suene utilizar calientes, es decir con una alta tensión de vapor. Lo que hace el extractor Soxhlet es realizar un sin fin de extracciones de manera automática, con el mismo solvente que se evapora y condensa llegando siempre de manera pura al material.
II. OBJETIVOS
Con la realización de la práctica se persigue que los alumnos adquieran la capacidad de:
o Conocer el procedimiento experimental para su realización ene l laboratorio
o Calcular el porcentaje de grasa de un alimento utilizando el método de Soxhelt.
III. FUNDAMENTO TEORICO
EXPLICACIÓN DE LA OPERACIÓN DE EXTRACCIÓN
La extracción Soxhlet se fundamenta en las siguientes etapas:
1) colocación del solvente en un balón.
2) ebullición del solvente que se evapora hasta un condensador a reflujo.
3) el condensado cae sobre un recipiente que contiene un cartucho poroso con la muestra en su interior.

4) ascenso del nivel del solvente cubriendo el cartucho hasta un punto en que se produce el reflujo que vuelve el solvente con el material extraído al balón.
5) Se vuelve a producir este proceso la cantidad de veces necesaria para que la muestra quede agotada. Lo extraído se va concentrando en el balón del solvente.
A continuación se tratará de explicar estas etapas de forma pormenorizada, realizando aclaraciones especiales cuando sean necesarias. Se debe auxiliar la lectura con la Figura Nº 1 que se halla a la derecha.
o Preparación de la muestra. La operación comienza por la preparación de la muestra. Cada sistema de trabajo tiene su manera de preparar la muestra. Con frecuencia debe ser dividida en fragmentos de mayor o menor tamaño. Con esta muestra así alistada se carga el cartucho de extracción.
o Cartuchos: Este cartucho consiste en un recipiente cilíndrico con base semiesférica para que apoye perfectamente en la base del equipo extractor y sea además más resistente. Los materiales más utilizados son el algodón prensado y la porcelana porosa, Figura Nº 2. Los primeros son más económicos pero menos durables. Los de porcelana, además, se pueden lavar periódicamente con mezcla sulfocrómica. Los de algodón se van contaminando con el tiempo con los extractivos. En el caso de sustancias que contienen taninos, como la madera y muchos otros vegetales, van quedando marrón rojizo. Es conveniente lavarlos con un solvente de
polaridad distinta con el que se mancharon. En el caso de hidrocarburos agua o alcohol. Los cartuchos se llenan hasta la mitad o un poco más y en lo posible no es conveniente comprimir demasiado la muestra para que no se vea impedida la difusión.
La cantidad de muestras lo condiciona el tamaño del cartucho y este el del extractor. Es por eso que existen varios tamaños de soxhlet, y es conveniente antes de comenzar a trabajar definir cuál es la medida que se requiere.
o Tapón del cartucho: Una vez cargado el material que se puede hacer con la mano en caso de hojas, tallos etc., o bien con un embudo o con una cuchara de cocina si está molido, se debe colocar un tapón por las dudas la muestra tienda a flotar e irse del cartucho. El más utilizado es el hecho con una torunda de algodón envuelta o no en gasa. Dado que las paredes del cartucho suelen ser ásperas hay que conseguir que el tapón llegue al fondo por medio de los dedos o de una espátula. Es conveniente asegurarse que no estamos ingresando extractivos con el algodón, por lo que se recomienda realizar el lavado previo de una provisión del mismo, así ya se tiene para futuras necesidades.

o Colocación del solvente: La cantidad de solvente debe ser la necesaria para que al ascender al cartucho y antes de que se haga la sifonada, no quede seco el balón inferior porque de esa manera, o se seca la muestra y se quema, o cuando caiga el líquido de la sifonada sobre el vidrio recalentado se puede producir una explosión de los vapores con el consiguiente riesgo de accidente. Si la cantidad a agregar no está estipulada en la norma, se carga el solvente desde arriba, lentamente, para que vaya cubriendo el cartucho y luego produzca el rechupe. Esta es la cantidad mínima. Pero como durante la operación hay pérdida del solvente por evaporación, y además debe quedar una cantidad mínima en el balón para que no se concentre el extracto demasiado, hay que agregar por lo menos una cantidad semejante en exceso.
o Solventes a utilizar: Si se sigue una norma o técnica obviamente que el solvente estará indicado. Pero con frecuencia, particularmente en los laboratorios de investigación, se suelen realizar extracciones no normalizadas. Por eso es conveniente saber el rango de estas sustancias que se pueden utilizar en el extractor soxhlet. La experiencia que se posee es que hay una temperatura máxima y mínima de ebullición en la que el equipo funciona adecuadamente. En el extremo inferior se encuentra el diclorometano (cloruro de metilo) que se utiliza para la extracción de grasas y resinas de manera selectiva. Este solvente tiene un punto de ebullición de 40º muy cercano a la temperatura ambiente particularmente en los climas cálidos. Cuando se efectúa una extracción con el agua de refrigeración a 26ºC, se pierde más de la mitad del solvente. Con respecto al extremo superior hay que decir que para la cantidad de energía limitada que generan los calentadores eléctricos comunes, a medida que aumenta el punto de ebullición disminuye significativamente el caudal de solvente que se evapora y por ende la velocidad de extracción.
Sin embargo hay que hacer notar que además del punto de ebullición es importante el calor latente de evaporación. En la tabla Nº 1 se expone una lista, no exhaustiva, de los solventes comunes utilizados en las extracciones con Soxhlet.
Otra característica importante en cuanto al tipo de solventes es que los de carácter no polar suelen tener alguna dificultad en sifonar puesto que no mojan el vidrio. Ello es frecuente con los derivados clorados como el diclorometano y el cloroformo y los hidrocarburos superiores al hexano.
o Calentamiento: Es corriente utilizar calentadores eléctricos de esos llamados múltiples, como el que se ve en la Figura Nº 3, que además poseen reóstatos para variar el tiempo en el que las resistencias están encendidas. Habitualmente tienen varios puntos. En el primero las resistencias están casi todo el tiempo apagadas y en el último no cortan nunca.

Con alguna frecuencia sucede que al comienzo de la evaporación el solvente se sobrecalienta y posteriormente produce una evaporación explosiva que hace que gran cantidad de vapores lleguen al refrigerante que no da abasto en la condensación. Inclusive puede darse que si el equipo no está bien sujeto en los dos lugares necesarios, es decir en el balón y en el extractor, salte la parte superior y escapen vapores calientes del solvente, circunstancia que puede ser peligrosa. Si lo que se va a utilizar es el residuo sólido se pueden colocar núcleos de evaporación en el balón como trozos de porcelana porosa o piedra pómez. En el caso de tener que cuantificar el extracto se conoce una sola forma segura de evitar el sobrecalentamiento y es introduciendo un trozo de capilar de teflón de manera que toque la pared del balón en dos partes diferentes.
o Refrigeración: En la Figura nº 3 se puede observar la importancia de la ubicación de las mangueras puesto que en este caso, al haber seis refrigerantes habrá doce conexiones de agua. Las conexiones se pueden realizar en serie o en paralelo. La conexión en serie es más práctica, usa menos manguera y requiere de una sola canilla y un solo desagüe. Su única limitación es el aumento de la temperatura del agua de refrigeración a medida que el mismo líquido pasa de un refrigerante al otro, y un defecto es que el sistema queda como un todo y si se saca un equipo hay que acomodar las mangueras de nuevo. En el sistema en paralelo o individual cada equipo tiene su entrada y salida de agua independiente, por lo que se requerirán más canillas y más desagües, aunque se puede instalar un sistema de canilla con varias salidas y un colector de efluentes. El flujo de agua debe regularse para utilizar solamente lo necesario, dado que el consumo es muy alto, particularmente en el caso de que se use agua potable de la canilla.
o Operación de extracción: (Es conveniente auxiliarse con la figura Nº 1) Una vez que el equipo está armado, abierta el agua el refrigerante, cargado el cartucho con muestra e introducido el solvente, sólo resta encender el calentador y comenzar la operación. Llegada la temperatura a la de ebullición del solvente éste comienza a evaporarse y, luego de que calienten las paredes del equipo, comienza a condensar en el refrigerante y a caer en forma de gotas sobre el cartucho. La primera operación es totalmente

atípica y no debe contabilizarse en el recuento que se hace para regular la velocidad de extracción como suelen pedir las normas. A medida que el condensado va cayendo sobre el cartucho este comienza a escurrir por la parte inferior del mismo llenando el recipiente de extracción hasta que llega al nivel de la bajada del sifón y rechupa, con todo el material disuelto, hacia el balón inferior. El tope del sifón está por encima del cartucho para asegurar que todas las veces el material a extraer quede embebido en el solvente. Una vez que el sistema está en régimen las sifonadas se producen a intervalos regulares. Los tiempos comunes del sifonado están entre 5 y 20 minutos, según la potencia del calentador, el solvente, la temperatura externa, etc.
o Culminación de la operación: Una vez que se ha dado por terminada la operación de extracción, es conveniente esperar un cierto tiempo para que el sistema se enfría hasta que sea fácil manipularlo.
A continuación no hay que olvidarse de cerrar el agua de refrigeración para no realizar consumo innecesario. Después se desarma el equipo y se extrae el cartucho que está saturado de solvente y se coloca en un sitio aireado o en la campana para que se seque la muestra. La extracción de la muestra del cartucho húmedo puede ocasionar su deterioro. Si es necesario se deberá enjuagar el extractor para que quede listo para la próxima vez. Y con esto se da por terminada la operación de extracción.
METODOS PARA RECUPERAR SOLVENTES DE LA DETERMINACION DE GRASAS
1. Método de Soxhlet (James, 1999) Colocar a peso constante un matraz bola de fondo plano con perlas o piedras de ebullición en la estufa a 100ºC, aproximadamente 2 hrs.Pesar de 4 a 5 g de muestra sobre un papel, enrollarlo y colocarlo en un cartucho de celulosa, tapar con un algodón (No apretar el algodón contra la muestra) y colocar el cartucho en el extractor. Conectar el matraz al extractor, en el que se debe encontrar el cartucho con la muestra, y posteriormente conectar éste al refrigerante. (No poner grasa en las juntas). Agregar dos cargas del disolvente (generalmente éter etílico) por el refrigerante y calentar el matraz con parrilla a ebullición suave. Para verificar que se ha extraído toda la grasa, dejar caer una gota de la descarga sobre papel filtro, al evaporarse el disolvente no debe dejar residuo de grasa. Una vez extraída toda la grasa, quitar el cartucho con la muestra desengrasada, seguir calentando hasta la casi total eliminación del disolvente, recuperándolo antes de que se descargue. Quitar el matraz y secar el extracto en la estufa a 100ºC por 30 min., enfriar y pesar. Calcular el porcentaje de grasa.

2. Método de Goldfish (Pomeranz y Meloan, 2000) Colocar un vaso para Goldfish en la estufa a 100ºC hasta peso constante, aproximadamente 2 hrs. Pesar de 4 a 5 g de muestra sobre un papel, enrollarlo y colocarlo en un cartucho de celulosa, tapar con un algodón. Situar el cartucho en un recipiente con el fondo perforado y colocarlo en el sostenedor del equipo. Adicionar en el vaso para Goldfish aproximadamente 40 ml del disolvente éter etílico) y colocarlo en el equipo mediante un anillo de hierro con empaque de hule. Subir la parrilla girando hacia un lado y al contrario. Calentar hasta la extracción completa de la grasa. Para verificar que se ha extraído toda la grasa, dejar caer una gota de la descarga sobre papel filtro, al evaporarse el disolvente no debe dejar residuo de grasa Al finalizar, cambiar el sostenedor del cartucho por un recipiente sin perforación y calentar de nuevo para recuperar el disolvente del vaso. Quitar el vaso del equipo y secar el extracto en una estufa a 100ºC por 30 min., enfriar y pesar. Calcular el porcentaje de grasa. 3. Método por lotes Colocar a peso constante un matraz bola de fondo plano con perlas o piedras de ebullición en la estufa a 100ºC, aproximadamente 2 hrs. Pesar de 5 a 10 g de muestra en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Adicionar 40 ml de disolvente. Agitar durante 10 min, dejar sedimentar y filtrar la parte superior sobre el matraz bola. Recuperar el residuo y adicionarle 40 ml del disolvente, agitar, dejar sedimentar y filtrar, juntar este filtrado con el anterior. Repetir la extracción hasta la extracción total de la grasa. Para verificar que se ha extraído toda la grasa, dejar caer una gota del filtrado sobre papel filtro, al evaporarse el disolvente no debe dejar residuo de grasa. Evaporar el disolvente en rota vapor, secar el extracto lipídico en la estufa a 100ºCdurante 30 min. Calcular el porcentaje de grasa. 4. Método Rose-Gottlieb (James, 1999) Colocar a peso constante un matraz bola de fondo plano con perlas o piedras de ebullición en la estufa a 100ºC, aproximadamente 1 h. A) Pretratamiento a la muestra a) Leche. Pesar 10-11g de muestra en un tubo Rose Gottlieb. Adicionar 1 ml de hidróxido de amonio 0.88 y mezclar. Dejar reposar toda la noche a temperatura ambiente. b) Leche en polvo. Pesar 1g de muestra en un tubo de extracción Rose Glottlieb. Adicionar cuidadosamente 9 ml de agua y mezclar hasta que

desaparezcan los grumos. Adicionar 1 ml de hidróxido de amonio 0.88 y mezclar. Dejar reposar toda la noche a temperatura ambiente. c) Crema. Pesar 2g de muestra en un tubo de extracción Rose-Gottlieb. Adicionar 8mL de una solución de cloruro de sodio 0.5% (m/v). Adicionar 1 ml de hidróxido de amonio 0.88 y mezclar. Dejar reposar toda la noche a temperatura ambiente. d) Yogurt, helado y dulce de leche. Pesar 4 g de muestra en un tubo Rose- Gottlieb. Adicionar 6 ml de agua a 60°C, agitar hasta dispersar la muestra. Adicionar1.5mL de hidróxido de amonio 0.88 y mezclar. Dejar reposar toda la noche a temperatura ambiente. B) Extracción de grasa Adicionar 10 ml de etanol, mezclar y enfriar. Adicionar 15 mL de éter etílico, tapar el tubo y agitar por un minuto. Enfriar, adicionar 15 mL de éter de petróleo y agitar por un minuto. Dejar reposar por 30-60 min o hasta que la capa etérea esté completamente separada. Quitar el tapón, enjuagarlo y el cuello del matraz con 5 mL de una mezcla de éter etílico: éter de petróleo (1:1). Insertar el tubo sifón, recuperar el solvente en el matraz bola a peso constante, enjuagar el tubo sifón con solvente recuperando este en el matraz. Repetir la extracción y lavados 2 veces. Eliminar el solvente en el rotavapor, secar el matraz por 1h a 100°C y pesar. Calcular el contenido de grasa.
IV. MATERIALES Y METODOS
- MATERIALES
 Extractor Soxhlet
 Muestra de alimentos
 Balanza

- METODOS
5g. de muestra
Envolver - Papel Filtro
Pesar Balòn Vacio P1
Armar Extractor Soxhlet
180 ml Hexano - solvente
Cocinilla x 3 horas.
Recuperar el solvente
Reposar 10'
Pesar Balon + Grasa P2
%Grasa= 푃2−푃1 휔푚푢푒푠푡푟푎 x100

Sistema de Soxhlet para este proceso se usó los siguientes materiales.
EQUIPOS
Colocación de sustancia: harina de pescado
Refrigerante de flujo
Sifón
Reciclo
Balón
Solvente
Agua
Balanza analítica
Papel filtro/ dedal de celulosa
Material usual de laboratorio
Solvente (éter dietílico)

Sistema de Soxhlet, en el cual observamos la extracción de de grasa en una muestra de almuerzo.
1.El solvente es éter 180 ml.
 Pesamos 5g de la muestra del almuerzo previamente secado.
Resultados de determinación del contenido de grasa (extracto Etéreo) en un almuerzo.
 Los resultados obtenidos en la determinación del contenido de grasa son.
 vaso de almuerzo: 27.9945 g.
 vaso del desayuno: 27.8035 g.
o Peso de la bolsita del almuerzo: 3.0231 g.
o Peso de la bolsita del desayuno: 3.0062 g.
 Pesos totales después de haber sacado de soxllet.
 vaso del almuerzo: 28.2149 g.
 vaso de desayuno: 28.3957 g.
AHORA USAMOS LA FÓRMULA PARA DETERMINAR EL CONTENIDO DE GRASAS.
5g. de muestra
Envolver – papel filtro

W= Grasa cruda en % de la muestra.
m= Masa en gramos de la porción de ensayo.
m1= Masa en gramos del balón vacío seco usado en la extracción.
m2= Masa en gramos del balón contenido la grasa seca después de la extracción.
ENTONCES CALCULAMOS EL % DE GRASA EN EL ALMUERZO.
m= 3.0231 g
m1= 27.9945 g
m2= 28.2149 g
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ENTONCES CALCULAMOS EL % DE GRASA EN EL DESAYUNO.
m= 3.0062 g
m1= 27.8035 g
m2= 28.3957 g
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V. CONCLUSIONES
 Las grasas, incluyendo los aceites, son una parte muy importante en todas las dietas (el aceite es grasa en estado líquido). Las grasas se digieren más lentamente que otros alimentos. Producen grasa corporal como aislante, para proteger a los órganos vitales y para mantenerlos en su lugar. Además, son necesarias para la asimilación de las vitaminas solubles en grasa (A, D, E Y K).
 El contenido en grasas es un indicador del tipo de alimentación que tiene una población, gracias al método que empleamos, utilizamos como muestra nuestro almuerzo para evaluar el porcentaje de grasa, y se concluyó con un promedio de 7.2 %, valor que no está en el límite inferior establecido. (intervalo: 10-25 % ).
VI. DISCUSIONES
 Los lípidos, junto con las proteínas y carbohidratos, constituyen los principales componentes estructurales de los alimentos. (Nielsen, 1998). Los lípidos se definen como un grupo heterogéneo de compuestos que son insolubles en agua pero solubles en disolventes orgánicos tales como éter, cloroformo, benceno o acetona. Todos los lípidos contienen carbón, hidrógeno y oxígeno, y algunos también contienen fósforo y nitrógeno (Aurand et al, 1987). Los lípidos comprenden un grupo de sustancias que tienen propiedades comunes y similitudes en la composición, sin embargo algunos, tales como los triacilgliceroles son muy hidrofóbicos. Otros, tales como los di y monoacilgliceroles tienen movilidad hidrofóbica e hidrofílica en su molécula por lo que pueden ser solubles en disolventes relativamente polares (Nielsen, 1998).
http://dspace.universia.net/bitstream/2024/1067/1/ManualdeFundamentosyTecnicasdeAnalisisdeAlimentos_6501.pdf
 El contenido total de lípidos se determina comúnmente por métodos de extracción con disolventes orgánicos (por ejemplo Soxhlet, Goldfish, Mojonnier), sin embargo también puede cuantificarse por métodos de

extracción que no incluyen disolventes (por ejemplo, Babcock, Gerber) y por métodos instrumentales que se basan en propiedades físicas o químicas de los lípidos (por ejemplo, infrarrojo, densidad y absorción es rayos X) (Nielsen, 2003).
 Método de Soxhlet Es una extracción semicontinua con un disolvente orgánico. En este método el disolvente se calienta, se volatiliza y condensa goteando sobre la muestra la cual queda sumergida en el disolvente. Posteriormente éste es sifoneado al matraz de calentamiento para empezar de nuevo el proceso. El contenido de grasa se cuantifica por diferencia de peso (Nielsen, 2003)
CARACTERIZACIÓN DE LÍPIDOS:
 3.2.1 Peso específico Es una determinación gravimétrica en donde un picnómetro se llena con la muestra de aceite y permanece en un baño a 25ºC por 30 min, se seca y pesa. Se expresa el peso especifico como la relación del peso del aceite con respecto al agua (g de aceite/g agua). (Aurand et al, 1987)
 Índice de refracción Se define como la relación de la velocidad de la luz en el aire (técnicamente un vacío) con respecto a la velocidad de la luz en el aceite. Se obtiene midiendo directamente en un refractómetro a 20-25ºC para los aceites y a 40ºC para las grasas. (Nielsen, 1998)
 Índice de saponificación El índice de saponificación denota el peso de hidróxido potásico en mg que se requieren para saponificar un gramo del aceite o grasa. El aceite se saponifica calentándolo con un exceso de álcali cáustico alcohólico. La cantidad de álcali consumida se calcula valorando por retroceso con ácido clorhídrico. El índice de saponificación es inversamente proporcional a la medida de los pesos moleculares de los ácidos grasos de los glicéridos presentes en el aceite o grasa. Como muchos aceites dan índices similares, el índice de saponificación es menos valioso

que el índice de yodo cuando se trata de identificar un aceite desconocido. Notables excepciones son los altos índices del aceite de coco y el aceite de almendra de palma (ambos utilizados en la margarina) y de la grasa de mantequilla. (Pearson, 1993)
CH2-OOC-R - CH-OOC-R - CH2-OOC-R + 3 KOH → CH2-OH -CH-OH - CH2-OH (glicerol) + 3 R-CO2-K
 Material insaponificable La materia insaponificable consta de aquellas sustancias contenidas en los aceites comerciales y grasas (diferentes a las de bajo p. de ebullición a los ácidos libres y a la materia mineral) que, después de saponificar y extraer con éter dietílico, quedan sin volatilizarse luego de secar a 80°C. Incluyen hidrocarburos y alcoholes de alto peso molecular. L/a mayoría de los aceites y grasas contienen una pequeña parte de materia insaponificable (normalmente menos del 2 %). (Pearson, 1993)
 3Colesterol El método químico de Liebermann-Burchard para la determinación de colesterol en una muestra lipídica se basa en el desarrollo de una coloración verde en presencia de anhídrido acético y ácido sulfúrico concentrado con temperatura, después de 30 min de reacción (Nollet, 1996). La intensidad de la coloración es medida por absorción en el espectrofotómetro a 620 nm. La intensidad tiene una relación lineal con la concentración de colesterol entre 100 y 600μg, se debe realizar una solución control de colesterol de diferentes concentraciones para realizar una comparación ( Kenny, 1952)
DETERIORO DE LIPIDOS.
 Acidez titulable La acidez titulable es una medida del contenido de ácidos grasos libres en una muestra. Su cálculo se basa en la masa molar de un ácido graso o una mezcla de ácidos grasos. Normalmente se mide por titulación directa en la disolución y con indicador visual. (Boekenoogen, 1964) R-COOH + KOH → R-COOK + H2O

 Determinación del Índice de Peróxidos. (Método volumétrico) Se define como los miliequivalentes (mEq) de peróxido por kilogramo de grasa. Es una determinación volumétrica de la cantidad de grupos peróxidos e hidroperóxidos. La cuantificación se basa en la reacción del yoduro de potasio con los peróxidos para liberar yodo, el cual es titulado con tiosulfato de sodio, empleando almidón como indicador (Nielsen, 1998). Las reacciones que se llevan a cabo son:
ROOH + KI (exceso) → ROH + KOH + I2
I2 + almidón + Na2S2O3 → 2NaI + almidón + Na2S4O6
(azul) (incoloro)
VII. BIBLIOGRAFIA
 Extracciones con Soxhlet. Carlos Eduardo Núñez. cenunez.com.ar. 2008
 http://dspace.universia.net/bitstream/2024/1067/1/ManualdeFundamentosyTecnicasdeAnalisisdeAlimentos_6501.pdf
 http://dspace.universia.net/bitstream/2024/1067/1/ManualdeFundamentosyTecnicasdeAnalisisdeAlimentos_6501.pdf
 KENNY A. P 1952, The Determination of Cholesterol by the Liebermann- Burchard Reaction, Biochemical Journal , 52(4): 611–619.
 NIELSEN S. (ed); Food Analysis Laboratory Manual; Kluwer Academic/Plenum Publishers, Nueva York, 2003.
 PEARSON. D; Técnicas de laboratorio para el análisis de alimentos; Acribia, S.A. Zaragoza (España) 1993.

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