1. UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA La Universidad Católica de Loja “Optimización de los Métodos de Recolección, Conservación y Extracción de ADN Nuclear a partir de Muestras de Excremento de Oso de Anteojos (Tremarctosornatus)” Autora: Antonia Germania Jiménez Coronel. Director: Blgo. Rodrigo Cisneros Vidal. Centro de Biología Celular y Molecular

2. INTRODUCCIÓN: El muestreo genético no invasivo. Poblaciones silvestres amenazadas. Peligro de extinción (Bosch et al., 2005). El análisis molecular mala y poca calidad de ADNn, el mismo que es difícil de amplificar (Nsubugaet al., 2004). 1g de heces puede tener grandes cantidades de ADN (Wasseret al., 1997).

3. JUSTIFICACIÓN: Proyecto de investigación a largo plazo. Estudio: diversidad y estructura genética. Resultados: protocolos óptimos Optimizar recursos. Estudio y conservación de esta y otras especies neotropicales en peligro de extinción. Colección y Extracción ADN Campo Laboratorio

4. MUESTREO NO INVASIVO DE ESPECIES ANIMALES SALVAJES. Pelos. Heces Orina. Plumas. % Amplificación. Contaminación frecuente. % Errores de genotipado con microsatélites (Taberlet et al., 1996, 1997 y 1999; Goossens et al., 1998 y Piggottet al., 2004). Conservación y manejo de especies en peligro de extinción (Piggott y Taylor, 2003). Detección y recuento de especies raras y amenazadas (Paetkau 2003 y Waits 2004). La identificación : especies. género. individual (Waits and Paetkau 2005). Manipulación Captura Observación Rara Difícil procedencia

5. EXTRACCIÓN DE ADN: Extracción de ADN de pelo: raíz (células del folículo). trampas (pelo fresco) Extracción de ADN de heces: (estudio de mamíferos salvajes) células epiteliales descamadas del lumen del intestino. Microorganismos Restos de comida no digeridos Enzimas digestivas Moco Sales biliares Bilirrubina Polisacáridos de plantas Escaso y degradado

6. FACTORES LIMITANTES DEL ÉXITO EN ESTUDIOS CON ADNn OBTENIDO DE MUESTRAS FECALES. La utilidad del ADN fecal depende: (a) Longitud/número de copias ADN extraer y amplificar. (b) Confirmación ADN amplificado obtenido. (c) Eliminación de los contaminantes. (d) Degradación de la muestra: laboratorio - campo. (e) Remoción de inhibidores dieta. Cantidad. Calidad. Tiempo Condiciones ambientales Dieta Método: Preservación Extracción

7. Degradación de ADN: Lesiones en el ADN: Pérdida Alteración Rotura de hebras. Pirimidinas ligadas. Fragmentos de desoxirribosa. Cruzamiento de hebras. Radicales de O2. Desnaturalización. Deleciones. Inserciones. bases Humedad Oxidación pH P mecánica Tº Contaminantes Hidrólisis

8. Errores comunes en el genotipado con ADN obtenido de muestras fecales: Alelo: Marginado Falso Múltiple Fuente: (Waits y Paetkau, 2005).

9. MARCADORES MOLECULARES (Microsatélites) Y SU UTILIDAD EN GENÉTICA POBLACIONAL. º Polimorfismo. Herencia: mendeliana simple. Codominantes (heterocigotos /homocigotos). Fáciles de medir y analizar. Confiabilidad: 100%. Repetitivos y automatizables. Regiones no codificantes uniformemente. Presencia de muchos alelos. Patrón de mutación. Poder discriminatorio entre individuos. Alelos nulos. Análisis de parentesco. Homoplasia. + -

10. OBJETIVOS: GENERAL: Optimizar la concentración de ADNn extraído de las muestras de excremento de oso andino (Tremarctosornatus). ESPECÍFICOS: Determinar la influencia del tiempo de recolección de las muestras en la concentración de ADNn. Establecer la eficacia de los métodos de conservación de ADNn de excremento de oso andino. Validar y mejorar los métodos convencionales de extracción de ADNn de excremento de oso andino. Verificar de forma cualitativa la concentración de ADNn de oso de anteojos a partir de muestras con productos amplificados.

11. METODOLOGÍA: Recolección Muestras: 10ml 3 tratamientos conservación/pre-extracción: EOH-C (4:1) 5 000 rpm x 30 min. EOH-H (4:1) 200 ul Buffer DETs-H(4:1) Experimento de Experimento de Exposición al Ambiente: Conservación: EOH-H EOH-C DETs-H Etanol 99,9% Buffer DETs 7 Repeticiones 1 Semana D 0 Tº ambiente 1 Mes D 7 2 Meses D 14 D 21

12. Muestra Lavada Páramo Parque Nacional Podocarpus Muestra Secada Diseño de Parcela

13. Extracción de ADNn: “Stool mini kit de Qiagen”. Amplificación de ADNn:“Multiplex PCR kit de Qiagen”. BOX MJ BOX MJ G1OB G10O G10X Mu23 Mu50 G10M G1OJ G10P G10H CXX20

15. DISENO EXPERIMENTAL:1. Experimento de exposición al ambiente.

16. 2.Experimento de Conservación:

17. RESULTADOS Y DISCUSIONES: EOH-H EOH-H EOH-C EOH-C BUFER BUFER

18. EOH-H EOH-C BUFER EOH-H EOH-C BUFER

19. Visualización del patrón de bandas y correspondencia genotípica: MJ Genotipo del Oso Macho (Augusto) G10H (235/235) G10M (219/219) G10P (148/148) CXX20 (132/132) G10J (100/100) BOX Genotipo del Oso Hembra (Nacha) G10O (179/179) G10B (157/157) Mu23 (111/113) Mu50 (105/109)

20. Experimento de Exposición al ambiente: ANOVA: Prueba TUKEY:

21. Experimento de Conservación: ANOVA: Prueba TUKEY:

24. GRACIAS