Die Studie untersucht die zytotoxischen Effekte des intrastromalen Krumeich-Kornearings auf menschliche dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (HMVEC). Die Ergebnisse zeigen, dass der Krumeich-Ring keine signifikanten toxischen Effekte hat, während verdünnte Molybdän-Extrakte tendenziell die metabolische Aktivität der Zellen steigern. Diese Erkenntnisse unterstützen die Hypothese, dass der Ring eine übermäßige Vaskularisation des Spendergewebes verhindern kann.

1. Originalien
Ophthalmologe
DOI 10.1007/s00347-016-0259-z
© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2016
C. Schmidt1
· S. Fabinyi2
· S. Rehfeldt1
· S. Klöpzig1
· V. Jentzen1
· J. Bohrisch1
·
A. Messner2
· J. Storsberg1
1
Fraunhofer-Institut für Angewandte Polymerforschung IAP, Potsdam-Golm, Deutschland
2
HumanOptics AG, Erlangen, Deutschland
Nichtantagonistische
Wirkungsweise des
intrastromalen Krumeich-
Kornearings in einem
experimentellen
Gewebekultursystem
Die Zahl an Hornhauttransplantationen
steigt jährlich, gleichzeitig aber mangelt
es an der Verfügbarkeit von Spenderge-
weben hoher Qualität [6, 18]. Ein An-
satz zur Verbesserung dieser Situation ist
beispielsweise die Anwendung geeigne-
ter chirurgischer Verfahren, um den bei
Transplantationen anfallenden Gewebe-
ausschuss der Spenderhornhäute zu ver-
ringern [3]. Zur Verlängerung der Über-
lebenszeit des Transplantats ist außer-
dem eine Reduzierung von Immunreak-
tionen, die in direktem Zusammenhang
mit der Ausbildung von Neovaskularisa-
tionen stehen [20], zu erstreben.
Lässt man die Aspekte der Indikatio-
nen und chirurgischen Verfahren außer
Acht und konzentriert sich stattdessen
auf das Einsetzen des Spendergewebes in
die Wirtshornhaut, so erfordern die je-
weilsunterschiedlichenBrechungseigen-
schaften von Spender- und Empfänger-
hornhaut eine bestimmte, unveränderli-
che Positionierung des Spendermaterials
während seiner gesamten Lebensdauer.
Dies trägt wesentlich zu einer Reduzie-
rung von optischen Artefakten, wie z. B.
einem Astigmatismus, bei [4, 12, 14].
Teile der Arbeit wurden auf dem Kongress
der European Association for Vision and Eye
Research (EVER) im Oktober 2015 in Nizza,
Frankreich,präsentiert.
Eine Methode zur stabilen Fixierung
des Spendergewebes in der Hornhaut
des Empfängers stellt das Einbringen
eines intrastromalen kornealen Rings in
das Interface zwischen Transplantat und
verbleibendem Gewebe dar [8]. Aller-
dings besteht in der Literatur – unter
der Annahme, dass die untersuchten
Kohorten und Materialen zwischen den
unterschiedlichen Studien vergleichbar
sind – keine Einigkeit über den Effekt,
den ein legierter Ring aus Cobalt (Co),
Chrom (Cr), Molybdän (Mo) und Titan
(Ti) in der klinischen Anwendung mit
sich bringt. Auch ist kein zugrunde lie-
gender Wirkmechanismus offensichtlich
[1, 8, 9].
Positive Effekte, die auf den Einsatz
des intrastromalen Rings (bestehend aus
Tab. 1 Katalognummer,ReinheitsgradundGrößenbereich derPartikel dereinzelnen Kompo-
nenten derKrumeich-Ring-Legierung nach Angaben desHerstellers (Goodfellow,BadNauheim,
Deutschland)
Katalognummer Material Reinheit (%) Partikelgröße (µm)
CO006011
482-522-92
Cobalt 99,9 50–100
CR006025
034-654-92
Chrom >99 38–45
MO006011
802-109-88
Molybdän >99,9 55–355
TI006020
051-375-01
Titan 99,5 <150
69,5 % Cobalt, 24 % Chrom, 4,5 % Mo-
lybdän und 2 % Titan) zurückzuführen
sind, beschrieben Krumeich und Dun-
cker [9] in einer prospektiven, rando-
misierten Studie, in der 179 konsekutive
Augen, die denintrastromalenkornealen
Ring erhielten(nachfolgend als Gruppe 1
bezeichnet), und 101 konsekutive Augen
ohne Ring (nachfolgend als Gruppe 2 be-
zeichnet) untersucht wurden. Die Auto-
ren beobachteten innerhalb von 48 Mo-
naten Immunreaktionen mit einer Häu-
figkeit von 1,14 % in Gruppe 1 verglichen
mit 7 % in Gruppe 2. Der Unterschied
erwies sich als statistisch relevant (p =
0,02;Log-Rank-Test).ZudemgebenKru-
meich und Duncker an, dass bei 18 Au-
gen mit Ring oberflächliche Vaskularisa-
tionen in 1 bis 1,5 Quadranten am Ring
Der Ophthalmologe

2. Originalien
10% DMSO
24h
Inkubation
100x Mag.
24h
Inkubation
+
Medium
Kontrolle
100x Mag.
2h
Inkubation
+
Medium
Kontrolle
+
MTT
100x Mag.
Abb. 1 8 Höhere Konzentrationen deraus den einzelnen Komponenten
derKrumeich-Ring-Legierung vorbereiteten Extrakte verändern dieZell-
morphologie unddas Erscheinungsbildvon dunkelblauem Tetrazolium-
Metabolit-Präzipitat. Die Umsetzung von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium Bromid(MTT)wurde als metabolischerMarkerheran-
gezogen. Gezeigt sindhierrepräsentative mikroskopischePhasenkontrast-
bilder(100-fache Vergrößerung)dermenschlichen dermalen mikrovasku-
lären Endothelzellen von erwachsenen Spendern (HMVEC)Kulturen vorder
Zugabe derjeweiligen Extrakte,nach 1TagKontakt mitden Extrakten und
nach Beendigung des MTT-Tests vorderZelllyse undBestimmung deropti-
schen Dichte. HMVEC wurden derWachstumsmediumkontrolleausgesetzt.
HMVECmenschlichedermalemikrovaskuläreEndothelzellenvonerwachse-
nen Spendern,MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
Bromid
24h
Inkubation
100x Mag.
Extrakt 100 % 50 % 20 % 10 %
24h
Inkubation
+
Cr-
Extrakt
100x Mag.
24h
Inkubation
+
Cr-
Extrakt
+
MTT
100x Mag.
Abb. 2 8 HMVEC wurden Chrom ausgesetzt.Nähere Erläuterungen
s. . Abb. 1.HMVEC menschliche dermale mikrovaskuläre Endothelzel-
len von erwachsenen Spendern,MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium Bromid
stopptenund nicht darüber hinaus in das
Transplantat wuchsen. Als dritten Punkt,
der die Annahme eines durch den Ring
positiven hervorgebrachten Effekts un-
terstützt, berichtendie Autorenvoneiner
Transplantatüberlebensratevon98,8 %in
Gruppe1und93 %inGruppe2miteinem
statistischsignifikantenUnterschiedzwi-
schen den Gruppen (p = 0,021; Kaplan-
Meier-Schätzung).
In scharfem Kontrast hierzu bringen
Birnbaum et al. [1] den Einsatz des in-
trastromalen kornealen Rings mit nega-
tiven Auswirkungen in Zusammenhang.
Die Autoren untersuchten Patienten mit
Fuchs-Endotheldystrophie oder Kerato-
konus, davon 10 Patienten, die den Ring
erhielten (nachfolgend als Gruppe 1 be-
zeichnet), und zur Kontrolle 10 Patien-
ten ohne intrastromalen kornealen Ring.
Die mittlere Nachuntersuchungszeit be-
trug 27,6 ± 5,3 Monate. Birnbaum et al.
geben an, dass bei 3 Patienten aus Grup-
pe 1 das Hornhauttransplantat abgesto-
ßen wurde, wobei bei 1 Patienten da-
von zusätzlich tief liegende Vaskulari-
sationen im Spendergewebe festgestellt
wurden (p = 0,047). Allerdings räumen
die Autoren ein, dass eine Kausalität zwi-
schen dem Einbringen des Rings und
der beobachteten Immunreaktion nicht
ausdrücklich hergestellt werden konnte.
Eine der schwerwiegendsten Immunre-
aktionen wurde entlang einer tiefen Neo-
vaskularisierung beobachtet, die in das
Transplantat unterhalb des Rings verlief.
Um die scheinbar widersprüchlichen
Aussagen, wie der beiden oben diskutier-
ten Studien, in Einklang zu bringen, ist
ein gründliches Verständnis der Zellbio-
logie an der Grenzfläche zwischen dem
Krumeich-Ring und dem umgebenden
Gewebe erforderlich. Für eine Vereinfa-
chung des Versuchsmodells berücksich-
tigten wir veröffentlichte und somit bis-
lang nicht angefochtene Anhaltspunkte,
die bei der Entwicklung von Neovaskula-
risationen die Notwendigkeit eines un-
verminderten Stoffwechsels von Endo-
thelzellen, höchstwahrscheinlich der Mi-
krovaskulatur, vermuten lassen [2, 7, 11,
15, 17].
Aus diesem Grund war es Ziel dieser
Studie, experimentell den Nachweis zu
bringen, ob der intrastromale Krumeich-
RingmessbarezytotoxischeVeränderun-
gen auf primäre menschliche dermale
mikrovaskuläre Endothelzellen von er-
wachsenenSpendern(HMVEC)bewirkt.
Material und Methoden
Metalle und Beschichtungs-
verfahren
Die einzelnen Bestandteile der Kru-
meich-Ring-Legierung [9] wurden von
der Firma Goodfellow (Bad Nauheim,
Deutschland) bezogen. Angaben zu
Reinheit und Größenbereich der Parti-
kel sind in . Tab. 1 zusammengefasst.
Der Ophthalmologe

3. Zusammenfassung · Abstract
Ophthalmologe DOI 10.1007/s00347-016-0259-z
© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2016
C. Schmidt · S. Fabinyi · S. Rehfeldt · S. Klöpzig · V. Jentzen · J. Bohrisch · A. Messner · J. Storsberg
Nichtantagonistische Wirkungsweise des intrastromalen Krumeich-Kornearings in einem
experimentellen Gewebekultursystem
Zusammenfassung
Hintergrund. Das intrastromale Einbringen
des Krumeich-Kornearings zwischen Trans-
plantat und verbleibendem Hornhautgewebe
scheint eine periphere, oberflächliche
und überflüssige Vaskularisation der
Spenderhornhaut zu verhindern.
Fragestellung. Ziel dieser Arbeit war es,
zytotoxische Effekte des Krumeich-Rings
mittels einer Gewebekultur aus primären
menschlichen dermalen mikrovaskulären
Endothelzellen von erwachsenen Spendern
(HMVEC) zu untersuchen.
Material und Methoden. Im Wachstums-
medium lösliche Extrakte der einzelnen
Komponenten der Krumeich-Ring-Legierung
wurden vorbereitet. Anschließend wurden
HMVEC für 1 Tag zu diesen Extrakten in
3-facher Ausführung gegeben, und es
folgten Untersuchungen mit dem 3-(4,5-
Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
Bromid (MTT)-Reagens. Weiter wurden
HMVEC für 5 Tage auf dem Krumeich-Ring
und auf Polypropylen (PP)-Plättchen, die mit
den einzelnen Bestandteilen der Krumeich-
Ring-Legierung beschichtet waren, gezüchtet.
Anschließend wurde eine Doppelvitalfärbung
mit Fluoresceindiacetat(FDA)/Propidiumiodid
(PI) durchgeführt.
Ergebnisse. Die MTT-Tests zeigten, dass
höhere Dosen der Extrakte die Viabilität
der HMVEC reduzieren, während hingegen
hochverdünnte Extrakte aus Molybdän (Mo)-
Pulver die Stoffwechselaktivitätvon HMVEC
zu steigern schienen. Verglichen mit den Titan
(Ti)- und Chrom (Cr)-beschichteten Plättchen,
zeigte die Anfärbung mit FDI/PI nur wenige
lebende HMVEC auf den Cobalt (Co)- und Mo-
beschichtetenPP-Plättchen. Lebende HMVEC
schienen nach 5 Tagen Inkubationszeit am
Krumeich-Ring zu haften.
Diskussion. Unsere Ergebnisse belegen, dass
derKrumeich-Ring keine zytotoxischen Effekte
in unserem Untersuchungsmodell zeigte.
Höhere Verdünnungen von mediumlöslichen
Molybdänpulver-Extrakten erhöhen die
metabolische Aktivität von HMVEC.
Schlüsselwörter
Krumeich · Biomaterial · Legierung ·
Zytotoxizität · Vaskularisation
Non-antagonistic influence of Krumeich’s intrastromal corneal ring in an experimental tissue culture
system
Abstract
Background. Intrastromal insertion of
Krumeich’s corneal ring between graft and
residual host corneal tissue appears to impair
preripheral, superficial and superfluous
vascularization of donor corneal tissue.
Objectives. The purpose of this study was to
investigate the cytotoxic effects of Krumeich’s
ring using tissue cultures composedof primary
human dermal microvascularendothelial cells
from adult donors (HMVEC).
Materials and methods. Soluble growth me-
dium extracts of the individual components
of Krumeich’s ring alloy were prepared and
HMVEC were exposed to these extracts in
triplicate for 1 day followed by investigation
with 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide (MTT) assays.
Furthermore, HMVEC were cultured for 5 days
on either Krumeich’s ring or polypropylene
(PP) discs coated with individual components
of the Krumeich’s ring alloy followedby double
vital staining with fluorescein diacetate (FDA)
and propidium iodide (PI).
Results. The MTT assays revealed that higher
doses of the extracts appeared to reduce
the viability of HMVEC, while highly diluted
extracts of molybdenum (Mo) powder
appeared to increase the metabolic activity
of HMVEC. The FDA-PI staining showed
only a few live HMVEC on either cobalt
(Co) or Mo-coated PP discs, compared to
the respective titanium (Ti) and chromium
(Cr) counterparts. Viable HMVEC appeared
to attach to Krumeich’s ring after a 5-day
incubation period.
Conclusion. The results confirm that
Krumeich’s ring does not exert measurable
cytotoxic effects in our chosen assay system.
High dilutions of medium-soluble Mo powder
extracts appear to increase the metabolic
activity of HMVEC.
Keywords
Krumeich · Biomaterial · Alloy · Cytotoxicity ·
Vascularization
Der intrastromale Krumeich-Ring wur-
de von der Firma HumanOptics AG
(Erlangen, Deutschland) zur Verfügung
gestellt.
Polypropylen (PP) wurde von der
Firma Borealis, Lutherstadt-Wittenberg,
Deutschland (Bezeichnung: BormedTM
;
Bestellnummer HD850) bezogen. Eine
Spritzgussmaschine (Haake Minijet; Fir-
ma Thermo Electron, Osterode am Harz,
Deutschland) wurde für die Herstellung
der PP-Plättchen herangezogen.
Zellen, Medien und Extraktions-
verfahren
Wir verwendeten primäre menschli-
che mikrovaskuläre Endothelzellen von
erwachsenen Spendern (abgekürzt als
HMVEC; Life Technologies, Darmstadt,
Deutschland; Bestellnummer 011-5C)
mit dem Zellkulturmedium 131 (Life
Technologies; Bestellnummer M-131-
500) und einem Wachstumszusatz (Life
Technologies; Bezeichnung: Bestellnum-
mer S-005-25) nach Empfehlung des
Herstellers. Die Subkultivierung der Zel-
len erfolgte, indem die Monoschicht mit
einer Mg2+
/Ca2+
-freien, phosphatgepuf-
fertenKochsalzlösung gespültund beiei-
ner befeuchteten Atmosphäre, bestehend
aus 95 % Luft und 5 % medizinischem
Kohlendioxid (Linde, Berlin, Deutsch-
land, Laparox®), in einem Brutschrank
bei 37 °C inkubiert wurde. Alle Ge-
webekulturmaterialien wurden von der
Firma TPP (Faust Lab Science, Klettgau,
Deutschland) bezogen.
Der Ophthalmologe

4. Originalien
24h
Inkubation
100x Mag.
Extrakt 100 % 50 % 20 % 10 %
24h
Inkubation
+
Co-Extrakt
100x Mag.
24h
Inkubation
+
Co-Extrakt
+
MTT
100x Mag.
Abb. 3 8 HMVEC wurden Cobalt ausgesetzt. Nähere Erläuterungen
s. . Abb. 1.HMVEC menschliche dermale mikrovaskuläre Endothelzel-
len von erwachsenen Spendern,MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium Bromid
24h
Inkubation
100x Mag.
Extrakt 100 % 50 % 20 % 10 %
24h
Inkubation
+
Mo-
Extrakt
100x Mag.
24h
Inkubation
+
Mo-
Extrakt
+
MTT
100x Mag.
Abb. 4 8 HMVEC wurden Molybdän ausgesetzt.Nähere Erläuterungen
s. . Abb. 1.HMVEC menschliche dermale mikrovaskuläre Endothelzellen
von erwachsenen Spendern,MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphe-
nyltetrazolium Bromid
Für die Herstellung löslicher Extrakte
der Metallpulver wurden 1 g Metallpul-
ver und 4 g Wachstumsmedium (Me-
dium 131 mit mikrovaskulärem Wachs-
tumszusatz)ineinesterile,50mlfassende
Glasflasche gegeben. Der Deckel wurde
geöffnet, um einen Gasaustausch mit der
befeuchteten Atmosphäre aus 95 % Luft
und 5 % Kohlendioxid im Inkubations-
schrank für 48 h bei 37 °C zu ermög-
lichen. Alle 12 h wurde die Suspension
aus Metallpulver und Wachstumsmedi-
umvorsichtigimUhrzeigersinnfür5sge-
schwenkt. Am Ende der Extraktionszeit
wurde die Suspension in ein konisches
Zentrifugenröhrchen überführt und bei
Raumtemperatur für 15 min mit 3000
Umdrehungen pro Minute in einer Ge-
webekulturzentrifuge zentrifugiert. Der
erhaltene Überstand wurde durch einen
0,2 μm Polyvinylidendifluorid (PVDF)-
Filter filtriert und bei 4 °C bis zur An-
wendung gelagert. Die Extrakte eines un-
beschichteten PP-Plättchens wurden ge-
nauso wie oben beschrieben vorbereitet.
MTT-Tests und Statistik
Der MTT-Test beruht auf der Fähigkeit
lebender Zellen, das 3-(4,5-Dimethyl-
thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
Bromid (MTT) zum schwer löslichen
Formazan zu reduzieren. Für den MTT-
Test verwendeten wir unverdünnte Ex-
trakte (bezeichnet als 100 % Extrakt),
Gemische aus 1 Volumen Extrakt und
1 Volumen Wachstumsmedium (be-
zeichnet als 50 % Extrakt), Gemische
aus 1 Volumen Extrakt und 4-fachem
Volumen Wachstumsmedium (bezeich-
net als 20 % Extrakt) und Gemische aus
1 Volumen Extrakt und 9-fachem Vo-
lumen Wachstumsmedium (bezeichnet
als 10 % Extrakt). Alle Lösungen wurden
in 1,5 ml Mikroreaktionsgefäßen herge-
stellt. Die Ausführung des MTT-Tests
erfolgte mit dem von der Firma LGC
Standards GmbH, Wesel, Deutschland,
bezogenen System (Bestellnummer 30-
1010K) exakt nach den Angaben des
Herstellers.
Wir trugen in jede Vertiefung einer
96-Loch-Platte 100 μl Zellsuspension
(104
HMVEC im Wachstumsmedium)
ein und züchteten die Zellen für einen
Tag. Nachdem Fotos aufgenommen
worden waren, wurden 100 μl des je-
weiligen Extrakts hinzugefügt, und die
Zellen wuchsen für einen weiteren Tag.
Nach erneuter Dokumentation wurde
10 μl MTT-Reagens pro Vertiefung zu
den Zellen hinzugefügt, und die Platten
wurden für 2 h im Brutschrank inku-
biert. Nach weiteren Fotoaufnahmen
wurden kolorimetrische Messungen der
optischen Dichte des solubilisierten Prä-
zipitates mittels eines Sunrise-ELISA-
Lesegerätes der Firma TECAN, Crails-
heim,Deutschland,vorgenommen.Dazu
wurden 100 μl Detergens pro Vertiefung
zugegeben und die abgedeckte Platte für
3 h im Dunkeln bei Raumtemperatur
inkubiert. Zur Negativkontrolle wurde
die optische Dichte bei 570 nm (Refe-
renz bei 750 nm gemessen) von Proben
mit Wachstumsmedium erhaltenen op-
tischen Dichten abgezogen.
Die Umsetzung von MTT wurde als
metabolischer Marker herangezogen.
Dazu wurde die optische Dichte am
Ende des MTT-Experiments von Zellen
auf PP-Plättchen als relative metabo-
lische Aktivität willkürlich auf 100 %
festgelegt. Vor der Beurteilung der opti-
Der Ophthalmologe

5. 24h
Inkubation
100x Mag.
Extrakt 100 % 50 % 20 % 10 %
24h
Inkubation
+
Ti-Extrakt
100x Mag.
24h
Inkubation
+
Ti-Extrakt
+
MTT
100x Mag.
Abb. 5 8 HMVECwurdenTitanausgesetzt.NähereErläuterungens..Abb.1.
HMVECmenschlichedermalemikrovaskuläreEndothelzellenvonerwachse-
nen Spendern,MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
Bromid
24h
Inkubation
100x Mag.
Extrakt 100 % 50 % 20 % 10 %
24h
Inkubation
+
PP-
Extrakt
100x Mag.
24h
Inkubation
+
PP-
Extrakt
+
MTT
100x Mag.
Abb. 6 8 HMVEC wurden Polypropylen ausgesetzt. Nähere Erläuterungen
s. . Abb. 1.HMVEC menschliche dermale mikrovaskuläre Endothelzellen
von erwachsenen Spendern,MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphe-
nyltetrazolium Bromid
schen Dichte des aufgelösten Materials
wurde eine Phasenkontrastdokumenta-
tion der exponentiell wachsenden Zellen
durchgeführt, und zwar vor der Zugabe
der Extrakte sowie nach der kolorime-
trischen Entwicklung des MTT-Tests.
Die relative Stoffwechselaktivität wurde
ermittelt, indem die optischen Dichten
der Negativkontrolle von der optischen
Dichte, die aus den Tests mit auf PP-
Plättchen erhalten wurden, von den
korrespondierenden Werten von metall-
beschichteten PP-Plättchen abgezogen.
Das Zellgift Dimethylsulfoxid (DM-
SO) diente in einer Endkonzentration
von 10 % als interne Kontrolle für die-
se Prüfreihe. Alle Experimente wur-
den in 3-facher Ausführung durch-
geführt. Die Mittelwerte der relativen
Stoffwechselaktivität wurden mit un-
korrigierter Standardabweichung (posi-
tiver und negativer Fehlerbalken einer
ungepaarten Student-t-Test-Analyse) in
einem Balkendiagramm dargestellt. Eine
Wahrscheinlichkeit einer doppelseitigen
Wahrscheinlichkeit einer Annahme der
Null-Hypothese (p-Wert) ist tabellarisch
aufgeführt, wobei p < 0,05 als statistisch
signifikant im Vergleich der Ergebnisse
angesehen wurde.
Wachstum von HMVEC auf
metallbeschichteten PP-Plättchen
Zur Beurteilung der Auswirkungen der
Krumeich-Ring-Legierung bzw. der ein-
zelnenMetallkomponentenwurdennach
der Desinfektion der Plättchen mit Etha-
nol 8,4 × 104
HMVEC auf die metall-
beschichteten PP-Plättchen gesetzt und
zusammen mit unbeschichteten PP-
Plättchen als Kontrolle für 5 Tage in
12-Loch-Platten inkubiert. Alle 48 h
erfolgte ein Mediumwechsel. Die Anfär-
bung mit Fluoresceindiacetat (FDA) und
Propidiumiodid (PI) erfolgte wie in der
Literatur beschrieben [5]. Hierfür wur-
den 1,2 ml Ringer-Lösung (Rekonstitu-
tion von gebrauchsfertigen Tabletten für
500 ml Lösung; Firma Thermo Scientific
Oxoid, Hampshire, UK; Bestellnummer
BR0052G) ergänzt, um final 100 μg
FDA (Sigma, Hamburg, Deutschland;
Bezeichnung: cat # F738-5G; 5 mg/ml in
Aceton gelagert) und 10 μg PI (Sigma,
Hamburg, Deutschland; Bezeichnung:
cat # P4170-10MG; 500 μg/ml Stamm-
lösung in Ringer-Lösung) zu enthalten.
Die so erhaltene Färbelösung wurde
frisch mit den Zellen für 10 s inkubiert.
Im Anschluss folgte eine fotografische
Dokumentation.
Ergebnisse
Der 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyl-2H-tetrazolium Bromid
(MTT)-Versuch beruht auf der Re-
duktion von MTT zu einem unlöslichen
purpurnen Formazan mit einer maxi-
malen optischen Dichte bei 570 nm
in vitalen Zellen. Tote Zellen besitzen
diese Fähigkeit nicht. Die Anzahl der
lebenden Zellen, die Konzentration des
eingesetzten MTT, die Länge der Inku-
bation von Zellen mit MTT sowie deren
metabolische Aktivität haben Einfluss
auf die Ergebnisse in diesem Versuch.
Werden gleiche Mengen lebender Zellen
und ein Überschuss an MTT verwendet
sowie gleichbleibende Inkubationsdau-
ern, kann anhand der optischen Dichte
des solubilisierten Formazan ein Rück-
schluss auf die metabolische Aktivität
deruntersuchtenZellengezogenwerden.
Der Ophthalmologe

6. Originalien
Abb. 7 8 Beschichtung derPlättchen mit Metallpulver. a Beschichtung undFixierung des Metallpul-
versaufdemPP-Plättchen.Vonlinksnachrechts:MetallpulveraufeinemfrischvorbereitetenPP-Plätt-
chen,welchesaufeinemGlasobjektträgerliegt(links).DasMetallpulverwurdedannmiteinemLabor-
spatel gleichmäßig auf demPlättchen verteilt (Mitte),bevoreinMetallring miteinemDurchmesser
von 1,5 cm überdas Plättchen gesetztwurde (rechts).b Erwärmung desPlättchens undPressen des
Metallpulvers auf das Plättchen.DerGlasobjektträgermitdem metallbeschichteten Plättchenund
demRingwurdesolangeaufeinerHeizplatte(130°C)platziert,bisderäußereRanddesopakenPlätt-
chens durchscheinendwurde.Dann wurde ein ca.120 g zylindrischesMassestückverwendet,umdas
Pulverfür15 s auf das Plättchen zudrücken.Im Anschluss wurde das heiße PlättchenunterderLast
des Massestücks auf Raumtemperaturabgekühlt.c Beispielevon fertig beschichtetenPlättchen mit
Metallpulver
Zuerst versuchten wir mittels einer
Tetrazolium-Untersuchung herauszu-
finden, ob einzelne Komponenten der
Krumeich-Ring-Legierung die Viabili-
tät von HMVEC beeinflussen [10, 16].
Dazu brachten wir, wie bereits oben be-
schrieben, die exponentiell wachsenden
HMVEC für einen Tag mit im Wachs-
tumsmedium löslichen Extrakten der
einzelnen Bestandteile der Krumeich-
Ring-Legierung in Kontakt. Während
Wachstumsmedium, bezeichnet als Me-
diumkontrolle, welches in der gleichen
Weise wie Metallpulver behandelt wur-
de, weder die Zellmorphologie noch
die Stoffwechselaktivität beeinträchtigte,
führtedieErgänzungdesWachstumsme-
diums bis zu einerEndkonzentrationvon
10 % DMSO zu einer Veränderung in der
zellulären Morphologie und reduzierte
das Erscheinungsbild des Bodensatzes
aus blauem Tetrazolium-Salz-Metabo-
lit erheblich. Somit konnten wir im
Rahmen der Untersuchung metabolisch
aktive und inaktive Zellen ausmachen
(. Abb. 1, 2, 3, 4, 5 und 6).
Zur Vorbereitung der im Durchmes-
ser 1,5 cm großen und 1 mm dicken
Plättchen wurde Polypropylen in einer
Spritzgussmaschinebei235°Cfür10sge-
schmolzen.DieFormherstellungfandbei
110 °C, einem anfänglichen Einspann-
druck von 40 MPa und einem Nach-
spritzdruck am Ende des Verfahrens von
25 MPa statt.
Es wurden keine signifikanten Verän-
derungen, weder was die Zellmorpholo-
gie noch das Auftreten eines dunkelblau-
en Präzipitats aus Tetrazolium-Salz-Me-
tabolit anbelangt, festgestellt.
Um Einflüsse der PP-Plättchen aus-
zuschließen, wurden weiter die Extrak-
te von 2 einzelnen PP-Plättchen in 2
unabhängigen Experimenten analysiert
(. Abb. 7a, b).
Um diese Ergebnisse zu untermauern,
wurden HMVEC für 5 Tage auf mit den
einzelnen Bestandteilen der Krumeich-
Ring-Legierung beschichteten PP-Plätt-
chen und dem Krumeich-Ring selbst ge-
züchtet.
Die auf diese Weise vorbereiteten PP-
Plättchen wurden zur Beschichtung mit
Metallpulver einzeln auf einen Glasob-
jektträger gelegt. Das Metallpulver wur-
de dabei mit einem Spatel gleichmäßig
auf dem Plättchen verteilt. Anschließend
wurde ein Metallring mit einem Durch-
messer von 1,5 cm um das Plättchen
gelegt (. Abb. 8a). Der Glasobjektträger
mit dem metallbeschichteten PP-Plätt-
chen wurde dann auf eine Heizplatte
(130 °C) gelegt, bis der äußere Rand des
opaken PP-Plättchens schmolz, was an-
hand des veränderten Erscheinungsbil-
des von opak zu transparent beurteilt
wurde. Im Anschluss wurde ein zylin-
drisches Massestück von 120 g auf das
Plättchen gestellt und auf Raumtempe-
ratur abgekühlt (. Abb. 8b, c). In unseren
ErgebnissenhabenunverdünnteExtrakte
der PP-Plättchen keinen Einfluss auf die
Stoffwechselaktivität von HMVEC. Wir
beobachteten, dass eine stärkere Verdün-
nung des Molybdänextrakts im Wachs-
tumsmedium die Viabilität von HMVEC
im Vergleich zu der relevanten Ti- bzw.
Co-Untersuchung statistisch signifikant
erhöhte (10 % Extrakt, Mo-Ti-Vergleich:
p = 0,0271 bzw. Mo-Co-Vergleich: p =
0,0118). Der Vergleich 10 % Extrakt Mo-
CrliefertezwareinenstatistischenTrend,
war jedoch nicht statistisch signifikant
(p = 0,0592; . Abb. 8d).
Eine vitale Zellschicht auf dem Refe-
renzmaterial wurde detektiert
(. Abb. 9a, b). Keine lebenden Zellen
wurden auf den mit Cobalt bzw. Molyb-
dän beschichteten PP-Plättchen detek-
tiert (. Abb. 9c, d). Im Gegensatz dazu
wurden lebende Zellen, wenn auch in
verringerter Dichte, auf den mit Chrom
und TitanbeschichtetenPlättchenausge-
macht (. Abb. 9e, f). Eine stabile, vitale,
einschichtige HMVEC-Besiedlung des
Krumeich-Rings lag vor (. Abb. 9g).
Daher schlussfolgern wir, dass der
intrastromale korneale Krumeich-Ring
keine messbaren zytotoxischen Einflüsse
auf primäre menschliche mikrovasku-
läre Endothelzellen von erwachsenen
Spendern ausübt.
Diskussion
Die anfänglichen Bemühungen um ein
tieferes Verständnis derzugrunde liegen-
Der Ophthalmologe

7. 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
100% 50% 20% 10%
RelaƟveStoffwechselakƟvität[%]
ExtraktkonzentraƟon
Titan
Cobalt
Chrom
Molybdän
Polypropylen
Experiment p-Wert
10% Mo-Co 0,0118
Mo-Cr 0,0592
Mo-Ti 0,0271
20% Mo-Co 0,0001
Mo-Cr 0,0004
Mo-Ti 0,0715
50% Mo-Co 0,0001
Mo-Cr 0,0001
Mo-Ti 0,0001
100%
Mo-Co 0,6184
Mo-Cr 0,0003
Mo-Ti 0,0021
a ba b
c d
Abb. 8 8 Höhere Konzentrationen derExtrakte, die aus den einzelnen Bestandteilen derKrumeich-Ring-Legierung vorbe-
reitet wurden, scheinen die Stoffwechselaktivitätvon HMVECzu beeinflussen. DieUmsetzung von MTT (.Abb. 1, 2, 3, 4,
5 und 6)wurde als metabolischerMarkerherangezogen.Dazu wurde die optische DichteamEnde desMTT-Experiments
von . Abb. 1, 2, 3, 4, 5 und 6von Zellen auf PP-Plättchen als relative metabolischeAktivitätwillkürlich auf 100% festge-
legt.Die relative Stoffwechselaktivitätwurde entsprechendden Angaben in Materialien undMethoden ermittelt.Gezeigt
sindhierdie kolorimetrischen Dichten alsErgebnisvon Expositionenvon HMVECmit den mediumlöslichen Extrakten von
PP-Plättchen (a,b)undden einzelnen Bestandteilen derKrumeich-Ring-Legierung (c).AlleExperimentewurden in 3-facher
AusführungdurchgeführtundinFormvonMittelwertenundunkorrigierterStandardabweichung,dargestelltalspositiveund
negative Fehlerbalken, in das Diagrammeingetragen.d TabellarischeDarstellung derWahrscheinlichkeiteinerdoppelseiti-
gen Wahrscheinlichkeit einerAnnahmederNull-Hypothese(p-Wert)imRahmen einerungepaarten Student-t-Test-Analyse
derdargestellten Vergleiche.p-Werte von unterhalb 0,05 sindals statistischsignifikantangesehen. HMVECmenschliche der-
malemikrovaskuläreEndothelzellenvonerwachsenenSpendern,MTT3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
Bromid
Der Ophthalmologe

8. Originalien
Gewebekulturschale PP- Plättchen
TitanChrom
Cobalt Molybdän
Krumeich-Ring
a b
c d
e f g
200 µm 200 µm
200 µm 200 µm
200 µm 200 µm200 µm
Abb. 9 8 HMVEC haften an undwachsen auf demintrastromalen kornealenKrumeich-Ring.Darge-
stelltsindhierHMVEC,dieaufdemReferenzmaterial(aZellkulturkunststoffschale,bPP-Plättchen)den
einzelnen Komponenten des Krumeich-Rings (c,d,e,f)unddem Krumeich-Ring selbst(g)wachsen.
Lebende Zellen sind grün undrote Zellen sind rot angefärbt. Der Maßstabsbalken entspricht200 μm.
HMVEC menschliche dermale mikrovaskuläre Endothelzellen von erwachsenenSpendern
Abb. 10 8 OptischesErscheinungsbildderExtrakteausTitan-,Chrom-,Mo-
lybdän- undCobaltmetallpulververglichen mitdemWachstumsmedium.
Von linksnach rechts: Titan-,Chrom-,Molybdän- undCobaltmetallpulver
verglichen mit dem WachstumsmediumnachderFiltrierung durch einen
0,2 μm PVDF-FilterundvorderBenutzung im MTT-Test.MTT 3-(4,5-Dime-
thylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid
den Zellbiologie waren motiviert durch
die scheinbare Unstimmigkeit in veröf-
fentlichten Arbeiten bezüglich der Aus-
wirkungen des intrastromalen kornealen
Krumeich-Rings auf das Gewebe der Pa-
tienten [1, 9]. Als Studienobjekt wurden
primäre menschliche dermale mikrovas-
kuläre Endothelzellen von erwachsenen
Spendern (HMVEC) ausgewählt, da die
publizierten Ergebnisse die Vermutung
nahelegen, dass die Entstehung von Neo-
vaskularisationen von einem unbeein-
trächtigtenStoffwechselderEndothelzel-
len abhängt [19].
Unsere Ergebnisse unterstützen die
Annahme, dass der intrastromale Kru-
meich-Kornearing die Viabilität von
HMVEC nicht beeinflusst. Eine höhere
Verdünnung von Molybdänmetallpul-
ver, welches in das Wachstumsmedium
eingegeben wurde, erhöht die Stoff-
wechselaktivität von HMVEC. Außer-
dem haften und wachsen HMVEC am
Krumeich-Ring. Während unsere Er-
gebnisse in Einklang mit der Annahme
sind, dass keine negativen Auswirkun-
geninunseremModellsystemaufgedeckt
werden, sind weitere Versuchsdurchfüh-
rungen erforderlich, um die scheinbare
Unstimmigkeit in der Literatur bezüg-
lich der nach dem klinischen Einsatz
des intrastromalen Krumeich-Rings be-
schriebenen Wirkungen zu lösen [1, 9].
Als mögliche Erklärung für dieses
Phänomen wird die noch nicht voll-
ständig verstandene Biochemie von
Molybdän in menschlichen Zellen vor-
geschlagen, (s. hierzu Plitzko et al. [13]
und die darin enthaltenen Referenzen).
Die Ergebnisse des MTT-Tests sind
jedoch im Lichte von Limitierungen des
MTT-Tests zu sehen: Verbindungen, die
den pH des Mediums verändern, sowie
die Sensitivität der untersuchten Zellen
gegenüber den eingesetzten Materialien
müssen berücksichtigt werden. Die ein-
gesetzten dermalen Zellen sind hier als
Modell für die stromale Umgebung des
Ringes in der Kornea hinreichend als
Studienobjekt, jedoch nicht direkt auf
die stromale Umgebung der Kornea in
Patienten übertragbar. Weiterhin ist von
besonderer Relevanz, dass in unseren
Untersuchungen eine Farbänderung des
Mediums nach Erstellung von löslichen
Extrakten von Metallpulvern beobachtet
wurde (. Abb. 10). Weitere Untersu-
chungen sind daher notwendig, um die
beobachteten Phänomene mit den oben
genannten Limitierungen einerseits auf
die zugrunde liegenden zellbiologischen
Mechanismen zurückzuführen und an-
dererseits durch weitere Modellversuche
auf eine breitere Basis zu stellen. Zudem
sind die Zeiträume in die Überlegungen
einzubeziehen. In dieser Studie wurden
Inkubationen über 5 Tage betrachtet,
während der Ring über Jahre im Patien-
ten verbleiben kann.
Fazit für die Praxis
4 Der intrastromale korneale Kru-
meich-Ring übt keine messbaren
zytotoxischen Auswirkungen auf
HMVEC aus.
4 Eine höhere Verdünnung von Molyb-
dänextrakten im Wachstumsmedium
erhöht die Viabilität von HMVEC.
Der Ophthalmologe

9. Korrespondenzadresse
Dr. J. Storsberg
Fraunhofer-Institut für Angewandte
Polymerforschung IAP
14476 Potsdam-Golm, Deutschland
joachim.storsberg@iap.fraunhofer.de
Einhaltung ethischer Richtlinien
Interessenkonflikt. C.Schmidt,S.Rehfeldt,S.Klöp-
zig,V.Jentzen,J.BohrischundJ.Storsberggeben
an,dasskeinInteressenkonfliktbesteht.A.Messner
istVorstandsvorsitzenderundGeschäftsführerder
HumanOpticsAG,derHerstellerindesKrumeich-Kor-
nearings.S.FabinyiistMitarbeiterinderHumanOptics
AG.AlleanderenAutorengebenan,dasssiekeiner
OrganisationoderEinrichtungzugehörigsind,die
einfinanziellesodernichtfinanziellesInteressean
ProduktenoderMaterialienhat,diehierdiskutiert
werden.
DieserBeitragbeinhaltetkeinevondenAutoren
durchgeführtenStudienanMenschenoderTieren.
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