Este documento presenta un resumen del seminario sobre la técnica de RTqPCR realizado en 2012. Describe las diferentes etapas de un experimento de RTqPCR, incluyendo la definición de la técnica, la terminología asociada, el flujo de trabajo con etapas como el diseño experimental, la preparación y extracción de muestras, la transcripción reversa, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y la validación y análisis de los resultados. El documento proporciona información fundamental sobre esta importante técnica de biolog

1. Programa del Seminario RTqPCR-
2012
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 qPCR Workflow
 Validación de un ensayo de qPCR
 Servicio de qPCR en la UCTS
 Bibliografía muy recomendada

2. Definición de la Técnica
PCR en tiempo real o qPCR o RT-qPCR
UNG
A G CU
T (opciona
Taq Ácido Tampón de l)
polimeras nucléico Cebadores dNTPs reacción
a
ROX
Agentes Sonda
R Q Termociclador
intercalantes
con sistema de detección
http://www.appliedbiosystems.com/support/apptech/#rt_pcr

3. Definición de la Técnica
PCR Convencional RT-qPCR
 Semi-cuantitativa:  Cualitativa y cuantitativa.
 Rango dinámico pequeño ›2 logs Cuantificación Absoluta
 Baja Precisión; baja resolución y A tiempo real
(fase exponencial) Cuantificación Relativa
poco Sensible.
 Manipulación post-PCR .
A tiempo final Plus/Minus
 Baja Resolución
(fase plató) Discriminación Alélica
 No-automatización
 Discriminación basada sólo en
tamaño  Elevado rango dinámico de
 Los resultados no están detección
expresados en números.  Capaz de detectar cambios 2-fold.
 El BrET no es muy cuantitativo  No requiere procesado post-PCR

4. Programa del Seminario RTqPCR-2012
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 qPCR Workflow
 Validación de un ensayo de qPCR
 Servicio de qPCR en la UCTS
 Bibliografía muy recomendada

5. Terminología asociada a qPCR
Escala semi-
logarítmica
a l Plató
Line
ial
Fluorescence
nc
ne
Rn
Log
po
Threshold
Ex
Baseline
Ct value= 15.5
Cycle Number

6. Terminología asociada a qPCR
ROX (6-carboxy-X-rhodamine) como referente pasivo
+ ROX - ROX
Desv St= ± 0.306
Desv St= ± 0.059
Δ Rn
Ciclos Ciclos
Fluoróforo referente pasivo más comúnmente utilizado
para normalizar la fluorescencia específica en instrumentos de ABI y
Stratagene.

7. Terminología asociada a qPCR
Aplicaciones 3´oligo
5´oligo
RTqPCR
Proteína
Tejido Target
mRNA
miRN
Célula RNA A
Eucariota ncRN
A
siRNA
Análisis en Células Stem Validación Microarrays
saRN
Análisis en célula Única
A
CNA
SNP
DNA
Bacteria CNV
Micoplasma Mutaciones
Patógenos en la comida Virus Análisis
Metilación

8. Programa del Seminario RTqPCR-2012
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 qPCR Workflow
 Validación de un ensayo de qPCR
 Servicio de qPCR en la UCTS
 Bibliografía muy recomendada

9. qPCR Workflow
Slope= -1.365
Slope= -2.276

10. qPCR Workflow

11. qPCR Workflow
DNA
Muestra Producto
RNA cDNA
Amplifica
do
Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis
qPCR
Experimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico

12. qPCR Workflow: Diseño
experimental
DNA
Muestra Producto
RNA cDNA
Amplifica
do
Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis
qPCR
Experimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico
 Definir el experimento y los grupos control
 Número muestras de cada grupo
 Réplicas Experimentales (Biológicas y Técnicas)
 Distribución de placa (genes vs muestras)

13. qPCR Workflow: Diseño
experimental
Diseño experimental

14. qPCR Workflow: Diseño
experimental
RÉPLICAS
BIOLÓGICAS
TÉCNICAS

15. qPCR Workflow: Preparación de la
muestra
DNA
Muestra Producto
RNA cDNA
Amplifica
do
Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis
qPCR
Experimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico
 Descripción de la muestra (Microdisección o macrodisección)
 Manipulación (si congelación o FFPE; cómo, que y cuando)
 Condiciones de almacenamiento

16. qPCR Workflow: extracción de ác.
nucléicos
DNA
Muestra Producto
RNA cDNA
Amplifica
do
Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis
qPCR
Experimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico
 Método de extracción
 Tratamiento con DNasa
 Calidad (Pureza & Integridad) & Cantidad
 Almacenamiento (-80ºC)

17. qPCR Workflow: extracción de ác.
nucléicos
Como afecta el método de extracción de RNA a los resultados qPCR

18. qPCR Workflow: extracción ác. nucléicos
 PUREZA: Libre de contaminación por:
 Proteínas, sales caotrópicas y fenoles (Absobancia A260/A280 >1.8-2.0; A260/A230=2)
 gDNA (Tratamiento con DNAsa
 Inhibidores (SPUD assay (Nolan, 2006)
 INTEGRIDAD: No degradado
 rRNA (28S:18S=2:1)
 RIN (Fleige & Pfaffl, Mol. Aspects Med. 27(2006): RIN › 5)
 PCR test: Ensayo 3´:5´(alrededor de 1 indica elevada integridad; ›5 degradado)
 CANTIDAD: Usar el mismo método de cuantificación en muestras que se quieren comparar.
(Expert Rev. Mol. Diagn. 5, 493-498 (2005))
do
da t o
ra c
Deg Inta
28S
18S
2:1

19. qPCR Workflow: extracción ác. nucléico
RT
FT-80ºC
-20ºC
4ºC FT-20ºC 4ºC
RT -20ºC FT-80ºC
FT-20ºC

20. qPCR Workflow: extracción ác. nucléicos
Inhibición de la RT-qPCR en qué muestras
 Material de partida:
 Muestras fecales
 Cartílago, hígado. Córnea, etc...
 Sangre total: heme
 Anticoagulante: Heparina
 Causada por el método de extracción/protocolo erróneo:
 Etanol en el eluido por una insufiente centrifugación en el
segundo lavado puede inhibir las reacciones de RT y qPCR
 cDNA o gDNA demasiado concentrado:
 Más del 10% de cDNA, gDNA en la qPCR inhibe la
reacción.

21. qPCR Workflow: extracción ác.
nucléicos
Como afecta la calidad del RNA a los resultados qPCR:

22. qPCR Workflow: extracción de ác.
nucléicos
http://biomedicalgenomics.org/RNA_quality_control.ht
ml

23. qPCR Workflow: Transcripción
Reversa
DNA
Muestra Producto
RNA cDNA
Amplifica
do
Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis
qPCR
Experimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico
Es la etapa mas variable de todo el proceso
 One-Step vs Two Step
 Cantidad de RNA y vol de reacción
 CDNA Priming
 Transcriptasa Reversa y concentración
 Pérfil Térmico
 Controles
 Réplicas

24. qPCR Workflow: Transcripción
Reversa
One-Step RT- Two-Step RT-PCR
PCR
RT
Descripción RNA cDNA
RT qPCR
RNA cDNA Amplicón qPCR
cDNA Amplicón
Minimiza tiempo de preparación y el Posibilidad de almacenar cDNA para la
riesgo de contaminación. cuantificación de varios tragets.
Pros
Menos Background en ensayos  Más eficiente porque se pueden usar
SYBRGreen Random primers y oligo(dT) a la vez.
Más flexible (Permite la optimización por
separado de ambas reacciones.
No es posible la optimización por
separado de ambas reacciones
Contras
AmpErase UNG, para prevenir
contaminación, no se puede usar
Elevado Background en ensayos
Menos sensible debido a la menor SYBRGreen
eficiencia de la actividad RT de la
polimerasa
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

25. qPCR Workflow: Transcripción
Reversa
cDNA Priming

26. qPCR Workflow: qPCR
DNA
Muestra Producto
RNA cDNA
Amplifica
do
Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis
qPCR
Experimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico
 Diseño Amplicón y Oligonts.
 Reactivos, Instrumento, Perfil Térmico .
 Validación (Especificidad, Eficiencia,
Reproducibilidad, Rango dinámico
lineal).
 Controles
 Estrategia de Normalización

27. qPCR Workflow: qPCR
MFOLD
 Las secuencias de los oligonts y del
amplicón tienen que ser únicas.
 No deben tener estructuras
secundarias.
 Los oligonts no deben amplificar DNA Efecto de la Tª de anillamiento sobre la estructura
secundaria del amplicón: El análisis de la secuencia del
(diseño en la zona exon/exon) amplicón mediante el MFOLD predice elevada estructura
secundaria a 60ºC y baja a 65ºC.
 Idealmente, deberían testarse dos Amplicón
parejas de oligonts.  75-150 bp.
 50-60% contenido en GC.
Oligonts
 TM= 55-65ºC.
 50-60% contenido en GC.
 Evitar homopolímeros, sobretodo
de G.
 Los 5 nts en el extr3¨no deben ser
más de 2 G y/o C.

28. qPCR Workflow: qPCR
 Aplicación
 Método de Normalización
 Química de detección:
 Sondas específicas marcadas con fluorocromos
 Agentes Intercalantes
 Fluorocromos unidos a primers
 Reactivos:
 Core kit vs Master Mix
 dNTPs/dUTPs y UNG enzyme
 ROX como referente pasivo
 Termociclador:
 Formato
 Número de canales de detección
 Software de análisis
 Duración del programa
 Precio y flexibilidad de la oferta

29. qPCR Workflow: qPCR
Perfil térmico qPCR que incluye paso de Activación UNG
1.- Activación UNG
2.- Activación Taq y desnaturalización UNG
3.- Desnaturalización del dsDNA
4.- Anillamiento y extensión primers

30. qPCR Workflow: qPC
Estrategias de Normalización qPCR
 Normalización respecto a la masa total de RNA exraído
(chequeo calidad –RIN, moleculas/ng RNA)
 Normalización respecto al volumen/masa de la muestra
( moléculas/mg tejido; moléculas/ml sangre)
 Normalización respecto al número de células
( moléculas/célula)
 Normalización respecto a un gen endógeno no regulable
(GAPDH, tubulina, actina, albúmina, ciclofilina, micro-globulina, histonas, rRNA, ……)
 Normalización respecto a más de un gen endógeno (›3)
 geNorm (Vandesompele et al. 2002. Genome Biology)
 BestKeeper (Pfaffl et. Al. 2004; Biotechnology Letters 2004)
 Normfinder
 Statistical modeling for selecting houskeeper genes (Szabo et al.2004, Genome
Biology)
Genes and Immunity (2005) 6, 279-284.
Review
BMC Bioinformatics 2009, 10:110

31. qPCR Workflow: qPC
Genes de Referencia
 Los genes de referencia tienen que:
 ser de expresión constante
 No ser regulados por las diferentes condiciones experimentales
 Suficientemente abundantes entre los diferentes tejidos y tipos celulares.
 Se recomienda el uso de al menos 3 genes de referencia para la normalización de
datos de qPCR.
 EL gen de referencia “Perfecto” NO existe.
Softwares: genNorm
Normfinder

32. qPCR Workflow: qPC
 Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes placas, la inclusión de una
muestra calibradora o curva estándar en cada placa es un control importante
para medir la variabilidad inter-ensayo.
 Duplicados técnicos son generalmente suficientes (Triplicados si Cts›35). Si las
réplicas difieren ›0.5 Ct, las reacciones deberían repetirse. Son más importantes
los duplicados biológicos.
 Incluir Controles negativo (NTC) y positivos. Cargar el NTC en el pocillo que esté
más distanciado de aquel que contenga mayor concentración de cDNA para
evitar contaminación cruzada.
 Preparar mezcla de reacción de pcr en laboratorio diferente de donde se
manipule el cDNA.
 Es siempre mejor no esperar demasiado en correr un run de qPCR después de la
preparación de la placa. Si necesitas comparar dos placas idénticas con diferente
ciclo de temperaturas, es mejor prepararlas al mismo tiempo, y guardar una de
ellas a 4ºC protegido de la luz hasta 10 horas.
 Especial atención en el sellado de la placa para evitar evaporaciones y evitar
marcas y huellas en la parte superior del cobertor/tapa.
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
Real-Time PCR Aplications Guide from Bio-Rad

33. Programa del Seminario RTqPCR-2012
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 qPCR Workflow
 Validación de un ensayo de qPCR
 Servicio de qPCR en la UCTS
 Bibliografía muy recomendada

34. qPCR Workflow: Validación de un ensayo de qP
 Reproducibilidad (viene indicada por las réplicas)
 Controles qPCR
NEGATIVOS
 NTC (Non Template Control) Detección de dímeros de primers y contaminación
 NAC (Non Amplif. Control) Detección de degradación de sondas
 No RT (No RT control) Detección de contaminación por DNA genómico
POSITIVOS
 Control Endógeno Testado de la calidad de los reactivos. Usado también para
normalizar.
 Control Exógeno Testado de la calidad de los reactivos
 Spiking Control Detecta presencia de inhibidores
 Curva de Disociación (SYBR Green)
 Curva Estándar
 Linealidad de los datos
 Distancia entre las curvas de amplificación
 Eficiencia de amplificación

35. qPCR Workflow: Validación de un ensayo de qP
Eficiencia Convertir E en
Pendient Amplificación Porcentaje
Curva e
(E= 10-1/slope) %E= (E-1)100%
Estándard:
-3,0 2,2 115
R2 ›0.98 o r › 0.99
-3,1 2,1 110
Slope= -3.73
-3,2 2,1 105
-3,3 2,0 101
-3,32 2,0 100 OK
-3,4 2,0 97
-3,6 1,9 90
-3,7 1,9 86
-4 1,8 78
2n=Factor de
dilución
Factor
n=LG(Factor
Dilució
Dil.)/LG(2)
n
2 1,00
5 2,32
10 3,32

36. qPCR Workflow: Validación de un ensayo de qP
Eficiencias del Gen Target vs Eficiencia gen
EC
Slope
R2
(Ct gen Target – Ct gen Endógeno)
Y = 0.0471x + 3.0178
R2 = 0.2315
ΔCt=
Log Diluciones

37. qPCR Workflow
DNA
Muestra Producto
RNA cDNA
Amplifica
do
Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis
qPCR
Experimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico
UEB

38. Programa del Seminario RTqPCR-2012
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 qPCR Workflow
 Validación de un ensayo de qPCR
 Servicio de qPCR en la UCTS
 Bibliografía muy recomendada

39. Servicio de RTqPCR en la
UCTS
7000 SDS 7900HT Fast SDS LightCycler 480
Tiras de 8 Tubos
Formato
Microfluidicas Placas-384 White Plates-384
Placas-96
(Arrays de baja densidad)
Ref. Pasivo ROX Ninguno
ROX
Formato 384-p: FAM, TAMRA, Filtros/canales detección:
Química FAM, TAMRA, VIC, VIC, JOE, NED, SYBR, ROX, TET.
JOE, NED, SYBR, ROX 500, 533, 568, 610, 640, 670
Formato LDA: FAM, VIC, ROX. nm
mode 9600 Emulation/Standard Fast
9600 Emulation /Standard
Fast
Softwares V1.2.3f2 con RQ study SDS 2.4.1
RQ Manager 1.2 SW 1.5
Primer Express 2.0

40. Servicio de RTqPCR en la
UCTS
Elección en el software del ensayo a realizar
Software qPCR Plantilla para el Run Análisis
1.-Absolute Quantification Absolute Quantification
(Standard curve) (Standard curve)
7000 SDS de ABI
2.-Relative Quantification
Relative Quantification
7000 SDS 1.1 RQ Study (ddCt) Plate (ddCt) Study
7900 SDS de ABI 1.- Standard Curve (AQ)
2.- ΔΔCt
LighCycler480

41. Servicio de RTqPCR en la
UCTS
LightCycler 480 II

42. Programa del Seminario RTqPCR-2012
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 qPCR Workflow
 Validación de un ensayo de qPCR
 Servicio de qPCR en la UCTS
 Bibliografía muy recomendada

43. Direcciones de interés relacionadas con
qPCR
http://qpcr.gene-quantification.info/
http://genex.gene-quantification.info/
http://www.horizonpress.com/pcr/qPCR-
machines.html
qPCR-Technical-Guide.pdf (Sigma Life Science)
http://www.eurogentec.com
http://www.dorak.info/genetics/glosrt.html

44. Gracias