Protein engineering

Rekayasa protein adalah campuran menarik dari
pengetahuan :
Biologi Molekuler
Analisa Struktur Kimia Protein
Matematika
Ekonomi
Komputasi atau Bio Informatika
Biokimia
Dengan tujuan pengembangan protein untuk sesuatu
yang berguna atau berharga di bidang industri,
kesehatan, dsbnya.
REKAYASA PROTEIN

•Mengembangkan protein untuk sesuatu yang berguna atau
berharga di bidang industri, kesehatan, dll. dengan :
• Membentuk produk baru dari suatu campuran protein
• Merubah struktur atau sifat protein sehingga dihasilkan
perubahan pada produk protein dengan target struktur atau
sifat yang diinginkan.
• Merubah protein sehingga dapat diterjemahkan untuk
memberikan informasi dan aplikasi lain.
• Menganalisa sifat protein yang ada untuk aplikasi produk lain
• Meningkatkan kemampuan dan efisiensi penggunaan produk
untuk suatu produk
TUJUAN REKAYASA PROTEIN

Protein Engineering
Proteins with Novel Properties
Rational Protein Design Nature
Random Mutagenesis
REKAYASA PROTEIN

KEGIATAN REKAYASA PROTEIN :
 Peningkatan katalisis dengan substrat alami atau kofaktor
 Peningkatan katalisis dengan substrat nonnatural atau kofaktor
 Peningkatan katalisis di nonnatural pelarut
 Peningkatan ligan mengikat
STABILITAS PROTEIN:
• Peningkatan termostabilitas
• Peningkatan aktivitas pada pH alternatif
• Peningkatan aktifitas dalam kekuatan ion yang berbeda
• Peningkatan protein lipat
• Penurunan kerentanan terhadap proteolisis
• Farmakokinetik
REKAYASA PROTEIN

SIFAT-SIFAT LAIN:
 Menambahkan tag untuk memfasilitasi pemurnian
 Mengubah kecenderungan untuk polimerisasi
 Menambahkan tag untuk memvisualisasikan lokalisasi
 Merekayasa mengikat situs alosterik
 Mengubah titik isoelektrik
 Menurunkan imunogenisitas
EKSPRESI PROTEIN:
• Peningkatan tingkat ekspresi di host nonnatural
• Target ekspresi ke lokasi selular yang berbeda
• Penambahan tag untuk mendeteksi ekspresi protein
• Perubahan modifikasi posttranslational
REKAYASA PROTEIN

APLIKASI REKAYASA PROTEIN
•Pembuatan enzim
•Memproduksi jenis obat obatan
•Menghasilkan vaksin antibody tertentu
Beberapa Contoh Aplikasi langsung secara komersial sebagai berikut :
•Menggukanan perancah/scaffold protein berdasarkan domain pada Protein A untuk
mengembangkan molekul moleku seperti antibody (Company : Affibody)
•Menambahkan asam amino yang tidak terkodekan kapada protein, memungkinkan sintesa
protein dengan diversity bahan kimia (Company : Ambrx)
•Menggunakan perancah protein berdasarkan perpindahan untuk mengembangkan molekul
molekul seperti antibody, membuat penggabungan protein protein (Fusi) dan receptor agonist
(Company: BioRexis)
•Menggunakan perancah protein berdasarkan lectin Tipe C untuk mengembangkan molekul
molekul seperti antibody, teknologi protein trimerisasi (Company : Borean).
•Merekayasa proteases untuk menurunkan molekul molekul yang ditargetkan (Company:
Catalyst). Menggunakan domain Fibronektin untuk mengembangkan molekul molekul seperti
antibody, menciptakan protein protein dua fungsi dengan domain ikatan target yang terhubung
terhadap domain enzimatik (Company: Compound Therpaeutics).

•Pengembangan peningkatan metode untuk humanisasi antibody (Company: Kalobios)
•Menggunakan perancah protein berdasarkan lipocalin untuk mengembangkan molekul
molekul seperti antibody (Company: Pieris)
•Menggunakan perancah protein berdasarkan Kristal gamma untuk mengembangkan molekul
molekul seperti antibody (Company: Scil)
•Menggunakan perancah protein berdasarkan Sistein Knots untuk mengembangkan molekul
molekul seperti antibody (Company: Selecore)
•Merekayasa fungsi efektor yang diinginkan terhadap protein protein SMIP seperti antibody
(Company : Trubion).
•Menggunakan teknologi PDA untuk Merekayasa fungsi efektor yang diinginkan terhadap
antibody dan menciptakan protein protein domain negative dan protein protein dengan
peningkatan sifat propertinya (Company : Xencor).
•Rancangan dan konstruksi dari protein atau enzim baru dengan teknologi baru/novel atau
fungsi fungsi yang diinginkan dengan memodifikasi susunan asam amino menggunakan
teknologi rekombinan deokssrinukleaikasid (RDT)

Rekayasa Protein Protokol mempertimbangkan
beberapa strategi dan Pendekatan untuk merekayasa
protein :
• Pendekatan Desain De Novo
• Pendekatan Desain Rasional, termasuk diantaranya
adalah teknik pendekatan mutagenesis Site Directed.
• Pendekatan Desain Mutagenesis Acak/Random ,
termasuk diantarnya adalah Evolusi yang
diarahkan/Directed Evolusi, DNA Shuffling, dan
Mutasi Kimia (Teknik pendekatan Glicosilasi,Pegilasi,
Lipida, dll)
• Teknik Penggabungan protein (Fusion Protein)
STRATEGI REKAYASA PROTEIN

TUJUAN STRATEGI DESAIN DE NOVO
• Mengidentifikasi susunan dan geometrik asam amino yang optimal
untuk stabilisasi geometry backbone
• Mengembangkan algoritma yang powerful untuk solusi optimal
• Mendesain dan merekonstruksi Protein Sintetik
menggunakan informasi dari Struktur 3D dari akumulasi Protein Alam
dan Ikatan ikatan protein . Contoh:
Methionine : Memperlihatkan segmen rigid, central part
segmen helix dan daerah buried natural protein.
Threonine : segmen flexible
Lysine : pembentukan helix yang baik dan mengajukan pada C-
terminal
Leucine : Helices yang stabil, prefer buried region, ditemukan
pada posisi tengah helix
• Menemukan susunan Asam Amino yang terbaik untuk memastikan
ikatan pada struktur yang dipilih (Alpha helical bundel atau Betha
barrel dan mempunyai energi rendah untuk target struktur

Limitasi/ Problem:
• Ketersediaan struktur protein 3-D masih terbatas.
• Pengetahuan yang terbatas terhadap ilmu ikatan
protein, struktur terhadap fungsi biologsi protein
protein tersebut.
Protein architecture vs. Protein folding vs. Biological
functions
LIMITASI STRATEGI DESAIN DE NOVO

Desain Komputasional Protein
• Mengidentifikasi susunan dan geometrik asam amino yang optimal untuk
stabilisasi geometry backbone
• Mengembangkan algoritma yang powerful untuk solusi optimal
STRATEGI DESAIN DE NOVO
•Desain komputasi protein
dengan algoritme
menemukan susunan asam
amino untuk mengidentifikasi
susunan asam amino yang
memiliki energi energi
rendah untuk struktur target.

X-RAY KRISTALOGRAFI
memberikan data resolusi tinggi tetapi tidak memberikan
informasi waktu tergantung fleksibilitas konformasi protein.
NMR (SPEKTROKOPI RESONANSI MAGNET)
menyediakan data resolusi agak rendah dan terbatas untuk
protein yang relatif kecil, tetapi dapat memberikan informasi
waktu bergantung tentang gerak protein dalam larutan.
• Mendesain dan merekonstruksi Protein Sintetik
menggunakan informasi dari Struktur 3D
• Menemukan susunan Asam Amino yang terbaik
untuk memastikan ikatan pada struktur yang dipilih
STRATEGI DESAIN DE NOVO

Workflow for solving the structure of a
molecule by X-ray crystallography.
Sinar masuk (datang dari kiri atas)
menyebabkan setiap scatterer
memancarkan kembali sebagian kecil
intensitas sebagai gelombang bola.
Jika scatterers disusun simetris dengan
pemisahan d, gelombang bola akan
selaras (tambahkan konstruktif) hanya
dalam arah perbedaan jalan-panjang
2d sin θ sama dengan multiple integer
dari panjang gelombang λ.
Dalam hal ini, bagian berkas yang
masuk dibelokkan oleh 2θ sudut,
memproduksi tempat refleksi
X-RAY KRISTALOGRAFI

Diagram Pita ofmyoglobin struktur,
menunjukkan alfa heliks
berwarna. Protein panjang, molekul linier
dengan ribuan atom, namun posisi setiap
atom relatif telah ditentukan dengan
resolusi sub-atom dengan kristalografi
sinar-X.
Karena sulit untuk memvisualisasikan
semua atom sekaligus, pita menunjukkan
jalan kasar polimer protein dari N-
terminus (biru) ke C-terminus nya
(merah).
X-RAY KRISTALOGRAFI

Struktur kristal protein pertama dari mioglobin paus sperma,
ditentukan oleh Max Perutz dan Kendrew Sir John Cowdery
tahun 1958, Hadiah Nobel dalam Kimia.
Difraksi sinar-X analisis mioglobin awalnya dimotivasi oleh
observasi kristal mioglobin di kolam kering dari darah di atas
geladak kapal dari perburuan paus.
X-ray diffraksi image untuk protein myoglobin
APLIKASI X-RAY KRISTALOGRAFI

Kurt Wüthrich, who won the Nobel prize in 2002,
Pacific
Northwest
National
Laboratory's high
magnetic field
(800 MHz) NMR
spectrometer
sample loaded.
NMR
sample is
prepared in
a thin walled
glass tube.
Protein NMR dilakukan pada sampel air dari protein yang sangat murni.
Sampel terdiri dari antara 300 dan 600 microlitres dengan konsentrasi
protein dalam rentang 0,1-3 milimol.
Sumber protein dapat berupa alam atau dihasilkan dalam sistem ekspresi
menggunakan teknik DNA rekombinan melalui rekayasa genetik.
NMR adalah pengetahuan stuktur biologi, yang diapalikasikan oleh NMR untuk
menginvestigasi jenis protein protein

Panah biru mewakili orientasi ikatan
peptidaN - H obligasi yang dipilih
dengan menentukan orientasi yang
relatif cukup obligasi terhadap medan
magnet luar, struktur protein dapat
ditentukan, dari catatan 1KBH PDB
Penentuan Nuklir struktur magnetik
resonansi menghasilkan ensemble
struktur.
Struktur hanya akan bertemu jika
data cukup untuk mendikte lipatan
tertentu. Dalam struktur ini, hanya
untuk menjadi bagian dari kasus
struktur, dari PDB 1SSU.

Struktur unik proteins menghasilkan rancangan :
1. Susunan Potensial Protein dari
100 hundred amino acids ⇒ ~10130 susunan protein potensial
Dilakukan dengan metode Komputasi atau eksperimental.
2. Estimasi Energi pada desain protein ⇒ Memperlihatkan perubahan
energi selama proses folding.
Hipotesa Thermodinamic : struktur asli protein diberikan oleh
konformasi asam amino yang meminimalkan energi bebas molekul.
Estimasi energi memperlihatkan :
-- Hot spot residu untuk adanya interaksi energi
-- Data Statistik terhadap fungsi efektif energi (SEEFs)  database struktur protein
-- Sifat sifat fisik terhadap fungsi efektif energi (PEEFs)  analisa komputasi.
-- Sifat sifat empiris terhadap fungsi efektif energi (EEEF) analisa single
termodinamik dan multiple site mutasi.
-- Kestabilan protein  baris multiple ikatan dan daerah konservatis jenis protein
(Current Opin. in Structural Biol. 2002, 12:441)
APLIKASI STRATEGI DESAIN DE NOVO

Protein degradation:

Disease
Exemple:
Neurodegenerative
diseases
Disease and protein folding:

Desain proses komputasional juga
berguna untuk merancang model
folding inverse bagian protein
kedalam rancangan untai yang
diasumsikan sebagai rotamer multiple
dan perancah tetap. Rotamer yang
berbeda dari tritopan asam amino
pada posisi tertentu dalam protein.
Model desain folding inverse (A) partisi protein
didesign side-chains mengasumasikan multiple
rotamer (merah) dan scaffold tetap (biru). (B-D)
rotamer berbeda tritopan asam amino pada
posisi tertentu di protein.
Desain komputer untuk faktor tumor nekrosis (TNF) varian
pada depicted gold. Mutasi, merah, mencegah desain
varian dari ikatan TNF reseptor, biru. Penambahan mutan
hasil TNF pada campuran hetrogen trimer, memiliki
aktivitas yang dikompromised. Penambahan mutat
berlebih TNF menjanjinkan level renda homotrimer aktive
native TNF. Gambar berdasarkan pada material suplemen
reference 39. Struktur kristal 1TNR digunakan untuk
menciptkan representatif struktur
Mengidentifikasi susunan dan geometrik asam
amino yang optimal dengan target terhadap
stabilisasi gemoteri backbone protein.

• Mendapatkan produk produk gen yang baru dari protein yang ada
• Menemukan hubungan antara struktur dan fungsi protein serta stabilitas
Molekul melalui informasi dari struktur 3 Dimensi protein.
• Mengidentifikasi susunan Asam Amino seperti mengetahui asam amino
memiliki energi terendah untuk merubah struktur ikatannya.
• Mengembangkan pengetahuan pengetahuan baru tentang karakteristik
protein.
• Merancang protein/enzym dengan sifat yang diinginkan melalui teknik
Manipulasi berdasarkan penerapan/ peniruan teknik mutasi alam seperti :
- Site Directed Mutagenesis , Error-Prone, PCR-based
- Penambahan atau penghilangan : PCR-based, nuclease, Kloning
- Perubahan Domain atau Fusions /penggabungan : Ligation, PCR-
based
Sehingga dapat dilakukan analisa terhadap interaksi antara protein-protein,
Ikatan DNA , aplikasi karakteristik antibodi , eksplorasi susunan protein,
kontruksi hybrid protein, probing promoter dan regulasi regions, serta analisa
aktifitas Enzim .
STRATEGI DESAIN RASIONAL PROTEIN

LIMITASI STRATEGI DESAIN RASIONAL PROTEIN
• Pengetahuan tentang ilmu ikatan protein, juga terhadap
fungsi biologsi, atau struktur protein sangat terbatas dan
sering tidak tersedia
• Aplikasinya diperkirakan akan sangat sulit dilakukan
untuk melihat efek efek dari variasi mutasinya.
• Strategi desain Site Direkted Mutaganesis memiliki
limitasi atau problem dengan Banyaknya librari pada
mutan yang dihasilkan

Studi Modern resolusi yang lebih tinggi Ini adalah metode eksperimental untuk dapat
memicu lipatan sampel unfolded protein, dan mengamati dinamika yang dihasilkan.
Teknik cepat digunakan secara luas termasuk neutron hamburan, ultrafast,
pencampuran solusi, fotokimia metode, dan spektroskopi laser suhu melompat.
Komputasi juga memprediksi struktur tersier protein.
Teknik initio De novo (memprediksi struktur protein berhubungan dengan komputasi),
Sangat berbeda dengan Metode lipatan Dinamika Molekul protein.
(MD) merupakan perangkat penting mempelajari pelipatan protein dan dinamika di
silico. Karena biaya komputasi, simulasi MD lipat dengan air eksplisit hanya terbatas
pada peptida dan protein yang sangat kecil.
MD simulasi protein yang lebih besar tetap terbatas pada dinamika struktur
eksperimental atau berlangsung pada temperatur tinggi.
Untuk mensimulasikan prosees lipat yang lama (diluar sekitar 1 mikrodetik), seperti
protein lipat ukuran kecil (sekitar 50 residu) atau lebih besar, beberapa pendekatan
atau penyederhanaan dalam model protein perlu diperkenalkan.
TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI

Teknik untuk mempelajari Protein Folding
Circular Dichroism Spektroskopi
adalah salah satu alat paling umum dan dasar untuk mengukur penyerapan cahaya
terpolarisasi sirkular.
Dalam protein, struktur seperti lembaran helicies alpha dan beta yang kiral, dan
dengan demikian menyerap cahaya tersebut.
Penyerapan cahaya ini bertindak sebagai penanda tingkat foldedness dari ansambel
protein.
Teknik digunakan untuk mengukur keseimbangan protein dengan mengukur
perubahan serapan sebagai fungsi konsentrasi denaturant atau suhu.
Jenis spektroskopi juga dapat dikombinasikan dengan perangkat cepat-pencampuran,
untuk mengukur protein kinetika lipat dan untuk menghasilkan plot chevron.
Perkembangan dichroism lingkaran getaran (VCD) melibatkan Fourier Transform (FFT)
instrumen, untuk menentukan konformasi protein dalam larutan bahkan untuk
molekul protein sangat besar.
VCD studi protein sering dikombinasikan dengan difraksi sinar X-kristal protein, FT-IR
data untuk solusi protein dalam air berat (d2O), atau perhitungan kuantum ab initio
untuk memberikan tugas struktural ambigu yang tak dpt diperoleh dari CD

Spektrometri Circular Dichroism (CD)
-- Mengukur struktur sekunder protein
-- Teknik standar untuk mengukur aktifitas optikal protein
-- Mengukur perbedaan absorbansi pada struktur sirkular bagian
kanan dan kiri – melalui cahaya polarisasi dari sample protein
The far-UV atau amide region (170-250 nm) untuk ikatan peptida
The Near-UV region (250-300 nm) – aromatik asam amino

Cahaya linier Terpolarisasi adalah cahaya osilasi terbatas untuk pesawat tunggal.
Semua bagian terpolarisasi cahaya dapat digambarkan sebagai jumlah dari dua
bagian linear terpolarisasi tegak lurus satu sama lain, sebagai cahaya
terpolarisasi vertikal dan horizontal.
Vertically Polarised Light Horizontally Polarised Light

Amplitudo terpolarisasi Horisontal dan vertikal
pada gelombang cahaya yang sama di fase satu
sama lain:
gelombang cahaya yang dihasilkan (biru) adalah
linear terpolarisasi pada 45 derajat.
Jika kedua polarisasi keluar dari fase, gelombang resultan berhenti menjadi terpolarisasi
linier. Misalnya, jika salah satu terpolarisasi keluar dari fase oleh gelombang-kuartal,
resultan akan heliks dan dikenal sebagai cahaya terpolarisasi sirkular (CPL). Heliks dapat
berupa- kanan (R-CPL) atau kidal (L-CPL) dan non-gambar cermin superimposable.
Unsur optik yang mengkonversi cahaya terpolarisasi linier dan cahaya terpolarisasi
sirkular disebut piring seperempat-gelombang.
Piring seperempat-gelombang birefringent, yaitu indeks bias dilihat oleh horizontal dan
vertikal terpolarisasi cahaya berbeda.
Pelat berorientasi akan mengkonversi cahaya terpolarisasi linier ke sirkular cahaya
terpolarisasi dengan memperlambat salah satu komponen linier balok sehubungan
dengan yang lain sehingga menjadi fase keluar seperempat-gelombang . Menghasilkan
berkas CPL kiri atau kanan.

Left Circularly Polarised (LCP) Light Right Circularly Polarised (RCP) Light
Ketika pesawat berpotongan yang dilihat dari depan maka gambar berikut terlihat :

-- Pengukuran yang sempurna untuk memperkirakan perubahan
konformasi dari protein
Spektrometri Fluorosense

a. Penglabelan Serotonin N acetiltransferasi (AANAT) dengan fluoresen (FL) dan
rhodamin (Rh) , yang mengharapkan terjadinya transfer resonansi energi
fluoresen (FRET) untuk AANAT sebagai monomer (no FRET) dan sebagai
oligomer (FRET).
b . Pelabelan in vivo pada Glutatione S-transferasi (GST) yang mengandung
residue sistein N-terminal dengan membran permiable tetrametilrhodamin
thioester (TMR).
Spektrometri Fluorosense

Susunan Asli Asam Amino
->Missense atau silent mutasi yaitu
Perubahan susunan nucleotide tanpa
adanya perubahan susunan protein
->Nonsense, perubahan asam amino
yang merubah terminal atau ujung-C
protein
-> Penambahan susunan amino yang
merubah terminal atau ujung-C
protein
-> Pemotongan susunan amino yang
merubah terminal atau ujung-N
protein
TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN
SITE DIRECTED MUTASI

Metode lama yang
digunakan pertama
kali,
Dengan sintesa
Oligonucleotide yang
di masukkan ke dalam
plasmid
Keterbatasan :
Banyaknya Library
pada Mutan
Primer extension
(the single-primer
method)
is a simple method
for site-directed
mutation
Dalam pengembangannya
Digunakan double sebagai
ganti rantai DNA primer

Teknik Mutasi Deletion atau insertion

Teknik Mutasi Penghilangan dengan menggunakan enzim
restriksi

Kloning gen dapat bermutasi secara khusus
Mutagenesis in vitro
Memungkinkan adanya mutasi
Tertentu •Komponen Utama
- DNA template
- Primer mutasi
- DNA pol, dNTP
• Ada banyak variasi sehingga
Dapat meningkatkan efisiensi
GCTAATTGGCGCAGCTAGTCGATGAAATTTGATGCCATACCCGGG
GCTAATTGGCGCAGCTAGGAAATGAAATTTGATGCCATACCCGGG
- Teknik Mutasi Perubahan
Domain (Fusion) dengan Enzim
Ligasi dan Multiplikasi PCR-Based
Oligonucleotide /Saturation mutagenesis

DNA Mismatch Repair Protein, MutH,
pRoses untuk mengoreksi kesalahan
replikasi organisme hidup; meningkatkan
keakuratan replikasi DNA sampai faktor
1000
The first method of site-directed mutagenesis to be developed was the single-primer method (Gillam et al. 1980, Zoller & Smith 1983). As
originally described the method involves in vitro DNA synthesis
with a chemically synthesized oligonucleotide (7–20 nucleotides long) that carries a base mismatch with the complementary sequence. the
method requires that the DNA to be mutated is available in single-stranded form, and cloning the gene in M13-based vectors makes this easy.
However, DNA cloned in a plasmid and obtained in duplex form can also be converted to a partially single-stranded molecule that is suitable
(Dalbadie- McFarland et al. 1982).
Oligonucleotide /Saturation mutagenesis

•Melakukan analisa terhadap interaksi antara protein protein,
dan folding/unfoloding protein
•Melakukan permodelan struktur protein.
•Melakukan analisa terhadap interaksi ikatan DNA,
•Melakukan eksplorasi susunan protein,
•Melakukan kontruksi hibrid protein, dan probing promoter
•Mengekspresikan Protein dan Regulasi region
•Menganalisa aktifitas enzim.
•Melakukan modifikasi sifat sifat kimia protein
•Memproduksi obat dengan misalnya mengefektifkan
Ribonukelasi yang digunakan pada terapi tumor.
•Menghasilkan aplikasi dalam mengkarakteristik jenis antibodi.
APLIKASI STRATEGI DESAIN RASIONAL PROTEIN

Penelitian ekstensif dan studi daerah ikatan 02 (ligand) protein hemoglobin.
Dengan struktur hemoglobin terlarut pada kristalografi X-ray , asam amino
yang bertugas untuk mengikat ligand pada protein, bersama dengan helix
spesifik dan posisinya ditentukan dan dapat ditampilkan. Residu residu
yang bekerja pada konjunksi dengan cincin heme porpirin.
Memperlihatakn tetramer hemoglobin dengan empat
daerah yang mengikat ligan dengan distal dan
proksimal histidines dalam model tongkat biru
cerah. Cincin heme porfirin ditampilkan dalam
model tongkat merah dan putih.
Gambar ini memperlihatkan peledakan di kawasan
yang mengikat ligan. Rantai samping dari asam
amino asam amino kunci pada ikatan ligan (O2 dalam
gambar) dan cincin heme porpirin ditunjukkan dalam
model tongkat. Ruang kuning penuh molekul
merupakan heliks sekitarnya yang membentuk
hemoglobin.

Menggunakan strategi desain rasional dapat menyarankan mutasi yang mungkin untuk asam
amino kunci yang bertanggung jawab atas pengikatan hemoglobin pada ligan. Sebagai contoh, jika
diinginkan sterically menghalangi situs pengikat jika hemoglobin, direncanakan membuat situs-
mutasi untuk memperkenalkan mutasi yang akan memberikan sifat fisik dan elektrokimia yang
dikehendaki. Memilih fenilalanin untuk menggantikan leusin pada posisi 29 akan mengisi situs
dengan rantai samping aromatic yang besar. Hasil ini dapat dilihat pada gambar berikut A dan B.
Gambar A. menggambarkan daerah yang mengikat atau
"saku" dari subunit hemoglobin. Spasi warna hijau diisi
domain memperlihatkan residu leusin wild type dan
orientasinya pada pocket. Molekul berwarna merah
adalah iksigen dan ditampilkan berikatan terhadap grup
heme porfirin (molekul flat pada model tongkat).
Gambar B. memperlihatkan daerah yang
mengikat setelah leusin wild type telah
digantikan oleh sebuah fenilalanin. Strategi
rasional fenilalanin mengisi saku hemoglobin
dikonfirmasi pada gambar yang didasarkan
dari x-ray kristalografi.

Banyak diaplikasikan pada pembuatan obat, seperti :
-Keefektifan Ribonuclease (Rnase) yang digunakan pada therapi
Anti tumor, dapat diimproved dengan teknik site directed mutagenesis
APLIKASI TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN

Sistem Ekspresi untuk memfungsikan protein aktif
E. coli expression sistem: Protein processing dan folding
pET sistem:
36 tipe vector , 15 host
strain yang berbeda
(developed by Studier et al., 1986)
-λDE3 lysogne:
T7 RNA Pol gene, pada
kontrol Promoter lacUV5
-pLysS or pLysE:
T7 lysozyme, Inhibitor/
penghabat T7RNA Pol,
u/pengkontrolan lebih
ketat. e.g.,BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS atau E
APLIKASI TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN

Polymer chain reaction METODE
MULTIPLIKASI
PENDUKUNG desain protein

Polymerase chain reaction untuk mengisolasi fragmen DNA
secara cepat
 PCR (polymerase chain reaction) mencapai akumulasi
eksponensial dari target DNA
 Berdasarkan urutan DNA yang telah ditentukan
sebelumnya, oligonucleotides pendek (~ 20bp)
dikembangkan dan dilengkapi untuk menyusun DNA
target yang diapit .
 Oligonucleotides bertindak sebagai primers untuk
menyalin DNA yang serupa (Replikasi DNA).
REAKSI RANTAI POLIMER (PCR)

Primer Oligonucleotide mulai menyalin DNA.

Setiap siklus replikasi menggandakan jumlah target DNA.

Amplifikasi Exponential

Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc.
Permission required to reproduce or display

APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING
PCR – Media Mutagenesis
Mutagenesis Oligonukleotida mismatch (site pre-determined) dengan molekul DNA
klone. Sel-base oligonukleotida mismatch (alternative PCR-base site directed
mutagenesis). Penggunaan mutagenetik oligonukleotide langsung pada nukleotida
tunggal yang disubstitusi pada gene. Gene dikloning pada M13 menciptakan
rekombinasi DNA rantai tunggal. Primer oligonukleotida melengkapi susunan gen yang
dimutasi (A) dan mengandung base non-komplementari yang diinginkan (C).
Annealing primer mutagenik, sintesa rantai kedua diperpanjang dengan polimerasi DNA
serta celah/gap ditutup dengan DNA ligase. Hasil heteroduplek ditransformasikan ke E-
coli, dua populasi rekombina dapat dikembalikan menjadi wilde type dan mutant
homoduplek, yang kemudian diidentifikasikan dengan hibridisasi molecular (dengan
primer mutagenic sebagai probe oligonuklotida alel spesifik).

PCR BASED – SITE DIRECTED MUTAGENESIS

PCR Based – Turunan Primer – Saturated Mutagenesis

PCR – MUTAGENESIS UJUNG 5’
Primer dimodifikasi pada ujung 5‘ untuk memulai proses, sebagai
contoh, Group yang telah dilabelkan, susunannya mengandung
site restriksi yang sesuai, atau promoter phage untuk
menggerakkan ekspresi gen.

PCR – MUTAGENESIS SITE SPESIFIK
Mutagenesis menghasilkan produk
amplifikasi dengan menglokasikan
mutasi pre-determinasi spesifik pada
segmen central.
Reaksi PCR A dan B dihadapkan pada
segmen overlapping yang diamplifikasi
pada DNA mengandung mutasi
(mempertimbangkan mismatching base
dengan primer mutant – 1M atau 2M).
2 produk dikombinasikan, denaturasi
dan reanneal, polimerasi DNA dapat
memperpanjang ujung 3‘ heteroduplek
dengan ujung 3‘ yang tersembunyi.
Produk panjang penuh dengan mutasi
segmen central diamplifikasi dengan
hanya primer outer 1 dan 2.

Dua primer reaksi PCR
memproduksi reaksi dengan
overlapping dua fragmen DNA
,menampung mutasi yang sama
pada daerah overlap .
Susunan overlap merubah
fragmen menjadi hibridisasi.
Dua hibrid diperpanjang dengan
DNA polymerase memproduksi
duplex fragment.
1 Hibrid recessed 5′ ends hilang
dari percampuran reaksi.
PCR - Mutasi site-directed – Base Tunggal mismatched
amplifikasi primer dan template

Kedua rantai vektor membawa target gen menggunakan
PCR tetapi satu dari primer membawa mutasi yang
diinginkan.
Hasil produksi populasi liner duplex membawa gen
mutasi yang dikontaminasikan dengan tingkat rendah
pada siklus template DNA aslinya.
Template DNA diturunkan dari Sel E-coli dengan sistem
modifikasi restriksi intak , kemudian dimetilasi dan
disensitifkan untuk restriksi dengan DpnI Endonuklease.
DNA linear diproduksi dengan amplifikasi resistan
terhadap pembukaan Dpnl dan setelah sirkulasi ligasi
blunt-end dikembalikan dengan transformasi ke E-coli.
Setiap molekul hibrid mengandung rantai tunggal
template metilasi DNA dan unmetilasi amplifikasi yang
akan dihancurkan dengan Endonuklease.
Metode Exsite TM untuk menghasilkan mutasi menggunakan PCR. Plasmid parental membawa target
gen yang diturunkan dari rantai restriksi-profisien E-coli dan dimetilasi. Sensitivitas dengan Dpnl
endonuklease dan dielminasi secara selektif dari hasil pencampuran akhir PCR
PCR – Metode Exsite TM

Menargetkan DNA yang dimetilasi
in vitro sebelum langkah
mutagenesis dan overlapping primer
digunakan.
Linier amplifikan yang diproduksi,
membawa mutasi yang diinginkan
tetapi saat ditransformasikan
langsung pada E-coli, Sel Host
memperbaiki sirkulasi enzim mutasi
DNA linear, sementara Endonukleas
McrBC menguraikan Metilat-
tempate DNA, meninggalkan hanya
un-metilat, produk mutasi.
PCR – Metode Gen Tailor

RT-PCR, salah satu metode sensitif
untuk mendeteksi dan menganalisa
transkripsi mRNA atau RNA lainnya
pada porsi yang rendah
RNA tidak dapat digunakan sebagai
template PCR, sehingga harus
ditranskripsikan dahulu menjadi cDNA
dengan reverse transcriptase dari
Moloney murine leukemia virus atau
Avian myeloblastosis virus, dan duplikat
cDNA kemudian diperbanyak.
Teknik ini diawali dengan pencampuran
mixing short (12-18 base) polymers
thymidine (oligo dT) dengan messenger
RNA, dan anneal RNA's polyadenylate
tail. Reverse transcriptase ditambahkan
dan menggunakan oligo dT sebagai
primer untuk sintesa first strand cDNA. Roche Molecular Biochemicals: PCR Application Manual. RT-PCR
PCR – Reverse Transkripsi

PCR – Gene Sekuensi untuk Mutasi
•(A) Genome DNA, Exons 1-4 dapat diamplifikasi secara terpisah dari Genome
DNA menggunakan pasangan primer intron yang spesifik (1F + 1R, 2F + 2R)
•(B) Reverse Transkripsi PCR. mRNA yang dipresentasikan pada sel secara
mudah diakses seperti sel darah, memungkinkan konversi ke cDNA. cDNA
kemudian digunakan sebagai template pasangan primer exon spesifk
menciptakan Fragmen DNA yang overlapping/tumpang tindih.
Produk PCR untuk
Mutasi gen yang
disaring didapatkan
dari Genome DNA
menggunakan primer
intron-spesfik yang
mengapit exon atau
dengan Reverse
Transkripsi PCR.

PCR – Perpanjangan Polimorphism Fragmen Restriksi
Allele 1 mempunyai daerah, alelle 2 mempunyai nukleotida yang telah dirubah.
PCR primer didesain sederhana dari susunan mengapit daerah restriksi untuk
memproduksi produk pendek. Penghancuran Produk PCR dengan enzime R
dan fraksinasi ukuran menghasilkan penulisan sederhana dua alelles.
Metode untuk
mendeteksi daerah
restriksi polimorp.
Alleles 1 dan 2
dibedakan dengan
polimorph yang
merubah susunan
nukleotida dari
daerah resktriksi
spesifik untuk
restriksi nuklease.

PCR – STRPS
PCR dapat digunakan untuk menghasilkan tandem pendek polimorps yang berulang
(STRPs). Penulisan dari dinukleotida CA/TG mengulang polimorphs yang mempunyai
tiga alel sebagai hasil variasi pada jumlah pengulangan CA. Pada autoradiograph
setiap alel direpresentasikan dengan band utama bagian atas dan dua minor „band
bayangan“. Setiap A dan B mempunyai genotipe A (1,3) dan B (2,2).

PCR – Spesifik Alel
Dasar dari PCR spesfik alel :koreksi pasangan base pada ujung 3‘ Primer PCR.
Spesik alel oligonukleotida primer ASP1 dan ASP2 dirancang untuk
menyamakan susunan dua alel terhadap posisi daerah sebelumnya pada
varian nukleotida, sampai dengan dan berakhir pada varian itu sendiri.
ASP1 mengikat sempurna,
melengkapi susunan rantai alel 1,
amplifikasi dengan primer yang
dilindungi. Namun, ujung C-3‘
pada ASP2 primer mismatched
dengan T susunan alel 1,
sehingga amplifikasi tidak dapat
dilakukan.
Serupa dengan ASP2 mengikat
sempurna alel 2 dan memulai
amplifikasi, tidak seperti ASP1.

PCR – Metode Taqman Assay
Penambahan 2 primer PCR konvensional, P1
dan P2, spesifik untuk susunan target, primer
ketiga P3, didesain mengikat spesifik susunan
target downstream P1. Pelabelan P3 dengan
dua fluorophores,. reporter dye (R) pada ujung
5’ dan quencher dye pada reporter dye yaitu
pada ujung 3’. Ujung 3’ diblok/dihalangin, P3
primer ketiga tidak dapat dengan sendirinya
prime pada setiap sintesa DNA baru. Selama
reaksi PCR, Polimerasi Taq DNA mensintesa
rantai prima DNA baru dengan P1 dan enzim
mendekati primer ketiga, aktifitas proses dari
arah 5’  3’ menurunkan P3 dari ujung 5’.
Hasil akhir rantai DNA melebihi daerah ikatan
P3 reporter serta quenche dye tidak lagi
mengikat molekul sama. Reporter dye tidak
lagi dekat pada quencher, meningkatkan emisi
intensitas reporter yang dengan mudah
dideteksi
Metode sensitif untuk mendeteksi spesifik Alel menggunakan aktifasi exo 5‘ dan
3‘ dan primer ketiga dengan Fluor dan Quencher

PCR – DOP
Kloning cDNA untuk porcine urate oksidase mneggunakan turunan oligonukleotida yang
berhubungan dengan susunan asam amino yang diketahui. Primer sense
dikonstruksikan terhadap kodon 7-11 dan dua base yang pertama dari kodon 12, dan
primer antisense berhubungan dangan kodon 34-38 (Lee et.al, 1980). Susunan asam
amino dipilih untuk mengkonstruksikan primer yang dipilih dari basis kandungan tinggi
asam amino yang dispesifikan dengan hanya dua kodon (Asp, Tyr, Lys, Asn, His).
Primer mempunya perpanjangan 5‘ mengandung susunan yang dikenali untuk restriksi
nukleases, untuk memfasilitasi kloning subsekuen sel base.

PCR – Linked Primer
Molekul Linked (adaptor) adalah rantai ganda oligonukleotida dibentuk dengan ligasi
dua rantai tunggal oligonukleotida dilengkapi pada susunan kecuali yang memiliki
kompatible tergantung 5‘ dengan retriksi nuklease tergantung/overhang (kasus ini,
GATC 5‘ tergantung diproduksi oleh Mbol). Setelah ligasi linker terhadap target fragmen
restriksi, primer linked-spesifik mengamplifikasi semua fragmen dengan mengikat dua
molekul linker yang mengapit.
PCR link primer
memungkinkan
amplifikasi in-
diskriminate
susunan DNA pada
target DNA yang
rumit/kompleks.

PCR – Genome Walking
Target komplek DNA terdiri dari banyak
fragmen dimana susunan anchor (labuhan)
dilampirkan, contoh: linker rantai ganda
oligonukleotida.
Ide untuk menggunakan spesifik primer
susunan anchor dan satu susunan spesifik
X diketahui dapat untuk membebaskan
fragmen fragmen mengandung susunan X
dan mendapatkan akses susunan yang
tidak teridentifikasi sebelumnya yang
berdampingan terhadap X.
Pada contoh ini, susunan anchored
ditunjukkan hanya pada sisi kiri dari
amplifikasi yang jelas dan dimungkinkan
dari susunan karakterisasi N1 sebelumnya
yang berdekatan dengan susunan X yang
diketahui. Variasi metode derivatif telah
disusun, seperti PCR buble-linker.

Teknik mengubah cara campuran PCR
dengan pemanasan awal. Polimerase
aktif, tapi target belum didenaturasi dan
Primer mengikat ke lokasi non-spesifik
(atau satu sama lainnya).
Teknik dilakukan manual memanaskan
komponen reaksi pada suhu pencairan
(mis. 95 ° C) sebelum menambahkan
polimerase .
Atau, sistem yang menghambat
aktivitas polimerase pada suhu
lingkungan, oleh pengikatan
antibodi, atau inhibitor terikat kovalen
yang hanya terdisosiasi setelah langkah
aktivasi temperatur tinggi. ‘
Hot-start/cold-finish PCR dicapai dengan
polimerase hibrida baru yang tidak aktif
pada suhu lingkungan dan hanya
diaktifkan pada temperatur tinggi.
PCR – Hot Start

PCR dengan ketelitian yang rendah!
Dicapai dengan:
- Peningkatan konsentrasi ion Mg2 +
- Penambahan Mn2 +
- Konsentrasi yang tidak sama pada
keempat dNTPs
- Penggunaan dITP
- Meningkatkan jumlah Taq polimerase
(Polymerase tanpa bukti fungsi
pembacaan)
Menentukan varians baru protein
Berdasarkan prinsip Annelaing Taq Polymerase pada pasangan base yang tidak
kompatibel satu sama lain selama proses amplifikasi / penguatan dalam kondisi
PCR yang tidak sempurna.
PCR Based – Error Prone

Menentukan varians baru protein
ERROR PRONE PCR:
- Taq Polymerase berannealing pada pasangan base yang tidak
kompatibel satu sama lain selama proses amplifikasi / penguatan
dalam kondisi PCR yang tidak sempurna
PCR Based – Error Prone

Teknik ini tidak memerlukan pengetahuan struktur, susunan, atau
mekasnisme protein, melainkan penerapan pengetahuan dalam :
- Random Mutagenesis
untuk menciptakan perbedaan genetik
- Seleksi atau Screening/penyaringan
untuk memilih varian yang memiliki kualitas yang diinginkan.
Beberapa tahapan Mutasi dan Seleksi, meniru evolusi alam.
Digunakan untuk Menghilangkan mutasi neutral dan merusak.
STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN

Faktor yang menentukan keberhasilan strategi
adalah :
- Kualitas dan desain Pustaka/Library
- Pemilihan metode Evolusi
- Pemilihan Rekombinasi DNA
- Metode Seleksi atau Penyaringan/Screening

LIMITASI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN
- Susunan protein yang dikembangkan memiliki
sifat yang hampir mirip dengan susunan
induk/parental, sepanjang path evolusinya
- Kapasitas metode untuk menciptakan susunan
fungsional yang baru sangat terbatas dan
membutuhkan libraries yang besar.

PERBEDAAN DESAIN RASIONAL vs DIRECT EVOLUSI

RANDOM MUTASI

Konstruksi aktual dari desain rasio genes domain-swapped genes
dapat diselesaikan dengan beberapa teknik.
Metode cassette mutagenesis
Susunan site restriksi mengapit susunan DNA tertentu untuk
ditempatkan dan dihancurkan dengan enzim restriksi dan penggantian
susunan dengan memasukkannya di antara sitesnya (Wells et.al.1985).
Metode Gene splicing by overlap extension polymerase
chain reaction
Molekul DNA direkombinasikan tanpa menggunakan pembatasan
endonuklease (Horton et al 1989).
Fragmen gen yang akan direkombinasikan (gen orangtua) dapat
dihasilkan dalam polimerase terpisah rantai reaksi (PCRs).
METODE NONKOMBINASI DOMAIN SWAPPING

Pembatasan situs terjadi secara alami atau artifisial dimulai pada
lokasi diinginkan pada gen target dengan oligonukleotida-directed
mutagenesis.
Pemilihan pembatasan situs didasarkan pada keunikannya terhadap
plasmid dan konservasi asam amino akhir urutan pengkodean.
METODE KASET MUTAGENESIS

Gene splicing by overlap extension polymerase chain reaction
(PCR). Arrows represent primers (1–4), the solid line and dotted
lines represent DNA sequences from two different parent genes
Primer didesain hingga ujung produk
mengandung urutan komplementer.
Ketika produk PCR dicampur, alur memiliki
urutan sesuai ujung rantai 3 ‘yang
tumpang tindih dan primer satu sama lain.
Ekstensi polimerase DNA menghasilkan
urutan asli dihubungkan untuk
menggabungkan dua fragmen dalam satu
langkah kloning, langkah kloning multiple
dibutuhkan untuk melakukan swap domain
internal.
Variasi metode, Protokol PCR tiga langkah
membentuk protein chimeric, hanya satu
langkah kloning dibutuhkan untuk bertukar
dari domain internal (Grandori et al 1997).
Metode digunakan untuk menggantikan
domain tertentu protein A oleh domain
analog protein B. Studi tentang hibrida
domain-bertukar dapat dihasilkan .
METODE SPLICING GEN PCR OVELAPPED EXTENSION

 Kadang-kadang sulit diketahui mutasi seperti apa yang dapat
menghasilkan sifat tertentu pada suatu protein
 Misalnya, untuk meningkatkan termostabilitas suatu protein masih
sulit untuk dilakukan hanya dengan melakukan prediksi pada struktur
3 dimensi (3-D) untuk menentukan asam amino mana yang
menentukan sifat ini
 Dengan metoda ini dapat dilakukan mutasi pada berbagai tempat
untuk kemudian dilakukan identifikasi protein mutan yang mana yang
dapat menghasilkan fungsi yang diinginkan
METODE KOMBINASI

Pendekatan in vitro acak , tidak perlu prediksi fragmen protein dan
posisi crossover
Metode ini memiliki beberapa teknik pendekatan yaitu :
•Pendekatan chimeragenesis acak
Metode penyisipan urutan DNA ke lokasi acak gen target.
Investigasi hibrida yang dihasilkan untuk mengidentifikasi situs yang
menerima insersi fungsional domain protein menjadi perancah.
•Pendekatan Permutasi melingkar protei
Menghasilkan relokasi N-dan C-Termini.
Metode digunakan untuk memahami jalur evolusi dan
mengidentifikasi situs permisif secara sistematis untuk permutasi
melingkar, informasi mengungkapkan modularitas scaffold/perancah.
•Pendekatan Rekombinasi Homolog
•Pendekatan Rekombinasi Nonhomolog.
METODE KOMBINASI

Metode sebenarnya dapat melalui Teknik Pendekatan Kombinasi
ataupun Nonkombinasi, dengan keuntungan dan kerugian:
METODE CHIMERAGENESIS ACAK

Hybrid proteins segments (domains / subdomains) dari paling sedikit
dua natural yang berbeda /protein dari orang tua lelaki .
Domains dan subdomains struktural motif variasi ukuran dan
kekomplekan
Tipe HIBRID:
-Single crossover hybrids terdiri dari bagian N-terminal satu protein dan
bagian C-terminal protein lainnya.

Tipe HYBRID:
-Multiple crossover hybrids,
Satu atau lebih internal stretches dari susunan asam amino
ditempatkan pada segmen yang berhubungan dari enzim lain.
-Fusion hybrids,
Domain fungsional protein yang terhubung dengan domain protein
lainnya, menciptakan produk gabungan/fuse yang lebih besar dari
parentnya.
Hybrid dapat menyebabkan mutasi, penghilangan dan penambahan
asam amino.

Hybrids between human GSTT1-1 and rat GSTT2-2. Susunan Asam amino dari manusia
GSTT1-1 dan tikus GSTT2-2 ditunjukkan pada daerah hitam dan abu abu. Segments
berhubunganan terhadap G site dan H site diidenkasi. R-h rat–human, H-r human–rat

Rekombinasi homolog fragmen DNA  DNA beberapa orang tua
 Produk akhir gen.
Mekanisme reassembly:
Urutan DNA homologi dan gen homologi rendah (< 70%) tidak dapat
dikombinasikan.  Bias inheren homolog libraries:
(posisi crossover pada Daerah tinggi, bukan rendah, kesamaan DNA)
Metode berguna dalam domain swapping Gen orangtua berbagi
homologi tingkat tinggi.
Rekombinasi homolog  Menggabungkan fragmen >> dua gen induk,
 menjelajahi urutan seluruh keluarga enzim dalam satu percobaan.
METODE REKOMBINASI HOMOLOG

“Knockouts”gen yang dihasilkan oleh rekombinasi homolog

Metoda untuk memisahkan protein dengan sifat yang diinginkan dan
mengidentifikasi mutasi penyebab perubahan:
1. Penelusuran (Skrining): semua pustaka yang ada diperiksa secara acak untuk
mencari protein dgn sifat yang diinginkan
2. Metoda seleksi: Pustaka diseleksi sedemikian rupa sehingga hanya yang
memiliki perbaikan sifat yang ditelusuri
Protokol diterapkan pada metoda kombinatorial:
1. Metoda pembuatan pustaka kombinatorial dengan keragaman yang tinggi
sehingga meningkatkan kemungkinan diperoleh protein dengan sifat yang
diinginkan
2. Penentuan metoda yang digunakan untuk memisahkan protein dengan sifat
yang diinginkan dan mengidentifikasi mutasi penyebab perubahan
METODE KOMBINASI

Protokol dasar in vitro homolog gen orangtua 
DNA Shuffling
yaitu Teknik evolusi dengan karakterisik berbeda meniru
proses desain atau rekombinasi alami reproduksi seksual dan
mempercepat proses perancangan melalui seleksi langsung in
vitro dengan mencampurkan dan menyesuaikan protein
(match) untuk menghasilkan varian lebih,
mempertimbangkan :
Teknik ikatan/Folding Protein
Termostabilitas
Aktivitas Enzim

METODE REKOMBINASI HOMOLOG–DNA SHUFFLING
Fragmen
menyelaraskan dan
cross-prime satu sama
lain untuk replikasi
memberikan untai DNA
hibrida dengan
beberapa komponen
dari gen induk yang
asli.
Aplikasi teknik :
Rekombinasi homolog invitro
Beberapa seleksi Pool Gen melalui Fragmentasi acak
Random menjadi fragmen kecil dengan penghancuran oleh Enzim
restriksi Dnasel. Fragmen dipasang kembali dengan Teknik PCR
dan berfungsi sebagai template dan primer.

Hal hal yang diperlukan :
- Penerapan pada susunan susunan
> 1 Kb
- Keberadaan daerah Homologous
memisahkan daerah daerah yang
berbeda (perbedaan wilayah)
- Struktur Scafford-like Protein yang
memungkinkan proses yang sesuai
untuk Shuffling / Pencampuran

DNase I treatment (Fragmentasi
10-50 bp,Mn2+)
Reassembly (PCR tanpa Primers,
Extension dan Recombinasi)
Pemanasan dan Renature
secara random
PCR amplification

Genes berasal dari gen
famili yang sama ->
homologous Tinggi
-> Family shuffling
REKOMBINASI HOMOLOG– FAMILY SHUFFLING

High DNA sequence similarity is required
REKOMBINASI HOMOLOG – FAMILY SHUFFLING

Famili shufling dengan Efisiensi Tinggi berdasarkan multi-step PCR dan
Rekombinasi DNA in vivo pada yeast:
Statistik dan Analisa fungsi dari Pustaka kombinasi antara
Human cytochrome P450 1A1 and 1A2
Valérie Abécassis, Denis Pompon and Gilles Truan* Centre de
Génétique Mol?culaire du CNRS, UPR 2137, Avenue de la Terrasse,
91198 Gif-sur-Yvette Cedex, France Nucleic Acids Res. 2000, 28: e88
SHUFFLING-COMBINATORIAL LIBRARIES ENHANCED by
RECOMBINATION IN YEAST (CLERY)

Keuntungan Enzim Restriksi Shuffling:
Menghasilkan frekuensi chimeras yang lebih tinggi karena tidak
menggunakan DNaseI.
(Hidrolisis DNaseI pada DNA beruntai ganda lebih memilih lokasi
berdekatan nukleotida pirimidin dan akibatnya bisa memulai urutan bias
ke rekombinasi tersebut.
Kelemahan Enzim Restriksi Shuffling :
Situs crossover bias bertepatan dengan pembatasan situs-situs yang
sudah ada.
DNA SHUFFLING – ENZIM RESTRIKSI SHUFFLING

DNA SHUFFLING – ENZIM RESTRIKSI SHUFFLING

Staggered extension proses (StEP) adalah variasi lain dari DNA
yang menggunakan terminal primer untuk meniru DNA target melalui
PCR dengan ekstensi waktu yang sangat singkat untuk menghasilkan
untai pendek DNA yang direplikasi.
Rantai tumbuh DNA bertindak sebagai primer dalam siklus berturut-
turut dan perubahan template direplikasi beberapa kali,
mengumpulkan Komponen dari gen induk yang berbeda.
Pada proses ini dibutuhkan susunan DNA homolog tinggi
DNA SHUFFLING–STAGGERED EXTENSION PROSES
(StEP)

Gen hibrid dikonstruksikan dari dua
gen homolog. Cloning dari gen hibrid
menghasilkan produksi protein hibrid.
Hanya satu rantai dari setiap gen
ditunjukkan setelah langkah
denaturasi awal.

Rekombinasi priming acak :
-Reassembli /pengumpulan kembali DNA oleh Sintesa
interuppting /penyelaan
- Chimeragenesis acak pada tempalte transiens (RACHITT)
Aplikasi praktis di bidang rekayasa protein hasilnya seringkali sulit untuk
merasionalisasi karena chimeras yang dihasilkan memiliki banyak
parents dan beberapa posisi crossover.
Tidak signifikan bila tujuannya adalah produk akhir,
yaitu enzim direkayasa dengan sifat yang diinginkan.
DNA SHUFFLING-REKOMBINASI PRIMING ACAK

DNA SHUFFLING- (RACHITT)

Teknologi pemotongan Tambahan chimeragenesis menghasilkan
hubungan struktur dan fungsi protein yang lebih sesuai.
Strategi pertama:
-Pemotongan incremental untuk pembuatan enzim hibrida
(ITCHY-Incremental truncation for the creation Hybrid Enzymes
(ITCHY)
menghasilkan perpustakaan protein hibrida single crossover antara dua
gen induk.
- Hasil ITCHY pada perpustakaan gen melalui pemotongan tambahan
pada positi crossover yang didistrusi acak.
DNA SHUFFLING-INCREMENTAL TRUNCATION for THE
CREATION HYBRID ENZYMES (ITCHY)

Tambahan pemotongan (arrow
pertama) dan penambahan
pemotongan enzim hibrida (ITCHY)
(Seluruh diagram).
Dalam ITCHY, perpustakaan
pemotongan inkremental dihasilkan
oleh penghancuran DNA oleh
exonuclease III.
Fragmen yang dihasilkan kemudian
diligasikan bersama-sama untuk
menghasilkan perpustakaan akhir

Internucleotide phosphothioate yang dihasilkan
menghubungkan ketahanan terhadap hidrolisis
exonuclease 3'-5 ', memberi ketahanan DNA target
terhadap degradasi dalam pembuatan ExoI
berikutnya.
Thio-ITCHY berhasil digunakan untuk menggabungkan
kembali gen dengan urutan identitas dengan hanya
36% untuk menghasilkan chimeras aktif
Keterbatasan utama ITCHY dan Thio-ITCHY adalah
Crossover hibrida tunggal hanya dapat dihasilkan
dari dua orang tua , membatasi potensi
keanekaragaman urutan.
Thio-ITCHY, dengan Analog nukleotida trifosfat
Pada PCR, dNTP α-phosphothioate digabung acak
pada frekuensi rendah ke wilayah target
pemotongan DNA.

Metode rekombinasi homolog berhasil digunakan kombinasi pada
metode lain untuk menentukan faktor penentu spesifisitas substrat dan
aktifitas enzim pada variasi family protein.
Metode digunakan mencari hubungan struktur-fungsi dan mekanisme
evolusi protein.
Ketika dikombinasikan dengan skrining genetik /teknik pilihan, dapat
digunakan untuk mendapat area baru pada enzim.
“SCRATCHY“ adalah teknik membuat perpustakaan crossover dengan
menggabungkan ITCHY dan DNA Shuffling secara berurutan.
DNA SHUFFLING – MIX ITCHY DAN DNA SHUFFLING
(SCRATCHY)

Sieber,et al. mengembangkan teknik untuk menciptakan crossover satu
perpustakaan chimeric antara dua gen parental tanpa bias untuk posisi
crossover .
Metode rekombinasi homologi urutan independen protein
(SHIPREC),
dimulai dengan produksi dimer gen yang kemudian terpecah-pecah
oleh DNaseI.
Fragment ukuran orangtua dipulihkan dan dibalikkan oleh ligasi
melingkar dan restriction menghancurkan untuk menghasilkan sebuah
perpustakaan enzim hibrida dengan distribusi yang merata dari posisi
crossover.
DNA SHUFFLING – HOMOLOGI URUTAN INDEPENDEN
PROTEIN (SHIPREC)

Libraries of Hybrid proteins dari distantly related sequences
Volker Sieber, Carlos A Martinez & Frances H Arnold, Nature Biotech, 2001,19,p456-460
DNA SHUFFLING – HOMOLOGI URUTAN INDEPENDEN
PROTEIN (SHIPREC)

DNA SHUFFLING – EXON SHUFFLING
In vitro exon shuffling merupakan
exon domain encoding atau set dari
exon pada target gen dan homolog
dari yang lainnya.
Gen yang berhubungan diamplifikasi
dengan chimeric oligonukleotide
pada primer dan template pada
reaksi seperti PCR yang menyusun
kembali Gen dengan panjang penuh.
Step terakhir melibatkan penyaringan
Pustaka Exon shuffling untuk fungsi
atau property yang diinginkan.

Metode rekombinasi non homolog tidak bergantung pada
urutan homologi gen orang tua
Karena tidak melakukan hibridisasi fragmen homolog ,
melainkan membuat langkah ligasi berujung tumpul (blunt-
ended)
yang digunakan untuk membawa gen fragmen bersama.
Akibatnya, tidak ada bias terhadap komposisi fragmen gen
ditemui.
Dengan metode rekombinasi nonhomolog,
Memungkinkan untuk membuat perpustakaan chimeras
dari dua gen yang sepenuhnya tidak berhubungan.
METODE REKOMBINASI NON HOMOLOG

Metode rekombinasi nonhomolog didasarkan pada pemotongan
inkremental, bentuk paling sederhana menciptakan perpustakaan
protein yang memiliki satu atau lebih asam amino , dihapus baik dari C-
atau N-terminus .
(Ostermeier et al 1999a).
Pemotongan Tambahan dan metode terkait tergantung pada
exonuclease III (ExoIII) protein dan sifat-sifatnya.
ExoIII mengkatalisis pencernaan fragmen gen dari 3 'ke ujung 5' pada
dikontrol, seragam, dan sinkron tingkat (Wu et al 1976).
Aliquots Kecil campuran reaksi dihapus selama langkah pencernaan
untuk membuat perpustakaan gen dengan nomor berbeda dari
pasangan basa DNA yang dihapus.
METODE REKOMBINASI NONHOMOLOG

Dipandu oleh informasi struktur
dan biokimia (independen pada
homologi)– dihalangi kompleksiti
struktur protein & fungsinya
• Random mutagenesis: (-) perlu
pengetahuan detail
• DNA shuffling: (-) perlu ilmu
detail menciptakan enzim hybrid
oleh multiple crossover (homolog
dependen bersusun tinggi)
• StEP: Homologi dependen
susunan tinggi
• ITCHY & SHIPREC: Homology-
Independent tetapi terbatas pada
single crossovers.Increased possible crossovers
(the darkness of the bar)

STRATEGI DESAIN RASIONAL- DIRECTED EVOLUTION

Meningkatkan enzyme fitness untuk aplikasi yang ditentukan
Enzyme adaptasi:
• Meningkatkan aktifitas Substrat Baru
• Substrate specificitas -- Multiple substrates affinity
• Thermostabilitas-- melting point (Tm)
• Adaptasi Temperatur: Activitas pada suhu yang berbeda
-- Psychrophilic vs. Mesophilic vs. Thermophilic
• Stabilitas atau aktifitas pada linkungan artificial/buatan
-- Solvent vs. aqueous solutions
-- Metal ions (protease)
• Antibiotic resistansi

• Antibiotic resistansi
Librari generasi mutan acak enzim TEM-1
menggunakan P dan 8 -oxoG mutagenesis
Kanan: A-TEM 1 mutan (3D.5) yang dihasilkan
oleh random mutagenesis dengan 2.500 kali
lipat aktivitas hidrolisis yang lebih tinggi
terhadap antibiotic sefalosporin (dari Zaccolo
dan Gherardi, J mol Biol 1999).

STRATEGI DIRECTED EVOLUTION

APLIKASI METODE REKOMBINASI
•Rancangan rekombinan Hemoglobin manusia digunakan
untuk menentukan pengganti darah.
Looker D, Abbott-Brown D, Cozart P, Durfee S, Hoffman S,
Mathews AJ, Miller-Roehrich J, Shoemaker S, Trimble S, Fermi
G, et al Nature 356:258-60 , (1992)
•Efek Penanaman allosterik unik dari buaya kepada
hemoglobin manusia, Komiyama NH, Miyazaki G, Tame J,
Nagai K Nature 373:244-6 (1995)
•Merekayasa mutan HGF/SF dengan ikatan yang dikurangi
untuk heparin sulfat proteoglikan dan meningkatkan aktifitas in
vivo. Hartmann G., Prospero T., Brinkmann V., Ozcelik O.,
Winter G., Hepple J., Batley S., Bladt F., Sachs M.

Susunan Asam amino Alignment pada Subtilisin S41(Davail, et.al 1992), S39 (Narinx, 1992), SSII (Wati,1997),
BPN (Wells, 1983), E (Stahl Ferrari ,84’),Carlsberg (Jacobs,85’) dan Termitase (Meloun, 85’). Alignmen
multiple dilakukan dengan CLUSTAK W (Thompson,94’). Residu ditemukan frekuen >50% pada posisi
(hitam). Mutasi pada 3-2G7 dilabelkan dengan Kotak terisi. Gap pada susunan (0)

Lineage substilisin varian S41.
Varian generasi pertama
Yang didapat sebelumnya.
(Miyazaki&Arnold, 1999).
Tujuh mutasi didapat dari
Generasi pertama direkombi-
nasikan oleh StEO dan varian
terbaik, 2-6C5 didapat pada
generasi Pustaka kedua.
Diparentkan /dihubungkan
dengan gen orangtua untuk
Menciptakan generasi pustaka
ketiga oleh PCR Error prone.
Hanya nonsinonim mutasi
ditunjukkan.

Subtilisin dari struktur yang diketahui. Tujuh mutasi termostabli diidentifikasi padad
varian 3-2G7. Kalsium Ca hitam menindikate site ikatan Ca2+ yang ketat dan indikate
Ca abu abu site mengikat Ca2+ yang lemah, yang dilokasikan dibelakang loop yang
mengandung Ser175 Model diciptakan menggunakan MOLSCRIPT (Kraulis, 1991).
Dependasi Temperatur aktifitas spesifik subtilisin S41, 3-2G7, dan SS11.

Divergent evolution leads untuk
Adaptasi pada lingkungan yang berbeda
Sebuah trade off antara aktivitas katalitik
pada suhu dan thermostabililt rendah

Directed evolution Enzim psychrophilic, Subtilisi S41
3-2G7: 7 mutasi asam
amino setelah jumlah siklus
shuffling
J. Biological Chemistry, 2000, 275: 31635
Ar, Aktifiti residu;
Ai, activitas inisial
Red dots: wild-type
clones Menunjukkan
reprodukibilitas
Assays pada temperatur
yang berbeda

Rekayasa Stabilitas Enzim – T4 Lysozye
Dengan Introduksi pada Iktan S-S

Rekayasa Stabilitas Enzim – Triosephospate isomerase dari Yeast
dengan menggantikan Asn (deaminasi pada temperatur tinggi)

Rekayasa Aktifitas Enzim – Tyrosyl-tRNA synthetase dari B.
Stearothermophilus dengan menggantikan Thr 51 (meningkatkan
affinitas ATP)

Rekayasa Pengaruh Ca – menganalisa Independensi Subtilisin
Saturasi mutagenesis -> 7 dari 10
daerah ditemukan untuk
memberikan peningkatan stabilitas
Mutan:
10x lebih stabil daripada enzim asli
dalam ketiadaan Ca
50 % lebih stabil daripada enzim
asli dengan adanya Ca

Mengurangi Sensitifitas Protein
•Streptococcus streptokinase, 47 kDa protein yang melarutkan clot darah
•Komplex dengan plasminogen untuk merubah ke plasmin, yang menurunkan serat pada clot,
Plasmin juga menurunkan streptokinase [feedback loop]
•Membutuhkano administer streptokinase pada 30-90 min infusi[heart attacks]
•A long-lived streptokinase diadministered sebagai single injection
•www-s.med.uiuc.edu; JMorrissey: Med Biochem 10/30/06

•www-s.med.uiuc.edu; JMorrissey: Med Biochem 10/30/06
•Streptococcus streptokinase, plasmin
sensitivity domain
•Attacks at Lys59 and Lys382, near each
end of protein
•Resultant 328 AAc peptide has ~16%
activity
•Mutate Lys to Gln
•Gln has similar size/shape to Lys also no
charge
•Single mutations similar to double to
native in binding and activating
plasminogen;
•In plasmin presence, half-lives increased
with double as 21x more resistant to
cleavage
•TBD…(2003) longer life wanted
Mengurangi Sensitifitas Protein

Mushroom peroxidase
•Wash conditions:
bleach-containing
detergents, pH 10.5,
50C, high peroxide
concentration
(inactivates peroxidas)
•Random mutagenes or
error-prone PCR,
followed by DNA
shuffling
•One construct had 114x
increase in thermal
stability, 2.8x increase in
oxidative stability
•Peroxidase, ink cap mushroom; dye transfer inhibitor

Molecular analysis hybrid peroxidase
•ex., Coprinus cinereus heme peroxidase (ink cap
mushroom); 343 AAc, heme prosthetic gr
•Multiple rounds directed evolution to generate
mutant for dye transfer inhibitor in laundry
detergent
•Native form or WT is rapidly inactivated under
laundry conditions at pH 10.5,
•50C and high peroxide concentrations (5-10mM)
•Combined mutants from site-directed and
random mutagenesis led to mutant with
•110x thermal stability, 2.8x oxidative stability
•Additional in vivo shuffling of pt mutations ->
174x thermal stability and 100x oxidative stability
•Cherry…Pedersen. 99. Nat Biotech “Directed evolution
of a fungal peroxidase”

Glycosylation
1 Thiol Tag (X: –SH)
2 Amine Tag (X: –NH2)
3 Carbonyl Tag (X: –C=O)
4 Olefin Tag (X: –=)
5 Azide Tag (X: –N3)
6 Alkyne Tag (X: –≡) .
Modifikasi bentuk kualitatif kimia , misalnya, biotinylation untuk tag afinitas,
fluoresensi label untuk visualisasi, sering mengabaikan isu-isu strategis utama
Tingkat Konversi - beberapa modifikasi metode kimia protein yang dipakai
sekarang telah dioptimalkan untuk tingkat yang memungkinkan konversi lengkap.
Partial konversi menciptakan kembali kebutuhan untuk pemurnian dimodifikasi dari
yang tidak dimodifikasi.
Selektivitas - metode yang dirancang untuk chemoselectivity jarang dilakukan
dalam konteks protein, yang seringkali mengandung banyak kelompok fungsional
sebagai potensial, kompetitif, reaktif partner.
PEGylation as
a Mimic of Glycosylation
1 Amine Tag (X: –NH2)
2 Azide Tag (X: –N3)
3 NCL Assembly
4 Hydroxyl Tag (X: –OH)
5 Thial Tag (X: –SH)
6 Disulfide Tag (X: –SS)
Lipidation
1 NCL Assembly
2 Hydroxyl Tag (X: –OH)
3 Thiol Tag (X: –SH)
4 Olefins (X: –=)
METODE MUTASI KIMIA POST TRANSLASI

-Teknologi dengan cara:
- Menghilangkan atau menambahkan daerah Glycosylation
- Merubah sifat biokimia atau aktifitas Protein
- Meningkatkan kestabilan protein
Dengan Merubah Daerah Glycosylation:
-Menggunakan teknik Mutagenesis Site-Directed untuk menetapkan
Daerah glycosylation yang baru. Sebagai contoh Erythropoietin.
-Hubungan direct/langsung antara Karbohidrat yang mengandung Asam
Sialik dan serum half-life nya dan aktifitas biologi in vivo.
-Hubungan Inverse/berlawanan antara ikatan Reseptor (contoh:
Glycosylation yang lebih banyak menyebabkan lemahnya ikatan)

Glycosidase:
Glikosida digunakan utnuk mendapatkan informasi tentang group
karbohidrat yang dilampirkan pada glikoprotein dan glikopeptida.
Glikosida ada pada dua variasi :
=Endoglikosida yang memotong seluruh group karbohidrat dari
protein dan exoglikosida yang menghilangkan monosakarida dari
ujung nonreduced pada karbohidrat.
Pengurangan ujung diciptakan oleh endoglikosida
Endoglikosida diikuti oleh satu atau lebih eksoglikosida dant
menganalisa produk menggunakan SDS-PAGE atau beberapa tipe
kromatografi cair.

Pengobatan Anemia dengan perlakuan awal
•Hypothesis :
Glikosilasi yang lebih banyak menyebabkan:
‐‐> half life yang lebih panjang
‐‐> Lebih aktif
‐‐> mengurangi afinitas ikatan
Produk pemrosesan :
HyperglycosylatedEPO (Aranesp)
Hasil In vivo
Tidak adanya kehilangan pada fungsi obat
Penambahan serum half‐life (3‐fold lebih panjang)
Mengurangi frekuensi administrasi

Amine Tag (X: –NH2)
Fig. 5 Modification of a protein with a generic 2-methoxy-2-imino activated monosaccharide.
a four equivalents of sodium methoxide; b pH 9.5, 2 h, 41 of 59 residues modified. BSA bovine
serum albumin
Glycan dimulai dari penggabungan daerah baru yang untuk kebutuhan
target sintesis reagen glycan kompleks dengan strategi untuk memulai
situs-selektif.
Meskipun peran glycans tersebar luas daam fungsi protein , ia hanya
muncul pada kasus-kasus dasar. Metode untuk mengakses glycoforms
murni atau meniru nya, saat ini mulai memainkan peranan kritis dalam
aspek unpicking yang tepat untuk fungsi glycan.

Modification of HSA using squarate-
mediated coupling. a DMF, Et3N, 40%;
b HSA, HCO3 buffer, pH 9.0, 25% of
lysine residues modified
Modification ketone handle introduced in the Z-
domain of staphylococcal protein A
with oxyamine-functionalized N acetylglucosamine.
Conditions are a NaOAc buffer, pH 5.5 and b (1)
UDP-Gal, β-1,4-GalT, (2) CMP-Sia, α-2,3-SiaT
(Olefin Tag)

Protein Kinases:
Penambahan reversible gugus fosfat pada protein penting untuk transmisi sinyal
dalam sel eukariotik dan, sebagai akibat, fosforilasi protein dan dephosphorylation
banyak mengatur proses seluler yang beragam. Karena jumlah kinase protein yang
dikenal telah meningkat dengan kecepatan yang terus meningkat, maka menentukan
protein kinase yang berinteraksi dengan substrat dalam sel dapat dilakukan.
Penentuan motif situs konsensus fosforilasi oleh urutan asam amino selaras dari
substrat yang dikenal telah terbukti bermanfaat dalam pengerjaan ini.
Motif ini dapat membantu untuk memprediksi situs fosforilasi untuk kinase protein
tertentu dalam substrat protein potensial.
Protein Phosphatases:
Protein fosforilasi memainkan peran dalam regulasi fungsi dan aktivitas faktor protein
dan enzim.
Protien fosforilasi dapat ditemukan pada tirosin, serin dan threonie residu. Analisis
adanya fosforilasi tersebut, dan efek petugas nya, sering dibantu oleh penghapusan
kelompok protein fosfat oleh fosfatase.

-PEGylation (monomethoxypolyethyleneglycol)
-Kovalen lampiran polimer, poli (ethylene glycol) (PEG) secara khusus,
untuk protein terapeutik adalah metode mapan (Harrisdan Catur 2003).
-Digunakan untuk meniru beberapa efek alam glikosilasi dalam rangka
meningkatkan perlindungan protein terhadap degradasi enzimatik,
memperpanjang sirkulasi setengah hidup dan meningkatkan daya
larut.
Prinsip serupa dengan Glycosylation:
Aplikasi pada Protein Drugs menghasilkan :
- Secara relatih memiliki half-lives yang singkat
- Distribusi tissue/jaringan yang lebar
- Potensial untuk Immunogenicity

METODE LIPIDASI
Tipe dominan : myristoylation, prenylation dan palmitoylation.
Protein prenilasi alam mengacu pada lampiran pasca-translasi rantai lipid farnesyl (C-
15) atau geranylgeranyl (C-20) urutan tertentu pada tulang punggung protein dan
dimodifikasi di C-terminal protein.
Proses ini dikatalis oleh tiga enzim berbeda: protein farnesyltransferase dan protein
geranylgeranyltransferase tipe I dan II.
Prenylation memiliki efek dramatis pada lipophilicity target protein, membantu
membran menahan protein, Ex.Ras G-protein membentuk kompleks dengan protein
pendampingnya,REP, selanjutnya terprenilasi .
Farnesylation Protein dan geranylgeranylation memainkan peran penyakit , seperti
osteoporosis, penghambatan geranylgeranylation mencegah pembentukan dan fungsi
normal osteoklas, sel-sel terlibat dalam penghancuran jaringan tulang, dan progeria
Hutchinson-Gilford, penyakit dimana pasien mengalami penuaan cepat.
REKAYASA PROTEIN
POST TRANSLASI KIMIA MIMIK

Modification of a tyrosine residue with
farnesyl or rhodamine by palladium-
mediated
π-allyl coupling of an allyl acetate or
carbamate precursor. Conditions are a
Pd(OAc)2, Triphenyl
phosphine trisulfonate (TPPTS),
H2O/dimethyl sulfoxide, pH 8.5–9.0
Carbenoid reactions with tryptophan as an aromatic tag. Although currently nonselective,
these reactions highlight a useful new reaction type for protein modification

Teknik ini adalah rekayasa protein baru / novel dengan menggabungkan
atau menyatukan susunan protein protein berkode pada satu gen
terhadap susunan protein berkodekan gen yang berbeda.
Contoh yang ada adalah penggunaan An untuk meracuni langsung
daerah target.
Seperti Denileukin diftitox (Ontax) – yaitu terapi yang disetujui FDA
untuk Kanker, dengan hasil 30% pasien menglami pengurangan
pembesaran tumor sebesar 50%.
Ontak berasal dari Fusion Protein : IL‐2 + diptheria toxix dan aa 2nd‐133
human IL‐2 +1st‐389 aa of diptheria toxintargets IL‐2 receptors pada
CTCLs untuk membunuh sel.
Denileukin diftitox (Ontak) telah disetujui FDA pada terapi kanker
Ontak mengikat permukaan sel lymphoma melalui reseptor IL‐2
Saat Internalisasi, diptheria toxin membunuh sel sel.
TEKNIK PENGGABUNGAN PROTEIN (FUSI)

 Protein ekstraseluler
 Tahapan isolasi
 Sentrifugasi cairan sel/ medium kultur  menghasilkan :
 Supernatan (crude extract)
 Pelet (sel & komponen non-protein)
 Protein intraseluler
 Tahapan isolasi :
 Cuci jaringan/ sel dengan bufer salin : untuk menghilangkan pengotor/
bahan ekstraseluler
 Sel mikroba : sentrifugasi & resuspensi dalam bufer
 Lisis sel  memecah/membuka sel  ekstrak : homogenat
 Menggunakan mortar/pestle, homogenizer, sonicator, tissue grinder,
cell disruptor, blender
 Menghasilkan : homogenat
 Sentrifugasi  menghasilkan :
 pelet (mengandung protein membran)
 supernatan (crude extract)
TEKNIK ISOLASI PROTEIN

KLASIFIKASI METODE ISOLASI PROTEIN vs JARINGAN
Klasifikasi Metode Isolasi Protein Berdasarkan Jenis
Jaringan Protein

Tujuan dari Pemisahan Protein adalah
kemurnian,
 penggunaan bentuk aktif
jumlah langkah minimum
Memungkinkan waktu yang singkat
TUJUAN PEMISAHAN PROTEIN
JANGAN MEMBUANG BAHAN BAHAN MURNI PADA IMPUPRE PROTEIN
PEMISAHAN DILAKUKAN BERDASARKAN KELARUTAN, UKURAN, MUATAN, DAN IKATAN AFINITAS

TEKNIK PENGHILANGAN KOMPONEN NON-PROTEIN

 Metode Kromatografi
 Protein protein membedakan bentuk dan charge
 Ion exchange Kromatografi
 Anion and Cation
 Gel Filtrasi (size exclusion)
 Memisahkan berdasarkan ukuran
 Metode Afinitas
 Affinitas terhadap ligands
 Rekayasa afinitas sites, e.g. histidine tag
METODE PEMISAHAN PROTEIN

TEKNIK PEMISAHAN PROTEIN - KROMATOGRAFI
Kromatografi gel filtrasi.
Campuran protein dalam volume kecil diterapkan pada kolom yang diisi dengan manik-
manik berpori.
Karena protein yang besar tidak bisa masuk volume internal manik-manik, mereka
muncul lebih cepat daripada yang kecil.

 Metode Penggaraman/Salting out
Kelarutan sensitif terhadap kekuatan ion. Awal "salting in" dan
kemudian "salting out" pada kadar garam tinggi. Pelarut terikat dengan
berinteraksi pada garam sehingga tidak cukup untuk melarutkan protein.
Kadar garam maksimal pada target protein larut, sentrifuge dan
membuang pelet. Tambahkan cukup garam untuk menurunkan
protein. Kumpulkan pelet.
 Pelarut organik
Mempunyai prinsip sama dengan penggaram; mengambil keuntungan
dari kelarutan yang berbeda. Menghindari total protein denaturasi.
 pH
Protein memiliki kelompok berionisasi berrentang pKs. Ketika muatan
total protein nol (titik isoelektrik/pI). Protein paling larut pada pl karena
interaksi mereka untuk meminimalkan muatan muatan.
 Kristalisasi
Metode kelarutan dimana protein adalah ppt dapat digunakan untuk
menumbuhkan kristal protein. Terjadi ketika protein relatif murni.
TEKNIK PEMISAHAN KELARUTAN / SOLUBILITAS

 Ketika konsentrasi garam yang tinggi hadir, protein cenderung terkumpul
dan mengendap keluar dari solusi: "salting out / penggaraman keluar"
 Endapan protein yang berbeda pada konsentrasi garam berbeda. pH, suhu
dan kemurnian protein memainkan peran menentukan titik salting out.
 Amonium sulfat adalah garam yang dipilih karena menggabungkan banyak
fitur yang berguna:
 Efektifitas penggaraman / Salting out
 pH versalitas
 Kelarutan tinggi
 Larrutan dengan temperature panas
 Harga yang rendah
 Amonium sulfat konsentrasi: persentasi kejenuhan
 Persamaan sederhana untuk perhitungan gram amonium sulfat yang
dibutuhkan untuk membuat suatu solusi X% dari% Xo:
515 (X-Xo)
G=-------------------------
100-0,27X
TEKNIK PENGENDAPAN AMONIUM SULFAT
(SALTING OUT)

TEKNIK ISOLASI PROTEIN DIALISIS

Low salt
High salt
P+ + Na+
Na+ + P+
IONIC ELUTION
pH ELUTION
TEKNIK ISOLASI KROMATOGRAFI ION EXCHANGE

TEKNIK ISOLASI KROMATOGRAFI ION EXCHANGE

STRONG CATION
─SO3
- ─ Sulpho
─ CH2SO3
- ─ Sulphomethyl
─ C3H6SO3
-─ Sulphopropyl
WEAK CATION
─ COO- ─ Carboxy
─ CH2COO- ─ Carboxymethyl
STRONG ANION
─ CH2N+(CH3)3 ─ Triethylaminomethyl
─ C2H4N+(C2H5)3 ─ Triethylaminoethyl
─ C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3 ─ Diethyl-2-hydroxy-
propylaminoethyl
WEAK ANION
─ C2H4N+H3 ─ Aminoethyl
─ C2H4N+H(C2H5)2 ─ Diethylaminoethyl
TEKNIK PEMURNIAN PROTEIN ION EXCHANGE

Porous beads yang terbuat dari
material yang berbeda. Ukuran
pores dapat dikontrol.
Molekul kecil cukup mudah
untuk melalui beads yang lebih
besar ukurannya dan berkeliling
kemudian mengalir lebih cepat.
Pengecualian pada semua
protein yang terlalu besar untuk
melalui pores.
 Dapat digunakan sebagai
metode preparasi atau digunakan
untuk menentukan ukuran
molekul.
Gels terbuat dari deekstran,
agarose or polyacrylamide
TEKNIK PEMISAHAN PROTEIN – FILTRASI GEL

 Ligan yang memiliki ikatan kuat
terhadap protein ditempatkan
pada matriks :
 Protein dengan ikatan yang
diinginkan tetapi yang lain
dapat melalui.
 Elute menggunakan larutan
ligan.
 Selain molekul kecil, juga dapat
menggunakan antibody
 Kemajuan biologi molekuler
memerlukan rekayasa grup
poli-nya yang mengikat Ni atau
menggunakan bagian dari
protein lain dan kolom yang
mengikat ke protein lain
TEKNIK PEMISAHAN PROTEIN – METODE AFINITAS

TEKNIK PEMISAHAN PROTEIN – METODE AFINITAS

TEKNIK ISOLASI PROTEIN dan VISUALISASI
•Protein bermigrasi pada medan listrik pada tingkat yang
tergantung pada muatan total, ukuran, dan bentuk
•Elektroforesis gel merupakan teknik pemisahan oleh muatan
(pemisahan dalam media sebagai gels) pada media Gel berpori
(pati / poliakrilamida): gel & pewarnaan
•Fokus isoelektrik *: protein dipisahkan dalam gel gradien pH
berkelanjutan, protein berpindah ke titik pada gel yang sama
untuk pl nya, yaitu tak ada muatan.
•SDS-PAGE *: Sodium Dodecil Sulfat - elektroforesis gel
poliakrilamida yang memperlakukan protein dengan deterjen ionik
yang memisahkan berdasarkan ukuran
SDS mengikat protein @ 1 SDS / 2 aa's sehingga proporsional
terhadap massa jenis protein.

TEKNIK ISOLASI PROTEIN – SDS PAGE

 Identification – biasa dilakukan dengan spectrophotometry
spectrophotometers mengukur intensitas cahaya beam sebelum dan
sesudah cahaya melewati larutan solveent dengan sampel terlarut
padanya, (in a cuvette)... Membandingkan intensitas dua cahaya
terhadaap panjang gelombang yagn dilewati.
 Percent transmittance...
Rasio dari intensitas cahaya melewati sampel terhadap intensitas
cahaya yang bersinar pada sampel dikalikan 100%.
Absorbance... adalah logaritma transmittans
Instruments... Spectronic 20/ spectrophotometer UV/ Vis
TEKNIK IDENTIFIKASI PROTEIN DAN QUANTIFIKASI

 UV absorbance at 280 nm. (measures aromatic aa's)
Colorimetry reactions - colored dye binds to amino acids
 Ninhydrin reaction - rx's w amino = blue color (10-9 M)
Biuret test = mg quantities… based on Copper ion
binds stiochiometrically = violet color
Bradford test = ug amounts
based on dye Coomassie blue - binds to peptide
Fluoroescamine dye = pg quantities... (10-12 M)
 Quantifikasi jumlah protein ditampilkan berdasarkan hukum BEER-
LAMBERT linear relationship antara... light Absorbance vs. Conc
 Protein Standard Curve
TEKNIK DETEKSI PROTEIN
METODE SPEKTROFOTOMETRI

Berkaitan jumlah protein &aktivitas enzim
1 (internasional) UNIT KEGIATAN Enzim
jumlah protein yang mengubah 1 micromole dari
Substrate ke produk per menit pada 250C pada pH yang optimal
UREASE - 1 unit (IU) akan membebaskan 1,0 μmole amonia dari
urea per menit pada pH 7,0 pada suhu 25 ° C
[Equivalent untuk 1.0 I.U.]
1UNIT KEGIATAN KHUSUS
jumlah micromoles dikonversi per min per mg protein
yaitu, Unit (seperti di atas) aktivitas enzim per mg protein
1 UNIT KEGIATAN MOLEKUL
jumlah unit aktivitas enzim per μmole
TEKNIK QUANTIFIKASI KONSENTRASI PROTEIN
DENGAN AKTIFITAS ENZIM

Protein Purification
TEKNIK PURIFIKASI PROTEIN

E. coli tidak dapat digunakan untuk menghasilkan beberapa protein terutama yang
membutuhkan modifikasi pasca-translasi untuk aktivitas biologis dan beberapa
kompleks protein lain yang mengandung beberapa ikatan disulfida.
Selain itu, banyak protein disajikan dalam E. Coli adalah akumulasi intra dalam bentuk
larut, inklusi bodies tidak aktif, dari aktivitas biologis yang harus dipulihkan oleh
denaturasi rumit dan mahal serta proses refolding.
Kelemahan E. coli menyebabkan perkembangan penggunaan sistem ekspresi dengan
sel hewan / sel tumbuhan.
Namun, meskipun sistem tersebut telah terbukti mampu menghasilkan protein aktif
yang otentif, sering ditemui kegagalan untuk mengembangkan metode yang
sederhana dan efisien, hasil tinggi, biaya rendah untuk produksi protein dalam jumlah
besar.
Kemajuan dalam protein refolding, translokasi dan peran chaperons molekul dan
foldases telah memungkinkan desain strain E. coli rekombinan yang menumpuk
protein dalam bentuk terlarut, protein mensekresikan ke periplasm, ekspor ke
medium, dan protein langsung ke membran luar sel untuk menampilkan
permukaan. Kemajuan ini akan diperkuat lebih lanjut status dominan E. coli sebagai
host untuk produksi protein rekombinan.
APLIKASI TEKNIK FUSION PROTEIN

untuk menargetkan ekspresi protein ke kompartemen selular
tertentu, yaitu, dengan ruang sitoplasma, ruang periplasmic atau
medium, terletak pada keseimbangan keuntungan dan
kelemahan dari masing-masing kompartemen (Gambar 2).
Figure 2. Keuntungan dan Kerugian
produksi pretin pada setiap kompartemen
Escherichia coli

Expression Systems: Overview
Dalam vektor ekspresi pMal Fusion ™ dan
Sistem PemurnianbProtein, kloning gen
dimasukkan ke dalam vektor vektor
ekspresi pMal turun dari gen laki-laki, yang
menyandikan protein-pengikat maltosa
(MBP).
Hal ini menyebabkan ekspresi protein fusi
MBP-yang kemudian dimurnikan oleh
pemurnian afinitas satu langkah khusus
untuk MBP.

Secreted protein processing with K. lactis. In the nucleus, an integrated
expression vector encoding a fusion between the α-MF domain (blue)
and a desired protein (black) is expressed.
A signal peptide in the α-MF domain directs entry of the fusion protein
into the endoplasmic reticulum (ER) and is removed by signal
peptidase (SP). The fusion protein is transported to the Golgi where the
Kex protease removes the α-MF domain. The protein of interest is then
secreted from the cell.

Purifikasi step tunggal chromatographic
Target penggabungan protein pada setiap
terminal C- or N
-Tidak memerlukan proteasis
-- T7 promotor menjadmin level ekspresi yang
tinggi
-- Hasil protein dengan susunan native
- Eluted protein dengan C-terminal thioester
dapat menjadi ligase untuk ptptida atau protein
(Intein Mediated Protein Ligation, IPL
Kit memungkinkan fusi dari Tag yang terdiri dari
ikatan intein dan domain chitin domain (CBD),
pada C-terminus (pTXB1) atau N-terminus
(pTYB21) target protein.
Dengan adanya thiols, seperti DTT, intein
menjalanin pemotongan sendiri yang sepesik
yang melepaskan target protein dari ikatan Tag
chitin-intein

•In Vitro Protein Sintesa Kit:
Sistem Transkripsi/Translasi Sel Bebas
•Rekonstitusi dari komponen murni seperti translasi E. coli
•Komponen Recombinant bebas mengkontaminasi exonucleases, RNases dan proteases
•Hasilnya protein yang bebas untuk dimoddifikasi dan degradasi
•Reaksi satu langkah membutuhkan pencampuran hanya dua tabung diikuti oleh penambahan
Template DNA hanya beberapa jam
•Sintesa protein divisualisasikan dengan Pewarnaan Gel Coomassie

Ideal untuk skrining proteomic throughput yang tinggi, isolasi protein kecil , isolasi
immunomagnetic atau percobaan pemisahan sel
- Memurnikan tagged protein, antigen, antibodi atau asam nukleat
- Pemisahan cepat fase-padat dari larutan
- Substrat immobil tetap aktif secara biologis
- Elute dalam volume kecil atau digunakan sebagai ligan dalam interakasi pull-
down atau target percobaan yang melibatkan DNA atau protein
Magnetic
Separation Racks
Magnetic Affinity

Protein Tools and
Glycomics Overview

Protein engineering

Empfohlen

Empfohlen

Weitere ähnliche Inhalte

Was ist angesagt?

Was ist angesagt? (20)

Ähnlich wie Protein engineering

Ähnlich wie Protein engineering (20)

Mehr von Siti Julaiha

Mehr von Siti Julaiha (16)

Protein engineering