卒業研究:小胞体モデル異常タンパク質△proに対するO型糖鎖付加の試験管内再構成 #卒論
- 2. 小胞体品質管理
リボソーム
mRNA サイトゾル
プロテアソーム
Sec61p Sec61p
タンパク質
小胞体
修復
異常タンパク質
正常タンパク質
ゴルジ体以降へ
- 3. 小胞体品質管理
小胞体関連分解
リボソーム (ERAD)
mRNA サイトゾル
プロテアソーム
Sec61p Sec61p
タンパク質
小胞体
修復
異常タンパク質
正常タンパク質
ゴルジ体以降へ
- 5. O型糖鎖付加
サイトゾル
in vivo in vitro
Sec61p Pmt
DGpaF ○ ○
Dpro ○
小胞体内腔
M:マンノース
異常タンパク質
- 6. O型糖鎖付加
サイトゾル
in vivo in vitro
Sec61p Pmt
DGpaF ○ ○
Dpro ○
小胞体内腔
M:マンノース
本研究の目的
モデル異常タンパク質
Dproを基質とした
ERAD/O型糖鎖付加の
異常タンパク質 in vitro再構成
- 7. in vitro ERAD / O型糖鎖付加 assay系
pDGpaF
ミクロソーム
Reference McCracken, A.A., and Bordsky, J.L. (1996). J. Cell Biol. 132, 291-298.
- 8. in vitro ERAD / O型糖鎖付加 assay系
pDGpaF
ミクロソーム pDGpaF
Sec61p
ミクロソーム
DGpaF
Reference McCracken, A.A., and Bordsky, J.L. (1996). J. Cell Biol. 132, 291-298.
- 9. in vitro ERAD / O型糖鎖付加 assay系
pDGpaF
ミクロソーム pDGpaF
Sec61p
ミクロソーム
DGpaF
サイトゾル
プロテアソーム
+ サイトゾル画分
+ ATP再生系
Reference McCracken, A.A., and Bordsky, J.L. (1996). J. Cell Biol. 132, 291-298.
- 10. in vitro ERAD / O型糖鎖付加 assay系
pDGpaF
ミクロソーム pDGpaF
Sec61p
ミクロソーム
DGpaF
ERAD
O型糖鎖付加
サイトゾル
プロテアソーム
Pmt
+ サイトゾル画分 30℃ MMM
+ ATP再生系 インキュベート
M:マンノース
Reference McCracken, A.A., and Bordsky, J.L. (1996). J. Cell Biol. 132, 291-298.
- 12. pDproの翻訳終了後の膜透過反応
トリプシン - + +
Triton X-100 - - +
min 0 10 30 60 0 10 30 60 0 10 30 60
pDpro
リボソーム
mRNA
pDpro pDpro
Sec61p
- 13. pDproの翻訳終了後の膜透過反応
トリプシン - + +
Triton X-100 - - +
min 0 10 30 60 0 10 30 60 0 10 30 60
pDpro
リボソーム
mRNA
pDpro pDpro
Sec61p
- 14. pDproの翻訳と共役した膜透過反応
トリプシン - + +
Triton X-100 - - +
min 0 10 30 60 0 10 30 60 0 10 30 60
pDpro
Dpro
リボソーム
mRNA
Sec61p
Dpro
- 15. Dproのin vitro ERAD / O型糖鎖付加 assay
野生株由来のミクロソーム
トリプシン - + +
Triton X-100 - - +
chase (min) 0 10 30 60 0 10 30 60 0 10 30 60
pDpro
Dpro
120
100
Dpro
Dproの存在量
80
スメアバンド
60
(%)
40
20
0 10 20 30 40 50 60 min
- 16. Dproのin vitro ERAD / O型糖鎖付加 assay
野生株由来のミクロソーム
トリプシン - + +
Triton X-100 - - +
chase (min) 0 10 30 60 0 10 30 60 0 10 30 60
pDpro
Dpro
120
合計量
100
Dpro
Dproの存在量
80
スメアバンド
60
(%)
40
20
0 10 20 30 40 50 60 min
- 17. Dproのin vitro ERAD / O型糖鎖付加 assay
Dpmt2株由来のミクロソーム
トリプシン - + +
Triton X-100 - - +
chase (min) 0 10 30 60 0 10 30 60 0 10 30 60
pDpro
Dpro
120
100
Dproの存在量
80 Dpro
60
(%)
40
20
0 10 20 30 40 50 60 min
- 18. 本研究のまとめ
1. in vitroにおいて、Dproを翻訳と共役した
膜透過反応によってミクロソームに
取り込ませることに成功した。
2. in vitroアッセイにおいても、Dproは
Pmt2p依存でO型糖鎖付加された可能性が
考えられた。
3. DproがERADでの分解が起こらなかったのは
in vitroでは、DGpaFの場合でもERADでの
分解効率が低く、O型糖鎖付加の方が進行
しやすいことと一致する。