Relatório referente às práticas de extração de DNA e eletroforese realizadas nos dias 18 e 25/8/2009, para o primeiro semestre do curso de Medicina na Universidade Católica de Brasília. Professora: Rosângela Vieira de Andrade

1. UNIVERSIDADE CATÓLICA DE BRASÍLIA
CURSO DE MEDICINA
BIOLOGIA CELULAR
RELATÓRIO
EXTRAÇÃO DE DNA E ELETROFORESE
MARIANA SANDOVAL, MARINA SOUSA DA SILVA, RAQUEL MATIAS DO
NASCIMENTO, REBECA ALEVATO DONADON
BRASÍLIA
2009

2. 1
MARIANA SANDOVAL, MARINA SOUSA DA SILVA, RAQUEL MATIAS DO
NASCIMENTO, REBECA ALEVATO DONADON
RELATÓRIO
EXTRAÇÃO DE DNA E ELETROFORESE
Relatório referente às práticas de
extração de DNA e eletroforese
realizadas nos dias 18 e 25/8/2009, para
o primeiro semestre do curso de
Medicina na Universidade Católica de
Brasília.
Professora: Rosângela Vieira de
Andrade
Brasília
2009

3. 2
Sumário
1. Introdução............................................................................................................................ 3
2. Material e Métodos .............................................................................................................. 6
2.1. Material ....................................................................................................................... 6
2.2. Métodos ...................................................................................................................... 7
3. Resultado e Discussão........................................................................................................9
4. Referências Bibliográficas................................................................................................. 10

4. 3
1. Introdução
A eletroforese foi inicialmente proposta por Arne Teselius (1937) como técnica
empregada para visualização de proteínas de acordo com as diferenças de
comprimento dos fragmentos de aminoácidos e cargas elétricas.1 A simplicidade e
rapidez da técnica impulsionaram seu aprimoramento e uso, atualmente, para
separar, identificar e purificar fragmentos de DNA.
A visualização do DNA por eletroforese baseia-se na carga negativa que os
fosfatos conferem ao DNA. Um gel é preparado com pequenos poços – utiliza-se um
pente antes de o gel secar – para a deposição do material. O gel é então submetido
a uma diferença de potencial elétrico. A presença da carga negativa deve ser
combinada com a adição de solução salina para maior eficiência na condução
elétrica. Posteriormente, há um deslocamento dos ácidos desoxirribonucléicos de
acordo com o tamanho das moléculas, as de menor massa apresentam maior
velocidade de migração enquanto que as de maior massa são mais lentas.1,2
Figura 1: Carga negativa apresentada pelo DNA devido ao
grupo fosfato.3
Os géis utilizados podem ser de agarose ou poliacrilamida. O gel de agarose,
utilizado nesta prática, apresenta maior extensão de separação quando comparado
ao de poliacrilamida, dessa forma é possível visualizar longos fragmentos de DNA.4

5. 4
A eletrofore se mostra mais eficiente para determinar fragmentos de DNA do que
outros processos como a centrifugação através de gradiente de concentração,4 e é
utilizada em testes de paternidade, identificação de criminosos e ainda, quando
combinada a outras técnicas como por exemplo enzimas de restrição possibilita à
indústria farmacêutica produção de vacinas, remédios e à agropecuária produção de
transgênicos.5
Esta prática combinou a extração do DNA de amostras sanguíneas de
crianças com leucemia linfóide aguda com a técnica da eletroforese a fim de
visualizar o DNA em luz ultravioleta.
As leucemias são doenças crônicas ou agudas em que as células-tronco dos
tecidos sanguíneos são incapazes de maturar-se normalmente e apresentam
replicação desregulada. As células do sangue acabam sendo substituídas por
células tumorais e a doença configura-se.6
A leucemia linfóide aguda é também conhecida como leucemia linfóide aguda
da infância, leucemia linfolítica e LLA. Caracteriza-se pelo crescimento incontrolável
e exagerado, além do acúmulo, de linfoblastos – os quais já não funcionam como
células normais – e pelo bloqueio da produção normal de células da medula, o que
gera uma deficiência de glóbulos vermelhos (anemia), plaquetas (trobocitopenia) e
glóbulos brancos (neutropenia). 7

6. 5
Figura 2: Comparação visual entre
as medulas ósseas de paciente
normal e paciente com LLA.7
A LLA ocorre em todas as idades, sabe-se que há maior frequência na
primeira década da vida e em indivíduos mais idosos.7 Em crianças há o melhor
prognóstico.8 O tratamento é prolongado, entre 2 e 3 anos, e sempre associado à
quimioterapia. A alta quantidade de estudos acerca da causa da LLA sugere que
fatores complexos estão envolvidos, a origem, entretanto, na maioria dos casos, não
é evidente.7
A. Aparência da
medula óssea
normal com seu
amplo conjunto
de formas de
células, que
representamo
desenvolvimento
normal das
células
B. A medula
substituída por
linfoblastos em
um paciente
com leucemia
linfóide aguda.
As células
normais não
são evidentes

7. 6
2. Materiale Métodos
2.1. Material
DNA: extração de DNA de célula dos elementos figurados do sangue de pacientes
com leucemia linfóide aguda.
Agarose: é um polissacarídeo que forma uma rede para segurar as moléculas
durante a migração e é utilizado na forma de gel para a eletroforese.
Solução tampão: foi utilizado o tampão preparado a partir de tris-acetato EDTA.
Sendo o pH desses tampões básico, o grupo fosfato é desprotonado, resultando em
uma carga líquida negativa induzindo a migração na cuba para o cátodo.Esse tipo
de tampão é utilizado quando queremos recuperar o DNA e quando a eletroforese é
de DNA grande tamanho(>12Kb).
Para a extração do DNA utilizamos a pipeta p200, para termos uma solução
de sangue e água destilada que colocamos em um tubo de eppendorf; esse tudo vai
para o Vórtex da marca Phoenix, que consiste em um instrumento para misturar
substancias em tubos ou frascos pequenos por meio de movimento circular com
operação contínua e possibilidade de mudar a freqüência da vibração. Após o
Vórtex, levamos o eppendorf para a centrifuga da marca Mini spin, que cria força
centrífuga girando os materiais rapidamente em torno de um pólo central, para isso
deve-se ter cuidado com o balanceamento de cargas , ou seja , a centrifuga deve
estar equilibrada, pois a agitação causada pelo desequilíbrio pode quebrar os tubos.
Após a adição de todos os reagentes (que serão descritos no tópico Métodos),
levamos a solução para o Banho –Maria da marca Nova técnica .

8. 7
Na eletroforese utilizou-se uma cuba eletrolítica da marca Hoefer, uma peça no
formato de um pente para delimitar os poços. Ainda utilizamos um béquer para
descarte de materiais e das ponteiras utilizadas nas pipetas.
2.2. Métodos
Primeiramente o DNA foi preparado, pipetando 300µLde sangue com 1000µL
de água destilada, essa solução foi colocada no Vórtex por 15 segundos para que
aconteça a quebra mecânica; logo após colocamos na centrifuga para que haja a
separação do plasma dos elementos figurados(pellet).
Adicionamos mais 1000µL de água destilada e levamos novamente para
centrifugação, adicionamos Buffer A(700µL) , Buffer B(500µL) ,SDS 10%(50µL) e
Proteinase K(10mg/ml) nesta ordem para haja a quebra da membrana e nuclear
colocando assim o DNA em suspensão, a proteinase K faz a quebra das histonas
deixando a molécula descondensada. Após a adição de todos esses reagentes
levamos a solução com apenas os elementos figurados para o Banho-Maria(65C)
por 10 minutos; depois desse processo adicionamos200µL NaCl(6M) que faz o
ataque à molécula deixando-a mais leve e suspendendo-a; os restos da célula
decantam.
Adicionou-se etanol, o qual reagiu com o NaCl, liberando o DNA, que
precipitou. O gel de agarose foi preparado com 0,5 g de agarose com a solução
tampão EDTA; essa solução foi levada para o aquecimento(microondas) fazendo
com que os polímeros fossem aquecidos para a formação da gelatina. Após a fusão
colocou-se brometo de etídio com o objetivo de fazer o material genético brilhar

9. 8
quando exposto à luz UV, pois ele intercala na molécula do DNA mas não a altera.
Com isso pudemos acompanhar a corrida do DNA pelo gel.
O endurecimento do gel já foi feito na própria cuba onde a corrida ocorreria.
Colocamos um pente no gel para criar poços, nos quais foram colocadas as
amostras. Ligou-se a cuba eletrolítica a dois pólos, criando uma diferença de
potencial; o DNA tem carga líquida negativa e por isso a molécula corre para o
ânodo (pólo positivo).
Para os devidos resultados comparamos os rastros das amostras extraídas,
com uma amostra padrão, neste caso, de vírus bacteriófago.

10. 9
3. Resultado e Discussão
A prática de eletroforese, discutida na introdução, consiste em criar uma DDP
entre os dois pólos opostos do gel em que será colocado o DNA, que possui carga
total negativa devido aos grupos fosfatos presentes em sua molécula. Sendo assim,
este irá migrar para o ânodo (pólo positivo). No início, achamos que a nossa
extração de DNA, grupo 10, não iria dar certo, pois havia pouco material (DNA
pouco concentrado). Sabendo disso, modificamos a etapa 22 de diluição – ao invés
de colocarmos 100uL de TE, colocamos 20uL.
Assim, todos os experimentos realizados por nossa turma - do grupo 7 ao 12
foi extraído DNA dos elementos figurados do sangue de pacientes com leucemia
linfóide aguda, já o grupo 12’ extraiu DNA do ovócito de uma passarinha, ou seja,
de um óvulo não fecundado, tendo o mesmo resultado dos outros grupos, como
pode ser observado na foto (Imagem 3) - tiveram bons resultados: o DNA migrou
como esperado. A extração do DNA e a eletroforese deram certo, pois todos os
materiais estavam devidamente limpos, a centrífuga calibrada e fomos bem
cuidadosos em colocar o DNA extraído no gel de agarose, não o deixando
extravasar muito.
Imagem3: Foto do gel de agorose sob luz UV. É possível a vizualização
de todas as amostras, ilustrando a eficiência da prática. A amostra 10,
destacada, refere-se a este grupo.

11. 10
4. ReferênciasBibliográficas
1. MARTINEZ, E. R. M e PAIVA, L. R. S. Eletroforese de ácidos nucléicos: uma
prática para o ensino da genética. < http://www.geneticanaescola.com.br/ano3vol
1/9.pdf> Acessado em 25 de setembro de 2009.
2. WIKIPEDIA. Eletroforese em gel. <http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_
em_gel> Acessado em 22 de setembro de 2009.
3. E-PORTEFOLEO.<http://e-porteflio.blogspot.com/2008/09/estrutura-do-dna.html>
Acessado em 25 de setembro de 2009.
4. TEXEIRA, A. B. Manual da aula prática de eletroforese para DNA. <
http://br.geocities.com/andbt/biofisica/Manual.PDF> Acessado em 25 de
setembro de 2009.
5. LABORATORIO DE BIOLOGIA. Enzimas de restrição e eletroforese. São Paulo,
2003. Trabalho de graduação. Instituto de Física de São Carlos. Universidade de
São Paulo. < http://educar.sc.usp.br/licenciatura/2003/siteprojeto/2003/6_enzima_
e_gel.pdf> Acessado em 25 de setembro de 2009.
6. THOMAS, C.L. Dicionário Médico Enciclopédico Taber. 17ª ed. São Paulo:
Manole, 2000. 2279 p.
7. ABRALE. Leucemia Linfóide Aguda. 1 ª ed. São Paulo, 2004. <
http://www.abrale.org.br/apoio_paciente/publicacoes/manuais/leucemia_linfoide_
aguda.pdf > Acessado em 22 de setembro de 2009.
8. MONTEIRA, I. M. U. Tratamento de leucemia linfóide aguda em meninas:
repercussões sobre o desenvolvimento puberal e crescimento. Campinas, 1994.
94 p. Dissertação de mestrado. Universidade Estadual de Campinas.