Método Elisa

1. ELISA
Guia de Aula Prática
Rita Maia

2. Fundamentos da Técnica
• Definição:
Método que combina a especificidade de um
anticorpo com a sensibilidade de um ensaio
simples enzimático.
• Princípio:
Reação Antígeno-Anticorpo

3. Fundamentos da Técnica
• Componentes:
Anticorpo ou Ag ligado
Enzima ativa
Substrato
Produtos solúveis (cor)
Antigen
Serum Ab
2 Enzyme-linked Ab

4. Fundamentos da Técnica
Enzima Substrato Cor
Fosfatase alcalina P-nitrofenil-fosfato (pNPP) Amarelo
Peroxidase ABTS Verde
Peroxidase OPD Laranja
Peroxidase TMB Azul
Comuns: enzimas que convertem um substrato sem cor num
produto de cor

5. Tipos de ELISA
1. Direto

6. Tipos de ELISA
2. Indireto 3. Sanduíche

7. Tipos de ELISA
5. Multiplex4. Competitivo

8. Uso Diagnóstico
• Identificar se o animal está com a doença:
 Presença do patógeno - Ag
 Título do mesmo
• Determinar se o animal tem Ac:
 Teve a doença (IgM, IgG ou IgA)
 Se está protegido:
 Título de anticorpos (vacina ou exposição)

9. Muito utilizado: Titulação
O Que é?
Titulação é um método para testar a diluição serial de uma amostra (ex. soro)
Como funciona?
Determina a quantidade relativa de Ac na diluição serial de uma amostra
Quais testes sorológicos podem utilizar titulação ?
Immunofluorescência
Aglutinação
Fixação do Complemento
Soro Neutralização
Inibição da Hemaglutinação

10. Como interpretar?
A maior diluição em que o anticorpo ainda consegue ser detectado é o Título de
Anticorpo
Como diferenciar doença de saúde ?
Incubação Aguda Convalescente
Time post-infection (weeks)
Título
Específico
de
Anticorpos
Controle negativo: soro antes da exposição
Reação positiva: duas vezes a absorbância
do controle negativo
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64

11. Método direto: sem título
• Utiliza-se a amostra sem diluições
• Adiciona-se os reagentes
• Faz-se a leitura

12. Para coletar a amostra:
-Ajusta o colume desejado
-Pressiona até atingir a primeira parada
-Libera lentamente até voltar totalmente à
posição inicial
Para liberar a amostra:
-Pressiona até passar da primeira parada e
sentir a segunda parada
Método: A Arte de Pipetar

13. Resumo da Prática em Grupo
1. Definir grupos;
2. Ir ao laboratório de Viroses;
3. Adicionar o anticorpo primário;
4. Adicionar anticorpo secundário;
5. Fazer leitura no leitor.

14. Prática

15. Protocolo da Prática
Controle (+)
Controle (-)
Cut off (CO)
Amostra
Incube por 30 minutos
37o C
Transfira 100uL
de cada controle
CO e amostra
para cada poço
Misture bem
Adicione 10uL
de cada amostra em
seu tubo respectivo
Adicione 1.000uL
do diluente
(serum diluent)
em cada tubo
Marque tubos
de diluição
Determine os
poços da sua equipe
Lembrem-se de Trocar as ponteiras
Lembrem-se de Trocar as ponteiras

16. Protocolo da
Prática
Cubra a placa
e incube mais
30 minutos
37oC
Adiciona 100uL
Conjugado HRP
anti-IgG-humano
em cada poço
Lave 6 vezes
com Wash Buffer
Após incubação
Lavagem: coloca o líquido com a Piceta e
remove invertendo a placa de uma só vez.
Na última vez, inverta a placa e bata con firmeza
sobre papel para remover excesso de liquidos

17. Adicione 100uL
Stop Solution
em cada poço
Formará uma
coloração AZUL
Incube 10 min
em T.A.
Adicione 100uL
TMB em cada
poço
Lave 6 vezes
com Wash Buffer
Protocolo da
Prática
Lavagem: coloca o líquido com a Piceta e
remova invertendo a placa de uma só vez.
Na última vez, inverta a placa e bata con firmeza
sobre papel para remover excesso de liquidos

18. Layout
•Utilize primeiro a placa re-utilizável para fazer a mistura inicial das amostras
•Só transfira para a placa de reação final quando for incubar
•Cada grupo utilizará uma fileira da placa com 8 poços
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H