1. Institut de Recerca
Hospital Universitari Vall d’Hebron
Institut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)
Tecnologies d’alt
rendiment
a l’ucts. Conceptes i
anàlisi de dades
28/11/12 – 05/12/12
Ricardo Gonzalo Sanz

2. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN la ucts.conceptos y análisis de datos
DIA 1. 28 de Noviembre. 10-14:00
Microarrays. Ricardo Gonzalo Sanz
Analisis de resultados de microarrays. Alex Sanchez
RTqPCR. Paqui Gallego
Análisis de resultados de RTqPCR. Jose Luis Mosquera
DIA 2. 5 de Diciembre. 10-14:00
Ultrasecuenciación. Paqui Gallego y Rosa Prieto
Analisis de resultados de Ultrasecuenciación. Alex Sanchez
Zeptosens. Paqui Gallego
Análisis de resultados de Zeptosens. Ferran Briansó
Hoja de asistencia. Certificado asistencia
Encuesta satisfacción.

3. Esquema
ARRAYS AFFYMETRIX
•Tipos
•¿cómo están hechos?
MATERIAL DE PARTIDA: RNA
•Calidad (Bioanalyzer/RIN)
•Cantidad (Kits amplificación)
EXPERIMENTO DE MICROARRAYS
•Procedimiento de amplificación / detección
•GeneTitan
•Controles de calidad

4. Esquema
ARRAYS AFFYMETRIX
•Tipos
•¿cómo están hechos?
MATERIAL DE PARTIDA: RNA
•Calidad (Bioanalyzer/RIN)
•Cantidad (Kits amplificación)
EXPERIMENTO DE MICROARRAYS
•Procedimiento de amplificación / detección
•GeneTitan
•Controles de calidad

5. Tipos de microarrays
Según lo que interrogan: DNA ANALYSIS ARRAYS RNA ANALYSIS ARRAYS
•SNPs •3’IVT
•Resequencing •Gene/Exon arrays
•Citogenética •miRNA
•Chip on chip •FFPE
Según el formato:
Cartucho individual
Placa de 16/24/96

6. Tipos de microarrays.DNA
DNA ANALYSIS ARRAYS
•Genome-Wide SNP Analysis GW Human SNP array 6.0
? 1.8 M marcadores genéticos (900.000 SNP + 900.000 CNV)
•Resequencing Arrays Human Mitochondrial array
“Custom” resequencing arrays
•Citogenética CytoScan HD Array
Dna copy number (ganancias/pérdidas), LOH, disomia uniparental, SNPs

7. Tipos de microarrays. DNA
DNA ANALYSIS ARRAYS
• ChiP-on-Chip: Estudio de interacciones entre DNA y proteínas y
modificaciones del DNA, ej.
 Sitios de unión de factores de transcripción
 Sitios de unión de histonas
 Metilación del ADN

8. Tipos de microarrays. RNA
EXPRESSION ANALYSIS ARRAYS
•3’IVT
5’ 3’
•Detección sesgada (buena cola polyA, buen extremo 3’)
•Muchas especies representadas
•Arrays más clásicos
Human U133 Plus 2.0 Prime View Array
(Unigene database 133) (Unigene database 219)

9. Tipos de microarrays. RNA
EXPRESSION ANALYSIS ARRAYS
Exon Arrays
5’ 3’
Gene Arrays
Exon Arrays Human, Mouse, Rat Exon 1.0 ST Array
Gene Arrays Human, Mouse, Rat, CHO, Porcine, Canine … Gene 1.0 ST Array
Human/Mouse/Rat/CHO Gene 2.0 ST Array
•Librería actualizada (RefSeq 36 51)
•Incluye sondas para detección long intergenic no-coding RNA transcripts (lincRNAs)

10. Tipos de microarrays. RNA
miRNA GeneChip miRNA 3.0 Array
•153 organisms in the array (human, mouse, rat, canine, ….)
•100% miRBase v17
•2.216 snoRNAs and scaRNAs (human small nuclear RNAs)
•Low inputs amounts (130 ng total RNA)
•2.999 probe sets unique to pre-miRNA hairpins
•Interroga de forma independiente pre-miRNAs y maduros
•También útil para muestras de FFPE

11. Tipos de microarrays. RNA
ALMAC XCEL ARRAY
•Tipo química 3’IVT
•Especialmente diseñado para muestras de FFPE. Muy problemáticas (calidad RNA baja, modif químicas,…)
•Diseño de kit “a medida” (Sensation Plus FFPE kit) 20 ngr
•Kits de extracción RNA (FormaPure BeckmanCoulter, RecoverAll LifeTech, Rneasy Qiagen,…)
•70% equivalente a HgU133 Plus 2.0
•8% información mejorada que no está en HgU133 plus2.0
•22% sondas derivadas de secuenciación de muestras de cáncer
OncoScan
•De momento es un servicio. En breve un array de catálogo.
•Especialmente diseñado para muestras de FFPE. Muy problemáticas (calidad RNA baja, modif químicas,…)
•75 ngr de DNA
•Información sobre cambios en número de copias, SNPs y LOH.
•Permite integración datos con expresión y miRNAs

12. Tipos de microarrays.
Human Transcriptome Array (HTA)
•Arrays todavía no en catálogo. Se pueden pedir a través de “core facilities”. Finales 2012.
•Más adecuado que Exon arrays (solamente 20% de la información está basada en datos bien
contrastados). Falsos positivos

13. Tipos de microarrays.

14. ¿Cómo están hechos? (I). Fotolitografía

15. ¿Cómo están hechos?

16. ARRAYS AFFYMETRIX
•Tipos
•¿cómo están hechos?
MATERIAL DE PARTIDA: RNA
•Calidad (Bioanalyzer/RIN)
•Cantidad (Kits amplificación)
EXPERIMENTO DE MICROARRAYS
•Procedimiento de amplificación / detección
•GeneTitan
•Controles de calidad

17. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
MATERIAL DE PARTIDA RNA TOTAL
Poli A mRNA
Células eucariótas QIAGEN
EXTRACCIÓN
Tejido TRIZOL
CALIDAD BIOANALYZER CANTIDAD

18. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (I): BIOANALYZER

19. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (II): BIOANALYZER

20. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (III): BIOANALYZER. Cálculo de la concentración
RNA Area: 192.0
RNA Concentration: 150 ng/µl
Result Flagging Color: 255
Result Flagging Label: Bad RNA quality
RNA Area: 155.7
RNA Concentration: 122 ng/µl
rRNA Ratio [28s / 18s]: 1.6
RNA Integrity Number (RIN): 8.5 (B.02.08)
Result Flagging Color: 65280
Result Flagging Label

21. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (IV): BIOANALYZER. Cálculo de la concentración
Not all expected ladder peaks have been found. You
should try to modify peak find settings or add peaks
using manual integration.
Issue with ladder peak detection. Please check
ladder.
RNA Area: 1,653.2
RNA Concentration: 50,101 pg/µl
rRNA Ratio [28s / 18s]: 1.3
RNA Integrity Number (RIN): 7.7 (B.02.08)
Result Flagging Color: 65280
Result Flagging Label: Good RNA quality

22. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
BIOANALYZER
Chips disponibles:
RNA Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent 2100 Small RNA Kit
DNA Agilent DNA 1000 Kit Agilent DNA 7500 Kit Agilent DNA 12000 Kit Agilent High Sensitivity DNA Kit
PROTEINAS Agilent Protein 80 Kit Agilent Protein 230 Kit High Sensitivity Protein 250 Kit
CÉLULAS Agilent Cell Kit

23. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (III): RNA INTEGRITY NUMBER
0 ≤ RIN ≤ 10

24. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (IV): RNA INTEGRITY NUMBER

25. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (V): RNA INTEGRITY NUMBER
?
¿qué RIN es el más adecuado?
¿hasta que RIN se puede utilizar?
¿se pueden mezclar diferentes RIN?
RIN 5.0 RIN 8.0

26. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (VI): TIPO DE MUESTRA
• kits especiales extracción RNA
• extracción “genes globina”
• no trabajar con sangre total
• HABLAR CON NOSOTROS ANTES

27. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CANTIDAD RNA
• 3’ IVT ARRAYS 200 ng / 3 µL
• Exon/Gene ARRAYS 200 ng / 3 µL
• NUGEN 500 pg / 5 µL
• miRNA 130ng / 8 µL

28. ARRAYS AFFYMETRIX
•Tipos
•¿cómo están hechos?
MATERIAL DE PARTIDA: RNA
•Calidad (Bioanalyzer/RIN)
•Cantidad (Kits amplificación)
EXPERIMENTO DE MICROARRAYS
•Procedimiento de amplificación / detección
•GeneTitan
•Controles de calidad

29. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
PROCEDIMIENTO (I)
3’IVT EXPRESS
TTTTT AAAAAA
IVT
AAAAAA
TTTTTTT
RNA (150 ng) O/N cRNA (≈ 40 µg)
RNA-cDNA dscDNA
EXON/GENE
NNNNN IVT NNNNN
RNA (150 ng) O/N
RNA-cDNA dscDNA cRNA ssDNA (7 µg)

30. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
PROCEDIMIENTO (II)
NUGEN
NNNNN SPIA
TTTTT
RNA (500 pg) RNA-cDNA dscDNA ssDNA (8 µg)
miRNA
Biotin-labeled 3DNA
ATP
AAAAAA AAAAAA
RNA (130 ng) Biotin-labeled RNA

31. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
PROCEDIMIENTO (III)
3’IVT EXPRESS EXON/GENE NUGEN miRNA Resequencing
Fragmentación
O/N

32. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA

33. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Y ESTO SOLO ACABA DE EMPEZAR…
.CEL
UEB

34. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
DIFERENCIAS ENTRE LOS KITS
3’ IVT Exon/Gene NUGEN
O oligo dT NNN oligo
dT + NNN
cRNA ssDNA ssDNA
15 µg 5.5 µg 5 µg
NO MEZCLAR DIFERENTES PROTOCOLOS DE AMPLIFICACIÓN
EN UN MISMO PROYECTO…

35. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
GENETITAN (I)

36. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
GENETITAN(II)
• Formato placa: 16, 24, 96 arrays

37. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
GENETITAN(III)
• Formato placa: 16, 24, 96 arrays
 mayor high throughtput
reducción del tiempo de procesado
 disminución de costes
 mayor reproducibilidad (disminución de efecto batch)
 Formato cerrado (16, 24, 96)
 No todos los tipos de especies, tipo de array representados

38. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CONTROL DE CALIDAD (I)

39. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CONTROL DE CALIDAD (II)

40. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CONTROL DE CALIDAD (III). cRNA Puricado

41. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CONTROL DE CALIDAD (III). cRNA Fragmentado