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![VERZEICHNISSE IV
3.3.4.3 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-
4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24) 201
3.3.4.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-
3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-45) 203
3.3.5 Versuche zur Darstellung von (±)-(1RS,5RS,8RS)-8-Dimethylaminomethyl-1-
(3-methoxy-phenyl)-2,4-dioxa-bicyclo-[3.3.1]-nonan-3-on (rac-48) 204
3.3.5.1 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit Bis-(trichlormethyl)-carbonat 204
3.3.5.2 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit 1,1´-Carbonyldiimidazol 205
3.4 Überprüfung der Hydrolysestabilität der Estersubstrate 207
3.4.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Überprüfung der Hydrolysestabilität der racemischen
Substrat Ester (AAV 5) 207
3.4.2 Hydrolysestabilität des Esters rac-15 207
3.4.3 Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und rac-25 207
3.4.4 Hydrolysestabilität des Esters rac-23 208
3.4.5 Hydrolysestabilität des Esters rac-16 208
3.4.6 Hydrolysestabilität des Esters rac-24 209
3.5 Bestimmung von Umsätzen und Enantiomerenverhältnissen 210
3.6 Enzym-katalysierte Racematspaltungen im wäßrigen und organischen
Medium 214
3.6.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 214
3.6.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrigen Einphasen
System (AAV 6) 214
3.6.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrig-organischen
Zweiphasen System (AAV 7) 214
3.6.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Transacylierung in organischen
Lösungsmitteln (AAV 8) 215
3.6.2 Berechnung des E-Werts 216
3.6.3 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15) 217
3.6.3.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem unter
Zusatz von Aceton als Cosolvens 217
3.6.3.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 217
3.6.3.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem zur
Darstellung von (+)-15 218
3.6.3.4 Versuch zur AChE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen
Einphasensystem 219
3.6.3.5 CAL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 219
3.6.3.6 Mucor miehei Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen
Einphasensystem 220
3.6.3.7 HLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 220
3.6.3.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 221](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-9-320.jpg)
![24 THEORETISCHER TEIL
Aufarbeitung analysiert werden konnten. Mittels dieser effektiven Analytik ließen sich
detaillierte Informationen über den gesamten Reaktionsverlauf einer enzymatischen
Reaktion unter Einsatz geringer Substanz- und vor allem Enzymmengen gewinnen.
2.2.1 Synthesewege der von GRÜNENTHAL bereitgestellten Substanzen96
Die von der GRÜNENTHAL GmbH verwendeten Synthesewege zur Darstellung der
cyclohexanoiden Ausgangsmaterialien rac-14⋅HCl97, rac-12⋅HCl98 und rac-13⋅HCl
basieren auf der in Kap. 1.2 beschriebenen Tramadol-Syntheseroute, so daß viele
Erfahrungen aus diesem Produktionsprozeß in die Reaktionen eingebracht werden
konnten.
O CH3 1) BrMg OMe
O
N Cl
H 3C N(Me)2
O THF
O O H 3C Cl O O 2) Trennung der
Diastereomeren
MeCN 3) H
OH OH
OMe NaBH4 OMe
HO
O Me2N Me2N
rac-27 rac-14
Abb. 2.3: Syntheseroute der GRÜNENTHAL GmbH zur Darstellung von rac-14.
Zur Einführung der neuen sekundären Hydroxylgruppe wurde anstelle von
Cyclohexanon ein als Monoketal geschütztes 1,4- bzw. 1,3-Diketon in die Mannich-
Reaktion eingesetzt (Abb. 2.3 und Abb. 2.4). Aus der Mannich-Reaktion des
3,3-Dimethyl-1,5-dioxa-spiro[5.5]undecan-8-on (26, Abb. 2.4) wurde nur das
gewünschte 9-Alkylierungsprodukt erhalten. Das unerwünschte 7-Alkylierungs-
produkt wurde wahrscheinlich aufgrund von sterischer Hinderung nicht gebildet. Die
erhaltenen jeweiligen Mannich-Basen wurden danach in einer Grignard-Reaktion mit
dem Grignard-Reagenz des 3-Bromanisols umgesetzt. Es wurden in beiden Fällen
cis /trans Mischungen erhalten, aus denen die gewünschten cis-Isomere abgetrennt
wurden und nach Abspaltung der Ketal-Schutzgruppen mit Mineralsäure die Ketone](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-38-320.jpg)
![30 THEORETISCHER TEIL
Aus Abb. 2.8 geht hervor, daß das Substrat (S) bei einer kinetischen Racemat-
spaltung prinzipiell immer bei hinreichend großen Umsätzen auf Kosten der
Ausbeute enantiomerenrein erhalten werden kann. Das Produkt (P) hingegen kann
nur bei sehr selektiven Reaktionen mit E-Werten größer als 100 nahezu
enantiomerenrein erhalten werden.
Zur Bestimmung von E müssen zwei der drei Variablen: Umsatz, ee-Wert des
Substrates und ee-Wert des Produkts bekannt sein und in eine der aufgeführten
Formeln eingesetzt werden6,107,108:
ln [1− c(1+ eeP )]
Formel 2.1: E= , für c < 50 %
ln [1 − c(1− eeP )]
ln [(1− c)(1− ee S )]
Formel 2.2: E= , für c > 50 %
ln [(1− c)(1+ ee S )]
1− ee S ee P (1− ee S )
ln ln (ee + ee )
1 + (eeS /ee P ) S
E= =
P
Formel 2.3:
1 + ee S ee P (1+ ee S )
ln ln
1 + (eeS /ee P ) ee P + ee S )
(mit: c = Umsatz, ee P = ee-Wert des Produkts, ee S = ee-Wert des Substrats)
KAZLAUSKAS et al. haben eine schnelle photospektroskopische Methode zur
Bestimmung des E-Werts entwickelt, die auf der Umsetzung der einzelnen
Enantiomeren basiert (“Quick E-Wert“).109 Häufig stehen gerade diese aber nicht zur
Verfügung.
E-Werte sind für sehr kleine und sehr große Umsätze mit einem großen Fehler
behaftet. Entweder läßt sich c nur mit beschränkter Genauigkeit bestimmen oder die
gefundenen ee-Werte sind sehr groß, so daß relativ kleine Fehler bei Bestimmungen
von c, eeS oder eeP einen großen Einfluß auf den berechneten E-Wert haben, da sie
logarithmisch in die Berechnung eingehen.6,21,108,110 Die Angabe von E-Werten
größer als 100 ist aus demselben Grund wenig sinnvoll, da hier ebenfalls der Einfluß
kleiner Meßfehler sehr groß ist.6,108,110,111 In einigen Fällen können sogar E-Werte um
die 50 nur mit einer Genauigkeit von ± 10 angegeben werden (Angabe als E ≈ 50).6
Häufig ist in der Praxis die Bestimmung von Enantiomerenüberschüssen genauer als
die Bestimmung des Umsatzes, bei der das Verhältnis zweier verschiedener Stoffe](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-44-320.jpg)
![32 THEORETISCHER TEIL
Hydrolysereaktionen führen.116 Für Gleichgewichtsreaktionen wurde von CHEN und
SIH ebenfalls eine Methode zur Bestimmung von E unter Kenntnis der
Gleichgewichtskonstanten K entwickelt (Formel 2.4).107 Wie aus Abb. 2.9 hervorgeht,
fallen bei reversiblen, kinetischen Racematspaltungen die ee-Werte des Substrats
bei Umsätzen über 50 % deutlich ab. Nicht umgesetztes Substrat kann also im Falle
einer reversiblen Reaktion nicht mehr enantiomerenrein erhalten werden. Hohe
ee-Werte des Substrats bei großen Umsätzen deuten hingegen auf eine extreme
Gleichgewichtslage (K ≈ 0, Fall a in Abb. 2.9) hin.
ln [1 − (1 + K)(c + ee S (1 − c))] ln [1 - (1 + K) c (1 + eeP )]
Formel 2.4: E= =
ln [1 − (1 + K)(c − ee S (1 − c))] ln [1 - (1 + K) c (1 - eeP )]
(mit: c = Umsatz, ee P = ee-Wert des Produkts, ee S = ee-Wert des Substrats)
Abb. 2.9: Abhängigkeit der ee-Werte a) des Produkts und b) des Substrats bei
reversiblen kinetischen Racematspaltungen mit E = 100 für verschiedene
Gleichgewichtskonstanten K (K = a: 0, b: 0.1, c: 0.5, d: 1, e: 5).
ANTHONSEN et al. haben einen einfachen Weg zur Bestimmung E und K entwickelt,
indem sie in einem regressiven mathematischen Verfahren über eine Serie von eeS-
und eeP-Werten eine Fit E-Wert Funktion berechnen.117
c) Substrat- oder Produktinhibierung
Bei dem Vorliegen von Produktinhibierung kann sich der E-Wert über den
Reaktionsverlauf ändern.118,119 Um den E-Wert zu beeinflussen, muß allerdings eine
enantioselektive Inhibierung vorliegen118, die sogar eine Rückreaktion des Produkts](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-46-320.jpg)
![ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 59
60 % der nicht umgesetzte Ester (+)-15 enantiomerenrein vorliegt und in einer
maximalen Ausbeute von ca. 40 % erhalten werden kann.
Es konnte somit gezeigt werden, daß eine Enzym-katalysierte Hydrolyse eines
Esters auf Tramadol-Basis unter Einbezug einer phenolischer Hydroxylgruppe mit
hoher Selektivität und Aktivität möglich ist. Dies, obwohl die vom Enzym
anzugreifende phenolische Hydroxylgruppe mehrere C-Atome von den Stereo-
zentren der Verbindungen entfernt ist.
Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Phenols 8 erfolgte
durch Vergleich der Drehwerte mit bereits publizierten.91,183 Von der Grünenthal
GmbH ist für das Hydrochlorid des (+)-(R,R)-3-(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-
cyclohexyl)-phenols ein Drehwert von [α ] 20 = + 5.4º (c = 1.0, MeOH) veröffentlicht
D
worden.91 Hierbei ist die Bestimmung der Absolutkonfiguration des (+)-8⋅HCl durch
Röntgenstrukuranalyse erfolgt.184
Die Bestimmung der Absolutkonfigurationen der Ester 15 und 16 erfolgte in Analogie
zu der des Phenols 8.
2.4.1.2 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-
(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16)
Neben den Effekten des Cosolvens auf die Enzym-katalysierte Hydrolyse von Estern
des O-Desmethyltramadols (rac-8), ist auch der Einfluß der Acylgruppe des
Substrats auf die Aktivität oder Selektivität der enzymatischen Reaktion von
Interesse.
Im allgemeinen stellt für Lipasen die einzige Limitierung hinsichtlich des akzeptierten
Substratspektrums ihre begrenzte Eignung für die Umsetzung raumerfüllender
Acylgruppen dar: gemäß dem Vorbild der Triglyceride werden lineare aliphatische
Acylgruppen besser umgesetzt als z.B. Arene.101,110,185](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-73-320.jpg)
![102 THEORETISCHER TEIL
geschwindigkeit bei einem Zusatz von 0.2 Vol% Wasser beobachtet worden.85 Daher
wurde für diesen Versuch mit dem Katalysator PLE/BSA/MPEG ein Wasserzusatz
von 0.25 % gewählt.
Tabelle 2.36: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des
Alkohols rac-12
Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)
PLE/BSA/MPEG (24.4 U/ml),
11 d 0%
Vinylpropionat (5), Dichlormethan
PLE/BSA/MPEG (20.0 U/ml), H2O (0.25 %),
11 d 0%
Vinylpropionat (5), Toluol
Im Laufe der Reaktionszeit änderte sich die Farbe des PLE/BSA-Katalysators von
weiß in ein dunkles rot-braun. Dies ist ein typisches Merkmal dafür, daß der Zusatz
BSA mit Carbonyl-Nebenprodukten reagiert. Diese Nebenprodukte können nur aus
der enzymatischen Hydrolyse des Vinylesters stammen. Eine derartige
Nebenreaktion in größerem Umfang ist ebenfalls von Ruppert84 wie auch anderen213
beobachtet worden.
O
+E
R1 OH
+ H2O A
O +E O
+ [R1-CO-E]
R1 O
B
+ R2-OH
O + H2O
O
R2 + E + R2-OH
R1 O R1 OH
C
Abb. 2.43: Hydrolyse des Acyldonors als Nebenreaktion der Transacylierung.](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-116-320.jpg)
![ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 169
Polarimetrie
Gerät: Perkin-Elmer-Polarimeter PE 241. Die Messung der Drehwerte erfolgte bei
20 ºC in einer Mikroküvette (Länge 10 cm) mit der Natriumdoppellinie (λ = 589.0 und
589.6 nm). Die Angabe der spezifischen Drehung [α ] 20 erfolgte in (grd⋅dm3)/(dm⋅g),
D
die Angabe der Konzentration c in (g/dm3).
Autotitrator
Gerät: STAT-Titrino 718 der Firma METROHM. Das Gerät wurde im pH-STAT Modus
mit NaOH-Maßlösungen (1 N und 0.1 N) der Firma MERCK betrieben.
Ultrafiltration
Gerät: Ultrafiltrationszelle Amicon Modell 2800 mit einer Membran PM 30
(Ausschlußgrenze: >30 kDa) von MILLIPORE.
Gefriertrocknung
Gerät: Christ Alpha 2-4.
Schmelzpunkte
Gerät: Büchi-Schmelzpunktapparatur SMP-20.
Die Schmelzpunkte wurden unkorrigiert angegeben.
Siedepunkte
Die Siedepunkte wurden unkorrigiert angegeben.
Dünnschichtchromatographie
Es wurden DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 der Firma MERCK mit einer Schichtdicke
von 0.25 mm verwendet. Die Detektion erfolgte durch UV-Fluoreszenzlöschung bei
λ = 254 nm sowie durch Anfärben mit einer Lösung aus Eisessig / dest. H2O / konz.
H2SO4 / p-Anisaldehyd (in einem Volumenverhältnis von 75 : 2 : 1.5 : 1) und an-
schließendem Erhitzen.
Präparative Säulenchromatographie
Es wurde Kieselgel 60, 0.062 - 0.100 mm, der Firma MERCK verwendet.](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-183-320.jpg)
![178 EXPERIMENTELLER TEIL
3.3.2 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen
Transacylierung
3.3.2.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-
phenyl)-cyclohexanol (rac-7)
Die Base rac-7 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden
10 g (33.3 mmol) rac-7⋅HCl in 16 ml dest. Wasser und 12 ml Dichlormethan
suspendiert und mit 4.4 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung
wurden 8.70 g (33.0 mmol, 99 %) rac-7 als farbloser Sirup erhalten.
OH
10
5 6 1 9 11
O
3 7 15
4 2 14
N 12
13
8
rac-7: MW = 263.4 g⋅mol-1
H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7.2 ppm (dd, 1 H, 3J = 8 Hz, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H),
1
7.2 (s, 1 H, 10-H), 7.0 (d, 3J = 8 Hz, 1 H, 12-H), 6.8 (dm, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 3.8 (s,
3 H, 15-H), 2.4 (dd, 3J=4 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 7´-H), 2.1 - 2.0 (m, 7 H, 8-H, 7-H), 1.9 -
1.5 (m, 8 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H).
13
C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 159.5 ppm [u] (C-11), 152.0 [u] (C-9), 128.9 [d]
(C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.2 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 76.9 [u] (C-1), 61.6 [u]
(C-7), 55.2 [d] (C-15), 47.7 [d] (C-8), 44.8 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.9
[u] (C-4), 22.3 [u] (C-5).
13
Die Zuordnung der C-NMR-Signale war durch einen Vergleich mit Literaturdaten
eindeutig möglich.245](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-192-320.jpg)
![DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 179
3.3.2.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-
cyclohexyl)-phenol (rac-8)91
Zu 5.2 g (19.8 mmol) rac-7, gelöst in 9 ml abs. Toluol, wurden bei Raumtemperatur
40 ml 20 %ige Diisobutylaluminiumhydrid-Lösung (39.6 mmol) in abs. Toluol
zugetropft, wobei es zu einer leicht exothermen Reaktion und einer Gasentwicklung
kam. Anschließend wurde für 15 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlung auf
Raumtemperatur wurden unter Eiskühlung 11.3 ml Ethanol so zugetropft, daß eine
Innentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Danach wurde 15 Min.
nachgerührt. Ebenfalls unter Eiskühlung wurden daraufhin 11.3 ml eines
Ethanol/Wasser-Gemisches (1 : 1) wieder so zugetropft, daß eine Innentemperatur
von 15 ºC nicht überschritten wurde. Anschließend wurde die Reaktionslösung mit
ca. 20 ml Toluol verdünnt und danach noch eine Stunde bei Raumtemperatur
nachgerührt. Der ausgefallene Feststoff wurde abfiltriert und mit fünf Volumenteilen
Essigsäureethylester bei 60°ºC für 30 Min. nachextrahiert. Nach Filtration wurden die
vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet und am
Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 4.592 g
(18.4 mmol, 93 %) eines farblosen Öls erhalten, welches farblose Kristalle mit einem
Schmelzpunkt von 139 ºC bildete.
OH
10
5 6 1 9 11
OH
3 7
4 2 14
N 12
13
8
rac-8: MW = 249.4 g⋅mol-1
H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7.5 ppm (s, 1 H, 10-H), 7.2 (dd, 3J = 8 Hz, 3J = 8 Hz,
1
1 H, 13-H), 6.8 (m, 2 H, 12-H, 14-H), 2.4 (dd, 3J = 4 Hz, 2J = 14 Hz, 1 H, 7´-H), 2.2 -
1.4 (m, 15 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H).
13
C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 157.0 ppm [u] (C-11), 151.0 [u] (C-9), 129.4 [d]
(C-13), 116.0 [d] (C-14), 113.3 [d] (C-12), 113.0 [d] (C-10), 78.3 [u] (C-1), 61.7 [u]
(C-7), 47.6 [d] (C-8), 44.4 [u] (C-2), 41.0 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.7 [u] (C-4), 22.2
[u] (C-5).](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-193-320.jpg)
![180 EXPERIMENTELLER TEIL
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 249 (M+, 18), 121 (3), 58 (100), 45 (6).
MS (CI, Isobutan, 100 eV) m/z (%):306 ([M + C4H9]+, 4), 250 ([M + H]+, 100), 249 (M+,
10).
IR (KBr): ∼ = 3201 (s), 2985 (s), 2863 (s), 2834 (s), 2789 (s), 2425 (w), 1280 (s),
ν
1252 (m), 1215 (s), 1166 (m), 1118 (m), 1098 (m), 1079 (m), 1033 (w), 10006 (w),
988 (s), 963 (m), 905 (w), 865 (m), 846 (m), 763 (m), 707 (m) cm-1.
C15H23NO2 (249.2 g⋅mol-1): berechnet gefunden
C 72.25 71.98
H 9.30 9.10
N 5.62 5.56
3.3.2.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-
dimethyl-propyl)-phenol (rac-11)
Die Base rac-11 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden
5.0 g (19.3 mmol) rac-11⋅HCl in 19 ml dest. Wasser und 2 ml Dichlormethan
suspendiert und mit 10 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung
wurden 4.188 g (18.8 mmol, 97 %) rac-11 als farbloser Sirup erhalten, welcher
farblose, weiße Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 98 ºC bildete.
OH
8
1 7 9
4 OH
3 5
2 12
N 10
11
6
rac-11: MW = 223.3 g⋅mol-1
H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 8.3 – 8.1 (br s, 1 H, 9-OH), 7.21 (s, 1 H, 8-H), 7.06 (t,
1
3
J = 8 Hz, 1 H, 11-H), 6.82 (d, 3J = 8 Hz, 1 H, 10-H/12-H), 6.61 (dd, 3J = 8 Hz, 4J =
2 Hz, 1 H, 10-H/12-H), 2.67 (dd, 3J = 11 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H´), 2.31 (s, 6 H, 6-H),](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-194-320.jpg)
![DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 181
2.23 (dd, 3J = 3 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H), 2.06 (m, 1 H, 2-H), 1.49 (s, 3 H, 4-H), 0.65
(d, 3J = 7 Hz, 3 H, 3-H).
C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 156.5 ppm [u] (C-9), 149.4 [u] (C-7), 128.5 [d]
13
(C-11), 117.2 [d] (C-12), 113.9 [d] (C-10), 113.7 [d] (C-8), 78.4 [u] (C-1), 64.1 [u]
(C-5), 45.6 [d] (C-6), 40.1 [d] (C-2), 21.8 [d] (C-4), 14.8 [d] (C-3).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 223 (M+, 10), 181 (3), 138 (3), 121 (11), 107 (6), 95 (4), 93
(10), 91 (5), 86 (69), 77 (9), 71 (18), 65 (14), 58 (100), 45 (62).
IR (KBr): ∼ = 3225 (s), 2981 (s), 2955 (s), 2884 (s), 2838 (s), 2802 (s), 2653 (s),
ν
2567 (m), 1615 (m), 1585 (s), 1507 (s), 1485 (s), 1467 (s), 1282 (s), 1255 (s), 1240
(s), 1260 (s), 1176 (m), 1162 (w), 1123 (s), 1103 (w), 1077 (w), 876 (s), 841 (s), 793
(s), 743 (m), 707 (s), 688 (w), 545 (w), 531 (w), 487 (w) cm-1.
C13H21NO2 (223.3 g⋅mol-1): berechnet gefunden
C 69.92 69.73
H 9.48 9.56
N 6.27 6.23
3.3.2.4 Darstellung von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-
(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12)
Die Base rac-12 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden
3.293 g (10.4 mmol) rac-12⋅HCl in 5 ml dest. Wasser und 20 ml Dichlormethan
suspendiert und mit ca. 3.0 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung
wurden 2.883 g (10.3 mmol, 99 %) rac-12 als farbloser, zäher Sirup erhalten, der
unter gelindem Erwärmen in einen Achatmörser überführt wurde und dort
anschließend erstarrte. 2.273 g (8.1 mmol, 79 %) wurden so als farblose Kristalle mit
einem Schmelzpunkt von 49 ºC gewonnen und 0.552 g (2.0 mmol, 19 %) als
farbloser Sirup zurückbehalten.](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-195-320.jpg)
![182 EXPERIMENTELLER TEIL
OH
5 10
6 1 9 11
HO O
3 7 15
4 2 14
N 12
13
8
rac-12: MW = 279.4 g⋅mol-1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 ppm (t, 1 H, 13-H), 7.10 (s, 1 H, 10-H), 7.01 (d,
1
3
J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.75 (ddd, 3J = 9 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 4.12 (m,
1 H, 5-H), 3.80 (s, 3 H, 15-H), 2.50 – 2.75 (br s, 1 H, 1-OH), 2.38 (dd, 2J = 14 Hz,
3
J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.25 – 1.20 (m, 14 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.6 [u] (C-11), 150.7 [u] (C-9), 129.1 [d] (C-13),
117.2 [d] (C-14), 111.6 [d] (C-12), 110.8 [d] (C-10), 78.6 [u] (C-1), 67.5 [d] (C-5), 60.7
[u] (C-7), 55.2 [d] (C-15), 50.0 [u] (C-6), 47.8 [d] (C-8), 44.3 [d] (C-2), 35.7 [u] (C-4),
26.3 [u] (C-3).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 64), 234 (5), 135 (11), 107 (4), 84 (3) 58 (100).
IR (in CHCl3): ∼ = 3371 (s), 3079 (s), 2945 (s), 2860 (s), 2831 (s), 2784 (s), 1600 (s),
ν
1583 (s), 1484 (s), 1463 (s), 1432 (s), 1365 (m), 1315 (m), 1287 (s), 1255 (s), 1206
(m), 1158 (s), 1096 (s), 1074 (s), 1048 (s), 1012 (m), 979 (m), 959 (m), 861 (m), 844
(m), 829 (w), 782 (s), 756 (s), 730 (m), 704 (s), 666 (m), 569 (w) cm-1.
C16H25NO3 (279.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden
C 68.79 68.44
H 9.02 9.38
N 5.01 4.93](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-196-320.jpg)
![DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 183
3.3.2.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-
(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13)
Die Base rac-13 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden
2.422 g (7.7 mmol) rac-13⋅HCl in 10 ml dest. Wasser und 30 ml Dichlormethan
suspendiert und mit ca. 1.5 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung
wurden 2.092 g (7.5 mmol, 98 %) rac-13 als weißer Feststoff mit einem
Schmelzpunkt von 106 ºC erhalten.
OH OH
10
5 6 1 9 11
O
3 7 15
4 2 14
N 12
13
8
rac-13: MW = 279.4 g⋅mol-1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.99 ppm (s, 1 H, 1-OH), 7.26 (t, 3J = 8 Hz, 1 H,
1
13-H), 7.09 (s, 1 H, 10-H), 6.99 (s, 1 H, 14-H), 6.75 (m, 1 H, 12-H), 5.15 (s, 1 H,
5-OH), 4.06 (s, 1 H, 5-H), 3.82 (s, 3 H, 15-H), 2.47 (m, 2 H, 7-H, 3-H), 2.15 (d, 1 H,
7-H´), 2.12 (s, 6 H, 8-H), 2.05 (m, 1 H, 4-H), 1.97 (ddd, 4J = 2.75 Hz, 3J = 2.75 Hz,
2
J = 14.6 Hz, 1 H, 6-H), 1.92 (m, 1 H, 2-H), 1.75 (dd, 1 H, 2J = 14.6 Hz, 3J = 3.05 Hz,
6-H´), 1.60 – 1.65 (m, 2 H, 4-H´, 3-H´).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.6 ppm [u] (C-11), 150.2 [u] (C-9), 129.1 [d]
(C-13), 117.0 [d] (C-14), 111.5 [d] (C-12), 110.8 [d] (C-10), 79.0 [u] (C-1), 67.0 [d]
(C-5), 61.3 [u] (C-7), 55.1 [d] (C-15), 47.8 [d] (C-8), 44.9 [u] (C-6), 44.0 [d] (C-2), 33.6
[u] (C-4), 21.8 [u] (C-3).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 17), 135 (5), 58 (100), 45 (4).
IR (KBr): ∼ = 3375 (s), 3046 (m), 2969 (s), 2942 (s), 2874 (s), 2826 (s), 1598 (s),
ν
1488 (s), 1461 (s), 1438 (s), 1406 (w), 1377 (w), 1326 (m), 1285 (s), 1263 (s), 1246
(s), 1206 (m), 1177 (m), 1158 (s), 1113 (m), 1083 (w), 1044 (s), 1011 (m), 986 (m),
971 (m), 956 (m), 926 (w), 883 (s), 852 (s), 835 (m) 789 (s), 706 (s), 597 (m) cm-1.](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-197-320.jpg)
![184 EXPERIMENTELLER TEIL
C16H25NO3 (279.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden
C 68.79 68.65
H 9.02 9.25
N 5.01 4.93
3.3.2.6 Darstellung von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-1-
(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14)
Die Base rac-14 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden
1.802 g (5.7 mmol) rac-14⋅HCl in 10 ml dest. Wasser und 30 ml Dichlormethan
suspendiert und mit ca. 0.9 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung
wurden 1.578 g (5.5 mmol, 99 %) rac-14 als farbloser, zäher Sirup erhalten, der
unter gelindem Erwärmen in einen Achatmörser überführt wurde und dort
anschließend erstarrte. 1.300 g (4.7 mmol, 82 %) wurden so als farblose Kristalle mit
einem Schmelzpunkt von 44 ºC gewonnen und 0.278 g (1 mmol, 17 %) als farbloses
sirupöses Öl zurückbehalten.
OH
10
5 6 1 9 11
O
HO 3 7 15
4 2 14
N 12
13
8
rac-14: MW = 279.4 g⋅mol-1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.25 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.13 (s, 1 H,
1
10-H), 7.01 (s, 1 H, 12-H), 6.78 (ddd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 3.81
(s, 3 H, 15-H), 3.75 (m, 1 H, 4-H), 2.7 - 2.9 (br s, OH), 2.42 (dd, 2J = 14 Hz,
3
J = 4.5 Hz, 1 H, 7-H´), 2.22 – 1.60 (m, 14 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.7 ppm [u] (C-11), 151.0 [u] (C-9), 129.3 [d]
(C-13), 117.5 [d] (C-14), 111.7 [d] (C-12), 111.3 [d] (C-10), 76.2 [u] (C-1), 71.2 [d]
(C-4), 61.5 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.5 [d] (C-2), 39.7 [u] (C-6), 37.2
[u] (C-3), 31.9 [u] (C-5).](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-198-320.jpg)
![186 EXPERIMENTELLER TEIL
7´-H), 2.1 - 1.4 (m, 17 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H),
1.0 (t, 3J = 5 Hz, 3 H, 18-H).
C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 172.1 ppm [u] (C-15), 152.2 [u] (C-11), 150.8 [u]
13
(C-9), 128.8 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 119.0 [d] (C-12), 118.6 [d] (C-10), 76.9 [u]
(C-1), 61.5 [u] (C-7), 47.7 [d] (C-8), 44.7 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 36.2 [u] (C-16), 27.9
[u] (C-3), 26.8 [u] (C-4), 22.2 [u] (C-5), 18.4 [u] (C-17), 13.7 [d] (C-18).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 319 (M+, 9), 58 (100).
IR (KBr): ∼ = 3400 (w), 3091 (m), 2975 (s) 2945, 2856 (s), 2829 (s), 1755 (s), 1608
ν
(m), 1588 (m), 1461 (m), 1445 (m), 1434 (s), 1417 (s), 1383 (m), 1156 (s), 1156 (s),
1096 (s), 808 (m), 708 (m) cm-1.
C19H29NO3 (319.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden
C 71.44 71.03
H 9.15 9.19
N 4.38 4.35
3.3.3.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16)
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 2.490 g (10.0 mmol) rac-8 mit
einer Mischung aus 1.318 g (12.9 mmol) Essigsäureanhydrid und 0.08 g (1.0 mmol)
Pyridin in 40 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf(rac-16)= 0.26;
Rf (rac-8) = 0.10) wurden 2.881 g (9.9 mmol, 99 %) eines weißen kristallinen
Feststoffs mit einem Schmelzpunkt von 84 ºC erhalten.](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-200-320.jpg)
![DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 187
OH
10
5 6 1 9 11
O 15 16
7
4 3 2 14
N 12
O
13
8
rac-16: MW = 291.4 g⋅mol-1
H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.3 ppm (m, 3 H, 13-H, 10-H, 12-H/14-H), 6.93 (m,
1
1 H, 12-H/14-H), 5.8 – 6.4 (br s, 1 H, 1-OH), 2.38 (dd, 3J = 4 Hz, 2J = 14 Hz, 1 H,
7´-H), 2.29 (s, 3 H, 16-H), 2.25 – 1.25 (m, 16 H, 2-H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H).
13
C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 169.3 ppm [u] (C-15), 152.0 [u] (C-11), 150.5 [u]
(C-9), 128.7 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 118.9 [d] (C-12), 118.4 [d] (C-10), 77.3 [u]
(C-1), 61.5 [u] (C-7), 47.7 [d] (C-8), 44.7 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.8
[u] (C-4), 22.2 [u] (C-5), 21.1 [d] (C-16).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 291 (M+, 31), 121 (3), 58 (100) 45 (8).
IR (KBr): ∼ = 3076 (w), 3007 (w), 2981 (w), 2947 (s), 2924 (s), 2856 (m), 2828 (m),
ν
2786 (m), 1755 (s), 1609 (w), 1588 (w), 1482 (w), 1459 (m), 1436 (m), 1377 (m),
1293 (w), 1268 (w), 1213 (s), 1154 (m), 1140 (w), 1094 (w), 1085 (w), 1022 (m), 991
(m), 965 (m), 938 (w), 889 (w), 839 (w), 806 (w), 784 (w), 710 (w) cm-1.
C17H25NO3 (291.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden
C 70.07 69.91
H 8.65 8.13
N 4.81 4.71
3.3.3.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-
hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17)
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 1.786 g (8.0 mmol) rac-11 mit
einer Mischung aus 1.52 g (9.6 mmol) Buttersäureanhydrid und 0.06 g (0.8 mmol)
Pyridin in 20 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-201-320.jpg)
![188 EXPERIMENTELLER TEIL
Säulenchromatographie (EE : MeOH = 2 : 1, 1 % Triethylamin über Kieselgel,
Rf (rac-17)= 0.58) wurden 1.995 g (6.8 mmol, 85 %) eines farblosen Öls erhalten.
OH 8
1 7 9 14 16
4 O 13
5
3 2 12 15
N 10 O
11
6
rac-17: MW = 293.4 g⋅mol-1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 (s, 1 H, Ar), 7.22 (s, 1 H, Ar), 7.15 (s, 1 H, Ar),
1
6.87 (m, 1 H, 11-H), 2.57 (dd, 3J = 11 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H´), 2.44 (t, 3J = 7 Hz,
2 H, 14-H), 2.22 (s, 6 H, 6-H), 2.14 (dd, 3J = 3 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H), 1.94 (m, 1 H,
2-H), 1.69 (m, 2 H, 15-H), 1.40 (s, 3 H, 4-H), 0.96 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 16-H), 0.70 (d, 3J
= 7 Hz, 3 H, 3-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 170.8 ppm [u] (C-13), 149.5 [u] (C-9), 149.3 [u] (C-
7), 127.3 [d] (C-11), 122.0 [d] (C-12), 118.3 [d] (C-10), 118.1 [d] (C-8), 76.2 [u] (C-1),
63.0 [u] (C-5), 44.7 [d] (C-6), 39.3 [d] (C-2), 35.2 [u] (C-14), 20.9 [d] (C-4), 17.4 [u]
(C-15), 14.8 [d] (C-3), 12.6 [d] (C-16).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 293 (M+, 4), 86 (7), 84 (12), 71 (4), 58 (100), 45 (7).
IR (kapillar): ∼ = 2971 (s), 2877 (m), 2827 (m), 2784 (m), 1759 (s), 1608 (m), 1586
ν
(m), 1466 (s), 1370 (m), 1236 (m), 1153 (s), 1098 (w), 1080 (w), 1029 (m), 947 (m),
838 (w), 704 (m) cm-1.
C17H27NO3 (293.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden
C 69.59 69.52
H 9.28 8.93
N 4.77 4.67](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-202-320.jpg)
![DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 189
3.3.3.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino-
methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18)
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 3.265 g
(10.3 mmol) rac-12⋅HCl, gelöst in 33 ml abs. THF, mit 2.950 g (26.3 mmol) Kalium-
tert-butylat über einen Zeitraum von 10 Min. mit 1.66 ml (1.703 g, 16.0 mmol)
Buttersäurechlorid, gelöst in 3 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1:1 über Kieselgel,
Rf (rac-18) = 0.41; Rf (rac-12) = 0.18) wurden 2.915 g (8.3 mmol, 81 %) eines klaren
sirupösen Öls erhalten.
O OH
18 10
5 6 1 9 11
19 16 O O
17 3 7 15
4 2 14
N 12
13
8
rac-18: MW = 349.5 g⋅mol-1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.26 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.14 (s, 1 H,
1
10-H), 7.03 (s, 1 H, 12-H), 6.75 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 5.21 (m, 1 H,
5-H), 3.82 (s, 3 H, 15-H), 2.42 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.30 – 1.40 (m,
18 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 0.91 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.8 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.6 [u]
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 78.4 [u]
(C-1), 71.1 [d] (C-5), 60.5 [u] (C-7), 55.1 [d] (C-15), 47.7 [d] (C-8), 46.0 [u] (C-6), 44.1
[d] (C-2), 36.4 [u] (C-17), 32.2 [u] (C-4), 25.9 [u] (C-3), 18.5 [u] (C-18), 13.6 [d]
(C-19).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 350 ([M+H]+, 9), 349 (M+, 38), 262 (7), 135 (8), 58 (100), 45
(3).
IR (kapillar): ∼ = 2947 (s), 2864 (m), 2831 (s), 2784 (m), 1730 (s), 1600 (m), 1583
ν
(m), 1484 (s), 1462 (s), 1432 (m), 1383 (m), 1358 (m), 1306 (m), 1288 (s), 1256 (s),](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-203-320.jpg)
![DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 191
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.7 ppm [u] (C-16), 159.7 [u] (C-11), 149.0 [u]
13
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.7 [d] (C-14), 112.0 [d] (C-12), 111.6 [d] (C-10), 76.1 [u]
(C-1), 70.5 [d] (C-5), 61.1 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 46.6 [d] (C-8), 43.4 [u] (C-6), 43.0
[d] (C-2), 37.0 [u] (C-17), 29.6 [u] (C-4), 22.4 [u] (C-3), 18.9 [u] (C-18), 14.0 [d]
(C-19).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 16), 135 (6), 58 (100).
IR (kapillar): ∼ = 3584 (m), 3079 (s), 2944 (m), 2873 (m), 2766 (m), 1733 (s), 1601
ν
(m), 1584 (m), 1485 (m), 1461 (s), 1432 (m), 1381 (w), 1287 (s) 1255 (s), 1201 (s),
1188 (s), 1166 (s), 1104 (m), 1088 (m), 1049 (m), 985 (w), 960 (w) 860 (w), 825 (w),
782 (w), 734 (w), 702 (w) cm-1.
C20H31NO4 (349.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden
C 68.74 68.35
H 8.94 9.08
N 4.01 4.30
3.3.3.6 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-3-(6-Dimethylaminomethyl-1,3-
dihydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-20)91
Zu 1.790 g (6.4 mmol) rac-13, gelöst in 8 ml abs. Toluol, wurden bei
Raumtemperatur 42 ml Diisobutylaluminiumhydrid-Lösung (1 M, 42.0 mmol) in abs.
Toluol zugetropft, wobei es zu einer leicht exothermen Reaktion und einer starken
Gasentwicklung kam. Anschließend wurde die Reaktionslösung für 1 Stunde bei
Raumtemperatur und danach für weitere 24 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach
Abkühlung auf Raumtemperatur wurden unter Eiskühlung 5.0 ml Ethanol so
zugetropft, daß eine Innentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Danach
wurde 15 Min. nachgerührt. Ebenfalls unter Eiskühlung wurden anschließend 10.0 ml
eines Ethanol/Wasser-Gemisches (1 : 1) wieder so zugetropft, daß eine
Innentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Nach Filtration wurde die](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-205-320.jpg)
![192 EXPERIMENTELLER TEIL
organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer unter
vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 1.653 g (5.6 mmol, 88 %) eines farblosen
Feststoffs mit einem Schmelzpunkt von 74 ºC erhalten, welcher noch Spuren rac-13
enthielt. Eine chromatographische Abtrennung dieser Verunreinigung war nicht
möglich, daher wurde im folgenden die in Spuren verunreinigte Substanz eingesetzt.
OH OH
10
5 6 1 9 11
OH
3 7
4 2 14
N 12
13
8
rac-20: MW = 265.4 g⋅mol-1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.18 ppm (mt, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.1 – 6.8 (br s,
1
1 H, 11-OH), 6.98 (s, 1 H, 10-H), 6.80 (s, 1 H, 14-H), 6.64 (dd, 1 H, 3J = 8 Hz,
4
J = 2 Hz, 12-H), 6.0 – 6.1 (br s, 2 H, 1-OH, 5-OH), 4.05 (m, 1 H, 5-H), 2.50 – 1.45
(m, 15 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 157.0 ppm [u] (C-11), 150.0 [u] (C-9), 129.6 [d]
(C-13), 116.3 [d] (C-14), 113.9 [d] (C-10), 112.5 [d] (C-12), 79.4 [u] (C-1), 67.8 [d]
(C-5), 61.6 [u] (C-7), 48.1 [d] (C-8), 45.1 [u] (C-6), 44.1 [d] (C-2), 33.6 [u] (C-4), 22.3
[u] (C-3).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 16), 135 (6), 58 (100).
IR (kapillar): ∼ = 3584 (m), 3079 (s), 2944 (m), 2873 (m), 2766 (m), 1733 (s), 1601
ν
(m), 1584 (m), 1485 (m), 1461 (s), 1432 (m), 1381 (w), 1287 (s) 1255 (s), 1201 (s),
1188 (s), 1166 (s), 1104 (m), 1088 (m), 1049 (m), 985 (w), 960 (w) 860 (w), 825 (w),
782 (w), 734 (w), 702 (w) cm-1.](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-206-320.jpg)
![DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 193
3.3.3.7 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylamino-
methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21)95
1.190 g (4.5 mmol) rac-20 wurde zu einer Lösung aus 50 ml dest. Wasser und 6.42 g
NaHCO3 (76.4 mmol) bei Raumtemperatur gegeben. Nach einer Stunde hatte sich
eine klare Lösung gebildet, zu der innerhalb von 15 Minuten tropfenweise 6.65 ml
(6.40 g, 40.5 mmol) Buttersäureanhydrid unter starker Gasentwicklung gegeben
wurden. Anschließend wurde noch 15 Min. bei Raumtemperatur zur
Vervollständigung der Reaktion gerührt und danach dreimal mit jeweils 15 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4
getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 1.446 g braunes,
sirupöses Rohprodukt erhalten. Nach Säulenchromatographie (EE : MeOH = 2 : 1
über Kieselgel, Rf = 0.33; Rf (rac-13) = 0.26) konnten 1.417 g (4.2 mmol, 93 %)
rac-21 als schwach hellbrauner Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 79 ºC erhalten
werden.
OH OH
10
5 6 1 9 11 16 18
O 15
3 7 17
4 2 14
N 12
O
13
8
rac-21: MW = 335.4 g⋅mol-1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.27 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.20 ( br s, 1 H, -
1
H), 7.09 (m, 1 H, -H), 6.88 (dd, 3J = 9 Hz, 4J = 2 Hz, 1 H, -H), 4.01 (mt, 3J = 3 Hz,
1 H, 5-H), 2.5 – 1.5 (m, 19 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 16-H, 17-H), 0.97 (t,
3
J = 7 Hz, 3 H, 18-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.2 ppm [u] (C-15), 151.0 [u] (C-11), 150.3 [u]
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 119.7 [d] (C-12), 118.7 [d] (C-10), 78.7 [u]
(C-1), 67.2 [d] (C-5), 61.4 [u] (C-7), 47.5 [d] (C-8), 46.1 [u] (C-6), 44.0 [d] (C-2), 36.5
[u] (C-16), 33.6 [u] (C-4), 22.1 [u] (C-3), 18.8 [u] (C-17), 14.0 [d] (C-18).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 265 (M+, 14), 121 (3), 58 (100) 45 (6).](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-207-320.jpg)
![194 EXPERIMENTELLER TEIL
IR (KBr): ∼ = 3371 (m), 3169 (s9, 2946 (s), 2830 (s), 2786 (m), 1615 (m) 1585 (m),
ν
1481 (s), 1424 (s), 1369 (w), 1352 (m), 1305 (m), 1293 (s), 1278 (s) 1251 (s), 1221
(m), 1165 (m), 1108 (s), 1075 (s), 1033 (m), 1007 (m), 984 (s), 952 (s), 904 (m), 874
(m), 863 (m), 841 (s), 782 (s), 734 (m), 703 (s), 579 (w), 469 (w) cm-1.
3.3.3.8 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylamino-
methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22)
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 2.761 g
(8.7 mmol) rac-14⋅HCl, gelöst in 28 ml abs. THF, mit 1.500 g (13.4 mmol) Kalium-
tert-butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 1.410 ml (1.447 g, 13.6 mmol)
Buttersäurechlorid, gelöst in 2 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.39;
Rf (rac-14) = 0.14) wurden 2.396 g (6.9 mmol, 79 %) eines klaren sirupösen Öls
erhalten.
OH
10
5 6 1 9 11
17 O
19 16 O 3 7 15
4 2 14
18
N 12
13
O 8
rac-22: MW = 349.5 g⋅mol-1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.18 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.05 (s, 1 H,
1
10-H), 6.93 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (ddd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 4.78
(m, 1 H, 4-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.35 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.25 –
1.50 (m, 18 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 0.89 (t, 3J = 7 Hz, 3 H,
19-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.5 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.8 [u]
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.1 [d] (C-10), 76.1 [u]
(C-1), 73.3 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.4 [d] (C-2), 39.4
[u] (C-6), 36.9 [u] (C-17), 33.3 [u] (C-3), 27.9 [u] (C-5), 18.9 [u] (C-18), 14.0 [d]
(C-19).](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-208-320.jpg)
![196 EXPERIMENTELLER TEIL
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.19 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.05 (s, 1 H,
1
10-H), 6.93 (s, 1 H, 14-H), 6.70 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 2.5 Hz, 1 H, 12-H), 6.08 (br s,
1 H, 1-OH), 4.78 (m, 1 H, 4-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.4 – 1.5 (m, 19 H, 2-H, 3-H, 5-H,
6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 1.25 (m, 4 H, 19-H, 20-H), 0.83 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 21-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.7 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.6 [u]
(C-9), 129.4 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.2 [d] (C-10), 76.0 [u]
(C-1), 73.2 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 47.9 [d] (C-8), 43.2 [d] (C-2), 39.4
[u] (C-6), 34.9 [u] (C-17) 33.3 [u] (C-3), 31.6 [u] (C-19), 27.9 [u] (C-5), 25.1 [u] (C-18),
22.7 [u] (C-20), 14.3 [d] (C-21).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 377 (M+, 10), 135 (3), 58 (100).
MS (CI, Isobutan, 100 eV) m/z (%): 434 ([M + C4H9]+, 3), 378 ([M + H]+, 100), 262 (4).
IR (kapillar): ∼ = 2955 (s), 2861 (s), 2832 (m), 2783 (m), 1729 (s), 1601 (m),1583
ν
(m), 1484 (s), 1464 (s), 1432 (s), 1380 (m), 1355 (m), 1317 (m), 1288 (s), 1251 (s),
1176 (s), 1137 (m), 1097 (m), 1049 (m), 1034 (s), 1014 (s), 783 (m), 736 (w), 703 (m)
cm-1.
C22H35NO4 (377.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden
C 69.99 70.15
H 9.34 9.49
N 3.71 3.61](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-210-320.jpg)
![DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 197
3.3.3.10 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylamino-
methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24)
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei 0 ºC, dazu wurden 1.700 g (5.4 mmol)
rac-14⋅HCl, gelöst in 20 ml Diethylether auf 0 ºC gekühlt, mit 1.510 g (13.45 mmol)
Kalium-tert-butylat und mit 0.630 g (8.0 mmol) Essigsäurechlorid, gelöst in 2.6 ml
Diethylether, versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 1.816 g eines gelben, öligen
Rohprodukts erhalten. Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH =
1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.46; Rf (rac-14) = 0.19) wurden 1.292 g einer gelblich
öligen Mischung aus rac-24 und eines Diesters (Rf = 0.51) aus rac-14 und
Essigsäure (Verhältnis nach den Signalen der Protonen der Methoxygruppe (15-H)
im 1H-NMR: 4 : 1) erhalten. Ein Versuch zur weiteren Aufreinigung durch präparative
HPLC (Acetonitril : Wasser = 3 : 1 über RP-Select B-LiChrosor b-Säule) führte zur
Zersetzung von rac-24. Eine weitere Aufreinigung von rac-24 war somit nicht
möglich. Im folgenden wurde daher die nach Säulenchromatographie erhaltene
Mischung eingesetzt.
OH
10
5 6 1 9 11
O
17 16 O 3 7 15
4 2 14
N 12
13
O 8
rac-24: MW = 263.4 g⋅mol-1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.18 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.10 (s, 1 H,
1
10-H), 6.90 (s, 1 H, 12-H), 6.70 (md, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 4.77 (m, 1 H, 4-H), 3.75
(s, 3 H, 15-H), 2.34 (md, 2J = 14 Hz, 1 H, 7-H´), 2.30 – 1.45 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 5-H,
6-H, 7-H, 8-H, 17-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 170.9 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.8 [u]
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.8 [d] (C-12), 111.1 [d] (C-10), 76.0 [u]
(C-1), 73.7 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.2 [d] (C-8), 43.3 [d] (C-2), 39.4
[u] (C-6), 33.3 [u] (C-3), 27.9 [u] (C-5), 21.8 [d] (C-17).](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-211-320.jpg)
![198 EXPERIMENTELLER TEIL
3.3.3.11 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-3-butyryloxy-4-
dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25)
Zu einer Mischung von 1.750 g (6.3 mmol) rac-13 und 0.250 g (0.5 mmol) Pyridin in
5 ml Dichlormethan wurden unter Rühren 1.090 g (6.9 mmol) Buttersäureanhydrid
gegeben. In einer schwach exothermen Reaktion verfärbte sich die Reaktionslösung
hierbei schwach gelb. Die Reaktionslösung wurde für 26 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt, bis durch DC-Kontrolle kein Edukt mehr detektiert werden
konnte. Anschließend wurde die schwach gelbe Reaktionslösung mit einem
Überschuß ges. NaHCO3-Lösung für weitere 20 Stunden kräftig gerührt. Nach
Phasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 ml Dichlormethan extrahiert. Die
vereinigten organischen Phasen wurden mit dest. Wasser gewaschen und über
NaSO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurde ein gelbliches,
Sirup ähnliches Öl erhalten, das im Hochvakuum von Pyridinresten befreit wurde.
Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel,
Rf = 0.48) wurden 1.916 g (4.6 mmol, 67 %) rac-25 erhalten.
O O
18 22
21
16 O O 20 23
19 17
1 10
5 6 9 11
O
3 7 15
4 2 14
N 12
13
8
rac-25: MW = 419.6 g⋅mol-1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 6.76 (m, 3 H,
1
10-H, 12-H, 14-H), 5.18 (m, 1 H, 5-H), 3.80 (s, 3 H), 15-H), 3.09 (dd, 2J = 15 Hz,
4
J = 3 Hz, 1 H, 6-H´), 2.46 – 2.30 (m, 4 H, 6-H, 7-H´,17-H/21-H), 2.22 (t, 3J = 7 Hz,
2 H, 17-H/21-H), 2.09 (s, 6 H, 8-H), 1.95 – 1.60 (m, H, 2-H, 3-H, 4-H, 7-H, 18-H,
22-H), 1.01 (t , 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H/23-H), 0.95 (t , 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H/23-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.6 ppm [u] (C-16), 171.9 [u] (C-20), 159.1 [u]
(C-11), 143.0 [u] (C-9), 128.8 [d] (C-13), 117.9 [d] (C-14), 112.4 [d] (C-12), 111.4 [d]
(C-10), 84.0 [u] (C-1), 69.0 [d] (C-5), 59.0 [u] (C-7), 55.2 [d] (C-15), 45.8 [d] (C-8),](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-212-320.jpg)
![DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 199
44.8 [d] (C-2), 37.5 [u] (C-17), 36.4 [u] (C-21), 28.8 [u] (C-4), 18.5 [u] (C-18), 18.2 [u]
(C-22), 13.9 [d] (C-19), 13.7 [d] (C-23).
MS (CI, Isobutan, DEP, 100 eV) m/z (%): 477 ([M + C4H9]+, 2), 420 ([M + H]+, 100),
375 (11), 355 (13), 332 (63), 287 (73), 275 (15), 199 (44), 187 (23), 113 (13), 97 (10),
85 (24), 83 (21), 81 (30), 79 (14), 71 (31).
IR (kapillar): ∼ = 2963 (s), 2943 (s), 2874 (m), 2819 (m), 2765 (m), 1733 (s), 1605
ν
(m), 1585 (m), 1490 (m), 1461 (s), 1433 (s), 1382 (m), 1362 (m), 1292 (s), 1256 (s),
1191 (s), 1154 (s), 1097 (s), 1049 (m). 1029 (m), 991 (m), 973 (m),849 (w), 803 (w),
778 (w), 700 (w) cm-1.
Die Synthese von rac-25 erfolgte ebenfalls gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur in
THF mit einer Ausbeute von 96 %.
3.3.4 Darstellung der racemischen Ester zur Bestimmung des Umsatzes in
der enzymatischen Transacylierung
3.3.4.1 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Essigsäure-4-dimethylamino-
methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-47)
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g
(0.25 mmol) rac-12, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert-
butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.031 g (0.39 mmol)
Essigsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.30;
Rf (rac-12) = 0.18) wurden 0.054 g (0.17 mmol, 68 %) eines klaren, gelblichen Öls
erhalten.](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-213-320.jpg)
![200 EXPERIMENTELLER TEIL
O OH
5 10
6 1 9 11
16 O O
17 7 15
3 14
4 2
N 12
13
8
rac-47: MW = 321.4 g⋅mol-1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.17 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.06 (s, 1 H,
1
10-H), 6.95 (d, 3J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.69 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 5.12
(m, 1 H, 5-H), 3.73 (s, 3 H, 15-H), 2.32 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.26 –
1.10 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 169.0 ppm [u] (C-16), 158.4 [u] (C-11), 149.1 [u]
(C-9), 127.9 [d] (C-13), 115.9 [d] (C-14), 110.3 [d] (C-12), 109.6 [d] (C-10), 77.0 [u]
(C-1), 69.9 [d] (C-5), 59.4 [u] (C-7), 54.1 [d] (C-15), 46.7 [d] (C-8), 44.9 [u] (C-6), 43.1
[d] (C-2), 31.2 [u] (C-4), 24.8 [u] (C-3), 20.3 [d] (C-17).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 321 (M+, 8), 135 (4), 86 (11), 84 (18), 58 (100), 47 (4).
IR (kapillar): ∼ = 2946 (m), 2830 (w),1730 (s),1601 (w), 1584 (w), 1483 (w), 1462
ν
(m), 1431 (w), 1287 (m), 1250 (s), 1157 (w), 1034 (m), 785 (w), 733 (m) cm-1.
3.3.4.2 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylamino-
methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-46)
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g
(0.25 mmol) rac-12, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert-
butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.036 g (0.39 mmol)
Propionsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.36;
Rf (rac-12) = 0.18) wurden 0.060 g (0.18 mmol, 71 %) eines klaren, schwach
gelblichen sirupösen Öls erhalten.](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-214-320.jpg)
![DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 201
O OH
18 5 10
6 1 9 11
16 O O
17 3 7 15
4 2 14
N 12
13
8
rac-46: MW = 335.4 g⋅mol-1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.17 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.07 (s, 1 H,
1
10-H), 6.96 (d, 3J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.69 (md, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 5.13 (m, 1 H,
5-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.33 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.26 – 1.30 (m,
16 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H), 1.01 (t, 3J = 8 Hz, 3 H, 18-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.7 ppm [u] (C-16), 159.4 [u] (C-11), 150.1 [u]
(C-9), 129.0 [d] (C-13), 117.0 [d] (C-14), 111.5 [d] (C-12), 110.7 [d] (C-10), 78.0 [u]
(C-1), 70.6 [d] (C-5), 60.9 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.2 [d] (C-8), 46.3 [u] (C-6), 44.5
[d] (C-2), 32.6 [u] (C-4), 38.3 [u] (C-17), 26.3 [u] (C-3), 9.6 [d] (C-18).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 335 (M+, 12), 279 (3), 135 (5), 84 (11), 58 (100).
IR (kapillar): ∼ = 2944 (s), 2862 (m), 2831 (m), 2783 (m), 1732 (s), 1601 (m), 1584
ν
(m), 1483 (m), 1462 (s), 1429 (m), 1351 (w), 1286 (m), 1255 (s), 1193 (s), 1158 (m),
1083 (m), 1048 (m), 1023 (m), 785 (m), 732 (w), 702 (w) cm-1.
3.3.4.3 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylamino-
methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24)
Die Synthese erfolgte, indem 0.070 g (0.25 mmol) rac-14, gelöst in 1 ml
Dichlormethan, mit 2.3 ml (25 mmol) Vinylacetat und 500 mg Novozym 435 versetzt
und bei Raumtemperatur gerührt wurden. Die Rührgeschwindigkeit wurde dabei nicht
zu hoch gewählt, um den immobilisierten Katalysator nicht zu beeinträchtigen. Nach
96 h konnte kein Edukt 14 mehr detektiert werden. Die Reaktionslösung wurde vom
Katalysator abfiltriert, mit 2 ml Dichlormethan versetzt und für weitere 15 h mit 5 ml
ges. NaHCO3-Lösung gerührt, um während der Reaktion entstandene Essigsäure zu
neutralisieren. Nach Phasentrennung wurde dreimal mit je 5 ml Dichlormethan](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-215-320.jpg)
![202 EXPERIMENTELLER TEIL
nachextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4 getrocknet.
Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.080 g (0.25 mmol, 99 %)
gelbliches Öl erhalten.
OH
10
5 6 1 9 11
O
17 16 O 3 7 15
4 2 14
N 12
O 8
13
rac-24: MW = 321.4 g⋅mol-1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.16 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.03 (s, 1 H,
1
10-H), 6.91 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 4.78 (m, 1 H, 4-
H), 3.71 (s, 3 H, 15-H), 2.33 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.20 – 1.55 (m,
17 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 169.4 ppm [u] (C-16), 158.3 [u] (C-11), 149.3 [u]
(C-9), 127.9 [d] (C-13), 116.0 [d] (C-14), 110.5 [d] (C-12), 109.7 [d] (C-10), 74.6 [u]
(C-1), 72.2 [d] (C-4), 59.9 [u] (C-7), 54.0 [d] (C-15), 46.7 [d] (C-8), 41.9 [d] (C-2), 38.0
[u] (C-6), 31.9 [u] (C-3), 26.5 [u] (C-5), 20.4 [d] (C-17).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 322 (3), 321 (M+, 11), 135 (3), 118 (3), 86 (57), 84 (91), 58
(100), 49 (16), 47 (16).
IR (kapillar): ∼ = 2951 (s), 2862 (w), 2831 (m), 2781 (w), 1730 (s), 1602 (s), 1584
ν
(s), 1483 (s), 1463 (s), 1431 (m), 1366 (m), 1317 (w), 1286 (s), 1252 (s), 1171 (m),
1094 (w), 1034 (s), 998 (m), 962 (w), 913 (m), 786 (m), 733 (s), 704 (m) cm-1.](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-216-320.jpg)
![DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 203
3.3.4.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylamino-
methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-45)
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g
(0.25 mmol) rac-14, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert-
butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.036 g (0.39 mmol)
Propionsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.33;
Rf (rac-14) = 0.14) wurden 0.055 g (0.16 mmol, 66 %) eines klaren, schwach
gelblichen sirupösen Öls erhalten.
OH
10
5 6 1 9 11
17 O
16 O 3 7 15
4 2 14
18 N 12
O 8
13
rac-45: MW = 335.4 g⋅mol-1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.17 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.05 (s, 1 H,
1
10-H), 6.93 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 4.77 (m, 1 H, 4-
H), 3.72 (s, 3 H, 15-H), 2.50 – 1.55 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 7-H´, 8-H, 17-
H), 1.07 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 18-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 174.2 ppm [u] (C-16), 159.7 [u] (C-11), 150.7 [u]
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.8 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 76.0 [u]
(C-1), 73.4 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.4 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.3 [d] (C-2), 39.4
[u] (C-6), 33.2 [u] (C-3), 28.2 [u] (C-17), 27.8 [u] (C-5), 9.5 [d] (C-18).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 335 (M+, 10), 135 (3), 86 (37), 84 (57), 58 (100), 49 (7).
IR (kapillar): ∼ = 2947 (s), 2861 (w), 2831 (m), 2782 (w), 1728 (s), 1602 (s), 1584
ν
(s), 1483 (s), 1728 (s), 1602 (s), 1584 (s), 1483 (s), 1463 (s), 1430 (s), 1352 (w),
1287 (m), 1255 (m), 1193 (s), 1084 (s), 1047 (s), 1020 (s), 997 (m), 962 (w), 911 (w),
785 (m), 734 (s), 704 (m) cm-1.](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-217-320.jpg)
![204 EXPERIMENTELLER TEIL
3.3.5 Versuche zur Darstellung von (±)-(1RS,5RS,8RS)-8-
Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-2,4-dioxa-bicyclo-[3.3.1]-
nonan-3-on (rac-48)
3.3.5.1 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit Bis-
(trichlormethyl)-carbonat222,246
1.150 g (3.6 mmol) rac-13⋅HCl und 2.888 g (36.5 mmol) Pyridin wurden in 20 ml abs.
Dichlormethan gelöst und auf −76 ºC gekühlt. Zu der klaren Lösung wurde über
einen Zeitraum von 10 Min. bei −76 ºC eine Lösung von 0.520 g (1.75 mmol) Bis-
(trichlormethyl)-carbonatf (Triphosgen) in 8 ml abs. Dichlormethan mittels Spritzen-
technik gegeben. Anschließend wurde noch 1.5 Stunden bei −76 ºC gerührt, dabei
verfärbte sich die Lösung schwach gelb und es bildete sich ein weißer Feststoff.
Nachdem die Lösung über einen Zeitraum von 1 Stunde auf Raumtemperatur
erwärmt wurde, wurde ein Überschuß an ges. NaHCO3-Lösung zugegeben und für
weitere 10 Stunden gerührt. Nach Phasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4
getrocknet, und das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt. Es
konnten 1.284 g einer Rohmischung erhalten werden, welche noch Pyridin enthielt.
Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel,
Rohmischung: Rf (Pyridin) = 0.68, Rf (1) = 0.34, Rf (2) = 0.28, Rf (rac-13) = 0.10)
konnte allerdings nur eine Mischung von nicht näher charakterisierten
Zersetzungsprodukten und 0.334 g rac-13 erhalten werden.
Ein analoger Versuch mit rac-13 als Edukt führte zum gleichen Ergebnis.
f
S. B. Damle, Safe handling of diphosgene and triphosgene, Chem. & Eng. News 1993, 71, 4.](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-218-320.jpg)
![206 EXPERIMENTELLER TEIL
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.8 ppm [u] (C-11), 148.4 [u] (C-9), 142.5 [u]
13
(C-1), 137.3 [n. b.] (C-2), 133.1 [u] (C-16), 130.8 [d] (C-17), 129.6 [d] (C-13), 124.1
[d] (C-17/19), 117.8 [d] (C-14), 117.3 [d] (C-17/19), 112.7 [d] (C-12), 111.3 [d] (C-10),
75.2 [d] (C-5), 55.5 [d] (C-15), 33.0 [u] (C-6), 26.9 [u] (C-4), 23.5 [u] (C-3).
Vor Säulenchromatographie: MS (EI, 70 eV) m/z (%): 305 (M+[rac-48], 22), 298
(M+[rac-49], 20), 186 (83), 121 (17), 58 (100).
Ein analoger Versuch mit rac-13⋅HCl als Edukt führte zum gleichen Ergebnis, hier
konnte allerdings neben rac-49 auch rac-13 in geringen Mengen isoliert werden.](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-220-320.jpg)
![216 EXPERIMENTELLER TEIL
3.6.2 Berechnung des E-Werts
Folgende Formeln wurden zur Berechnung der E-Werte benutzt6,106,108:
ln [1 − c(1+ eeP )]
Formel 3.2: E= , für c < 50 %
ln [1− c(1− ee P )]
ln [(1− c)(1− ee S )]
Formel 3.3: E= , für c > 50 %
ln [(1− c)(1+ ee S )]
ee S
Formel 3.4: Umsatz ber =
ee S + ee P
1− ee S ee P (1− ee S )
ln ln (ee + ee )
1 + (eeS /ee P ) S
E= =
P
Formel 3.5:
1 + ee S ee P (1+ ee S )
ln ln
1 + (eeS /ee P ) ee P + ee S )
(mit: c = Umsatz, ee P = ee-Wert des Produkts, ee S = ee-Wert des Substrats)
Alle E-Werte in dieser Arbeit wurden aus dem ee-Wert des Substrats und dem
ee-Wert des Produkts berechnet. Dazu wurde Formel 3.5, die sich aus Formel 3.4
eingesetzt in Formel 3.2 oder Formel 3.3 ergibt, verwendet.6 Von einer Berechnung
des E-Werts aus dem gemessenen Umsatz und nur einem ee-Wert wurde
abgesehen.](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-230-320.jpg)
![218 EXPERIMENTELLER TEIL
Tabelle 3.8: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen
Einphasensystem
Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute
E
zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Phenol (−)-8
2h 62 % 47 % 47 % 49 % 13
3.6.3.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen
Einphasensystem zur Darstellung von (+)-15
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
1.120 g (3.5 mmol) des Esters rac-15 in 8 ml tert-Butanol und 72 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 400 µl (4.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die
Reaktion wurde nach 3 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 85 % durch
kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach
Säulenchromatographie (CHCl3 : i-Propanol = 2 : 1 über Kieselgel, Rf ((−)-8) = 0.22;
Rf ((+)-15) = 0.01) konnten 0.560 g (2.25 mmol, 64 %) (−)-8 und 0.113 g (0.35 mmol,
10 %) (+)-15 isoliert werden.
(+)-15: [α ] 20 = + 10.74º (c = 0.7, MeOH)
D
(−)-8: [α ] 20 = − 3.43º (c = 1.5, MeOH)
D
Tabelle 3.9: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen
Einphasensystem
Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute
E
zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Phenol (−)-8
3h ≥ 98 % 10 % 27 % 64 % 7](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-232-320.jpg)
![ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 223
Tabelle 3.17: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen
Einphasensystem
Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E
3h 64 % 98 % 45 % 10
3.6.3.12 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen
Zweiphasensystem mit roher CRL
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.0, dazu wurden
0.316 g (1.0 mmol) des Esters rac-15 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 45 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 3.25 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 51 % durch kontinuierliche
Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach
Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf ((+)-15) = 0.31;
Rf ((−)-8) = 0.10) konnten 0.203 g (0.64 mmol, 64 %) (+)-15 und 0.076 g (0.30 mmol,
30 %) (−)-8 isoliert werden.
(+)-15: [α ] 20 = + 17.90º (c = 1.3, MeOH)
D
(−)-8: [α ] 20 = − 11.45º (c = 2.0, MeOH)
D
Tabelle 3.18: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen
Zweiphasensystem mit roher CRL
Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute
E
zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Alkohol (−)-8
3.25 h 75 % 64 % 85 % 30 % 27](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-237-320.jpg)
![234 EXPERIMENTELLER TEIL
Rf ((−)-18) = 0.32; Rf ((+)-12) = 0.15) konnten 0.082 g (0.23 mmol, 47 %) (−)-18 und
0.042 g (0.15 mmol, 30 %) (+)-12 isoliert werden.
(−)-18: [α ] 20 = − 6.01º (c = 1.50, MeOH)
D
(+)-12: [α ] 20 = + 21.70º (c = 0.80, MeOH)
D
Tabelle 3.32: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18
Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute
E
zeit (−)-18 Ester (−)-18 (+)-12 Alkohol (+)-12
5.75 h 86 % 47 % 94 % 30 % 89
3.6.8.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen
Einphasensystem
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.500 g (1.43 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
37 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war zu Beginn stark getrübt, am Ende der
Reaktionszeit klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 4.75 Stunden bei Umsatz
(GC) von ca. 49 % durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 an
Kieselgel, Rf ((+)-18) = 0.36; Rf ((−)-12) = 0.18) konnten 0.216 g (0.62 mmol, 43 %)
(+)-18 und 0.162 g (0.58 mmol, 41 %) (−)-12 isoliert werden.
(+)-18: [α ] 20 = + 7.03º (c = 0.72, MeOH)
D
(−)-12: [α ] 20 = − 28.30º (c = 1.00, MeOH)
D](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-248-320.jpg)
![ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 235
Tabelle 3.33: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen
Einphasensystem
Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute
E
zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12
4.75 h 93 % 41 % 95 % 41 % 133
3.6.8.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen
Zweiphasensystem
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.5, dazu wurden
0.349 g (1.0 mmol) des Esters rac-18 in 26 ml MTBE und 26 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 6 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
37 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 72 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 45 % durch kontinuierliche
Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1:1 an Kieselgel,
Rf ((+)-18) = 0.36; Rf ((−)-12) = 0.18) konnten 0.140 g (0.40 mmol, 40 %) (+)-18 und
0.110 g (0.39 mmol, 39 %) (−)-12 isoliert werden.
(+)-18: [α ] 20 = + 7.03º (c = 0.72, MeOH)
D
(−)-12: [α ] 20 = − 28.30º (c = 1.00, MeOH)
D
Tabelle 3.34: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen
Zweiphasensystem
Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute
E
zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12
72 h ≥98 % 40% ≥98 % 39 % >200](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-249-320.jpg)
![236 EXPERIMENTELLER TEIL
3.6.8.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen
Zweiphasensystem mit extraktiver Aufarbeitung
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.2, dazu wurden
0.500 g (1.43 mmol) des Esters rac-18 in 25 ml MTBE und 25 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.2) gelöst und mit 13 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
25.9 U/mg) versetzt. Nach 48 Stunden bei einem Umsatz von ca. 50 % wurde zum
Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung die Reaktionslösung zunächst einmal mit
40 ml MTBE extrahiert und anschließend dreimal mit je 30 ml Diethylether. Die
vereinigten organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet und im
Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.254 g (0.73 mmol, 50.8 %) farbloser,
öliger Ester (+)-18 mit einem ee-Wert von ≥98 % isoliert werden. Die verbliebene
wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck von
Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10 eingestellt.
Anschließend wurde viermal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und die
vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen am
Rotationsverdampfer wurden 0.184 g (0.66 mmol, 46.1 %) Alkohol (−)-12 mit einem
ee-Wert von 97 % erhalten.
(+)-18: [α ] 20 = + 7.9º (c = 0.69, MeOH)
D
(−)-12: [α ] 20 = − 28.60º (c = 0.93, MeOH)
D
Tabelle 3.35: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 wäßrig-organischen
Zweiphasensystem mit extraktiver Aufarbeitung
Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute
E
zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12
48 h ≥98 % 51 % 97 % 46 % >200](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-250-320.jpg)
![ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 255
3.6.13.7 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen
Einphasensystem mit extraktiver Aufarbeitung
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu
wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Cholesterolesterase
(CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Zum Abbruch
der Reaktion nach 22.5 Stunden und zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung
dreimal mit je 40 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
wurden mit Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten
0.105 g (0.30 mmol, 53 %) (+)-22 mit einem ee-Wert von 91 % isoliert werden. Die
verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem
Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10
eingestellt. Anschließend wurde dreimal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und
die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen am
Rotationsverdampfer wurden 0.071 g (0.25 mmol, 45 %) (−)-14 mit einem ee-Wert
von 91 % erhalten.
(+)-22: [α ] 20 = + 14.14º (c = 1.02, MeOH)
D
(−)-14: [α ] 20 = − 34.75º (c = 1.05, MeOH)
D
Tabelle 3.63: CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 mit extraktiver
Aufarbeitung
Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute
E
zeit (+)-22 Ester (+)-22 (−)-14 Alkohol (−)-14
22.5 h 91 % 53 % 91 % 45 % 67](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-269-320.jpg)
![258 EXPERIMENTELLER TEIL
3.6.13.11 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester
rac-22 (rac-22⋅HCl) im wäßrigen Einphasensystem
Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22
(rac-22⋅HCl) unter Zusatz von Aceton als Cosolvens
1.00 g (2.59 mmol) rac-22⋅HCl wurden zu einer Mischung aus 2 ml (16 Vol%) Aceton
und 10.8 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M, pH 7.0) gegeben. Die Lösung
wurde anschließend auf pH 7.0 eingestellt. Nachdem durch GC-Reaktionskontrolle
überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte,
wurden 9 mg Chirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg) zugegeben. Danach wurde
der Ansatz bei Raumtemperatur über den gesamten Reaktionszeitraum kräftig
gerührt. Der pH-Wert der Reaktionslösung wurde durch einen pH-STAT Autotitrator
mit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten. Der Verbrauch an NaOH-Lösung wurde
über die gesamte Reaktionsdauer verfolgt. Zur HPLC-Reaktionskontrolle wurden
analog zur AAV 6 zehn 100 µl Proben entnommen. Nach 24 Stunden wurde zum
Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung die Reaktionslösung zunächst viermal
mit je 30-40 ml MTBE extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit
Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.591 g
(1.69 mmol, 65 %) farbloser, öliger Ester (−)-22 mit einem ee-Wert von 28 % isoliert
werden. Die verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter
vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3
auf pH 10 eingestellt. Anschließend wurde fünfmal mit je 30 ml Dichlormethan
extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach
Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.165 g einer Mischung aus 82 %
(0.46 mmol, 18 %) Alkohol (+)-14 mit einem ee-Wert von 91 % und 18 % (0.10 mmol,
4 %) Ester (−)-22 (mit einem ee-Wert von 28 %) erhalten.
(−)-22: [α ] 20 = − 4.62º (c = 0.96, MeOH)
D
(+)-14: [α ] 20 = + 26.40º (c = 0.32, MeOH)
D](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-272-320.jpg)
![262 EXPERIMENTELLER TEIL
(0.62 mmol, 54 %) durch Spuren von Hexansäure penetrant ziegenähnlich
riechender Ester (−)-23 mit einem ee-Wert von 92 % isoliert werden. Die verbliebene
wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck von
Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10 eingestellt.
Anschließend wurde fünfmal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und die
vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen am
Rotationsverdampfer wurden 0.146 g (0.52 mmol, 46 %) (+)-14 als Öl mit einem ee-
Wert von 77 % erhalten.
(−)-23: [α ] 20 = − 6.70º (c = 1.93, MeOH)
D
(+)-14: [α ] 20 = + 25.83º (c = 0.9, MeOH)
D
Tabelle 3.71: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-23 unter Zusatz
von Aceton als Cosolvens
Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute
E
zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14
24 h 92 % 54 % 77 % 46 % 24
3.6.15 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-
Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol
(rac-14)
3.6.15.1 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14
Die Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vier
verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des
Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.72 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit
jeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. In allen Reaktionen
entstand eine klare Lösung in der das unlösliche Enzym suspendiert war.](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-276-320.jpg)
![ANHANG ZUM EXPERIMENTELLEN TEIL 271
3.7 Anhang zum experimentellen Teil
3.7.1 Programm zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE durch
Verseifung von Buttersäureethylester
Mode STAT
Regelparameter Endpunkt pH 8.00
Regelbereich 0.5
Max. Rate 10.0 ml/Min.
Min. Rate 25.0 µl/Min.
Titrationsparameter Start V aus
Start 0s
Start pH aus
Startrate aus
Zeitintervall 60 s
Titrationsrichtung +
Meßeingang 1
Parameter
Abbruchbedingungen Stoppzeit abs. 7000 s
Stoppvolumen abs. 99.99 ml
Stopprate aus
Füllgeschwindigkeit max
Statistik Status aus
Auswertung U. Grenze 1 aus
Fix-V1 bis Fix-V9 alle 600 s (→ C51 bis C59)
Fix-Zeit 1 aus
Überwachung Alle Unterpunkte aus
Vorwahl Ident. abfragen aus
Einmass abfragen alle (→ C00)
Rate anzeigen aus
Aktivierpuls aus
c-fml C01=0.01
Formel RS1 = (C52 − C51) / (C00 ∗ C01) = 10 – 20 Min. [U]
Report Kurve, voll, Liste](https://image.slidesharecdn.com/griebelcarsten-120314145749-phpapp01/85/Enzyme-catalyzed-kinetic-resolution-of-racemic-tramadol-and-its-analogues-industrial-applicability-285-320.jpg)
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
- 1. Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungvon Tramadol-Analoga und deren industrielle Anwendbarkeit Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Rheinisch- Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation vorgelegt von Diplom-Chemiker Carsten Griebel aus Niebüll Berichter: Universitätsprofessor Dr. H.-J. Gais Universitätsprofessor Dr. D. Enders Tag der mündlichen Prüfung: 13. Dezember 2002 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.
- 2. Die vorliegende Arbeitwurde im Zeitraum vom 01.04.1998 bis zum 28.02.2002 am Institut für Organische Chemie der Rheinisch Westfälischen Technischen Hochschule Aachen unter Anleitung von Prof. Dr. H.-J. Gais angefertigt.
- 3. „Wenn wir wüßten,was wir tun, würden wir das nicht Forschung nennen.“ (Albert Einstein)
- 4. Danksagung Ich möchte michan dieser Stelle bei allen Mitarbeitern des Instituts für Organische Chemie der RWTH Aachen bedanken. Besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. H.-J. Gais für die engagierte Unterstützung und Betreuung dieser Arbeit, die interessanten und anregenden Diskussionen sowie für die Bereitstellung der ausgezeichneten Arbeitsbedingungen. Allen Arbeitskreismitgliedern danke ich für die angenehme und freundschaftliche Arbeitsatmosphäre, die stete Diskussionsbereitschaft sowie für die gute Zusammenarbeit. Für die hilfreichen Anregungen bei der Fertigstellung der vorliegenden Arbeit danke ich Herrn Dipl.-Chem. Stefan Koep. Bei Frau Ing. Cornelia Vermeeren möchte ich mich besonders für die Lösung einer Vielzahl von Trennproblemen und für ihre stete Hilfsbereitschaft bedanken. Besonderer Dank gebührt auch Frau Magdalena Grosch und Frau Ursula Ripkens für die durchgeführten HPLC- Trennungen. Für die Ausführung von analytischen Aufgaben möchte ich mich bei Frau Dittrich, Frau Glensk, Frau Kuyper, Frau Müller, und Herrn Dr. Runsink bedanken und für die Abwicklung organisatorischer Aufgaben bei Frau Bertrand, Frau Renardy, Herrn Dr. Bettray und Herrn Dr. Geibel. Meiner Forschungspraktikantin Frau Dipl.-Chem. Martina Mennicken danke ich für ihre präparative Unterstützung und engagierte Mitarbeit. Ein großer Dank gebührt auch den Mitarbeitern der Grünenthal GmbH, die mich hilfsbereit unterstützt haben. Im besonderen möchte ich Herrn Dr. Helmut Buschmann für seine engagierte Unterstützung dieser Arbeit danken, ebenso Herrn Heinz-Günter Döteberg, Herrn Dr. Michael Finkam, Herrn Dr. Bernd Sundermann, Herrn Dr. Oswald Zimmer und nicht zuletzt denjenigen Mitarbeitern, die es ermöglicht haben, daß mir die benötigten Substanzen zur Verfügung gestellt werden konnten. Ganz besonders möchte ich mich herzlich bei meiner Familie und meinen Freunden bedanken, die mich während meiner Promotionszeit unterstützt haben.
- 5. Teile dieser Arbeitwurden auszugsweise publiziert in: Enzymatic resolution of analgesics: δ-hydroxytramadol, ε-hydroxytramadol and O-desmethyltramadol. H.-J. Gais, C. Griebel, H. Buschmann, Tetrahedron: Asymmetry 2000, 11, 917-928. Verfahren zur enzymatischen Racematspaltung von Aminomethyl-Aryl- Cyclohexanol-Derivaten. H. Buschmann, D. Kaulartz, C. Griebel, H.-J. Gais, DE 10004926 A1, 04.02.2000 und WO 01/57232 A1, 09.08.2001; Chem. Abstr. 2001, 135, 179820.
- 6. Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VIII 1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 1 1.1 Opioide Analgetika 3 1.2 Tramadol und analgetisch aktive Analoga 7 1.3 Zielsetzung 11 2 THEORETISCHER TEIL 13 2.1 Darstellung und Charakterisierung der MPEG/PLE-Katalysator Präparation 13 2.2 Darstellung der racemischen Tramadol-Analoga 16 2.2.1 Synthesewege der von GRÜNENTHAL bereitgestellten Substanzen 24 2.3 Vorbemerkungen zu Enzym-Katalyse 26 2.3.1 Kinetische Racematspaltungen 26 2.3.1.1 Der E-Wert 29 2.3.2 Auswahl geeigneter Enzyme und Reaktionsmedien 35 2.3.2.1 Auswahl der verwendeten Substrate und Reaktionsbedingungen in der enzymatischen Hydrolyse 38 2.3.2.2 Auswahl der verwendeten Acyldonoren und Reaktionsbedingungen in der enzymatischen Transacylierung 39 2.4 Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungen von Tramadol-Analoga 42 2.4.1 Substrate auf Basis aromatischer Hydroxylfunktionen 42 2.4.1.1 Enzym-katalysierte Hydrolysen des (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylamino- methyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylesters (rac-15) 49 2.4.1.2 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylamino- methyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 59 2.4.1.3 Enzym-katalysierte Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8) 63 2.4.1.4 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino- 1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 73 2.4.1.5 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethyl- amino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) 75 2.4.2 Substrate auf Basis sekundärer Hydroxylfunktionen 77 2.4.2.1 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino- methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 82 2.4.2.2 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl- 1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 93 2.4.2.3 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure- 4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 104
- 7. VERZEICHNISSE II 2.4.2.4 Versuche zur enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)- 6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 108 2.4.2.5 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylamino- methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 113 2.4.2.6 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethyl- aminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 120 2.4.2.7 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylamino- methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23) 138 2.4.2.8 Darstellung von (+)-14 durch enzymatische Racematspaltung im präparativen Maßstab 140 2.4.2.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl- 1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) 144 2.4.3 Substrate auf der Basis tertiärer Hydroxylfunktionen 154 2.4.3.1 Versuche zur Enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure- 3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 155 2.5 Zusammenfassung 158 2.6 Ausblick 163 3 EXPERIMENTELLER TEIL 164 3.1 Allgemeine Vorbemerkungen 165 3.1.1 Eingesetzte Computerprogramme 165 3.1.2 Analytische Methoden und Geräte 165 3.1.3 Lösungsmittel und Reagenzien 170 3.1.4 Verwendete Proteine 170 3.1.5 Besondere Arbeitstechniken 173 3.2 Darstellung und Analytik der MPEG/PLE Präparationen 174 3.2.1 Darstellung von MPEG/PLE 174 3.2.2 Standardtest zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE 174 3.3 Darstellung der Substrate zur enzymatischen Racematspaltung 176 3.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 176 3.3.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Freisetzung der racemischen Basen (AAV 1) 176 3.3.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester von Phenolen (AAV 2) 176 3.3.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester von Hydroxysubstituierten-Tramadolen (AAV 3) 177 3.3.1.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung von Hydrochloriden aus den racemischen Basen (AAV 4) 177 3.3.2 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung 178 3.3.2.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexanol (rac-7) 178
- 8. III VERZEICHNISSE 3.3.2.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)- phenol (rac-8) 179 3.3.2.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)- phenol (rac-11) 180 3.3.2.4 Darstellung von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 181 3.3.2.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 183 3.3.2.6 Darstellung von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexan-1,4-diol (rac-14) 184 3.3.3 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse 185 3.3.3.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy- cyclohexyl)-phenylester (rac-15) 185 3.3.3.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy- cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 186 3.3.3.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy- 1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 187 3.3.3.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 189 3.3.3.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 190 3.3.3.6 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-3-(6-Dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy- cyclohexyl)-phenol (rac-20) 191 3.3.3.7 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylaminomethyl- 1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 193 3.3.3.8 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- 4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 194 3.3.3.9 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- 4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23) 195 3.3.3.10 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- 4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24) 197 3.3.3.11 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylamino- methyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 198 3.3.4 Darstellung der racemischen Ester zur Bestimmung des Umsatzes in der enzymatischen Transacylierung 199 3.3.4.1 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Essigsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-47) 199 3.3.4.2 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-46) 200
- 9. VERZEICHNISSE IV 3.3.4.3 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- 4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24) 201 3.3.4.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-45) 203 3.3.5 Versuche zur Darstellung von (±)-(1RS,5RS,8RS)-8-Dimethylaminomethyl-1- (3-methoxy-phenyl)-2,4-dioxa-bicyclo-[3.3.1]-nonan-3-on (rac-48) 204 3.3.5.1 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit Bis-(trichlormethyl)-carbonat 204 3.3.5.2 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit 1,1´-Carbonyldiimidazol 205 3.4 Überprüfung der Hydrolysestabilität der Estersubstrate 207 3.4.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Überprüfung der Hydrolysestabilität der racemischen Substrat Ester (AAV 5) 207 3.4.2 Hydrolysestabilität des Esters rac-15 207 3.4.3 Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und rac-25 207 3.4.4 Hydrolysestabilität des Esters rac-23 208 3.4.5 Hydrolysestabilität des Esters rac-16 208 3.4.6 Hydrolysestabilität des Esters rac-24 209 3.5 Bestimmung von Umsätzen und Enantiomerenverhältnissen 210 3.6 Enzym-katalysierte Racematspaltungen im wäßrigen und organischen Medium 214 3.6.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 214 3.6.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrigen Einphasen System (AAV 6) 214 3.6.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasen System (AAV 7) 214 3.6.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Transacylierung in organischen Lösungsmitteln (AAV 8) 215 3.6.2 Berechnung des E-Werts 216 3.6.3 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15) 217 3.6.3.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem unter Zusatz von Aceton als Cosolvens 217 3.6.3.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 217 3.6.3.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem zur Darstellung von (+)-15 218 3.6.3.4 Versuch zur AChE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 219 3.6.3.5 CAL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 219 3.6.3.6 Mucor miehei Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 220 3.6.3.7 HLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 220 3.6.3.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 221
- 10. V VERZEICHNISSE 3.6.3.9 PPL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 221 3.6.3.10 BCL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 222 3.6.3.11 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem mit roher CRL 222 3.6.3.12 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system mit roher CRL 223 3.6.3.13 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system mit aufgereinigter CRL 224 3.6.4 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 224 3.6.4.1 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem mir roher CRL 224 3.6.4.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem bei pH 7.0 225 3.6.4.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem bei pH 8.0 225 3.6.5 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8) 226 3.6.5.1 Versuche zur enzymatischen Transacylierung des Phenols rac-8 unter Verwendung verschiedener Lipasen 226 3.6.5.2 Versuch zur PPL-katalysierten Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 227 3.6.5.3 BCL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 228 3.6.5.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 229 3.6.5.5 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylbutyrat 230 3.6.5.6 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 230 3.6.6 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino- 1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 231 3.6.6.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen Einphasensystem 231 3.6.6.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen Einphasensystem mit roher CRL 232 3.6.7 Versuche zur Enzymatischen Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethyl- amino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) unter Verwendung verschiedener Lipasen 232 3.6.8 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino- methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 233 3.6.8.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem 233 3.6.8.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem 234 3.6.8.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system 235 3.6.8.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system mit extraktiver Aufarbeitung 236
- 11. VERZEICHNISSE VI 3.6.8.5 Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem 237 3.6.8.6 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasen- system 237 3.6.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl- 1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 238 3.6.9.1 Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat 238 3.6.9.2 BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat 238 3.6.9.3 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat 239 3.6.9.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat 241 3.6.9.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 242 3.6.9.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 243 3.6.10 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure- 4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 244 3.6.10.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 unter Verwendung verschiedener Lipasen im wäßrigen Einphasensystem 244 3.6.10.2 Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem 245 3.6.10.3 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrigen Einphasen- system 246 3.6.11 Versuche zur Enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethyl- aminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 246 3.6.11.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Verwendung verschiedener Lipasen 246 3.6.11.2 Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 247 3.6.11.3 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Zusatz von Triethylamin 248 3.6.12 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylamino- methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 249 3.6.12.1 CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 249 3.6.12.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 249 3.6.12.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 250 3.6.12.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system 250 3.6.13 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylamino- methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 251 3.6.13.1 Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 251 3.6.13.2 Novozym 435-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen- system 252
- 12. VII VERZEICHNISSE 3.6.13.3 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen- system 252 3.6.13.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 253 3.6.13.5 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system 253 3.6.13.6 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 254 3.6.13.7 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem mit extraktiver Aufarbeitung 255 3.6.13.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl im wäßrigen Einphasensystem 256 3.6.13.9 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 256 3.6.13.10 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen- system unter Zusatz von Aceton als Cosolvens 257 3.6.13.11 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22 (rac-22⋅HCl) im wäßrigen Einphasensystem 258 3.6.14 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylamino- methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23) 261 3.6.14.1 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-23 im wäßrigen Einphasen- system mit Aufarbeitung durch kontinuierliche Extraktion 261 3.6.15 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl- 1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) 262 3.6.15.1 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 262 3.6.15.2 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat 263 3.6.15.3 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat 264 3.6.15.4 Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Isopropenylacetat 267 3.6.15.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 267 3.6.15.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 268 3.6.15.7 Versuch zur Chirazyme E1-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 268 3.6.16 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure- 3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 269 3.6.16.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 im wäßrigen Einphasensystem 269 3.6.16.2 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 269 3.7 Anhang zum experimentellen Teil 271 3.7.1 Programm zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE durch Verseifung von Buttersäureethylester 271 4 LITERATUR 272
- 13. VERZEICHNISSE VIII Abkürzungsverzeichnis AAV Allgemeine Arbeitsvorschrift Abb. Abbildung AChE Acetylcholinesterase abs. absolut APT attached proton test Äq. Äquivalent BSA Rinderserum-Albumin (bovine serum albumin) BCL Burkholderia cepacia Lipase c Umsatz (conversion) d Duplett d Tag dest. Wasser vollentmineralisiertes Wasser CAL-B Candida antarctica Lipase, Typ B CE Cholesterolesterase CRL Candida rugosa Lipase CVL Chromobacterium viscosum Lipase Da Dalton DC Dünnschichtchromatographie DCM Dichlormethan DiBAl-H Diisobutylaluminiumhydrid E-Wert Selektivitätsparameter nach Chen und Sih (Enantiomeric Ratio) ee Enantiomerenüberschuß (enantiomeric excess) EE Essigsäureethylester Et Ethyl EtOH Ethanol GC Gaschromatographie ges. gesättigt h Stunde HLE Pferdeleber-Esterase (horse liver esterase) HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie HV Hochvakuum J Kopplungskonstante
- 14. IX VERZEICHNISSE KOtBu Kalium-tert-butylat log P-Wert Logarithmus des Verteilungskoeffizienten eines Lösungsmittels zwischen Oktanol und Wasser m Multiplett MeOH Methanol Min. Minuten MPEG Polyethylenglykolmonomethylether MPEG/PLE Colyophilisat aus Schweineleber-Esterase und Poly- ethylenglykolmonomethylether MTBE tert-Butyl-methylether MW Molekulargewicht n. b. nicht bestimmt NMR Kernmagnetische Resonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance) PLE Schweineleber-Esterase (porcine liver esterase) PLE/BSA/MPEG Colyophilisat aus Schweineleber-Esterase, Poly- ethylenglykolmonomethylether und Rinderserum- Albumin PPL Schweinepankreaslipase (porcine pancreatic lipase) ppm parts per million Pr Propyl PrOH Propanol Rf Retentionsfaktor (ratio of fronts) Rfl. Rückfluß RT Raumtemperatur s Singulett Smp. Schmelzpunkt TEA Triethylamin TMS Tetramethylsilan t Triplett tR Retentionszeit U Aktivitätseinheit (Units) wfr. Wasserfrei
- 15. 1 Einleitung und Zielsetzung Enzymatische Transformationen gehören mittlerweile zu den Grundoperationen der präparativen organischen Chemie. Es sind bis heute zahlreiche industrielle Prozesse mit enzymatischen Schlüsselschritten etabliert, die weit über die enzymatische Racematspaltung von Aminosäurederivaten hinausgehen.1,2 Die Vorteile von Biokatalysatoren liegen vor allem in den milden Reaktionsbedingungen, dem damit verbundenen geringeren Sicherheitsrisiko3 und der geringen Neigung zur Bildung von Nebenprodukten, da sie Prozesse mit hoher Chemo-, Regio- und Stereoselektivität katalysieren. Enzyme aus der Klasse der Hydrolasen (Lipasen, Proteasen u. a.) sind für technische Anwendungen besonders interessant, da sie in großer Zahl kommerziell erhältlich sind4, zur Entfaltung ihrer katalytischen Aktivität keine teuren und eventuell zu regenerierenden Cofaktoren benötigen und ein breites Substratspektrum akzeptieren.5,6,7,8 Lipasen werden zur Modifizierung von Fetten, zur Synthese von Estern und zur kinetischen Racematspaltung eingesetzt.9,10,11 Hierbei ist die Stabilisierung und effektive Immobilisierung der Enzyme zur Erhöhung der Betriebsstabilität, zur leichten Abtrennung und zur Wiederverwendung bei der absatzweisen Reaktionsführung von besonderer Bedeutung.9 Als aktuelle Methoden zur Stabilisierung von Enzymen sind vor allem die von der Firma ALTUS entwickelte Quervernetzung von Enzymkristallen (CLECs)12,13 und das von REETZ et al. entwickelte Verfahren zum Einschluß von Enzymen in hydrophobe Sol-Gele14,15 zu nennen. Alternativen zur Immobilisierung von Enzymen auf unlöslichen Trägern stellen Systeme zur Enzymrückhaltung wie Enzym-Membran-Reaktoren (EMR)16,17 oder die von der Firma SEPRACORE entwickelten Hohlfasermodule18,19 dar. Der Einsatz von nicht-wäßrigen Reaktionsmedien eröffnet der Enzymkatalyse den Zugang zu einer Vielzahl von neuartigen Anwendungen.20,21 In Zukunft wird auch der Einsatz von Enzymen, die durch Mutationen optimiert wurden, eine wichtige Rolle spielen. Solche Mutationen können zufällig eingeführt werden, so daß in einem anschließenden Selektionsverfahren dann Enzyme mit verbesserten Eigenschaften identifiziert werden können (directed evolution).22 Mutationen können auch gezielt vorgenommen werden, nachdem anhand der Proteinstruktur Aminosäuren identifiziert wurden, deren Austausch verbesserte Eigenschaften erwarten läßt.23
- 16. 2 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG Die Wirkstoffsynthese in der medizinischen Chemie ist ein ideales Einsatzgebiet für biokatalytische Methoden.10,24 Viele Wirkstoffe sind chiral, und es muß mit unterschiedlicher biologischer Aktivität der Enantiomeren gerechnet werden.25 Ein Racemat wird daher als Gemisch zweier Wirkstoffe behandelt. Nur wenn beide Enantiomere annähernd identische Wirkung aufweisen oder synergistische Effekte zwischen den beiden Wirkstoffe bestehen, kann ein Racemat als Medikament zugelassen werden. Ausnahmen sind Substanzen, die unter physiologischen Bedingungen racemisieren oder Substanzen die metabolisch deracemisiert werden, wie beispielsweise das Ibuprofen: (R)-Ibuprofen wird unter physiologischen Bedingungen in das ungefähr viermal wirksamere (S)-Ibuprofen umgewandelt.26 1522 Wirkstoffe 426 (28 %) 1096 (72 %) Naturstoffe Synthetika 422 (99 %) 4 (1 %) 422 (38 %) 674 (62 %) enantiomerenrein achiral oder racemisch chiral achiral 52 (12 %) 370 (88 %) enantiomerenrein racemisch Abb. 1.1: Statistik über die Aufteilung von Wirkstoffen (1982).27 KLEEMANN und ENGEL haben 1982 eine repräsentative Auswahl an Arzneistoffen untersucht und festgestellt, daß darunter fast alle eingesetzten Naturstoffe und deren Derivate chiral sind und in enantiomerenreiner Form vorliegen. In der Mehrheit werden synthetisch gewonnene Arzneistoffe eingesetzt, von denen hingegen nur 38 % chiral sind. Der überwiegende Teil davon (88 %) wurde 1982 noch als Racemat eingesetzt (s. Abb. 1.1).27 Für die Neueinführungen der letzten Jahre hat sich dieses Verhältnis deutlich in Richtung zu enantiomerenreinen Substanzen verschoben. 1985 betrug der Anteil enantiomerenreiner Wirkstoffe am pharmazeutischen Weltmarkt noch ca. 2 %. Dieser Anteil ist bis ins Jahr 1995 auf 20 % angestiegen und weiter auf 32 % im Jahr 2000.28,29 Für die folgenden Jahre wird auch weiterhin ein wachsender Anteil vorhergesagt.29 Auch vor dem Hintergrund der Auflagen nationaler und internationaler 30 Gesundheitsbehörden , welche die Erforschung der Wirkung jedes einzelnen
- 17. 3 Stereoisomers als Notwendigkeitverlangen, wird enantiomerenreinen Substanzen (enantiomerically pure compounds, EPC)31 von der pharmazeutischen Industrie ein vermehrtes Interesse entgegengebracht.10,32 Daneben können auch patentrechtliche Überlegungen von Unternehmen eine Rolle spielen, da nach Ablauf einer Schutzfrist eines Racemats anschließend das aktiviere Enantiomer geschützt werden kann (chiral switch). So können verlängerte Schutzfristen für Wirkstoffe erzielt werden.33 Die vermehrte Bedeutung enantiomerenreiner Verbindungen erfordert die Suche nach neuen Zugängen zu diastereo- und enantiomerenreinen Produkten bei der Entwicklung neuer Pharmaka. In den letzten Jahren sind zur Synthese enantiomerenreiner Wirkstoffe viele Methoden eingesetzt worden: asymmetrische Synthese, katalytische kinetische Racematspaltung und Racematspaltungen durch Chromatographie an chiraler stationärer Phase (CSP) oder durch stereoselektive Kristallisation.34,35 Trotz der Fortschritte auf dem Gebiet der asymmetrischen Synthese, basieren die Synthesen vieler chiraler Wirkstoffe noch auf der Trennung der racemisch synthetisierten Verbindung.36 Unter den genannten Methoden spielen biokatalytische Verfahren als Schlüsselschritt eine wichtige Rolle.35 Extracelluläre Lipasen sind hierbei besonders attraktive Katalysatoren für synthetische Verfahren.9,37 1.1 Opioide Analgetika Die Behandlung von Schmerzen hat in der Medizin eine große Bedeutung. Es besteht zur Zeit noch ein weltweiter Bedarf an gut wirksamen Schmerztherapien für eine patientengerechte und zielorientierte Behandlung. Zentralwirksame Opioide38, die auch als stark wirksame (morphinartige) Analgetikaa bezeichnet werden, werden seit langem in der Schmerztherapie eingesetzt, obwohl sie ein dem Morphin ähnliches Wirkungsprofil haben. Sie rufen eine Reihe von Nebenwirkungen wie Sucht, Abhängigkeit, Atemdepression, gastro-intestinale Hemmwirkung und 39 Obstipation in unterschiedlicher Stärke hervor. Die moderne Analgesieforschung ist a algos (griech.) = Schmerz
- 18. 4 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG daher bemüht Medikamente zu entwickeln, die eine schmerzstillende Wirkung, nicht aber die für Opioide typischen Nebenwirkungen, zeigen.40 Die hohe Spezifität der Wirkung stark zentralwirksamer Analgetika hat ihre Erklärung gefunden, nachdem es gelang, Opioid-Rezeptoren im Organismus nachzuweisen.41 Diese Rezeptoren werden normalerweise mit körpereigenen, morphinartig wirkenden Peptiden, den Endorphinenb und Enkephalinen, die endogene Agonisten dieser Rezeptoren sind, aktiviert.26,42,43,44 Das endogene schmerzhemmende System hat die Funktion die lähmende Schmerzreaktion zu unterdrücken, so daß dem Organismus seine Handlungsfähigkeit erhalten bleibt. Opioid-Rezeptoren kommen in unterschiedlicher Dichte sowohl prä- als auch postsynaptisch im Zentralnervensystem vor.44 Außerhalb des Zentralnervensystems findet man Opioid-Rezeptoren vor allem im Dünndarm. 41 Wie bei anderen Neurotransmitter-Rezeptoren werden auch bei den Opioid-Rezeptoren verschiedene Subtypen unterschieden, die man als µ-, κ- und δ-Rezeptoren bezeichnet45. Seit kurzem kennt man einen weiteren neuen Rezeptor, den ORL1-Subtyp (Opioid- Receptor-Like 1), und dessen endogenen Liganden, das Peptid Nociceptin.46 Dabei ist je nach Rezeptorsubtyp eine bestimmte pharmakologische Wirkung möglich. Bei der supraspinal analgesierenden Wirkung spielt beispielsweise der µ-Rezeptor eine dominante Rolle.47 Jeder Subtyp ist jedoch auch für ganz bestimmte Nebenwirkungen verantwortlich. µ-Rezeptoren sind vor allem für die durch Opiate ausgelöste Atemdepression und Abhängigkeit verantwortlich.44 Durch eine unterschiedliche Affinität zu den verschiedenen Rezeptoren kann das variable Wirkungsprofil verschiedener Opioide erklärt werden. Morphinc (1, s. Abb. 1.2) ist eines der wenigen Beispiele eines Naturstoffs, der auch heute noch in seiner ursprünglichen Form in der Therapie eingesetzt wird.48 SERTÜRNER isolierte 1806 das Morphin erstmals aus Opium. Die Klärung der Struktur des Morphins, an der viele Forscher beteiligt waren, hat über 120 Jahre gedauert. Die 1925 von ROBINSON und GULLAND angegebene Strukturformel wurde 1952 von GATES und TSCHUDI bestätigt, denen die Totalsynthese des Morphins und damit auch die Klärung der Stereochemie gelang. Diese vielstufige Synthese hat allerdings keine praktische Bedeutung erlangt, da Morphin bis heute aus Opium gewonnen wird.49 b Endo-Morphine c Morpheus = griech. Gott des Schlafs
- 19. OPIOIDE ANALGETIKA 5 R1O OH O H O N CH3 Me N R2O OH Morphin (1): R1 = R2 = H 1 Codein (2): R1 = Me, R2 = H Heroin (3): R1 = R2 = Acetyl Abb. 1.2: Morphin in einer konventionellen Darstellung nach Robinson (links) und in einer Stereoformel (rechts). Morphin stellt den Prototyp und auch den Standard der stark wirksamen Analgetika zur Behandlung heftiger akuter und chronischer Schmerzen dar.50 Auf der Suche nach analgetisch wirksamen Verbindungen ist die Struktur des Morphins vielfältig variiert worden. Dabei zeigte sich, daß auch sehr weit abgewandelte Derivate typisch morphinartige Eigenschaften besitzen können.51 Die Forschung auf dem Morphingebiet zeigt weiter, wie aus einem komplexen Naturstoff durch systematische Strukturvariation leichter herzustellende, strukturell einfache Analoga mit identischer Wirkung, zum Teil sogar mit höherer Spezifität der Wirkung, gewonnen werden.26 Erste Abwandlungsprodukte wie Codein, der Methylether von 1, oder Heroin, das Diacetylderivat von 1, waren ebenfalls Naturstoffe. Codein ist zwar schwächer wirksam als Morphin, weist aber auch ein geringeres Suchtpotential auf. Für Heroin trifft das Gegenteil zu, es weist ein sehr großes Suchtpotential auf.26 CH3 O O CH3 N O O CH3 CH3 N H 3C N N CH3 CH3 4 (-)-5 6 Pethidin Levomethadon Fentanyl Abb. 1.3: Verschiedene opioide Wirkstoffe. Pethidin52 (4, s. Abb. 1.3), das erste vollsynthetische Schmerzmittel vom Morphintyp, wurde 1939 von EISLEB bei der Suche nach krampflösenden Wirkstoffen durch
- 20. 6 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG Variation der Struktur des Atropins entdeckt.26,41,46 Das ebenfalls vollsynthetische Methadon (rac-5) wurde 1941 von BOCKMÜHL und EHRHART gefunden. Als sich herausstellte, daß nur das (−)-(R)-Enantiomer des Methadons für die analgetische Wirkung verantwortlich ist, wurde es als Levomethadon53 ((−)-5, s. Abb. 1.2) eingeführt. Es wird durch Racematspaltung mit (+)-(2R,3R)-Weinsäure aus Methadon erhalten.41,47 Levomethadon wird hauptsächlich in der Schmerztherapie eingesetzt, wohingegen racemisches Methadon, oral verabreicht, in der Ersatztherapie bei Opioid-Abhängigkeit verwendet wird.54 Pethidin und Methadon besitzen nur etwa ein fünftel bis ein viertel der analgetischen Wirkung des Morphins. Zwar sind auch die Nebenwirkungen entsprechend schwächer ausgeprägt26,41,44, jedoch ist ein entscheidender Fortschritt mit diesen Substanzen nicht erreicht worden. Fentanyl (6, s. Abb. 1.3), das ebenfalls synthetisch hergestellt wird, ist eines der am stärksten wirksamen Analgetika, das etwa 100mal stärker wirksam ist als Morphin. Es wirkt hauptsächlich über den µ-Rezeptorsubtyp.47 Fentanyl wird wegen seiner relativ kurzen Wirkungsdauer von etwa 30 Minuten ebenfalls in der Neuroleptanalgesie eingesetzt. Darunter versteht man ein Verfahren bei dem ein Neuroleptikum gleichzeitig mit einem stark wirksamen Analgetikum injiziert und dadurch ein Zustand induziert wird, bei dem der Patient sediert und angstfrei ist. So können kleinere Eingriffe (wie beispielsweise Endoskopien) vorgenommen werden, bei denen das Erwachen ohne Desorientierung vor sich geht und eine postoperative Analgesie gewährleistet ist.41,44,55 Fentanyl und dessen Derivate mit einem hohen Mißbrauchspotential („Designer Drogen“)56 zeigen die typischen Nebenwirkungen starker µ-Opioide und führen zu einer physischen Abhängigkeit, ähnlich wie beim Morphin. Neben Molekülen mit einer agonistischen Wirkung gibt es auch Morphin- Antagonisten (s. Abb. 1.6, S. 9), die eingesetzt werden, um die Wirkung von opioiden Analgetika aufzuheben, im besonderen zur Aufhebung der Atemlähmung bei akuter Vergiftung.41,47
- 21. TRAMADOL UND ANALGETISCHAKTIVE ANALOGA 7 1.2 Tramadol und analgetisch aktive Analoga Tramadol57 (rac-7, s. Abb. 1.4) nimmt unter den stark wirksamen Analgetika eine Sonderstellung ein, da dieser Wirkstoff eine starke Schmerzhemmung ohne die für Opioide typischen Nebenwirkungen hervorruft.58 Das Suchtpotential ist so gering43, das dieser Wirkstoff nicht unter Kontrollmaßnahmen von Narkotika fällt, in Deutschland das Betäubungsmittelgesetz. Tramadol, das 1976 von der GRÜNENTHAL GmbH in die Schmerztherapie eingeführt wurde, wird von der WORLD HEALTH ORGANISATION (WHO) auf Stufe zwei der Schmerztherapie krebskranker Patienten empfohlen.59 Tramadol wird weltweit vermarktet und ist eines der wichtigsten zentralwirksamen Schmerzmittel.59 OH OH (S) (R) OCH3 H3CO (R) (S) H3C N N CH3 CH3 H3C (+)-(1R,2R)-Tramadol (−)-(1S,2S)-Tramadol Abb. 1.4: Die Enantiomere des Tramadols ((+)-7, (−)-7). Tramadol ist ein Racemat aus (+)-(1R,2R)- und (−)-(1S,2S)-2-Dimethylaminomethyl- 1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexanol. Das in der Therapie eingesetzte Tramadol hydrochlorid ist ein partieller Opiat-Agonist, dessen Wirkstärke etwa 1/10 bis 1/5 der des Morphins entspricht, jedoch mit stark reduzierter Opioidwirkung.44 Tramadol zeigt eine µ-opioide und eine nicht-opioide Wirkung. Die nicht-opioide Wirkung ist eine Inhibierung der spinalen Schmerzleitung durch Inhibierung der Wiederaufnahme der Neurotransmitter Noradrenalin (NA) und Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5HT). Dieses wird durch das (−)-(1S,2S)-Enantiomer bewirkt, wohingegen das (+)-(1R,2R)- Enantiomer ein starker µ-Agonist ist und für die opioide Wirkung verantwortlich ist. Die analgetische Wirksamkeit des Tramadols resultiert aus einer synergistischen Kombination beider Enantiomere auf die die beiden Wirkmechanismen verteilt sind.38,47,60,61,62 Zusätzlich trägt auch der in vivo durch oxidative Dealkylierung gebildete Hauptmetabolit O-Desmethyltramadol (8, M1), der eine wesentlich höhere µ-Opioidrezeptor-Affinität besitzt, zur komplexen Gesamtwirkung bei.46,47,61,63,
- 22. 8 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG OH OH O H3C HO CH3 N N OH CH3 (−)-1 (+)-8 Abb. 1.5: Strukturelle Ähnlichkeit zwischen Morphin und (+)-O-Desmethyltramadol. Das (+)-(1R,2R)-Enantiomer des Tramadols und insbesondere das (+)-(1R,2R)- Enantiomer des O-Desmethyltramadols lassen sich als stark vereinfachte Derivate des physiologisch aktiven (−)-Morphins auffassen, deren Struktur durch Wegfall von Ringanteilen flexibler wird (s. Abb. 1.5). Sowohl für Opioide als auch für Endorphine und Enkephaline, die an diesen Rezeptoren eine analgetische Wirkung auslösen, sind intensive Untersuchungen zur Struktur-Aktivitäts-Beziehung durchgeführt worden.26,57,64 Demnach ist für ein aktives Molekül ein in 1-Stellung arylsubstituiertes Cycloalkangrundgerüst, welches in 2- Stellung aminoalkyliert ist, essentiell. Bei systematischen Variationen des Tramadol- grundgerüsts stellte die GRÜNENTHAL GmbH fest, daß eine meta-Hydroxyfunktion am Phenylring zur stärksten analgetischen Wirkung führt und daß die agonistische Wirkung an die Dimethylaminogruppe gebunden ist. Bei Variationen der Ringgröße hat sich der Sechsring als optimal herausgestellt.57 Eine freie Hydroxyfunktion am quarternären Zentrum erweist sich außerdem als günstig, da die analgetische Wirkung durch Substitution mit Chlor oder Wasserstoff verringert wird, bei Veresterung geht sie völlig verloren.57 Daß sich das Agonist/Antagonist-Verhältnis eines Moleküls über die Stickstoff- substitution beeinflussen läßt, zeigt sich im Naloxon (9) und Naltrexon (10) (s. Abb. 1.6, S. 9). Hier ist unter anderem ein N-Methylrest gegen einen Allyl- oder einen Methylencyclopropyl-Rest ersetzt worden: beide Verbindungen sind dadurch Opioid- Antagonisten. Des weiteren ist die räumliche Anordnung dieser Gruppen für die Analgesiewirkung entscheidend. Allerdings kann eine vollständige Struktur-Aktivitäts- Beziehung immer noch nicht aufgestellt werden.38
- 23. TRAMADOL UND ANALGETISCHAKTIVE ANALOGA 9 HO HO O OH O OH N N CH2 O O Naloxon (9) Naltrexon (10) Abb. 1.6: Opioid-Antagonisten. Die Synthese des racemischen Tramadol hydrochlorids erfolgt durch Grignard- Reaktion von 2-(Dimethylaminomethyl)-cyclohexanon, welches durch Mannich- Reaktion65 von Cyclohexanon, Formaldehyd und Dimethylamin hydrochlorid erhalten wird, und dem Grignardreagenz des 3-Bromanisols. Aus dieser Reaktion wird eine cis /trans (cis : trans = 85 : 15) Mischung erhalten. Das gewünschte cis-Isomer wird durch Kristallisation des diastereomerenreinen Hydrochlorids erhalten. Das trans- Isomer kann unter Verwendung starker Säuren epimerisiert werden.47,57,66 Präparative Verfahren zur Racematspaltung von Tramadol sind seit langem dokumentiert. Die wichtigsten basieren auf der „klassischen“ diastereomeren Salzbildung unter Verwendung von Weinsäure67, O,O´-Dibenzoyl-weinsäure66,68, Mandelsäure69 und seit neustem auch O,O´-Di-para-toluoyl-weinsäure70. Die Anwendbarkeit von chromatographischen Trennverfahren in einem präparativen Maßstab ist ebenfalls demonstriert worden (unter Verwendung der simulated moving bed Technologie, SMB).71 Analytisch lassen sich die Enantiomere chromato- graphisch durch HPLC an chiraler stationärer Phase (s. Kap. 3.5, S. 210), durch Kapillarelektrophorese (CE)72 oder spektroskopisch durch 1H-NMR-Spektroskopie in Gegenwart von paramagnetischen Verschiebungsreagenzien73 identifizieren. GRIGG et al. gelang die erste Festphasensynthese racemischen Tramadols mittels eines „Linker“-Systems74, welches auf Hydroxylamin basiert.75 Das in der Mannich- Reaktion eingesetzte Iminiumsalz wurde nach einer modifizierten Variante von SCHROTH et al.76 aus einem N-Trimethylsilylamin mit einem Chlormethylether hergestellt (s. Abb. 1.7).
- 24. 10 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 1) TMSCl, TEA O O CH3 2) ClCH2OEt O N N H OTMS CH3 57 % RMgBr H3CO OH H3CO (H3C)2N 1) MeOTf OH 2) TEA O N rac-7, de = 92 % CH3 Abb. 1.7: Festphasensynthese von Tramadol nach GRIGG et al. Einen ersten Ansatz zur asymmetrischen Festphasensynthese von Tramadol verfolgten ENDERS et al., die einen „Linker“ auf Basis der THP-Schutzgruppe von ELLMAN77 mit einem Derivat des Auxiliars (S)-2-Methoxy-methyl-pyrrolidin (SMP) funktionalisierten. In dieser Syntheseroute wurde die chirale Mannich-Base vom polymeren Träger abgespalten und dann in flüssiger Phase mit dem Grignardreagenz des 3-Bromanisols umgesetzt. Das Produkt (+)-7 konnte hierbei nur mit einem Enantiomerenüberschuß von 38 % erhalten werden (s. Abb. 1.8).78 Da nach dieser Methodik andere Mannich-Basen mit hoher Enantioselektivität dargestellt wurden79, ist zu vermuten, daß enantiomerenangereicherte Mannich- Basen unter Grignardbedingungen partiell racemisieren. O O O O O O O OCH3 OCH3 N N H OCH3 67 % (H3C)2N CH2I OH 1) THF / verd. HCl O O O OCH3 N(CH3)2 2) Extraktion + N 3) 3 Äq. RMgBr N(CH3)2 (+)-7, 78 % de 38 % ee Abb. 1.8: Asymmetrische Festphasensynthese von Tramadol nach ENDERS et al.
- 25. 11 1.3 Zielsetzung In einem Tramadol-Nachfolgeprojekt der GRÜNENTHAL GmbH sind ca. 2000 Strukturanaloga synthetisiert worden. Ziel dieses Projekts ist es, die Opioid-Wirkung als auch die Wiederaufnahmehemmung in einem enantiomerenreinen oder achiralen Molekül zu vereinigen. Die vorgenommenen Strukturvariationen lassen sich wie in Abb. 1.9 dargestellt zusammenfassen. Einführung zusätzlicher Eliminierung oder Substitution sekundärer OH-Gruppen der tertiären OH-Gruppe OH O CH3 Aromaten- N substitution offenkettige Strukturen H3C CH3 oder -variation Abb. 1.9: Zusammenfassung der relevanten Strukturvariationen im Tramadol- Nachfolgeprojekt der GRÜNENTHAL GmbH. Für die pharmakologische und toxikologische Evaluierung dieser neuen Tramadol- Analoga müssen, sowohl für die Entwicklung eines einzelnen Enantiomers als auch für die eines Racemats, beide Enantiomere dargestellt werden. Tramadol-Analoga sind als Racemate auf der Basis der Tramadol-Syntheseroute sehr gut darzustellen. Eine alternative asymmetrische Synthese dieser Verbindungen ist wegen der partiellen Racemisierung der Mannich-Basen bei ihrer Umsetzung mit Grignard-Verbindungen noch nicht durchführbar. Dies macht eine Racematspaltung notwendig, die gerade die Bereitstellung beider Enantiomere zu leisten vermag. Bei der Racematspaltung von Tramadol und seinen Derivaten durch Kristallisation diastereomerer Salze konnten bisher noch keine allgemeinen Richtlinien zur Prädiktivität entwickelt werden, da schon geringe strukturelle Variationen häufig zu einem nicht vorhersagbaren Verhalten in der Umsetzung mit den Kristallisationsreagenzien führen. Präparative chromatographische HPLC an chiraler stationärer Phase ist nur bedingt zur Bereitstellung kleiner Substanzmengen (1 bis 10 g) geeignet.
- 26. 12 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, in Zusammenarbeit mit der GRÜNENTHAL GmbH beide Enantiomere von Tramadol-Analoga durch eine Hydrolasen-katalysierte kinetische Racematspaltung enantiomerenrein darzustellen. Mögliche Funktionalitäten von Substraten auf Tramadol-Basis, die als Angriffspunkt für eine Hydrolasen-katalysierte Reaktion dienen können, sind in Abb. 1.10 dargestellt. Zusätzliche sekundäre tertiäre OH-Funtion OH-Funktionen OH phenolische OH-Funktion O CH3 N offenkettige Strukturen H3C CH3 Abb. 1.10: Mögliche Angriffspunkte für eine Hydrolasen-katalysierte kinetische Racematspaltung von Tramadol-Analoga. Das solche Tramadol-Analoga Substrate für Hydrolasen sind, konnte bereits in eigenen Vorarbeiten am Beispiel eines Phenylesters des O-Desmethyltramadols (rac-15) gezeigt werden.80 Dieses Ergebnis soll als Ausgangspunkt für eine mögliche Optimierung der Racematspaltung von Phenylestern des O-Desmethyltramadols dienen. Es sollen ebenfalls Substrate eingesetzt werden, bei denen eine zusätzliche Hydroxyfunktion in den Cyclohexylring eingefügt ist. Eine Vielzahl unterschiedlich substituierter, racemischer Cyclohexanole sind bereits als Substrate in der Lipasen- katalysierten Hydrolyse oder Acylierung untersucht worden.5-8 Diese Gruppe cyclohexanolischer Substrate sollte somit ideal für eine Hydrolasen-katalysierte kinetische Racematspaltung sein. In dieser Arbeit sollen zur Enzym-katalysierten Racematspaltung beide möglichen Verfahrensweisen eingesetzt werden: die Acylierung von racemischen Alkoholen oder Phenolen im organischen Medium und die Hydrolyse der entsprechenden Ester. Im Hinblick auf eine Optimierung der Reaktionsführung sollte der Einfluß verschiedener Reaktionsparameter untersucht werden. Mögliche Variablen sind: Lösungsmittel, Acyldonoren, verschieden Additive sowie pH-Wert, Cosolventien und die Art der Estergruppe. Im Hinblick auf eine mögliche synthetische Anwendung soll weitergehend untersucht werden, ob sich eine solche Enzym-katalysierte Reaktion in größeren Maßstäben realisieren läßt.
- 27. 2 Theoretischer Teil 2.1 Darstellung und Charakterisierung der MPEG/PLE- Katalysator Präparation Es ist bekannt, das native PLE im Gegensatz zu Lipasen nur eine sehr geringe Aktivität im organischen Medium aufweist. Für einige Lipasen ist gezeigt worden, daß durch Zusatz von Proteinen oder amphiphilen Verbindungen wie Polyethylenglycol sie vor Änderung ihrer Konformation und somit Verminderung ihrer katalytischen Aktivität geschützt werden können. GAIS et al. konnten dieses Konzept auf die PLE erweitern und zeigen, daß eine Aktivierung durch Methoxypolyethylenglycol (MPEG) möglich ist.81,82,83 Die besten Erfolge wurden hier durch Colyophilisierung von PLE mit MPEG erzielt, wobei eine aufwendige kovalente Modifizierung des Enzyms nicht notwendig ist.84 Durch die gemeinsame Gefriertrocknung von PLE und MPEG werden vermutlich nicht-kovalente Komplexe zwischen Enzym und Polymer gebildet, die, sofern sie nicht durch Lösungsmitteleinflüsse zerstört werden, zu einer Aktivitätssteigerung führen. Das MPEG kann weiterhin geringe Mengen Wasser, die für die katalytische Aktivität des Enzyms benötigt werden und auf der Oberfläche des Enzyms gebunden sind, bereitstellen. Das Colyophilisat aus MPEG/PLE wurde nach einer bekannten Methode dargestellt.84,85 Hierzu wurde die PLE unter Eiskühlung entsalzt und die zurückbleibende wäßrige Enzymlösung anschließend mit MPEG5000 versetzt. Nach vollständiger Auflösung wurde die Lösung in flüssigem Stickstoff eingefroren und danach gefriergetrocknet. Es entstand ein weißes, flockiges und gut handhabbares Pulver in quantitativer Ausbeute. Die Standardaktivität von PLE wird im Rahmen dieser Arbeit durch Hydrolyse von 0.25 M Buttersäureethylester fein emulgiert in 0.1 M Phosphatpufferlösung pH 8.0 bei Raumtemperatur bestimmt.86 Um eine direkte Vergleichbarkeit von Standard- aktivitäten der PLE oder anderen Enzymen zu erhalten, muß gewährleistet sein, daß diese unter einheitlichen Bedingungen gemessen werden. Häufig variieren aber die Reaktionsbedingungen bei verschiedenen Quellen. HORGAN et al. berichten
- 28. 14 THEORETISCHER TEIL beispielsweise so von einem Aktivitätstest zur Bestimmung der PLE-Aktivität, der durch Hydrolyse von 0.0125 M Buttersäureethylester bei pH 7.5 und 38 ºC durchgeführt wird.87 Die beobachtete spezifische Aktivität der colyophilisierten PLE/MPEG war verglichen mit der Aktivität der PLE-Ammoniumsulfat Suspension ca. 15 % geringer. Bei der Lyophilisierung nativer PLE wurden im Vergleich dazu Aktivitätsverluste von 30 - 50 % beobachtet.85 In dieser Arbeit wurde auch ein Colyophilisat aus PLE/BSA/MPEG eingesetzt. Die spezifische Aktivität dieses Katalysators entsprach der des MPEG/PLE-Colyophilisats. Eine Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit und auch der Selektivität der MPEG/PLE-katalysierten Transacylierung vom Wassergehalt der Reaktionslösung ist bekannt.21,81,82 Hier zeigte sich, daß ein zu großer Wassergehalt in enzymatischen Transacylierungen zu hydrolytischen Nebenreaktionen führen kann, in denen das Acylierungsmittel bevorzugt verseift wird.88 Dies führt zu Aktivitätsverlusten, da bei der enzymatischen Hydrolyse des Vinylesters die entsprechende Carbonsäure entsteht, die den pH-Wert in der Umgebung des Enzyms drastisch reduziert und so zur Deaktivierung des Enzyms führt. Weiterhin kann der in der Transacylierung gebildete Ester vom Enzym hydrolysiert werden. Da in diesem Fall das bevorzugt gebildete Enantiomer auch bevorzugt hydrolysiert werden würde, würde dies zu einer Selektivitätserniedrigung führen. Daher ist es notwendig eingesetzte Reagentien unter dem Aspekt Wassergehalt zu charakterisieren, um Bedingungen, die zu hydrolytischen Nebenreaktionen in der Transacylierung führen können, zu vermeiden. Der Wassergehalt von MPEG/PLE ist bereits durch zwei Methoden bestimmt worden. Nach der ersten Methode wird MPEG/PLE bei 2.5·10-4 mbar und 120 ºC für 12 Stunden getrocknet und anschließend der Wassergehalt durch den Gewichtsverlust ermittelt. Hiernach wurde ein Wassergehalt der MPEG/PLE (colyophilisiert bei 0.009 mbar, RT für 48 h) von 1 – 2 % bestimmt.84 Die zweite Methode stellt die Karl-Fischer-Titration der MPEG/PLE dar. Bei der Karl-Fischer- Titration besteht die Möglichkeit von Fehlern in der Wassergehaltsbestimmung dadurch, daß fest gebundenes Wasser teilweise zu langsam abgegeben wird und
- 29. DARSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNGDER MPEG/PLE-KATALYSATOR PRÄPARATION 15 daß es zu Reaktionen von funktionellen Gruppen des Proteins mit dem Reagenz kommen kann.89 Nach dieser Methode wurde der Wassergehalt einer vergleichbaren MPEG/PLE Probe (colyophilisiert bei 0.009 mbar, RT für 48 h) zu 1.2 % bestimmt. Bei einer Verlängerung der Trocknungsdauer auf 72 h sank der Wassergehalt auf 0.6 %.85 Aufgrund der unterschiedlichen Temperaturen, die bei der Gefriertrocknung unterschiedlicher Chargen herrschen, können die so erhaltenen Werte aber nur ein grober Anhaltspunkt sein.90 Diese Ergebnisse zeigen, daß durch den MPEG/PLE Katalysator keine erheblichen Wassermengen in die Reaktionslösung eingebracht werden. Der in dem Katalysator vorhandene Wassergehalt wird wahrscheinlich sogar vom Protein benötigt.
- 30. 16 THEORETISCHER TEIL 2.2 Darstellung der racemischen Tramadol-Analoga Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche enzymatische Reaktionswege untersucht: die Enzym-katalysierte Transacylierung racemischer Alkohole (s. Tabelle 2.1) und die Hydrolyse der entsprechenden racemischen Ester (s. Tabelle 2.2). Die eingesetzten Substrate lassen sich in zwei Gruppen einteilen. Die Erste besteht aus Substraten mit einer phenolischen OH-Gruppe und den entsprechenden Estern, die sich durch O-Demethylierung von Tramadol und Analogen ableiten lassen. Die zweite Gruppe besteht aus Substraten mit einer zusätzlichen sekundären Hydroxylgruppe im Cyclohexylgerüst des Tramadols und den dazugehörigen Estern. Aufgrund der unterschiedlichen Reaktivität der phenolischen und der sekundären Hydroxylgruppe werden beide Substratgruppen in den folgenden Abschnitten dieser Arbeit dementsprechend getrennt diskutiert. Innerhalb der Zusammenarbeit mit der GRÜNENTHAL GmbH wurden Vorstufen zu den Substraten zur Verfügung gestellt, so daß alle in dieser Arbeit eingesetzten Verbindungen durch Standardreaktionen aus den zur Verfügung stehenden Verbindungen zugänglich waren. Auf die einzelnen bei GRÜNENTHAL durchgeführten Syntheseschritte zur Darstellung der bereitgestellten Substanzen wird in Kapitel 2.2.1 näher eingegangen. Die racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung wurden in der Regel in Form ihrer Hydrochloride, die einfach zu handhaben sind, zur Verfügung gestellt. Lediglich das Phenol rac-8 wurde in Form des Hydrochlorids der entsprechenden O-methylierten Verbindung Tramadol (rac-7) bereitgestellt (Tabelle 2.1). Alle bereitgestellten Hydrochloride waren über Monate bei Raumtemperatur lagerstabil. Zur Freisetzung der racemischen Basen aus ihren Hydrochloriden werden diese in einer Emulsion aus dest. Wasser und Dichlormethan suspendiert. Nach Zugabe von äquivalenten Mengen Natronlauge können die freien Basen nahezu quantitativ (97 - 98 % Ausbeute) extrahiert werden (s. AAV 1, S. 176).91
- 31. DARSTELLUNG DER RACEMISCHENTRAMADOL-ANALOGA 17 Tabelle 2.1: Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung Substrat zur enzymatische Transacylierung Darstellung (±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- 1. Freisetzen der Base rac-7 cyclohexanol (rac-8): aus dem Hydrochlorid. OH 2. O-Demethylierung von rac-7 OH mit DiBAl-H. Me2N (±)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl- propyl)-phenol (rac-11): Freisetzen der Base aus OH dem Hydrochlorid. OH Me2N (±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexan-1,3-diol (rac-12): Freisetzen der Base aus OH dem Hydrochlorid. OMe HO Me2N (±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexan-1,3-diol (rac-13): Freisetzen der Base aus OH OH dem Hydrochlorid. OMe Me2N (±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexan-1,4-diol (rac-14): Freisetzen der Base aus OH dem Hydrochlorid. OMe HO Me2N Das phenolische Substrat rac-8 und das zur Synthese des Esters rac-21 benötigte 3-(6-Dimethylamino-methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-20) wurden aus rac-7 und rac-13 dargestellt, in denen die phenolische Hydroxylgruppe noch als Methylether vorliegt. Eine bekannte Methode zur Etherspaltung bei Verbindungen
- 32. 18 THEORETISCHER TEIL des Tramadoltyps, die starke Basen wie Natrium- oder Kaliumhydrid in Gegenwart von Thiophenol und Diethylenglycol verwendet92, ergibt jedoch O-Desmethyltramadol (rac-8) aus rac-7 nur in unbefriedigenden Ausbeuten.91 Zur Etablierung der phenolischen Hydroxylgruppe wurden daher die Methylether rac-7 und rac-13 durch Reaktion mit Diisobutylaluminiumhydrid (DiBAl-H) in Toluol unter Rückfluß in guten bis sehr guten Ausbeuten (88 - 93 %) demethyliert.91 Eine Dealkylierung am Stickstoff war in keinem Fall zu beobachten. Die Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse erfolgte durch Acylierung der entsprechenden Phenole und Alkohole unter den angegeben Reaktionsbedingungen (Tabelle 2.2). Tabelle 2.2: Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse Substrat zur enzymatische Hydrolyse Darstellung (±)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15): Pyridin katalysierte OH Veresterung von 8 mit O Pr Buttersäureanhydrid. Me2N O (±)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16): Pyridin katalysierte OH Veresterung von 8 mit O Me Essigsäureanhydrid. Me2N O (±)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy- 1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17): Pyridin katalysierte OH Veresterung von 11 mit O Pr Buttersäureanhydrid. Me2N O
- 33. DARSTELLUNG DER RACEMISCHENTRAMADOL-ANALOGA 19 Fortsetzung Tabelle 2.2: Substrat zur enzymatische Hydrolyse Darstellung (±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- Darstellung des Alkoholats 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18): aus 12⋅HCl mit KOtBu und O OH OMe Acylierung mit Buttersäure- Pr O chlorid bei RT. Me2N (±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19): Darstellung des Alkoholats O aus 13 mit KOtBu und Acylierung mit Buttersäure- Pr O OH OMe chlorid bei –10 ºC. Me2N (±)-Buttersäure-3-(6-dimethylaminomethyl- 1. O-Demethylierung von 13 1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21): mit DiBAl-H zum Phenol 20. 2. Darstellung des Phenolats OH OH O Pr aus 20 mit NaHCO3-Lsg. und Veresterung mit Butter- Me2N O säureanhydrid. (±)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- Darstellung des Alkoholats 4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22): aus 14⋅HCl mit KOtBu und OH OMe Acylierung mit Buttersäure- Pr O chlorid bei RT. Me2N O (±)-Hexansäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- Darstellung des Alkoholats 4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23): aus 14⋅HCl mit KOtBu und OH OMe Acylierung mit Hexansäure- C5H11 O chlorid bei RT. Me2N O
- 34. 20 THEORETISCHER TEIL Fortsetzung Tabelle 2.2: Substrat zur enzymatische Hydrolyse Darstellung (±)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- Darstellung des Alkoholats 4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24): aus 14⋅HCl mit KOtBu und OH OMe Acylierung mit Essigsäure- Me O chlorid bei RT. Me2N O (±)-Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylamino- methyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester Pyridin katalysierte (rac-25): O O Veresterung von 13 mit Pr O O Pr Buttersäureanhydrid. OMe Me2N Allgemein verliefen die Veresterungen mit guten Ausbeuten. Als Nebenreaktion trat in manchen Fällen in einem geringen Ausmaß eine unerwünschte Acylierung der tertiären Hydroxylgruppe auf. Lediglich bei der Veresterung von rac-13 mit Buttersäurechlorid in Gegenwart von Kalium-tert-butylat bei Raumtemperatur ist diese Nebenreaktion so groß, daß als Hauptprodukt der Diester rac-25 nahezu quantitativ (96 % Ausbeute) anfällt. Ein Absenken der Reaktionstemperatur auf -10 ºC liefert aber neben nicht umgesetztem Edukt schon bevorzugt den Monoester der sekundären Hydroxylgruppe, rac-19, in 58 %iger Ausbeute. Ebenfalls nicht zu vernachlässigen war die Bildung eines Diesters bei der Darstellung von rac-24. In diesem Fall ist nach chromatographischer Aufreinigung eine Mischung von Monoacetat und Diacetat im Verhältnis 4 : 1 (Verhältnis der Signale der Protonen der Methoxygruppe im 1H-NMR) erhalten worden, die sich nicht weiter auftrennen ließ und somit in weiteren Reaktionen als Mischung eingesetzt worden ist. Bei einer erneuten Synthese von rac-24, sollte daher versucht werden die Reaktionstemperatur herabzusenken, um einer Bildung des Diesters entgegen- zuwirken.
- 35. DARSTELLUNG DER RACEMISCHENTRAMADOL-ANALOGA 21 Zur Synthese des Phenylesters rac-21, wurde eine Methode zur selektiven Acylierung der phenolischen OH-Gruppe in Anwesenheit einer sekundären benötigt. Bei einer zunächst versuchten Acylierung von rac-20 mit einem Säurechlorid unter Phasentransferkatalyse mit Tetrabutylammoniumbromid, wie von ILLI beschrieben93, konnte lediglich das eingesetzte Edukt zurückgewonnen werden. RICE et al. gelang bei Untersuchungen zu substituierten 3,14-Dihydroxy-17-methyl-4,5α-epoxy- morphinanen die selektive Acylierung einer phenolischen OH-Gruppe in Anwesenheit sekundärer Hydroxylgruppen nach einer modifizierten Methode von WELSH94 et al.95 Analog zu der von RICE beschriebenen Prozedur wurde rac-20 mit 10 Äquivalenten Buttersäureanhydrid in Gegenwart eines Überschusses an wäßriger NaHCO3- Lösung in sehr guter Ausbeute (93 %) zu rac-21 umgesetzt. Bevor die in Tabelle 2.2 vorgestellten Substrate in eine Enzym-katalysierte Hydrolyse eingesetzt wurden, wurde ihre Hydrolyse-Stabilität unter den verwendeten Reaktionsbedingungen ohne Zugabe des Katalysators überprüft, um eventuelle nicht Enzym-katalysierte Reaktionen auszuschließen. Eine nicht-enzymatische Autohydrolyse würde zu racemischen Produkten führen, die, sollten sie während der Enzym-katalysierten Reaktion ebenfalls entstehen, einen niedrigeren ee-Wert des Produkts und damit eine niedrigere Selektivität der enzymatischen Katalyse vortäuschen würden. Eine Autohydrolyse-Stabilität ist daher eine wichtige Voraussetzung der zu verwendenden Substrate. Alle in Tabelle 2.2 gezeigten Ester der Buttersäure waren unter den Reaktionsbedingungen im Bereich von pH 7.0 bis pH 8.0 stabil gegen eine nicht Enzym-katalysierte Hydrolyse. Dahingegen zeigten rac-16 und rac-24, beides Ester der Essigsäure, nur eine unbefriedigende Autohydrolysestabilität. Die Stabilität von rac-16 ist bei verschiedenen pH-Werten überprüft worden (Tabelle 2.3). Tabelle 2.3: Überprüfung der Hydrolysestabilität von rac-16 in Phosphatpuffer- Lösung in Anwesenheit von 10 % tert-Butanol. pH-Wert Reaktionszeit Hydrolyseprodukt (GC) 7.0 2h 0.1 % rac-8 8.0 2h 1.2 % rac-8 8.0 16 h 15.0 % rac-8
- 36. 22 THEORETISCHER TEIL Es zeigte sich, daß bei pH 7.0 innerhalb von 2 Stunden noch tolerierbare Mengen an Hydrolyseprodukt detektiert worden sind. Bei pH 8.0 wurde allerdings eine merkliche Autohydrolyse von bereits 1 % nach 2 Stunden und 15 % nach 16 Stunden beobachtet. Eine Enzym-katalysierte Reaktion erscheint bei diesem pH-Wert wenig sinnvoll. Die Hydrolysestabilität des Esters rac-24 wurde in wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.5) mit Aceton (16 %Vol) als Cosolvens überprüft. Nach vier Tagen bei Raumtemperatur konnten 2 % Hydrolyseprodukt detektiert werden. Da der ein- gesetzte Ester rac-24 noch das Diacetat rac-14 als nicht zu entfernende Verunreinigung enthält, wurde auf eine detaillierte Untersuchung zur Hydrolyse- beständigkeit, wie beispielsweise bei verschiedenen pH-Werten verzichtet. Um die Ansatzgrößen der enzymatischen Transacylierungen möglichst klein halten zu können und um schnell zuverlässige Daten auch in der enzymatischen Hydrolyse zu erhalten, wurde die gesamte Analytik der Reaktionsgemische auf gas- und flüssigchromatographische Analyse aufgebaut. Zur Validierung von Analyse- bedingungen wurden zunächst separat die reinen racemischen Substrate und Produkte und danach dieselben als Mischung untersucht. Auf diese Art war eine eindeutige Zuordnung der Verbindungen in den Chromatogrammen möglich (Abb. 2.1). Um ebenfalls eine zuverlässige, schnelle sowie möglichst einfache Bestimmung der Enantiomerenverhältnisse von Edukten und Produkten bei den enzymatischen Reaktionen zu gewährleisten, wurden Mischungen der racemischen Edukte mit den jeweiligen racemischen Produkten durch Gas- oder Flüssigchromatographie an chiralen stationären Phasen getrennt. Anschließend wurden unter den erhaltenen Bedingungen zur eindeutigen Identifizierung der Verbindungen nochmals die racemische Edukte und Produkte separat analysiert. Bis auf wenige, an entsprechender Stelle explizit genannte Verbindungen, konnten sowohl die Signale beider Enantiomere des Substrats als auch des Produkts in einem Chromatogramm basisliniengetrennt erhalten werden (Abb. 2.2).
- 37. DARSTELLUNG DER RACEMISCHENTRAMADOL-ANALOGA 23 OH OMe Pr O Me2N O rac-22 OH OMe HO Me2N rac-14 Abb. 2.1: Gaschromatographische Trennung von (±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3- methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) und (±)-Buttersäure-3- dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl Ester (rac-22) an einer CP-Sil-8-Säule. Me2N OH OMe O O Pr (−)-22 OH OMe Pr O Me2N Me2N OH O (+)-22 OMe HO (−)-14 OH OMe HO Me2N (+)-14 Abb. 2.2: HPLC Trennung von (−)- und (+)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4- hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl Ester ((−)-22, (+)-22) sowie von (+)- und (−)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan- 1,4-diol ((+)-14, (−)-14) an einer OD-H-Säule mit chiraler stationärer Phase. Dies ermöglichte es, daß Proben direkt aus der Reaktionsmischung, nach Abtrennung der hochmolekularen Proteine durch Filtration, ohne weitere
- 38. 24 THEORETISCHER TEIL Aufarbeitung analysiert werden konnten. Mittels dieser effektiven Analytik ließen sich detaillierte Informationen über den gesamten Reaktionsverlauf einer enzymatischen Reaktion unter Einsatz geringer Substanz- und vor allem Enzymmengen gewinnen. 2.2.1 Synthesewege der von GRÜNENTHAL bereitgestellten Substanzen96 Die von der GRÜNENTHAL GmbH verwendeten Synthesewege zur Darstellung der cyclohexanoiden Ausgangsmaterialien rac-14⋅HCl97, rac-12⋅HCl98 und rac-13⋅HCl basieren auf der in Kap. 1.2 beschriebenen Tramadol-Syntheseroute, so daß viele Erfahrungen aus diesem Produktionsprozeß in die Reaktionen eingebracht werden konnten. O CH3 1) BrMg OMe O N Cl H 3C N(Me)2 O THF O O H 3C Cl O O 2) Trennung der Diastereomeren MeCN 3) H OH OH OMe NaBH4 OMe HO O Me2N Me2N rac-27 rac-14 Abb. 2.3: Syntheseroute der GRÜNENTHAL GmbH zur Darstellung von rac-14. Zur Einführung der neuen sekundären Hydroxylgruppe wurde anstelle von Cyclohexanon ein als Monoketal geschütztes 1,4- bzw. 1,3-Diketon in die Mannich- Reaktion eingesetzt (Abb. 2.3 und Abb. 2.4). Aus der Mannich-Reaktion des 3,3-Dimethyl-1,5-dioxa-spiro[5.5]undecan-8-on (26, Abb. 2.4) wurde nur das gewünschte 9-Alkylierungsprodukt erhalten. Das unerwünschte 7-Alkylierungs- produkt wurde wahrscheinlich aufgrund von sterischer Hinderung nicht gebildet. Die erhaltenen jeweiligen Mannich-Basen wurden danach in einer Grignard-Reaktion mit dem Grignard-Reagenz des 3-Bromanisols umgesetzt. Es wurden in beiden Fällen cis /trans Mischungen erhalten, aus denen die gewünschten cis-Isomere abgetrennt wurden und nach Abspaltung der Ketal-Schutzgruppen mit Mineralsäure die Ketone
- 39. DARSTELLUNG DER RACEMISCHENTRAMADOL-ANALOGA 25 rac-27 und rac-28 erhalten wurden. Die Ketone rac-27 und rac-28 wurden anschließend mit Natriumborhydrid zu den gewünschten Alkoholen reduziert. Im Falle der Reduktion des Ketons rac-27 konnte unter optimierten Bedingungen das gewünschte (1RS,2RS,4SR)-konfigurierte 1,4-Diol rac-14 erhalten werden. Eine Bildung des (1RS,2RS,4RS)-konfigurierten Epimers konnte nicht beobachtet werden. Im Falle der Reduktion des Ketons rac-28 wurde eine Epimerenmischung aus (1RS,3SR,6RS)-konfigurierten 1,3-Diol rac-12 und dem (1RS,3RS,6RS)- konfigurierten Diol rac-13 erhalten, die anschließend getrennt worden sind. Auf diesem Weg war es möglich beide in dieser Arbeit eingesetzte Epimere aus einer Reaktion zu erhalten (Abb. 2.4). 1) CH3 O H 2C N Cl 1) Trennung der O OH CH3 Diastereomeren O OMe 2) 2) H Me2N O BrMg OMe 26 rac-28 OH OH OH NaBH4 OMe OMe HO + Me2N Me2N 32 % 45 % rac-12 rac-13 Abb. 2.4: Syntheseroute der GRÜNENTHAL GmbH zur Darstellung von rac-12 und rac-13.
- 40. 26 THEORETISCHER TEIL 2.3 Vorbemerkungen zu Enzym-Katalyse 2.3.1 Kinetische Racematspaltungen Der Reaktionsmechanismus von Lipasen und Esterasen entspricht weitgehend dem von Serinproteasen.99 Typisch für diese Enzyme ist eine katalytische Triade im aktiven Zentrum, die aus in dichter räumlicher Nähe stehendem Serin (Ser), Histidin (His), Asparaginsäure (Asp) beziehungsweise Glutaminsäure (Glu) und verschieden stabilisierenden Aminosäureresten gebildet wird. Darüberhinausgehend zeigen alle bisher untersuchten Lipasen eine ähnliche dreidimensionale Struktur, das α/β-Hydrolasen Faltungsmotiv100,101 dessen zentrales Element acht nahezu parallele β-Faltblätter sind, die von α-Helices an beiden Seiten umgeben werden (Abb. 2.5).102 Abb. 2.5: α/β-Hydrolasen Faltungsmotiv aus β-Faltblättern (Pfeile 1 bis 8) und α-Helices (Zylinder A bis F) mit katalytischer Triade und einem Bereich zur Stabilisierung von Oxyanionen. Im Katalysezyklus (Abb. 2.6) wird der primär gebildete Enzym-Substrat-Komplex (A) nukleophil vom aktiven Serinrest der katalytischen Triade angegriffen. Im entscheidenden Katalyseschritt bildet sich über einen tetraedrischen Übergangszustand (B) eine kovalente Bindung zwischen dem Serinrest und dem Acylrest des Substrates zum Acylenzym (C). Der negativ geladene Übergangszustand (B) wird durch das Enzym stabilisiert (Oxyanion-Bereich in Abb.
- 41. VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 27 2.5). Die Bildung des Acylenzyms ist eine Gleichgewichtsreaktion und stellt eine Umesterung zwischen dem Enzym und dem eingesetzten Ester dar. (A) (B) (C) Ser Ser Ser O O O O H R1 OR2 R1 OR2 R1 O + R2OH O Ser Ser Ser O O O O R1 OR3 H R1 O + R3OH R1 OR3 O (D) (E) (F) Abb. 2.6: Katalysemechanismus bei Hydrolasen (ping-pong Mechanismus). Entsprechend reagiert das Acylenzym in einer weiten Umesterung mit einem Nukleophil, wie einem Alkohol (Transacylierung) oder Wasser (Hydrolyse), zu dem freien Enzym und dem Produkt einem Ester (Transacylierung) oder Säure (Hydrolyse) weiter (F). Kinetisch wird diese Reaktionsfolge als ping-pong Mechanismus bezeichnet.103 In den meisten Reaktionen ist die Deacylierung des Acylenzyms der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Katalyse.6 Die Hydrolasen-katalysierten Reaktionen lassen sich in zwei prinzipielle Reaktionstypen unter Beteiligung chiraler Moleküle einteilen: Desymmetrisierung und kinetische Racematspaltung (s. Abb. 2.7).
- 42. 28 THEORETISCHER TEIL Kinetische Dynamische-kinetische Racematspaltung Racematspaltung Desymmetrisierung schnell schnell R P R P schnell P kR kR + + krac + A + langsam langsam S Q S Q langsam Q kS kS Produkt: 50 % P + 50 % S Produkt: 100 % P Produkt: 100 % P R, S: Enantiomere des Substrats P, Q: Enantiomere des Produkts kR, kS: individuelle Geschwindigkeitskonstanten (kR >> kS) krac: Geschwindigkeitskonstante der Racemisierung (krac ≥ kR) Abb. 2.7: Prinzipien der Racematspaltung und Desymmetrisierung. In Desymmetrisierungs-Reaktionen104 (s. Abb. 2.7) werden prochirale Substrate eingesetzt, wie beispielsweise meso-konfigurierte Diester. Diese können entweder zum Produkt P oder seinem Enantiomer Q umgesetzt werden. Das Verhältnis der Produkte wird durch die Reaktionsgeschwindigkeiten beider Reaktionen bestimmt. Es ist somit unabhängig vom Umsatz und wird nur durch den Grad der enantiotopen- Differenzierung des Enzyms beeinflußt. Daher ist es möglich, Produkte sowohl in hohen Ausbeuten als auch mit hohen Enantiomerenüberschüssen zu isolieren. In kinetischen Racematspaltungen (s. Abb. 2.7) dagegen wird ein racemisches Substrat eingesetzt und in einer Enantiomer-differenzierenden Reaktion vom Enzym umgesetzt. In dem Idealfall einer hohen Selektivität wird das eine Enantiomer R des Substrats vollständig umgesetzt und das andere Enantiomer S nicht. In diesem Fall kann sowohl das nicht-reagierende Enantiomer des Substrats (S) und das Enantiomer des Produkts (P) mit Ausbeuten bis zu 50 % isoliert werden. Der entscheidende Nachteil einer kinetischen Racematspaltung ist, daß die theoretisch mögliche Ausbeute jedes Enantiomers 50 % nicht überschreitet. Zudem ist eine Trennung des Reaktionsprodukts von dem nicht umgesetzten Substrat notwendig. In der Mehrzahl der Prozesse ist nur eines der Reaktionsprodukte gewünscht, so daß das andere racemisiert oder in einer enantiokonvergenten Weise umgesetzt werden muß, was einen Mehraufwand bedeutet. Wenn möglich wird daher in solchen Fällen die kinetische Racematspaltung um einen Schritt, eine schnelle in-situ
- 43. VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 29 Racemisierung des Substrates, erweitert.105 In einer solchen dynamischen- kinetischen Racematspaltung (s. Abb. 2.7, S. 28) kann das Produkt P ebenfalls enantiomerenrein mit 100 % Ausbeute erhalten werden. In der Aufgabenstellung dieser Arbeit ist aber gerade die Darstellung beider Enantiomere gewünscht, so daß das Anfallen beider enantiomerer Reaktionsprodukte, wenn auch in Form eines Esters und eines Alkohols, als ein Vorteil der kinetischen Racematspaltung für diese Arbeit gewertet werden kann. 2.3.1.1 Der E-Wert In einer kinetischen Racematspaltung ist der Grad der Enantiomerenanreicherung von Substrat und Produkt abhängig vom Umsatz. Daher ist ein Vergleich von kinetischen Racematspaltungen hinsichtlicht ihrer Selektivität nur bei gleichem Umsatz sinnvoll. Um eine allgemeinere Vergleichbarkeit zu erreichen, ist von CHEN 106,107 und SIH der dimensionslose Selektivitätsparameter E eingeführt worden. Der E-Wert einer Reaktion entspricht dem Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten der Reaktionen der beiden Enantiomere (E = kR / kS) und ist unabhängig von Substratkonzentration und Umsatz. Auf die Voraussetzungen bei der Definition des E-Werts und deren Gültigkeit wird auf Seite 31 näher eingegangen. Bei bekanntem E-Wert lassen sich somit die ee-Werte von Substrat und Produkt in Abhängigkeit vom Umsatz bestimmen und graphisch auftragen (s. Abb. 2.8). Abb. 2.8: Abhängigkeit der ee-Werte von Substraten (S) und Produkten (P) bei drei kinetischen Racematspaltungen mit verschieden Selektivitäten.
- 44. 30 THEORETISCHER TEIL Aus Abb. 2.8 geht hervor, daß das Substrat (S) bei einer kinetischen Racemat- spaltung prinzipiell immer bei hinreichend großen Umsätzen auf Kosten der Ausbeute enantiomerenrein erhalten werden kann. Das Produkt (P) hingegen kann nur bei sehr selektiven Reaktionen mit E-Werten größer als 100 nahezu enantiomerenrein erhalten werden. Zur Bestimmung von E müssen zwei der drei Variablen: Umsatz, ee-Wert des Substrates und ee-Wert des Produkts bekannt sein und in eine der aufgeführten Formeln eingesetzt werden6,107,108: ln [1− c(1+ eeP )] Formel 2.1: E= , für c < 50 % ln [1 − c(1− eeP )] ln [(1− c)(1− ee S )] Formel 2.2: E= , für c > 50 % ln [(1− c)(1+ ee S )] 1− ee S ee P (1− ee S ) ln ln (ee + ee ) 1 + (eeS /ee P ) S E= = P Formel 2.3: 1 + ee S ee P (1+ ee S ) ln ln 1 + (eeS /ee P ) ee P + ee S ) (mit: c = Umsatz, ee P = ee-Wert des Produkts, ee S = ee-Wert des Substrats) KAZLAUSKAS et al. haben eine schnelle photospektroskopische Methode zur Bestimmung des E-Werts entwickelt, die auf der Umsetzung der einzelnen Enantiomeren basiert (“Quick E-Wert“).109 Häufig stehen gerade diese aber nicht zur Verfügung. E-Werte sind für sehr kleine und sehr große Umsätze mit einem großen Fehler behaftet. Entweder läßt sich c nur mit beschränkter Genauigkeit bestimmen oder die gefundenen ee-Werte sind sehr groß, so daß relativ kleine Fehler bei Bestimmungen von c, eeS oder eeP einen großen Einfluß auf den berechneten E-Wert haben, da sie logarithmisch in die Berechnung eingehen.6,21,108,110 Die Angabe von E-Werten größer als 100 ist aus demselben Grund wenig sinnvoll, da hier ebenfalls der Einfluß kleiner Meßfehler sehr groß ist.6,108,110,111 In einigen Fällen können sogar E-Werte um die 50 nur mit einer Genauigkeit von ± 10 angegeben werden (Angabe als E ≈ 50).6 Häufig ist in der Praxis die Bestimmung von Enantiomerenüberschüssen genauer als die Bestimmung des Umsatzes, bei der das Verhältnis zweier verschiedener Stoffe
- 45. VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 31 wie Ester und Alkohol bestimmt werden muß, in diesen Fällen ist zur Berechnung von E Formel 2.3 die geeignetste.6 Im Rahmen dieser Arbeit wurde generell darauf verzichtet E-Werte basierend auf Umsatzbestimmungen zu berechnen. Vielmehr wurden alle E-Werte mittels Enantiomerenüberschüssen des Substrats und des Produkts nach Formel 2.3 berechnet. Bei der Definition von E wird vorausgesetzt, daß eine Michaelis-Menten Kinetik als Reaktionsmechanismus vorliegt, daß die Reaktion irreversibel ist, daß keine Produktinhibierung vorliegt, daß nur eine Katalysatorspezies vorliegt und daß die Reaktionslösung homogen ist.6,106,106,112 Auf diese Voraussetzungen soll im folgenden näher eingegangen werden: a) Reaktionsmechanismus nach Michaelis-Menten: Es konnte gezeigt werden, daß Lipasen katalysierte Reaktionen nach einem ping- pong-bi-bi-Mechanismus verlaufen.113 Kinetische Racematspaltungen nach einem bi- bi-Mechanismus verlaufen allgemein unter Involvierung eines nicht-chiralen und eines chiralen Substrates sowie Produktes.103 CHEN et al. setzen aber für ihre Herleitung des E-Werts eine Michaelis-Menten Kinetik nach einem uni-uni- Mechanismus voraus und betrachten formal nicht die Involvierung mehrerer Substrate und Produkte. Von STRAATHOF et al. werden unter Berücksichtigung mehrerer möglicher bi-bi-Meachanismen bis zu acht verschiedene Formeln zur Berechung von E vorgeschlagen.103 Diese haben sich jedoch nicht durchgesetzt, da sich vielfach die häufig nur geringen Abweichungen von einem uni-uni-Mechanismus erst bei hohen Umsätzen beobachten lassen.103 Für Esterhydrolysen im wäßrigen Medium ist zudem die Näherung einer Michaelis-Menten Kinetik meist gut erfüllt.114 b) Reversibilität: Allgemein wird davon ausgegangen, daß enzymatische Hydrolysen aufgrund der hohen Konzentration des Lösungsmittels Wasser (55.5 M) irreversibel verlaufen. Bei enzymatischen Transacylierungen unter Einsatz von Enolestern mit hinreichend hohem Überschuß des Acyldonors und geringen Wassergehalten spielt eine Rückreaktion des gebildeten Esters ebenfalls keine Rolle.107 Der gebildete Ester kann prinzipiell allerdings als Acyldondor fungieren, wodurch der zweite Teilschritt der Transacylierung reversibel wird.115 Ebenfalls können geringe Mengen Wasser zu
- 46. 32 THEORETISCHER TEIL Hydrolysereaktionen führen.116 Für Gleichgewichtsreaktionen wurde von CHEN und SIH ebenfalls eine Methode zur Bestimmung von E unter Kenntnis der Gleichgewichtskonstanten K entwickelt (Formel 2.4).107 Wie aus Abb. 2.9 hervorgeht, fallen bei reversiblen, kinetischen Racematspaltungen die ee-Werte des Substrats bei Umsätzen über 50 % deutlich ab. Nicht umgesetztes Substrat kann also im Falle einer reversiblen Reaktion nicht mehr enantiomerenrein erhalten werden. Hohe ee-Werte des Substrats bei großen Umsätzen deuten hingegen auf eine extreme Gleichgewichtslage (K ≈ 0, Fall a in Abb. 2.9) hin. ln [1 − (1 + K)(c + ee S (1 − c))] ln [1 - (1 + K) c (1 + eeP )] Formel 2.4: E= = ln [1 − (1 + K)(c − ee S (1 − c))] ln [1 - (1 + K) c (1 - eeP )] (mit: c = Umsatz, ee P = ee-Wert des Produkts, ee S = ee-Wert des Substrats) Abb. 2.9: Abhängigkeit der ee-Werte a) des Produkts und b) des Substrats bei reversiblen kinetischen Racematspaltungen mit E = 100 für verschiedene Gleichgewichtskonstanten K (K = a: 0, b: 0.1, c: 0.5, d: 1, e: 5). ANTHONSEN et al. haben einen einfachen Weg zur Bestimmung E und K entwickelt, indem sie in einem regressiven mathematischen Verfahren über eine Serie von eeS- und eeP-Werten eine Fit E-Wert Funktion berechnen.117 c) Substrat- oder Produktinhibierung Bei dem Vorliegen von Produktinhibierung kann sich der E-Wert über den Reaktionsverlauf ändern.118,119 Um den E-Wert zu beeinflussen, muß allerdings eine enantioselektive Inhibierung vorliegen118, die sogar eine Rückreaktion des Produkts
- 47. VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 33 begünstigen kann119. In verdünnten Lösungen sind diese Effekte jedoch als gering einzuschätzen.112b) d) Reinheit des Biokatalysators: Besteht ein Enzym aus verschieden Isoenzymen oder enthält ein Enzym Verunreinigungen anderer Enzyme, wie häufig in kommerziellen nur roh aufgereinigten Präparationen, so stellt der E-Wert ein gewichtetes Mittel aller Biokatalysatoren, die mit dem Substrat reagieren, dar. KARNERVA et al. haben beispielsweise unterschiedliche Selektivitäten für Isoenzyme der Candida rugosa Lipase in Hydrolysereaktionen beobachtet.120 Auch für die Schweineleber-Esterase werden in verschiedenen Publikationen unterschiedliche Selektivitäten der einzelnen Isoenzyme postuliert.130,131 Im Falle der Candida antarctica Lipase sind zwei Isoenzyme bekannt, die signifikante unterschiedliche katalytische Eigenschaften auf- weisen. Ausgewählte physikalische Eigenschaften der Isoenzyme CAL-A und CAL-B, welche die Unterschiedlichkeit beider Katalysatoren verdeutlichen, sind in Tabelle 2.4 aufgeführt.121 Tabelle 2.4: Charakteristika der Isoenzyme der Candida antarctica Lipase CAL-A CAL-B Molekulargewicht122 45 kD 33 kD Isoelektrischer Punkt (pI)122 7.5 6.0 pH-Optimum123 7 7 spezifische Aktivität123 420 LU/mg 435 LU/mg pH-Stabilität122 6-9 7-10 Grenzflächenaktivierung123 schwach nein
- 48. 34 THEORETISCHER TEIL Ein allgemein deutliches Anzeichen für ein Abweichen der angenommenen Voraussetzungen ist eine Änderung des E-Werts über den Verlauf der Reaktion.124 Auch liefert ein Vergleich des experimentell bestimmten Umsatzes mit dem nach Formel 2.5 berechneten Umsatz114 Hinweise auf die Konsistenz der durchgeführten Berechnungen. ee S Formel 2.5: Umsatz ber = ee S + ee P Im allgemeinen werden für enzymatische Reaktionen E-Werte nach CHEN und SIH zur übergreifenden Vergleichbarkeit angegeben, ohne explizit anzugeben, ob die kinetischen Voraussetzungen erfüllt sind. Von STRAATHOF et al. wird sogar generell die Gültigkeit der Formel 2.1 und Formel 2.2 für Reaktionen nach einem bi-bi- Mechanismus bestritten.103 Vor diesem Hintergrund sollen im Rahmen dieser Arbeit verschiedene enzymatische Hydrolysen und Transacylierungen möglichst einfach untereinander verglichen werden. Obwohl nicht alle Voraussetzung für die formale Gültigkeit der Formeln zur Berechnung von E erfüllt sind, werden in dieser Arbeit E-Werte nach CHEN und SIH zu einer einfachen und übersichtlichen Vergleichbarkeit angegeben, da eine Angabe von ee-Werten über den Umsatz wenig sinnvoll erscheint und außerdem keine Untersuchungen zur Kinetik durchgeführt werden sollen. Für präparative Zwecke interessant und somit das angestrebte Ziel in dieser Arbeit sind kinetische Racematspaltungen mit einem E-Wert größer 20, denn sie können in der Synthese genutzt werden (Abb. 2.10).6,110 Aus den Kurven für die Abhängigkeit der ee-Werte vom Umsatz kann man bestimmen, bei welchem Umsatz eine Reaktion abzubrechen ist, um Produkt oder Substrat mit möglichst hohem Enanantiomeren- überschuß und möglichst großer Ausbeute zu erhalten (Abb. 2.10).
- 49. VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 35 Abb. 2.10: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (S) und Produkt (P) in einer kinetischen Racematspaltung bei einer Selektivität von E = 21. Eingezeichnet ist ein Umsatz von 63 %, ab dem das Substrat (S) enantiomerenrein vorliegt. 2.3.2 Auswahl geeigneter Enzyme und Reaktionsmedien Hydrolasen sind in großer Anzahl kommerziell erhältlich.4 Allerdings werden in der organische Synthese davon vorwiegend nur einige wenige, empirisch ausgewählte eingesetzt.5,6,21 Diese Enzyme sind besonders gut untersucht und über einen langen Zeitraum in ähnlicher Präparation und Qualität kommerziell verfügbar. Im einzelnen sind diese Enzyme in Tabelle 2.5 aufgeführt.
- 50. 36 THEORETISCHER TEIL Tabelle 2.5: Wichtige Hydrolasen mit ausgewählten Eigenschaften Schweinepankreas- Molekulargewicht: 50 kDa lipase (PPL) Substrate: sekundäre Alkohole, primäre Alkohole Burkholderia ehemals: Pseudomonas cepacia Lipase (PCL) cepacia Lipase Molekulargewicht: 33 kDa (BCL) Substrate: sekundäre Alkohole, primäre Amine Protein kann rekombinant aus Pseudomonas Spezien gewonnen werden. Candida rugosa Molekulargewicht: 63 kDa Lipase (CRL) Substrate: große cyclische, sekundäre Alkohole Präparationen können ein bis fünf Isoenzyme 120,125, die in Reaktivität und Selektivität variieren, aber die gleiche Enantiopräferenz120 zeigen, enthalten. Lipase B aus Molekulargewicht: 33 kDa Candida antarctica Substrate: kleine sekundäre Alkohole, primäre Amine (CAL-B) Protein wird rekombinant aus Aspergillus oryzae produziert.126,127 Schweineleber- Molekulargewicht: 165 kDa (Trimer)128 Esterase (PLE) Substrate: Carbonsäuren, sterisch gehinderte Alkohole PLE ist eine Mischung mehrerer Isoenzyme mit komplexer Mikroheterogenität.128,129 Die Isoenzyme können signifikante Unterschiede in Aktivität und Selektivität, sowie in ihrer Enantiopräferenz zeigen.130,131 Die Gewinnung einer rekombinanten, isoenzymeinheitlichen PLE ist seit kurzem bekannt.131a),b) Angabe der bevorzugten Substrate nach NAEMURA et al.132,6 6 Angabe des Molekulargewichts, außer für PLE, nach BORNSCHEUER und KAZLAUSKAS. An das Enzym eines möglichen technischen Prozesses zur Darstellung eines Tramadol-Analogons, der einen enzymatischen Zwischenschritt beinhaltet, werden folgende Ansprüche gestellt: es katalysiert die gegebene Reaktion mit hoher Aktivität und Selektivität, es ist unter den Reaktionsbedingungen stabil und es ist möglichst
- 51. VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 37 lange in gleicher Qualität und Präparation zu einem annehmbaren Preis kommerziell verfügbar. Dies trifft im besonderen auf die obengenannten Enzyme zu, die daher in dieser Arbeit besondere Beachtung finden. Es ist wohlbekannt, daß Lipasen sowohl in wässrigen als auch in unpolaren Medien katalytisch aktiv sind und eine breite Palette auch nicht natürlicher Substrate akzeptieren. Dies liegt an der Flexibilität der Proteinkette, die eine Vielzahl von Konformationen annehmen kann, um Substrate aufzunehmen, weshalb Lipasen auch als „induced fit“ Enzyme bezeichnet werden. Jedoch macht diese Eigenschaft eine Vorhersage der stereochemischen Wechselwirkung von Enzym und Substrat schwierig. Viele Enzyme zeigen im wäßrigen Ein- oder Zweiphasensystem ihre größte katalytische Aktivität, da sie im wässerigen Medium ihrem optimalen pH-Bereich und ihrer optimale Solvatation ausgesetzt sind.133 Aufgrund der erhöhten Flexibilität von Enzymen im wässerigen Medium können Substrate akzeptiert werden, die im organischen Medium nur unzureichend umgesetzt werden. Verlaufen Hydrolysen jedoch mit schlechter Enantioselektivität, so sollte die Enzymkatalyse auf die entsprechende Transacylierung im organischen Medium erweitert werden. Im organischen Medium haben hydrophobe Verbindungen eine erhöhte Löslichkeit, so daß hier Substrate eingesetzt werden können, die nicht im wässerigen Milieu umgesetzt werden können. Eine Umsetzung hydrolyselabiler Verbindungen ist ein weiterer Vorteil. Zusätzlich verhalten sich Hydrolyse und Transacylierung unter dem Blickpunkt der asymmetrischen Synthese enantiokomplementär, so daß durch einen Wechsel des Reaktionsmediums ebenfalls beide Enantiomere dargestellt werden können. Im Rahmen dieser Arbeit sollen daher beide Möglichkeiten des Reaktionsmediums der enzymatischen Racematspaltung untersucht werden, um eine möglichst breite Grundlage zur Gewinnung von enantiomeren Tramadol-Analoga zu schaffen.
- 52. 38 THEORETISCHER TEIL 2.3.2.1 Auswahl der verwendeten Substrate und Reaktionsbedingungen in der enzymatischen Hydrolyse Bei den in die enzymatische Hydrolyse einzusetzenden Verbindungen handelt es sich um Tramadol-Analoga mit einer phenolischen oder sekundären Hydroxylgruppe, die durch eine geeignete Wahl des Acylrestes in Ester überführt werden und so als Substrate eingesetzt werden können. Üblicherweise werden für Lipasen-katalysierte Hydrolysen langkettige Ester von Fettsäuren bevorzugt, die dem Vorbild der Triglyceride entsprechen. Dagegen werden Esterase-katalysierte Hydrolysen am besten mit Estern kurzkettiger Carbonsäuren durchgeführt.6,110,101 Um bei der Wahl der Acylgruppe sowohl den Lipasen als auch den Esterasen ein Substrat zu bieten, daß umgesetzt werden kann, wurde die Butyratgruppe als Standard gewählt, da Buttersäureester sowohl von Lipasen als auch Esterasen als Substrate akzeptiert werden. So gelang COOPE et al. beispielsweise die PLE-katalysierte Hydrolyse eines tertiären Quinclidinol Esters nur im Falle eines Butyrats als Acylgruppe mit ausreichender Aktivität.134 In anderen Beispielen konnten KAZLAUSKAS135 et al. sowie WHITESIDES136 et al. für einige Fälle Lipasen-katalysierter Hydrolysen zeigen, daß bei einem Wechsel der Acylgruppe vom Acetat zum Butyrat ein Anstieg der Selektivität zu beobachten war. In der Umkehrreaktion zu Hydrolyse, der PLE-katalysierten Transacylierung racemischer sekundärer Alkohole mit Vinylacetat, -propionat und -butyrat, konnten GAIS et al. ebenfalls beobachten, daß bei größerer Kettenlänge des Acyldonors eine Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität auftritt.81,84 Zur Verbesserung der Löslichkeit von Substraten im wäßrigen Medium ist die Zugabe von Cosolventien wie Aceton, Methanol, tert-Butanol oder DMSO möglich, diese werden dabei in Konzentrationen bis zu 20 % toleriert.5,6,8,137,138 Bei Untersuchungen zum Einfluß des Cosolvens auf die PLE-katalysierten Hydrolyse von meso-Diestern konnten GUANTI et al. zeigten, daß die besten Ergebnisse hinsichtlich Ausbeute und Selektivität durch einen Zusatz von 10 % tert-Butanol als Cosolvens erreicht wurden.138 Aufgrund dieser Ergebnisse wurde für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten enzymatische Hydrolysen im wäßrigen Einphasensystem standardmäßig ein Zusatz von 10 % tert-Butanol als Cosolvens gewählt. Eine mögliche Nebenreaktionen der Alkoholyse des Cosolvens, also der enzymatischen Acylierung des Cosolvens statt des Wassers, ist aufgrund der tertiären Hydroxyl- gruppe am tert-Butanol nicht möglich.
- 53. VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 39 2.3.2.2 Auswahl der verwendeten Acyldonoren und Reaktionsbedingungen in der enzymatischen Transacylierung Lipasen katalysierte Transacylierungen mit aktivierten Acyldonoren (Abb. 2.11) verlaufen im allgemeinen schnell und das Gleichgewicht der Transacylierung liegt auf der Seite der Produkte. Aktivierte Ester: Anhydride: O O O O O O N C3H7 O CF3 C7H15 S O O 29 30 31 Enolester: O O O O OEt O O O O 32 33 34 35 Abb. 2.11: Beispiele für gebräuchliche Klassen von aktivierten Acyldonoren zur irreversiblen enzymatischen Transacylierung. Die bedeutensten aktivierten Acyldonoren sind Enolester, wie Vinylacetat (32) oder Isopropenylacetat (34). Der aus Enolestern entstehende Alkohol tautomerisiert zur Carbonylverbindung, wodurch das Gleichgewicht der Transacylierung auf der Seite der Produkte liegt. Die meisten Lipasen tolerieren die Anwesenheit von Acetaldehyd. CRL bildet hier eine bekannte Ausnahme 139,140,141. Neuere Untersuchungen gehen von einer Reaktion des Acetaldehyds mit Lysin-Resten des Proteins unter Bildung einer Schiff´schen Base aus, wodurch eine positive Ladung von der Proteinoberfläche entfernet wird und zur Deaktivierung des Enzyms führt (Abb. 2.12).140,142,143,144,145 Als Alternative bieten sich hier die Acylierungsmittel Isopropenylacetat (34) und 1-Ethoxyvinylacetat142,146 (35) an, da die aus diesen Reagentien gebildeten Alkohole zu den weniger reaktiven Verbindungen Aceton bzw. Essigsäureethylester tautomerisieren. 1-Ethoxyvinylester sind allerdings schwer zugänglich.
- 54. 40 THEORETISCHER TEIL H O Lys NH3 Lys N - H3O Abb. 2.12: Deaktivierung von Proteinen durch Acetaldehyd. Im Falle der Enolester und Anhydride verläuft die Transacylierung praktisch irreversibel. Eine möglichst extreme Gleichgewichtslage ist in kinetischen Racematspaltungen von entscheidender Bedeutung, da eine mögliche Rückreaktion den Enantiomerenüberschuß des verbleibenden Substrats und somit den E-Wert der Reaktion herabsetzt (s. Kap. 2.3.1.1).165 Es wurden daher in den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Transacylierungen nur Enolester als Acylierungsmittel eingesetzt. Alle Acylierungsmittel sind vor ihrer Verwendung über Na2CO3 destilliert worden, um die Anwesenheit von Säurespuren, die eine nicht-enzymatische Reaktion katalysieren könnten, auszuschließen. In einer großen Zahl an Veröffentlichungen wird beschrieben, daß Proteineigenschaften, wie die Enantioselektivität von Enzymen, durch die Art des Lösungsmittels, das als Reaktionsmedium eingesetzt wird, beeinflußt werden können.147,148 Im allgemeinen wird davon ausgegangen, daß unpolare Lösungsmittel besser für eine Enzymkatalyse geeignet sind, da das an das Enzym gebundene und zur Entfaltung der Aktivität notwendige Wasser nicht entfernt wird.149 Stark hydrophile Lösungsmittel können das aktive Zentrum dehydratisieren und sind daher zur Enzymkatalyse nur bedingt geeignet. Neben der Aktivität wird auch die Selektivität von Enzymen stark durch die Eigenschaften des Lösungsmittels beeinflußt. Mehrere Hypothesen zur Erklärung dieses Phänomens wurden bereits formuliert. So kann nach KLIBANOV et al. die Enzymkonformation durch die Polarität des Lösungsmittels modifiziert werden und so den molekularen Erkennungsprozeß zwischen Enzym und Substrat beeinflussen.150 Nach einer weiteren Hypothese hängt die Selektivität von der Energetik der Substratsolvatisierung ab.151 Eine andere Theorie beruht auf der Vorstellung, daß Lösungsmittelmoleküle im aktiven Zentrum binden und bei der Assoziierung des Substrats interferieren.152 Allerdings sind diese Hypothesen hinsichtlich ihres Vorhersagewertes unbefriedigend. Sie scheinen entweder nur für das jeweils betrachtete Enzym und Substrat gültig zu sein, oder es
- 55. VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 41 ist, wie im Falle von Lösungsmittel-Enzym-Komplexen, überhaupt keine Verallgemeinerung möglich. Zusammenfassend scheint weiterhin gegenwärtig keine Gemeinsamkeit zwischen den verschiedenen Hypothesen zu existieren, obgleich es wahrscheinlich ist, daß das Lösungsmittel die enzymatische Selektivität über mehr als einen Mechanismus beeinflußt. Eine allgemeingültige Aussage über das optimale Medium für eine Enzymkatalyse unter bestimmten Bedingungen ist daher nicht möglich. Daraus läßt sich folgern, daß für jede Reaktion eine Optimierung der Lösungsmitteleigenschaften durchzuführen ist.153 Um diese Möglichkeit der Veränderung von Enzymeigenschaften durch den Lösungsmitteleinfluß zu beschreiben, wird der Ausdruck „Medium-Engineering“ verwendet, um damit eine Alternative zum oder auch eine Vervollständigung des „Protein-Engineering“ zu bezeichnen.147 Die bislang publizierten Ergebnisse haben gezeigt, daß für eine Modifizierung oder Verbesserung der Enzymselektivität das Medium-Engineering eine gute Alternative zum Protein-Engineering und zur zeitaufwendigen Suche nach neuen Katalysatoren ist.
- 56. 42 THEORETISCHER TEIL 2.4 Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungen von Tramadol-Analoga 2.4.1 Substrate auf Basis aromatischer Hydroxylfunktionen Da nur ein kleiner Teil der bekannten Wirkstoffe eine sekundären Hydroxyfunktion enthält, ist der weitaus größere Anteil kein klassisches Substrat für die bisher etablierten enzymatischen Racematspaltungen. Viele Wirkstoffe haben zwar eine Aminofunktion mittels derer eine Aminoacylasen-katalysierte Racematspaltung durchgeführt werden könnte154, die Aminogruppe kann aber wie im Beispiel von rac-7 einer solchen Reaktion unzugänglich sein. Ein neuerer Ansatz, der bereits in eigenen Vorarbeiten verfolgt wurde80, ist die in Wirkstoffen weitaus häufigere phenolische Hydroxylgruppe in einer Hydrolasen-katalysierten Racematspaltung zu nutzen. Dieser Ansatz bietet neue Herausforderungen, da die Distanz zu vorhandenen Chiralitätszentren beträchtlich erhöht ist. Hydrolasen-katalysierte Umsetzungen von phenolischen Estern sind in der Schutzgruppentechnik bereits etabliert.155 Enzyme ermöglichen eine gezielte Entfernung enzymlabiler Schutzfunktionen unter milden Reaktionsbedingungen, wie beispielhaft an der enzymatischen Hydrolyse des phenolischen Acetats an einem 4-Acetoxybenzyloxycarbonyl Urethan mit anschließender Fragmentierung gezeigt ist (Abb. 2.13)156. O Acetyl- O R esterase R N O O N O R NH2 H pH 7.0, H O 45 ºC O R = Lipoprotein Abb. 2.13: Enzymatische Spaltung der 4-Acetoxybenzyloxycarbonyl-Schutzgruppe. In mehreren Untersuchungen konnte bereits auch gezeigt werden, daß Hydrolasen in der Lage sind, Reaktionen von Phenolen oder Phenylestern sowohl mit hoher Regio-157,158 als auch Chemoselektivität157,159 zu katalysieren. Aufgrund dessen
- 57. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 43 empfehlen sich Enzym-katalysierte Hydrolysen von Phenylestern nicht nur für Schutzgruppenoperationen, sondern auch allgemein für die organische Synthese. Um den Ansprüchen der modernen organischen Synthese voll gerecht zu werden, sollte die Methodik der Enzym-katalysierten Transformation der Phenolgruppe allerdings auch in einer enantioselektive Art möglich sein. Für enzymatische Enantiomeren-differenzierende Racematspaltungen von Phenol- derivaten sind jedoch bis heute nur wenige Beispiele bekannt. Ein gut untersuchtes Substrat mit axialer Chiralität ist das 1,1´-Binaphthalin-2,2´-diol (rac-36) bzw. dessen Ester. MIYANO et al. beschrieben 1987 die Schweinepankreas- lipase katalysierte Hydrolyse eines Divaleriansäureesters (rac-37a) mit sehr guter Selektivität (Abb. 2.14).160 Die Hydrolyse eines solchen Diesters bezieht zwei Stufen enzymatischer Racematspaltungen ein. Solche zweistufigen Hydrolysen lassen in der Theorie einen höheren ee-Wert der Produkte als einstufige Reaktionen erwarten161. Der als primäres Produkt entstehende Monoester konnte nur in geringen Mengen nachgewiesen werden, da er umgehend vom Enzym weiter umgesetzt wird. Wird ein Monoester direkt als Substrat eingesetzt, verläuft eine Lipasen-katalysierte Hydrolyse ebenfalls mit hoher Selektivität (E > 100).162,163 Einer Schweineleber- Esterasen-katalysierten Hydrolyse ist das entsprechende Butyrat rac-37b nicht zugänglich164. Des weiteren konnte von INAGAKI et al. demonstriert werden, daß das 1,1´-Binaphthalin-2,2´-diol (rac-36) auch direkt als Substrat in eine Lipasen- katalysierte Transacylierung eingesetzt werden kann, die mit guter Selektivität verläuft (E > 60) und auf der Stufe des monoacylierten Produkts stehen bleibt.162 Allerdings zeigte die von INAGAKI et al. eingesetzte Lipase aus Pseudomonas sp. eine zu den bisherigen eingesetzten Lipasen entgegengesetzte Enantiopräferenz. WANG et al. war es zuvor nicht gelungen rac-36 mit verschiedenen Lipasen sowie der Cholesterolesterase zu acylieren.165 O O O R Enzym OH O R + O R H2O OH O R O O rac-37 a = nBu (−)-(aS)-36 (+)-(aR)-37 a b = nPr b Abb. 2.14: Enzymatische Hydrolyse von Estern des 1,1´-Binaphthalin-2,2´-diols.
- 58. 44 THEORETISCHER TEIL KAZLAUSKAS konnte weiterhin unter Verwendung des Enzyms Cholesterolesterase zeigen, daß nicht nur substituierte 1,1´-Binaphthalin-2,2´-diole, sondern auch entfernte Derivate mit sehr guten Selektivitäten hydrolysiert werden und somit ein allgemeiner Zugang zu enantiomerenreinen Verbindungen diesen Typs existiert.166 In systematischen Untersuchungen zur Lipasen-katalysierten Hydrolyse von verschiedenen substituierten racemischen Essigsäure-1-(3,4-dimethoxyphenyl)- tetrahydroisoquinolinylestern konnten HOSHINO et al. zeigen, daß Ester von Phenolen, bei denen das Chiralitätszentrum mehrere C-Atome von der Phenolgruppe entfernt ist, Substrate für eine enzymatische kinetische Racematspaltung sind. Unter anderem zeigte sich hierbei die Lipase aus Candida rugosa als geeigneter Katalysator. Somit stellt die Hydrolasen-katalysierte Racematspaltung von phenolischen Substraten eine Möglichkeit zur Gewinnung von enantiomerenreinen Verbindungen dar. Die erzielten Selektivitäten in den Lipasen-katalysierten Reaktionen waren allerdings niedrig, es konnten E-Werte im Bereich von 2 bis maximal 11 erreicht werden.167 AcO HO AcO MeO Lipase MeO MeO NMe NMe NMe H2O gesättigtes H + H n organisches n n Lösungsmittel MeO MeO MeO OMe OMe OMe (S) (R) Abb. 2.15: Enzymatische Hydrolyse von racemischen Essigsäure-1-(3,4-dimethoxy- phenyl)-tetrahydroisoquinolinylestern. ACHIWA et al. stellten einen neuen Zugang zu (R)-α-Tocopherol vor, indem sie eine am aromatischen Ring demethylierte Vorstufe in eine Lipasen-katalysierte kinetische Racematspaltung einsetzten (Abb. 2.16). Auch hier war die Selektivität der Hydrolyse des phenolischen Esters, wahrscheinlich ebenfalls aufgrund des entfernten stereogenen Zentrums, gering (E ≤ 10).168 Eine enzymatische Hydrolyse der am aromatischen Ring permethylierten Verbindung, dem α-Tocopherol, war aufgrund von sterischen Hinderungen nicht möglich. Von ZAMMATTIO et al. wird die Lipasen-
- 59. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 45 katalysierte Hydrolyse eines ähnlich aufgebauten phenolischen Substrats, mit einem 2H-Benzopyrangerüst, ebenfalls mit geringer Selektivität beschrieben (Abb. 2.17 links).169 AcO HO AcO CRL R + O R H 2O O O R (S) (R) R= Abb. 2.16: Lipase-katalysierte kinetische Racematspaltung von Tocolacetat. Höhere Selektivitäten mit E-Werten von 24 bis 60 beobachten HUTCHINSON et al. bei der PLE-katalysierten Hydrolyse von phenolischen Estern bei denen das Chiralitätszentrum im Säureanteil des Moleküls und somit näher an der vom Enzym angegriffenen Bindung lokalisiert ist (Abb. 2.17 rechts).170 Interessanterweise wurde hier aus Löslichkeitsgründen nicht das freie Amin sondern das Hydrochlorid der Base als Substrat eingesetzt. AcO O O N(CH2CH2OCH3)2 ⋅HCl R1 O R2 O n OMe n = 1,2 R1 = H, Me, R2 = Et, nPr Abb. 2.17: Racemische Substrate mit aromatischer Hydroxylgruppe, die in Hydrolasen-katalysierte kinetische Racematspaltungen eingesetzt worden sind. Ebenfalls sehr gute Selektivitäten konnten LIU et al. in der enzymatischen Hydrolyse eines phenolischen Esters mit dem Chiralitätszentrum im phenolischen Teil des Moleküls erzielen. Sie erzielten E-Wert bis zu 60 bei der Cholesterolesterasen- katalysierten Hydrolyse von Essigsäureestern des Lasofoxifene (Abb. 2.18).171
- 60. 46 THEORETISCHER TEIL N O CE + H2O AcO HO AcO (5R,6S) (5S,6R) Lasofoxifene Abb. 2.18: CE-katalysierte kinetische Racematspaltung zur Darstellung von Lasofoxifene. Zusammenfassend kann nach Kenntnisstand der Literatur zu Beginn dieser Arbeit festgestellt werden, daß Ester von aromatischen Alkoholen von Enzymen als Substrate akzeptiert werden. Die erzielten Selektivitäten waren zu jenem Zeitpunkt aber sehr niedrig und präparativ nicht nutzbar. Erst in jüngster Zeit ist vermehrt in Publikationen über Enantiomeren-differenzierende Hydrolysen von Phenylestern mit präparativ nutzbaren Enantiomerenüberschüssen berichtet worden. In eigenen Vorarbeiten wurde das O-Desmethyltramadol (rac-8, M1) als Substrat mit aromatischer Hydroxylgruppe für eine Enzym-katalysierte Racematspaltung ausgewählt. Das O-Desmethyltramadol, ein Hauptmetabolit des Wirkstoffs Tramadol, und seine einzelnen Enantiomere sind für die Pharmakokinetik des Tramadols von Bedeutung. Zudem bieten die Enantiomere dieser Verbindung nach Methylierung Zugang zu den Enantiomeren des Tramadols. Daß Ester des O-Desmethyltramadols, wie der (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3- (2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15), als Substrate von dem Enzym PLE akzeptiert werden, konnte bereits in diesen Vorarbeiten demonstriert werden (Abb. 2.19).80
- 61. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 47 OH O Pr OH PLE O Me2N O Pr Phosphatpuffer- Lösung (pH 8.0) (+)-15 Me2N O + 10 % Cosolvens rac-15 Me2N OH RT OH (−)-8 Abb. 2.19: PLE-katalysierte Hydrolyse von (±)-Buttersäure-3-(2-dimethylamino- methyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15). In der PLE-katalysierten Hydrolyse von rac-15 unter Zusatz von 10 % tert-Butanol als Cosolvens konnte der enantiomerenreine Ester (+)-15 bei hohen Umsätzen erhalten werden (Tabelle 2.6). Die Selektivität der Reaktion war insgesamt sehr niedrig (E = 7). Unter Verwendung von 10 % Methanol als Cosolvens konnte eine Steigerung der Aktivität und der Selektivität des Enzyms PLE beobachtet werden (E = 11). Tabelle 2.6: Zusammenfassung der Ergebnisse eigener Vorarbeiten zur PLE- katalysierten Hydrolyse von rac-15 Reaktionsbedingungen E-Wert Umsatz (nach 1.5 h) 23 % 9.0 U/ml; pH 8.0; ee Ester (+)-15 76 % 7 10 % tert-Butanol ee Phenol (−)-8 51 % Umsatz (nach 0.5 h) 20 % 3.9 U/ml; pH 8.0; ee Ester (+)-15 17 % 11 10 % Methanol ee Phenol (−)-8 81 % Es konnte somit gezeigt werden, daß in den Enzym-katalysierten Racematspaltungen mit Verbindungen auf Basis des Tramadols eine für erste Laborsynthesen zur Gewinnung von Enantiomeren ausreichende Selektivität erzielt werden kann, und dies, obwohl die Chiralitätszentren nicht direkt an der zu
- 62. 48 THEORETISCHER TEIL hydrolysierenden Estergruppe lokalisiert sind. Des weiteren konnte belegt werden, daß das zugesetzte Cosolvens einen entscheidenden Einfluß auf die Enzym- katalysierte Hydrolyse von Tramadol-Analoga ausübt.
- 63. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 49 2.4.1.1 Enzym-katalysierte Hydrolysen des (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3- (2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylesters (rac-15) Ausgehend von den vorgestellten eigenen Vorarbeiten wurden weitergehende Untersuchungen zur Enzym-katalysierten Racematspaltung von phenolischen Tramadol-Analoga durchgeführt. Im Vordergrund stand hierbei die Suche nach Reaktionsbedingungen für ein in einem präparativen Maßstab nutzbaren Verfahren zur enzymatischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga mit aromatischer Hydroxylgruppe. Die Schweineleber-Esterase (PLE) benötigt, wie andere Hydrolasen auch, kein Coenzym oder Cofaktor, ist kommerziell verfügbar und verbindet eine geringe Substratspezifität mit hoher Enantioselektivität.5 PLE ist eine der am erfolgreichsten eingesetzten Hydrolasen in der enantiotopos-differenzierenden Hydrolyse von Dicarbonsäure-diestern und von Diacetaten von Diolen5, welche bereits exemplarisch in einem 100 mol Maßstab durchgeführt worden sind172. Aus diesen Gründen erscheint die PLE als ein zweckmäßiges Enzym und wurde zunächst als Biokatalysator für die Hydrolyse von Tramadol-Analoga beibehalten. Da das Cosolvens in der enzymatischen Hydrolyse einen entscheidenden Einfluß ausüben kann, wurde neben den bisher verwendeten Lösungsmitteln tert-Butanol und Methanol ebenfalls der Einfluß von Aceton als Cosolvens auf die PLE- katalysierte Hydrolyse des (±)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy- cyclohexyl)-phenylesters (rac-15) untersucht (Tabelle 2.7). Aceton ist ein übliches Cosolvens in der PLE-katalysierten Hydrolyse von Estern.5 Häufig kann ein aktivitäts- und selektivitätssteigernder Einfluß des Acetons auf die PLE-Katalyse beobachtet werden. So berichten beispielsweise TAMM et al. von einem Anstieg der Selektivität in einigen Fällen der PLE-katalysierten Desymmetrisierung, wenn sie statt keinem 10 % Aceton als Cosolvens verwendeten.173 PIETZSCH et al. untersuchten den Einfluß der Konzentration des Cosolvens Aceton auf die Aktivität von PLE unter Standardaktivitätstest- bedingungen.174 Sie beobachten bei einer Konzentration von 3 – 5 % Aceton eine Aktivitätssteigerung der PLE von 75 % im Vergleich zur Aktivität der PLE ohne Cosolvens. Sie berichten ebenfalls von einer Steigerung der Selektivität in der PLE-
- 64. 50 THEORETISCHER TEIL katalysierten kinetischen Racematspaltung von Allenen bei Zusatz von 3 % Aceton als Cosolvens. Tabelle 2.7: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 unter Zusatz von 10 % Aceton als Cosolvens (3.3 U/ml; Phosphatpuffer, pH 8.0) Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E-Wert 5 Min 52 % 27 % 46 % 4 Aus Tabelle 2.7 geht hervor, daß Aceton als Cosolvens im Vergleich zu den Cosolventien tert-Butanol und Methanol (Tabelle 2.6) zu einer weiteren Steigerung der Aktivität der PLE führt, da die Reaktionsgeschwindigkeit erheblich zunimmt. Dieser Einfluß auf die Reaktionsgeschwindigkeit geht allerdings mit Einbußen in der Selektivität der Reaktion einher. Die Selektivität ist so gering, daß keine weiteren Versuche in der Enzym-katalysierten Hydrolyse von Substraten mit aromatischer Hydroxylgruppe mit Aceton als Cosolvens unternommen wurden. Für andere Substrate, bei denen die Selektivität der enzymatischen Hydrolyse hoch genug ist, kann sich die Verwendung von Aceton als Cosolvens zu einer Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit anbieten. Um die präparativen Möglichkeiten der Enzym-katalysierten Hydrolyse von Substraten mit aromatischer Hydroxylgruppe zu demonstrieren, wurde die PLE- katalysierte Hydrolyse von rac-15 in einem 3.5 mmol Maßstab durchgeführt. Es wurden die bereits optimierten und bewährten Reaktionsbedingungen pH 8.0 und 10 % tert-Butanol als Cosolvens gewählt (Tabelle 2.9). Um die einzusetzenden Lösungsmittelmengen zu reduzieren wurde für diese Versuche in einem präparativen Maßstab eine erhöhte Substratkonzentration von ca. 0.09 mol/l statt der bisher verwendeten 0.025 mol/l gewählt. Nachdem ein Umsatz von ca. 50 % erzielt worden war, wurde die Reaktion durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan für mindestens 24 Stunden abgebrochen. In Vorversuchen hatte sich die kontinuierliche Extraktion als effektivste Methode zur Aufarbeitung und Extraktion herausgestellt, da sich das gebildete Phenol (−)-8 aufgrund seiner amphoteren Eigenschaften63 sonst nur mit Verlusten in der Ausbeute erhalten läßt.
- 65. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 51 LINTZ et al. erhielten ebenfalls zum Teil sehr schlechte Ausbeuten bei der Extraktion des O-Desmethyltramadols (rac-8) bei nicht kontinuierlicher Weise (Tabelle 2.8).63 Tabelle 2.8: Extraktionsausbeuten für O-Desmethyltramadol (rac-8) beim Ausschütteln wäßriger Lösungen mit organischen Lösungsmitteln (Verhältnis 1 : 1) in Abhängigkeit vom pH-Wert63 pH 5.0 pH 7.0 pH 9.0 pH 11.0 Chloroform 5% 7% 88 % 70 % Essigsäureethylester 6% 28 % 72 % n. b. Nach kontinuierlicher Extraktion lassen sich das gebildete Phenol (−)-8 und der nicht umgesetzte Ester (+)-15 durch Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1) an Kieselgel trennen. Das (1S,2S)-konfigurierte Phenol (−)-8 konnte so in 49 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 76 % und der (1R,2R)-konfigurierte, nicht umgesetzte Ester (+)-15 in 47 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 62 % erhalten werden (Tabelle 2.9, S. 52). Zur Angabe der Ausbeuten ist zu beachten, daß aufgrund des erreichten Umsatzes von 52 % die maximal erreichbare Ausbeute des Phenols 52 % und die des Esters 48 % beträgt. Die Selektivität der Reaktion läßt sich entsprechend durch einen E-Wert von 13 beschreiben. Der theoretische Verlauf der ee-Werte von Substrat und Produkt über den Umsatz der Reaktion ist in Abb. 2.20 dargestellt. Aus ihr geht hervor, daß ab einem Umsatz von ca. 70 % der nicht umgesetzte Ester (+)-15 enantiomerenrein vorliegt. Um die präparativen Möglichkeiten der Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltung zu demonstrieren, wurde daher in einem weiteren Versuch in einem präparativen Maßstab (+)-15 enantiomerenrein dargestellt.
- 66. 52 THEORETISCHER TEIL Abb. 2.20: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (+)-15 (S) und Produkt (−)-8 (P) bei einer Selektivität von E = 13. Dazu wurden dieselben Reaktionsbedingungen wie zuvor gewählt, nur diesmal die Reaktion nicht bei einem Umsatz von 50 % abgebrochen, sondern erst, wie aus Abb. 2.20 bestimmt, bei einem Umsatz von ca. 80 % (Tabelle 2.9 ). Der nicht umgesetzte Ester (+)-15 konnte nach Aufarbeitung so in einer Ausbeute von 10 % enantiomerenrein erhalten werden. Hiermit wurden sich die prinzipielle Möglichkeit einer kinetischen Racematspaltung zu nutze gemacht, daß das nicht umgesetzte Substrat selbst bei einer relativ schlechten Selektivität der Reaktion bei genügend hohem Umsatz, und somit auf kosten der Ausbeute, enantiomerenrein erhalten werden kann. Tabelle 2.9: PLE-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-15 im 3.5 mmol Maßstab (6.5 U/ml; Phosphatpuffer, pH 8.0; 10 % tert-Butanol) Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute Umsatz E zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Phenol (−)-8 2h 52 % 62 % 47 % 76 % 49 % 13 3h 85 % ≥ 98 % 10 % 27 % 64 % 7 Da zu Beginn der beiden Reaktionen jeweils eine starke Trübung zu beobachten war, die im Laufe der Reaktion verschwand, ist davon auszugehen, daß aufgrund der
- 67. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 53 geringen Löslichkeit des Esters rac-15, bei einem pH-Wert von 8.0, die Substratkonzentration nicht mehr wesentlich erhöht werden kann. Häufig stellen geringe Löslichkeiten von Substraten in Prozessen, die im wäßrigen Medium durchgeführt werden, eine Limitierung der Substratkonzentration dar, obwohl es auch einige hervorstechende Beispiele mit sehr hohen Substratkonzentrationen in biokatalytischen Prozessen gibt.175 Auffällig in Tabelle 2.9 ist auch, daß der ermittelte E-Wert für beide Reaktionen unter gleichen Reaktionsbedingungen mit steigendem Umsatz fällt, da dieser nach den in Kap. 2.3.1.1 gemachten Voraussetzungen für eine gegebene Reaktion konstant sein sollte. Eine Änderung des E-Werts im Verlauf der Reaktion stellt in der Regel eine Abweichungen von den gemachten Voraussetzungen dar. Eine Möglichkeit zur Erklärung dieses Verhaltens ist, daß die Vorraussetzung daß nur ein Enzym (aktives Zentrum) an der Reaktion beteiligt ist, nicht erfüllt ist. Der E-Wert stellt in diesem Fall ein gewichtetes Mittel aller Biokatalysatoren, die mit dem Substrat reagieren, dar. PLE besteht aus mehreren Isoenzymen, die alle in der Hydrolyse von rac-15 beteiligt sein können und unterschiedliche Aktivitäten und Selektivitäten zeigen. Ähnlich haben PIETZSCH et al. auch schon zur Erklärung von schwankenden E-Werten in der PLE-katalysierten Hydrolysen von Allen-Derivaten argumentiert.174 Zusammenfassend konnten die präparativen Möglichkeiten einer Enzym- katalysierten kinetischen Racematspaltung von phenolischen Tramadol-Analoga am Beispiel der PLE-katalysierten Hydrolyse von rac-15 gezeigt werden. Das Enzym PLE zeigt eine hinreichend gute Aktivität hinsichtlich dieses nicht natürlichen Substrates und katalysiert dessen Hydrolyse innerhalb von Stunden. Die Selektivität der Reaktion ist allerdings noch nicht zufriedenstellend. Bei einem E-Wert von 13 läßt sich der nicht umgesetzte Ester (+)-15 in Ausbeuten von maximal 30 % enantiomerenrein erhalten und das enantiomere Phenol (−)-8 läßt sich gar nicht mit ee-Wert von über 90 % erhalten. Eine entscheidende Verbesserung der Selektivität der PLE-katalysierten Hydrolyse von rac-15 konnte auch durch Variation des Cosolvens nicht erreicht werden. Um eine weitere Verbesserung in der Selektivität der Enzym-katalysierten Hydrolyse von rac-15 zu erreichen, wurde auf den Versuch verzichtet, die PLE-katalysierte
- 68. 54 THEORETISCHER TEIL Reaktion zu Optimieren, da hier die Aussicht durch eine weitere Variation des Cosolvens oder der Reaktionstemperatur zu einer gesteigerten Selektivität zu kommen, als gering betrachtet wurde. Vielmehr wurde die Möglichkeit untersucht, daß es eine oder sogar mehrere weitere Hydrolasen gibt, welche die Hydrolyse von rac-15 mit einer höheren Selektivität katalysieren (Abb. 2.21). OH O Pr OH Enzym O Me2N O Pr Phosphatpuffer- (+)-15 Me2N O Lösung + 10 % Cosolvens rac-15 RT Me2N OH OH (−)-8 Abb. 2.21: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15. Es wurde daher ein „Enzymscreening“ mit kommerziell verfügbaren Hydrolasen durchgeführt. Dazu wurden 5 Lipasen und drei weitere Esterasen in die Enzym- katalysierte Hydrolyse von rac-15 eingesetzt. Die Auswahl der Enzyme erfolgte auf Basis eines Lipasen-Screening Grundkits. Es wurde beachtet, daß die vorwiegend in der organischen Synthese verwendeten Enzyme (s. Kap. 2.3.2, S. 35) in dieser Auswahl vertreten sind. Als Standardbedingungen wurde ein wäßrigen Einphasensystem aus Phosphatpuffer, pH 7.0, mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens verwendet (Tabelle 2.10). Somit lassen sich erzielte Ergebnisse auch mit denen der bereits durchgeführten PLE-Katalyse vergleichen.
- 69. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 55 Tabelle 2.10: Enzymscreening zur Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem (Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol) Reaktions- ee Ester ee Phenol Enzym Umsatz E-Wert zeit (+)-15 (−)-8 Acetylcholinesterase 7.5 h 3% n. b. n. b. - (AChE; 145 U/ml); pH 8.0 Candida antarctica Lipase 3.8 h 8% 3% 3% 1.1 (CAL; 0.8 U/ml) Mucor miehei Lipase 19.5 h 25 % 11 % 30 % 2 (MML; 0.7 U/ml) Horse liver esterase 4.0 h 31 % 17 % 51 % 4 (HLE; 0.3 U/ml) Cholesterolesterase 24.0 h 90 % 72 % 39 % 5 (CE; 22 U/ml) Porcine pancreatic Lipase 2.5 h 66 % 19 % 78 % 10 (PPL; 21 U/ml) Burkholderia cepacia 22.0 h 35 % 75 % 67 % 11 Lipase (BCL; 15 U/ml) Candida rugosa Lipase 3.0 h 64 % 98 % 45 % 10 (CRL; 3 U/ml) Wie aus Tabelle 2.10 hervorgeht, wird die Hydrolyse des Esters rac-15 von den meisten eingesetzten Hydrolasen mit einer ausreichend hohen Reaktions- geschwindigkeit katalysiert. In diesem Enzym-Screening zeigten alle katalytisch aktiven Enzyme die gleiche Enantiopräferenz, es wurde, wie schon zuvor in der PLE-Katalyse beobachtet, bevorzugt das (−)-Enantiomer des Esters zum aromatischen Alkohol umgesetzt. Die Selektivitäten, die unter den Standardbedingungen des Enzym-Screenings erreicht werden konnten, waren allerdings gering und für eine angestrebte Racematspaltung im präparativen Maßstab zu niedrig. Nur drei Lipasen katalysieren die Reaktion mit einer ähnlichen Selektivität wie die zuvor getestete PLE. Von mehreren Autoren wird beschrieben, daß in Reaktionen mit Horse liver esterase (HLE) als Katalysator geringfügig höhere ee-Werte als in der entsprechenden Katalyse mit PLE erreicht werden können.176 In der Katalyse der Hydrolyse des
- 70. 56 THEORETISCHER TEIL Esters rac-15 konnte diese Beobachtung allerdings nicht bestätigt werden, da die in der HLE-katalysierten Reaktion erzielte Selektivität geringer ist, als die der PLE katalysierten Reaktion. Eine höhere Selektivität, die eine in einem präparativ nutzbaren Rahmen durchführbare Racematspaltung zulassen würde, war insgesamt nicht zu beobachten. Ein weiteres Austesten von neuen Hydrolasen wurde nicht durchgeführt, da die bisher getesteten Hydrolasen als repräsentativ betrachtet wurden. Natürlich ist nicht auszuschließen, daß unter den kommerziell oder andersseitig verfügbaren Enzymen welche sind, die eine höhere Selektivität zeigen, doch sollte ein Enzym nach den in Kap. 2.3.2 (S. 35) gemachten Voraussetzungen über einen langen Zeitraum in ähnlicher Präparation und Qualität kommerziell verfügbar sein. Diese Voraussetzung wurde für weitere Enzyme nicht ohne weiteres als erfüllt betrachtet. Statt dessen wurde daraufhin versucht die Reaktionsbedingungen für eine Lipasen- katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 zu optimieren. Schon 1958 beschrieben SARDA und DESNUELLE das für Lipasen typische Phänomen der „Grenzflächenaktivierung“.177 Lipasen haben im allgemeinen nur eine geringe Aktivität gegenüber nichtassoziierten Substraten, die oberhalb der kritischen Micellenkonzentration des Substrats steil ansteigt. Lipasen benötigen zur Aktivierung also häufig aggregierte Moleküle, wie sie in einer Emulsion oder einer mizellaren Lösung vorliegen. 1990 konnte durch Röntgenstrukturanalyse der beiden ersten Lipasenstrukturen der Mechanismus aufgeklärt werden178: Die „Grenzflächen- aktivierung“ der Lipasen beruht auf einem amphiphilen Peptidsegment, das wie ein Deckel das aktive Zentrum des Enzyms bedeckt.179 Dieser scheint in Gegenwart einer Grenzfläche im Zuge einer Konformationsänderung aufzuklappen und so dem Substrat den Zugang zum aktiven Zentrum zu ermöglichen.180 Außerdem entsteht beim Öffnen des Deckels eine große hydrophobe Fläche, an die das Substrat binden kann.181 Allerdings zeigen nicht alle Lipasen diese Grenzflächenaktivierung. Beispielsweise weist zwar die Candida antarctica Lipase (Typ B), deren Tertiärstruktur bekannt ist, eine amphiphilen Deckelstruktur auf, aber keine Grenz- flächenaktivierung.182 Um eine möglichst große Grenzfläche zu erhalten, wurde daher statt eines wäßrigen Einphasensystems eine Emulsion aus Wasser und organischem Lösungsmittel, ein
- 71. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 57 wäßrig-organisches Zweiphasensystem, als Reaktionsmedium für eine Lipasen- katalysierte Reaktion ausgewählt. Ein häufig in der Literatur verwendetes wäßrig- organisches Zweiphasensystem besteht aus Phosphatpuffer und tert-Butyl- methylether im Verhältnis 1 : 1. Die Verwendung des tert-Butyl-methylethers hat den Vorteil, daß dieser Ether keine Peroxide bildet und somit verhältnismäßig gefahrlos eingesetzt werden kann. In einer feinen Emulsion aus Phosphatpuffer und tert-Butyl-methylether wurde daraufhin eine Candida rugosa Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 durchgeführt (Tabelle 2.11). Die Reaktionsgeschwindigkeit und somit die Aktivität der Candida rugosa Lipase im wäßrig-organischen Zweiphasensystem ist ähnlich der im wäßrigen Einphasensystem. Eine Aktivierung in Form einer erhöhten Reaktionsgeschwindigkeit ist also nicht zu beobachten. Die Selektivität der Reaktion ist aber wesentlich größer als im Einphasensystem. So konnte das gebildete Phenol (−)-8 mit einem ee-Wert 85 % in 30 % Ausbeute und der nicht umgesetzte Ester (+)-15 mit ee-Wert 75 % in 64 %Ausbeute isoliert werden. Dies entspricht einer Selektivität von E = 27. Dieser Wert erreicht nahezu den angestrebten Bereich eines Wertes von E ≥ 30, welcher für eine präparativ nutzbare Reaktion Voraussetzung ist. Diese erhöhte Selektivität kann auf eine geringe Konformationsänderung der Lipase in der Grenzfläche zurückgeführt werden. Diese Konformationsänderung bewirkt in erster Linie, das sich der Deckel über dem aktiven Zentrum öffnet180, sie bewirkt aber auch eine Veränderung der Polaritäten im aktiven Zentrum und somit der potentiellen Bindungsstellen für das Substrat.181 Der vorhergehende Versuch wurde mit einer Candida rugosa Lipase durchgeführt, die eine spezifische Aktivität von 2.4 U/mg hatte. Dieser Wert stellt für dieses Enzym einen niedrigen dar und bedeutet, daß in dieser Enzym-Präparation neben der CRL auch andere Enzyme und nicht katalytisch-aktive Proteine vorliegen, die auf die Katalyse Einfluß nehmen können. Um einen etwaigen Einfluß anderer Proteine auszuschließen oder wenigstens zu minimieren, wurde daraufhin eine weiter aufgereinigte Präparation der Candida rugosa Lipase mit einer spezifischen Aktivität von 37.0 U/mg in die Enzym-katalysierte Hydrolyse von rac-15 im wäßrig- organischen Zweiphasensystem eingesetzt (Tabelle 2.11). Diese aufgereinigte Candida rugosa Lipase ist ebenfalls kommerziell verfügbar.
- 72. 58 THEORETISCHER TEIL Tabelle 2.11: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem (2.7 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; MTBE; 1 : 1) spezifische Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E-Wert Aktivität 2.4 U/mg 3.25 h 51 % 75 % 85% 27 37.0 U/mg 5.25 h 33 % 58 % 90 % 34 Aus dieser Reaktion konnte das gebildete Phenol (−)-8 mit einem ee-Wert 90 % in 27 % Ausbeute und der nicht umgesetzte Ester (+)-15 mit ee-Wert 58 % in 58 % Ausbeute isoliert werden. Die Selektivität dieser Reaktion kann mit einem E-Wert von 34 beschrieben werden. Diese weitere Erhöhung der Selektivität kann durch den Ausschluß von Nebenaktivitäten in der Enzympräparation erklärt werden. In Abb. 2.22 ist der theoretische Verlauf der ee-Werte von Substrat und Produkt für diesen E-Wert gegen den Umsatz aufgetragen. Abb. 2.22: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (+)-15 (S) und Produkt (−)-8 (P) bei einer Selektivität von E = 34. Die erzielte Selektivität von E = 34 ist die höchste, die in einer Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltung von Tramadol-Anolga mit phenolischer Hydroxylgruppe bisher erreicht worden ist. Sie liegt zudem in dem angestrebten Bereich von E ≥ 30. Dies bedeutet, wie auch in Abb. 2.22 zu erkennen ist, daß ab einem Umsatz von ca.
- 73. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 59 60 % der nicht umgesetzte Ester (+)-15 enantiomerenrein vorliegt und in einer maximalen Ausbeute von ca. 40 % erhalten werden kann. Es konnte somit gezeigt werden, daß eine Enzym-katalysierte Hydrolyse eines Esters auf Tramadol-Basis unter Einbezug einer phenolischer Hydroxylgruppe mit hoher Selektivität und Aktivität möglich ist. Dies, obwohl die vom Enzym anzugreifende phenolische Hydroxylgruppe mehrere C-Atome von den Stereo- zentren der Verbindungen entfernt ist. Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Phenols 8 erfolgte durch Vergleich der Drehwerte mit bereits publizierten.91,183 Von der Grünenthal GmbH ist für das Hydrochlorid des (+)-(R,R)-3-(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy- cyclohexyl)-phenols ein Drehwert von [α ] 20 = + 5.4º (c = 1.0, MeOH) veröffentlicht D worden.91 Hierbei ist die Bestimmung der Absolutkonfiguration des (+)-8⋅HCl durch Röntgenstrukuranalyse erfolgt.184 Die Bestimmung der Absolutkonfigurationen der Ester 15 und 16 erfolgte in Analogie zu der des Phenols 8. 2.4.1.2 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3- (2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) Neben den Effekten des Cosolvens auf die Enzym-katalysierte Hydrolyse von Estern des O-Desmethyltramadols (rac-8), ist auch der Einfluß der Acylgruppe des Substrats auf die Aktivität oder Selektivität der enzymatischen Reaktion von Interesse. Im allgemeinen stellt für Lipasen die einzige Limitierung hinsichtlich des akzeptierten Substratspektrums ihre begrenzte Eignung für die Umsetzung raumerfüllender Acylgruppen dar: gemäß dem Vorbild der Triglyceride werden lineare aliphatische Acylgruppen besser umgesetzt als z.B. Arene.101,110,185
- 74. 60 THEORETISCHER TEIL Im Gegensatz zu Lipasen akzeptiert die PLE als Esterase keine stark hydrophoben Substrate wie z.B. Triglyceride, sondern idealerweise wasserlösliche Ester. Daher ergibt sich hinsichtlich der Substratstruktur für die PLE die Einschränkung kurzkettige lineare aliphatische Acylgruppen einzusetzen. So werden Acetate von Alkoholen am häufigsten von der PLE hydrolysiert. Längerkettige Acylgruppen werden nur in Ausnahmefällen als Substrate akzeptiert. Dieser Unterschied in dem Substratspektrum zeigt auch das sicherste Merkmal, um eine Esterase als „Lipase“ zu klassifizieren: die Fähigkeit langkettige Glycerinester zu hydrolysieren.101,185,186 Ebenfalls unter dem Aspekt der Wirtschaftlichkeit eines möglichen enzymatischen Teilschrittes in der industriellen Synthese eines Tramadol-Analogons sollte die zu verwendende Acylgruppe möglichst kurz sein. Denn das Substrat muß zuvor in einem separaten Schritt verestert werden, wobei eine kürzere Acylgruppe eine geringere einzusetzende Menge bedeutet. In der anschließenden Racematspaltung wird der enzymatisch hydrolysierte Acylrest verworfen, dabei reduziert eine kürzere Acylgruppe die zuverwerfende Masse. Von diesen Voraussetzungen ausgehend wurde daher der (±)-Essigsäure-3- (2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) synthetisiert. Wie bereits in Kap. 2.2 auf S. 21 dargestellt wurde, ist rac-16 im Vergleich zu rac-15 hydrolyselabil. Die Stabilität gegen Autohydrolyse bei pH 7.0 ist noch ausreichend groß, hingegen bei pH 8.0 nicht mehr. Es können erhebliche Mengen an Hydrolyseprodukt nach 16 h detektiert werden (Tabelle 2.12). Tabelle 2.12: Überprüfung der Hydrolysestabilität von rac-16 in Phosphatpuffer- Lösung in Anwesenheit von 10 % tert-Butanol pH-Wert Reaktionszeit Hydrolyseprodukt 7.0 2h 0.1 % rac-8 8.0 2h 1.2 % rac-8 8.0 16 h 15.0 % rac-8 Das Substrat rac-16 wurde daraufhin in die Enzym-katalysierte Racematspaltung eingesetzt (Abb. 2.23). Aufgrund der mangelnden Hydrolysestabilität von rac-16
- 75. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 61 wurde ein pH-Wert von 7.0 gewählt und zur Vergleichbarkeit mit den bisherigen Ergebnissen als Reaktionsmedium das wäßrige Einphasensystem mit 10 % tert- Butanol als Cosolvens. Als Enzyme wurden zunächst PLE und CRL aufgrund der bisher mit diesen Enzymen erzielten Ergebnisse eingesetzt (Tabelle 2.13, Zeilen 1 und 2). OH O OH Enzym O Me2N O Phosphatpuffer- (+)-16 Me2N O Lösung + 10 % Cosolvens rac-16 RT Me2N OH OH (−)-8 Abb. 2.23: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16. Aus Tabelle 2.13 geht hervor, daß die CRL-katalysierte Reaktion wenig langsamer verläuft, als die des entsprechenden Buttersäureesters rac-15 (Tabelle 2.10). Die Selektivität der CRL-katalysierten Hydrolyse von rac-16, ausgedrückt in einem E-Wert von 2, ist erheblich geringer als die Selektivität, die mit dem Ester rac-15 als Substrat beobachtet wurde. Dies Ergebnis deutet darauf hin, daß langkettigere Acylreste, wie in dem Ester rac-15 vorhanden, bevorzugt von dieser Lipase umgesetzt werden. Auf eine Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem als Reaktionsmedium wurde daraufhin verzichtet. Die PLE-katalysierte Hydrolyse von rac-16 bei pH 7.0 verläuft mit ähnlicher Reaktionsgeschwindigkeit wie die Hydrolyse des Buttersäureesters rac-15 bei pH 8.0 nur mit geringerer Selektivität. Die Aktivität des Enzyms PLE ist unter standardisierten Aktivitätstestbedingungen allerdings auch bei pH 8.0 größer als bei pH 7.0. Aus diesem Grund wurde auch eine PLE-katalysierte Hydrolyse von rac-16 bei pH 8.0 durchgeführt, obwohl das Substrat bei diesem pH-Wert entsprechend hydrolyselabiler ist (Tabelle 2.13, Zeile 3).
- 76. 62 THEORETISCHER TEIL Tabelle 2.13: Enzym-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-16 (Phosphatpuffer; 10 % tert-Butanol) Reaktions ee Ester ee Phenol Reaktionsbedingungen Umsatz E-Wert zeit (+)-16 (−)-8 Candida rugosa Lipase 7.25 h 45 % 4% 26 % 2 (CRL; 2.4 U/ml) pH 7.0 Schweineleber-Esterase 1.75 h 36 % 35 % 52 % 4 (PLE; 3.3 U/ml), pH 7.0 Schweineleber-Esterase 0.75 h 31 % 50 % 74 % 10 (PLE; 2.6 U/ml), pH 8.0 Bei pH 8.0 verläuft die PLE-katalysierte Hydrolyse von rac-16 entsprechend der höheren Aktivität des Enzyms auch schneller als bei pH 7.0. Nach einer Reaktionszeit von 0.75 h werden ca. 30 % Umsatz erreicht, bei pH 7.0 wurde zum Erreichen des entsprechenden Umsatzes ca. 1 h länger benötigt. Die kurze Reaktionszeit begünstigt einen höheren Enantiomerenüberschuß des gebildeten Phenols (−)-8, da die Autohydrolyse von rac-16 vergleichsweise langsam ist und somit bei kurzen Reaktionszeiten wenig racemisches Phenol entsteht (<1 % in 1 h nach Tabelle 2.12). Somit ist auch trotz der geringen Hydrolysestabilität von rac-16 eine relativ hohe Selektivität von E = 10 in dieser Reaktion möglich. Die beobachtete Selektivität liegt im Rahmen der Selektivität, die auch schon in der PLE- katalysierten Hydrolyse des entsprechenden Buttersäureesters rac-15 erzielt wurde (Tabelle 2.6). Verglichen mit der Hydrolyse des Buttersäureesters rac-15 verläuft die Hydrolyse des kurzkettigeren Acetats rac-16 aber mit einer höheren Aktivität. Dies Ergebnis bestätigt die zuvor gemachte Aussage, daß Acetate aufgrund ihres kurzen Acylrests und der damit erhöhten Polarität eine größere Ähnlichkeit mit den natürlichen Substraten besitzen und somit die geeigneteren Substrate für die PLE- katalysierte Hydrolyse sind. Es wurden allerdings keine weiteren Untersuchungen zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Essigsäureesters rac-16 durchgeführt. Trotz der Hydrolyselabilität dieser Verbindung lassen sich zwar enzymatische Reaktionen mit einer Selektivität im Rahmen von hydrolysestabilen Substraten im Labormaßstab durchführen, aber eine Umsetzung in einen größeren Maßstab ist nicht sinnvoll. Hier würde der Enzym-
- 77. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 63 katalysierten kinetischen Racematspaltung von stabilen Verbindungen wie rac-15, die einen Zugang zu dem gleichen Phenol (−)-8 gestatten, der Vorzug gegeben. Zusammenfassend stellt der Buttersäureester (C4) von O-Desmethyltramadol (rac-15) ein Substrat dar, welches gleichermaßen von Lipasen und Esterasen akzeptiert und umgesetzt wird. Ausgehend von diesem Substrat führen kurzkettigere Ester wie Essigsäureester (C2) rac-16 zu Substraten, die von der Esterase PLE mit größerer Aktivität bei ähnlicher Selektivität wie der Buttersäureester umgesetzt werden, da es sich um einen bevorzugteren Acylrest im Substrat handelt. Von Lipasen, wie der CRL, werden diese Substrate allerdings mit geringerer Aktivität und auch Selektivität umgesetzt, da es sich nicht um für Lipasen typische Acylreste handelt. Des weiteren sind diese Ester schon so aktiviert, daß sie nur eine begrenzte Stabilität gegen Autohydrolysereaktionen aufweisen, welches gerade im Hinblick auf eine Racematspaltung in einem präparativen Maßstab ein entscheidender Nachteil ist. Eine weitere Verlängerung der Acylgruppe über die C4-Säure hinaus, würde zwar zu von Lipasen bevorzugteren Substraten führen, aber auch den Nachteil einer ungünstigeren Bilanz für die enzymatische kinetische Racematspaltung beinhalten. Aus anwendungsbezogener Sicht ist daher ein möglichst einfacher kurzer Acylrest zu verwenden. Oft haben auch aktivierte Ester wie Halogen- oder Methoxycarbonsäureester einen günstigen aktivierenden Einfluß auf die Enzym-katalysierte Hydrolyse. Die Darstellung eines Choressigsäureesters von O-Desmethyltramadol gelang aber nicht, da diese Verbindung so reaktiv war, daß sie unter gaschromatographischen und flüssigchromatographischen Bedingungen nicht stabil war. 2.4.1.3 Enzym-katalysierte Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3- (2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8) Die Hydrolyse eines Esters von rac-8 zur Gewinnung der Enantiomeren setzt die Darstellung dieser Verbindung voraus, was einen, wenn auch geringen, Aufwand
- 78. 64 THEORETISCHER TEIL darstellt. Einfacher wäre eine direkte enzymatische Acylierung von rac-8. Dies vermag die Enzym-katalysierte Transacylierung im organischen Medium zu leisten. Zudem kann auch in diesem Medium eine Racematspaltung von Verbindungen gelingen, deren Ester hydrolyselabil sind. Auch haben im organischen Medium hydrophobe Verbindungen eine erhöhte Löslichkeit, so daß hier Substrate eingesetzt werden können, die sonst nicht im wässerigen Milieu umgesetzt werden können. Ein weiterer interessanter Aspekt ist, daß in der enzymatischen Transacylierung bevorzugt das Enantiomer acyliert wird, welches in der Umkehrreaktion der enzymatischen Hydrolyse bevorzugt hydrolysiert wird. Somit sollte in der enzymatischen Transacylierung von rac-8 bevorzugt das (−)-Enantiomer acyliert werden, da in der hydrolytischen Reaktion (−)-8 gebildet worden ist (Abb. 2.21). Neben dem (−)-Ester bleibt das nicht umgesetzte (+)-8 in der Reaktion als Produkt zurück (Abb. 2.25). Enzym-katalysierte Transacylierung und Hydrolyse sind daher unter dem Blickpunkt der Synthese enantiokomplementär. Unter diesen Gesichtspunkten ist die Entwicklung einer Methodik zur enzymatischen Transacylierung von rac-8, obwohl Bedingungen zu einer selektiven Enzym- katalysierten Hydrolyse bekannt sind, durchaus von großem Interesse und auch anwendungsbezogen. Da die Hydrolyse von Estern des O-Desmethyltramadols durch verschiedene Hydrolasen katalysiert wird, sollte die Umkehrreaktion, die Transacylierung im organischen Medium, ebenfalls von diesen Enzymen, bei Wahl der richtigen Reaktionsbedingungen, katalysiert werden können. In eigenen Vorarbeiten gelang es allerdings nicht, rac-8 in einer PLE-katalysierten Reaktion mit Vinylbutyrat (4 Äquiv.) in Toluol als Lösungsmittel zu acylieren (Abb. 2.24).80 Es wurde zwar in dieser Reaktion eine Katalysatorspezies aus MPEG/PLE gewählt, die eine höhere Aktivität im organischen Lösungsmittel besitzt als native PLE81,82, doch ist das Enzym PLE im allgemeinen wesentlich weniger aktiv im organischen Medium als Lipasen.5,6 Eine Lipasen-katalysierte Transacylierung von rac-8 sollte daher trotz dieser Ergebnisses möglich sein.
- 79. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 65 Me2N OH O Pr OH MPEG/PLE OH O (−)-15 Vinylbutyrat + Me2N Toluol OH rac-8 RT OH Me2N (+)-8 Abb. 2.24: Versuch zur PLE-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8. INAGAKI et al. führten die bereits auf S. 43 erwähnte enzymatische Acylierung des 1,1´-Binaphthalin-2,2´-diols (rac-36) mit 20 Äquiv. eines Vinylesters in Diisopropyl- ether mit 10 % Aceton als Lösungsmittel mit guter Selektivität (E > 60) durch.162 Der Zusatz an Aceton wurde benötigt, um das Substrat zu lösen, welches in reinem Diisopropylether nur mäßig löslich war. Von einem Einfluß des Acetons auf die Aktivität des Enzyms oder die Selektivität der Reaktion wird nicht berichtet. Von diesen Reaktionsbedingungen ausgehend wurden für eine Enzym-katalysierte Transacylierung des Substrats rac-8 2 Äquiv. Vinylpropionat als Acylierungsmittel und das Lösungsmittel Diethylether als Reaktionsbedingungen ausgewählt (Abb. 2.25). Me2N OH O Et OH Lipase OH O Vinylpropionat (−)-15 + Me2N Diethylether RT OH rac-8 OH Me2N (+)-8 Abb. 2.25: Enzym-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-8. Es wurden sieben Lipasen in die enzymatische Transacylierung unter den genannten Bedingungen eingesetzt (Tabelle 2.14). Um den Verbrauch an Substrat und eingesetzten Reagenzien möglichst gering zu halten, wurden alle Reaktionen in einem 0.25 mmol Maßstab in 5 ml Lösungsmittel durchgeführt.
- 80. 66 THEORETISCHER TEIL Tabelle 2.14: Versuche zur Transacylierung des Phenols rac-8 in Diethylether Reaktionsbedingungen Reaktions- Enzym Umsatz (Äquiv.) zeit Porcine pancreatic Lipase Vinylpropionat (2) 14 d 0% (PPL; 335 U/ml) Burkholderia cepacia Lipase Vinylpropionat (2) 14 d 0% (BCL, 120 U/ml) Candida rugosa Lipase Vinylpropionat (2) 14 d 2% (CRL; 29 U/ml) Rhizopus niveus Lipase Vinylpropionat (2) 14 d 0% (0.026 U/ml) Candida antarctica Lipase Vinylpropionat (2) 14 d 0% (CAL; 3.2 U/ml) Rhizopus arrhizus Lipase Vinylpropionat (2) 14 d 0% (0.02 U/ml) Aspergillus niger Lipase Vinylpropionat (2) 14 d 0% (1 U/ml) Keine der in Tabelle 2.14 eingesetzten Lipasen katalysiert die Transacylierung von rac-8 unter den gewählten Reaktionsbedingungen. Da die Enzyme CRL, BCL und PPL in der Hydrolyse von rac-15 eine hohe Aktivität und eine moderate Selektivität zeigen, ist davon auszugehen, daß diese Enzyme auch in der Acylierung von rac-8 aktiv sein sollten. Dies deutet daraufhin, daß für das Enzymscreening in Tabelle 2.14 ungeeignet Reaktionsbedingungen gewählt wurden. Hiervon ausgehend wurde daraufhin, um bessere Bedingungen zu finden, eine ausgewählte Lipase (PPL) mit 5 Äquiv. Vinylacetat in verschiedenen Lösungsmitteln eingesetzt (Tabelle 2.15).
- 81. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 67 Tabelle 2.15: Versuche zur PPL-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 unter verschiedenen Reaktionsbedingungen (335 U/ml) Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (Äquiv.) Vinylacetat (5), 28 d 2% Dichlormethan (H2O ges.) Vinylacetat (5), 28 d 1% Trichlormethan (H2O ges.) Vinylacetat als Solvens 12 d 6% Aus Tabelle 2.15 geht hervor, daß in den polaren Lösungsmitteln Dichlormethan und Trichlormethan ebenfalls keine nennenswerte Acylierung zu beobachten ist. In reinem Vinylacetat als Transacylierungsmittel und Lösungsmittel, was einem Überschuß von 252 Äquiv. entspricht, ist eine geringe Enzym-katalysierte Bildung des Acetats 16 nach 2 Wochen zu beobachten. Aufgrund des geringen Umsatzes wurde keine Enantiomerenüberschußbestimmung durchgeführt. Die in Vinylacetat als Solvens erzielte enzymatische Acylierung von O-Desmethyltramadol bestätigt die zuvor gemachte Aussage, daß eine Acylierung von rac-8 unter geeigneten Bedingungen möglich ist. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist aber extrem langsam. Es wurden daher die beiden Lipasen BCL (Tabelle 2.16) und CRL (Tabelle 2.17 und Tabelle 2.18), die in der Hydrolyse von rac-15 die größten Selektivitäten erreichten, ebenfalls unter diesen Reaktionsbedingungen in die Transacylierung von rac-8 eingesetzt.
- 82. 68 THEORETISCHER TEIL Tabelle 2.16: BCL-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-8 (120 U/ml) Reaktionsbedingungen Nach E-Wert (Äquiv.) 28 d Umsatz 3% Vinylacetat (5), n. b. ee Ester (−)-16 - Diisopropylether ee Phenol (+)-8 n. b. Umsatz 18 % Vinylacetat als Solvens ee Ester (−)-16 10 % 1.2 ee Phenol (+)-8 2% Wie in der PPL-katalysierten Transacylierung von rac-8 wird auch mit dem Enzym BCL eine Transacylierung mit Vinylacetat als Lösungsmittel beobachtet. Entsprechend dem zuvor erzielten Ergebnis verläuft auch die BCL-katalysierte Transacylierung mit einer geringen Reaktionsgeschwindigkeit. Ein Umsatz von 18 % ist erst nach 3 Wochen zu beobachten (Tabelle 2.16). Es wird der (1S,2S)- konfigurierte Ester (−)-16 mit einem ee-Wert von 10 % gebildet. Die Racemat- spaltung verläuft allerdings unselektiv (E = 1.2). Mit dem Enzym CRL wurden in der Hydrolyse von rac-15 die besten Ergebnisse erzielt. In der enzymatischen Transacylierung ist, wie bei allen zuvor getesteten Enzymen, kein nennenswerter Umsatz von rac-8 in den als Lösungsmittel eingesetzten Ethern MTBE und Diisopropylether zu beobachten (Tabelle 2.17). In Vinylacetat als Lösungsmittel ist ein Umsatz von 36 % nach 3 Wochen zu beobachten. Die Verwendung des Acylierungsmittels nicht nur als Reagenz, sondern auch als Solvens, führt somit bei allen eingesetzten Lipasen zu einer Acylierung des Phenols rac-8, wenn auch mit relativ langsamer Reaktionsgeschwindigkeit. Die in dieser Reaktion erzielte Selektivität ist zwar die bisher höchste, die zu beobachten war, sie ist aber ausgedrückt in einem E-Wert von 3 als schlecht zu bewerten.
- 83. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 69 Tabelle 2.17: CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinyl- acetat als Acylierungsmittel (14 U/ml) Reaktionsbedingungen Nach E-Wert (Äquiv.) 28 d Umsatz 2% Vinylacetat (5), n. b. ee Ester (−)-16 - Diisopropylether ee Phenol (+)-8 n. b. Umsatz 8% Vinylacetat (5), n. b. ee Ester (−)-16 - MTBE ee Phenol (+)-8 n. b. Umsatz 36 % Vinylacetat als Solvens ee Ester (−)-16 38 % 3.0 ee Phenol (+)-8 21 % Umsatz 66 % Vinylacetat (5), 33 % ee Ester (−)-16 2.5 Dichlormethan ee Phenol (+)-8 26 % Interessanterweise kann mit dem Lösungsmittel Dichlormethan in der CRL- katalysierten Transacylierung von rac-8 mit Vinylacetat die größte Aktivität des Enzyms beobachtet werden. Unter diesen Bedingungen werden 66 % Umsatz nach 3 Wochen erreicht. Eine Steigerung der Selektivität der CRL-katalysierten Transacylierung verglichen mit dem Solvens Vinylacetat ist aber nicht zu beobachten. Von GAIS et al. ist in Untersuchungen zur MPEG/PLE-katalysierten Transacylierung racemischer sekundärer Alkohole mit Vinylacetat, -propionat und –butyrat beobachtet worden, daß mit zunehmender Kettenlänge des Acyldonors die Geschwindigkeit und die Selektivität der Transacylierung zunehmen.81,84 Aus diesem Grund wurde Vinylbutyrat als Acylierungsmittel in die CRL-katalysierte Transacylierung von rac-8 unter den bisher geeigneten Bedingungen, Acylierungsmittel oder Dichlormethan als Lösungsmittel, eingesetzt (Tabelle 2.18). Mit Dichlormethan als Solvens und
- 84. 70 THEORETISCHER TEIL Vinylbutyrat als Acylierungsmittel ist allerdings nicht wie zuvor im Falle des Vinylacetats ein Umsatz zu beobachten. Die CRL-katalysierte Reaktion mit Vinylbutyrat als Acylierungs- und Lösungsmittel hingegen verläuft mit einer ähnlichen geringen Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität wie die Reaktion in Vinylacetat. Eine Steigerung wie im Falle der sekundären Alkohole in der MPEG/PLE-Katalyse ist nicht zu beobachten. Tabelle 2.18: CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinyl- butyrat als Acylierungsmittel (37 U/ml) Reaktionsbedingungen nach E-Wert (Äquiv.) 17 d Umsatz 4% Vinylbutyrat (5), n. b. ee Ester (−)-15 - Dichlormethan ee Phenol (+)-8 n. b. Umsatz 15 % Vinylbutyrat als Solvens ee Ester (−)-15 28 % 2 ee Phenol (+)-8 15 % Mit dem Acylierungsmittel als Solvens ist eine Reaktionsbedingung gefunden worden, in der eine Lipasen-katalysierte Transacylierung möglich ist, wenn auch mit geringer Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität. Es lag nun nahe die PLE ebenfalls unter diesen neuen Reaktionsbedingungen einzusetzen. Zusätzlich wurden neben dem Acylierungsmittel noch Di- und Trichlormethan als Lösungsmittel eingesetzt (Tabelle 2.19). Da native PLE im organischen Medium nur eine geringe Aktivität besitzt, wurde MPEG/PLE als Katalysatorpräparation eingesetzt (vgl. Kap. 2.1). Wie aus Tabelle 2.19 hervorgeht ist eine PLE-katalysierte Acylierung von rac-8 in Di- oder Trichlormethan als Lösungsmittel nicht durchführbar. In Vinylpropionat als Solvens ist eine PLE-katalysierte Transacylierung zu beobachten. Somit ist es prinzipiell gelungen die für Lipasen gefundenen Reaktionsbedingungen auf die PLE zu übertragen, allerdings ist die Reaktionsgeschwindigkeit wie in Fall der Lipasen äußert gering.
- 85. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 71 Tabelle 2.19: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (Äquiv.) Vinylpropionat (5), 21 d 0% Dichlormethan Vinylpropionat (5), 21 d 0% Trichlormethan Vinylpropionat als Solvens 4d 5% Zusammenfassend ist es gelungen, Reaktionsbedingungen zu finden, unter denen eine Enzym-katalysierte Acylierung des Phenols rac-8 durchführbar ist. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist allerdings in allen Fällen sehr langsam. Die bisher erzielten Reaktionszeiten von mehreren Wochen sind wenig ansprechend und für eine präparative Racematspaltung nicht akzeptabel. Zudem sind keine geeigneten Reaktionsbedingungen für eine selektive enzymatische Racematspaltung des Phenols rac-8 gefunden worden. Die bisher erzielten Selektivitäten mit E-Werten von 1 bis 3 sind ebenfalls nicht für eine Racematspaltung des Phenols rac-8 im präparativen Sinne verwendbar. Die höchste Selektivität in der enzymatischen Acylierung von rac-8 wird mit der Candida rugosa Lipase beobachtet, die somit nicht nur in der Hydrolyse des Buttersäureesters von rac-8 das geeigneteste Enzym darstellt, sondern auch das für die Umkehrreaktion, die Transacylierung von rac-8. Daß die enzymatischen Hydrolysen mit hoher Selektivität katalysiert werden, die Transacylierungen im organischen Medium jedoch nicht, kann gerade im Hinblick auf die zusätzlich noch sehr langsame Reaktion dadurch erklärt werden, daß die eingesetzten Enzyme im wäßrigen Medium flexibler sind. Eine Anpassung der Struktur des aktiven Zentrums an unterschiedliche Strukturmerkmale des Substrats bei der Bildung des Substrat-Enzym-Komplexes im Sinne eines „induced fit“ ist im wäßrigen Milieu erleichtert, da Wassermoleküle als „molekulares Schmiermittel“ fungieren können.150,187,188 Auch kann die unterschiedliche Solvatation von Reaktanden, hier gerade des sehr polaren Phenols, und von Übergangszuständen
- 86. 72 THEORETISCHER TEIL im organischen und wäßrigen Medium ein Grund für die unterschiedlichen Selektivitäten sein. Die in der enzymatischen Transacylierung erzielten Ergebnisse sind auch unter dem Blickpunkt zu sehen, daß die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Reaktionen erst einen Anfang in der Untersuchung der enzymatischen Acylierung von Tramadol- Analoga mit phenolischer Hydroxylgruppe darstellen. Umfassendere Untersuchungen zu Reaktionsparametern wie Acylierungsreagenz (s. Kap. 2.3.2.2), Lösungsmitteleinfluß und Wasseraktivität können Reaktionsbedingungen aufzeigen, unter denen eine selektive Enzym-katalysierte Racematspaltung von phenolischen Substraten wie rac-8 durchaus möglich ist.
- 87. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 73 2.4.1.4 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3- (3-dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) Ein neues Tramadol-Analoga, dessen Entwicklung in der GRÜNENTHAL GmbH mit vielversprechenden Resultaten betrieben wird, ist das (±)-(2RS,3RS)- 4-Dimethylamino-2-(3-methoxyphenyl)-3-methyl-butan-2-ol (rac-38, Abb. 2.26).189 Es unterscheidet sich vom Tramadol (rac-7) dadurch, daß es statt einem Cyclohexylring eine offenkettige Struktur besitzt. Über die analgetische Aktivität offenkettiger Tramadolderivate ist jüngst von BUSCHMANN, SUNDERMANN und MAUL berichtet worden.46 Sie stellen Untersuchungen über die Aktivität der Enantiomeren des 3-(3-Dimethylamino-1-ethyl-1-hydroxy-2-methyl-propyl)-phenols vor. Diese Wirkstoffe unterscheiden sich von rac-38 durch eine um ein C-Atom verlängerte Kette an der tertiären OH-Gruppe. Außerdem wird direkt das Phenol untersucht, welches im Falle des rac-38 wahrscheinlich ebenfalls in vivo als Metabolit gebildet wird. OH OMe Me2N rac-38 Abb. 2.26: Racemisches 4-Dimethylamino-2-(3-methoxyphenyl)-3-methyl-butan- 2-ol, ein Entwicklungskandidat der GRÜNENTHAL GmbH mit offenkettiger Struktur. Die Struktur des rac-38 bietet ebenso wie das Tramadol keinen direkten Angriffs- punkt für eine Enzym-katalysierte Racematspaltung. Nach O-Demethylierung steht aber auch hier die aromatische Hydroxylgruppe zur Verfügung. Es sollte daher versucht werden, eine Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung mit diesem offenkettigem Phenol (rac-11) durchzuführen. Zuerst wurde die enzymatische Hydrolyse des Buttersäureesters von rac-11 untersucht, da im Falle des O-Desmethyltramadols in der Hydrolyse die besten Ergebnisse in der Racematspaltung erzielt worden waren. Es wurde der racemische Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) in die Enzym-katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.27). Als Reaktions-
- 88. 74 THEORETISCHER TEIL bedingungen wurden die bisherigen Standardreaktionsbedingungen, wäßriges Einphasensystem mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens bei Raumtemperatur, gewählt. Als Enzyme wurden zunächst die bisher in der Hydrolyse von Estern des O-Desmethyltramadols erfolgreich angewendeten Hydrolasen Schweineleber- Esterase und Candida rugosa Lipase eingesetzt (Tabelle 2.20). Me2N OH O Pr OH Enzym O Pr O Phosphatpuffer- 17 Me2N O Lösung + 10 % Cosolvens OH rac-17 RT OH Me2N 11 Abb. 2.27: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17. Die Ergebnisse der enzymatischen Hydrolysen von rac-17 sind in Tabelle 2.20 zusammengefaßt. Rac-17 wird von beiden eingesetzten Enzymen als Substrat akzeptiert und beide Hydrolasen zeigen eine hohe Aktivität in der Hydrolyse des Esters. Es ist allerdings nahezu keine Enantiomer-Differenzierung der beiden Enzyme zu beobachten. Beide Reaktionen verlaufen unselektiv. Tabelle 2.20: Enzym-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-17 (Phosphatpuffer; 10 % tert-Butanol) Reaktions- ee Ester ee Phenol Enzym Umsatz E-Wert zeit 17 11 Schweineleber-Esterase 25 Min. 69 % 7% 1% 1.1 (PLE; 1.3 U/ml), pH 8.0 Candida rugosa Lipase 2.5 h 17 % 1% 3% 1.1 (CRL; 2.4 U/ml), pH 7.0 Der Grund für die mangelnde Selektivität der enzymatischen Reaktionen kann nur in der Molekülstruktur des Substrates liegen. In Molekül rac-17 fehlt die geschlossenen Ringstruktur des Tramadol-Moleküls, daher ist das Molekül und besonders die Dimethylaminomethyl-Seitenkette viel flexibler. Von der angreifenden Seringruppe im
- 89. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 75 Enzym gesehen, liegen die Stereozentren am „anderen Ende“ der angegriffenen Acylgruppe. Ihr Einfluß auf die Enantiomer-Differenzierbarkeit des Enzyms ist aufgrund der erhöhten Flexibilität viel geringer als beispielsweise bei rac-15. Den Versuch rac-17 in die CRL-katalysierte Hydrolyse im wäßrig-organischem Zweiphasensystem einzusetzen, wurde nach den bisherigen Erfahrungen wenig Erfolg in Aussicht gestellt und daher nicht durchgeführt. 2.4.1.5 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)- 3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) Es wurde ebenfalls in einem „Enzymscreening“ untersucht, ob eine Enzym- katalysierte Transacylierung des Phenols rac-11 möglich ist und ob diese unter Umständen selektiver verläuft als die entsprechende enzymatische Hydrolyse. Für diese Versuchsreihe wurde allerdings Diethylether als Lösungsmittel, nach Reaktionsbedingungen von INAGAKI et al 162, gewählt, da zu dem Zeitpunkt dieser Untersuchungen noch nicht bekannt war, daß das Transacylierungsreagenz ein geeignetes Reaktionsmedium für die enzymatische Acylierung von Phenolen darstellt. Um eine eventuelle enzymatische Reaktion günstig zu beeinflussen, wurde Vinyllaurat als Acylierungsmittel gewählt (Abb. 2.28), da dies aufgrund seiner erhöhten Kettenlänge in eine Lipasen-katalysierte Reaktion bevorzugter als Vinylpropionat (vgl. Tabelle 2.14) umgesetzt werden könnte. Me2N OH OH OH Enzym OH 11 Vinyllaurat Me2N Diethylether + RT OH rac-11 O C11H23 Me2N O 44 Abb. 2.28: Enzym-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-11.
- 90. 76 THEORETISCHER TEIL Allerdings, wie aus den Versuchen zur Transacylierung des O-Desmethyltramadols in Diethylether zu erwarten war, ist auch bei allen in die Transacylierung von rac-11 eingesetzten Lipasen keine Reaktion zu beobachten (Tabelle 2.21). Tabelle 2.21: Versuche zur Lipasen-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-11 in Diethylether Reaktionsbedingungen Reaktions- Enzym Umsatz (Äquiv.) zeit Burkholderia cepacia Lipase Vinyllaurat (2) 14 d 0% (BCL, 800 U/ml) Candida rugosa Lipase Vinyllaurat (2) 14 d 0% (CRL; 29 U/ml) Candida antarctica Lipase Vinyllaurat (2) 14 d 0% (CAL; 16 U/ml) Rhizopus arrhizus Lipase Vinyllaurat (2) 14 d 0% (0.02 U/ml) Aspergillus niger Lipase Vinyllaurat (2) 14 d 0% (0.001 U/ml) Eine Enzym-katalysierte Acylierung von rac-11 wäre sicherlich unter den für das O-Desmethyltramadol (rac-8) gefundenen Bedingungen möglich, doch wird auch hier nach den bisherigen Ergebnissen sowohl in der Acylierung von rac-8 als auch in der Hydrolyse von rac-17 keine Enantiomer-Differenzierung der Enzyme zu beobachten sein. Das offenkettige, phenolische Tramadol-Analogon rac-11 ist somit kein geeignetes Substrat für eine Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung zur Darstellung von Enantiomeren. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Flexibilität des Moleküls vergleichen mit dem Tramadol-Molekül der Fall. Zur Darstellung der Enantiomeren kann ausgehend von Verbindung 38 aber auf ein Verfahren zur thermodynamischen oder klassischen Racematspaltung mit Weinsäurederivaten zurückgegriffen werden. Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Phenols 11 erfolgte durch Vergleich der Drehwerte mit bereits in der Literatur publizierten Drehwerten der Hydrochloride der Enantiomeren von 11.189
- 91. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 77 2.4.2 Substrate auf Basis sekundärer Hydroxylfunktionen Während es sich bei dem Substrat O-Desmethyltramadol (rac-8) noch um einen Metaboliten des Tramadols und daher um eine Substanz mit seit längerem bekannten pharmakologischen Profil handelt, stellt die Gruppe der Tramadol- Analoga mit zusätzlicher sekundärer Hydroxylfunktion, eine Gruppe von Verbindungen mit bisher noch nicht erschlossenen Potential in der Schmerztherapie dar. Entdeckt wurde diese interessante Gruppe von Verbindungen von der GRÜNENTHAL GmbH bei systematischen Strukturvariationen des Tramadol-Grund- gerüsts auf der Suche nach neuen analgetisch aktiven Verbindungen. In die, im Rahmen dieser Arbeit, untersuchten enzymatischen Racematspaltungen wurden die in Abb. 2.29 dargestellten hydroxylsubstituierten Tramadol-Analoga eingesetzt. Sie leiten sich vom Tramadol dadurch ab, daß in 4- bzw. 5-Position des Tramadols eine Hydroxylgruppe in den Cyclohexylring eingefügt worden ist. Der Syntheseweg dieser Verbindungen wurde bereits in Kap. 2.2.1 auf S. 24 dargestellt. Das zur Verbindung rac-14 epimere (±)-(1RS,2RS,4RS)-1,4-Diol ist nicht mehr im Rahmen dieser Arbeit bearbeitet worden, obwohl die pharmakologischen Eigenschaften dieser Verbindung ebenfalls untersucht werden. OH OH OH 3 1 OMe 3 1 OMe 1,3-Diole: HO 6 6 Me2N Me2N (±)-(1RS,3SR,6RS)-12 (±)-(1RS,3RS,6RS)-13 OH 1 OMe 1,4-Diol: HO 2 4 Me2N (±)-(1RS,2RS,4SR)-14 Abb. 2.29: Hydroxysubstiutierte Tramadol-Analoga, die in der Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltung als Substrate untersucht werden. Sekundäre Alkohole sind die idealen, fast klassischen Substrate für eine Hydrolasen- katalysierte kinetische Racematspaltung. Aufgrund der Vielzahl der einsetzbaren Enzyme und deren geringer Substratspezifität bei trotzdem hoher Selektivität hat diese Methode eine große Anwendungsbreite erlangt. Gerade bei unterschiedlicher
- 92. 78 THEORETISCHER TEIL Größe der Substituenten am Chiralitätszentrum werden häufig sehr hohe Selektivitäten in der Enantiomer-Differenzierung des Enzyms beobachtet und sehr gute Ergebnisse in der Racematspaltung erzielt. Daher gibt es in der Literatur auch eine monatlich wachsende Zahl von Beispielen. Ebenso gibt es bis heute eine Vielzahl von Beispielen zur Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltung von substituierten Cyclohexanolderivaten als einen Sonderfall der sekundären Alkohole.190,191,192 Exemplarisch seien hier die Enzym-katalysierte Racematspaltung von trans- 2-substituierten Cyclohexanolen191 (39, Abb. 2.30) und trans-2-substituierten 2-Cylohexenolen192 (40, Abb. 2.30) im organischen Medium erwähnt, welche sehr gut untersuchte Reaktionen darstellen. Sie verlaufen im allgemeinen mit sehr guter Selektivität und können so zur Synthese einer Vielzahl synthetisch wertvoller Intermediate herangezogen werden. OH OH OH OH R R OMe N OMe 39 40 rac-41 rac-42 R = Me, Ph, SPh R = H, Br, SPh I, Br, Cl, CN NHPh, NO2, N3 OTs, OMe, OAc CH2SPh, CH2COPh, CO2Et Abb. 2.30: Beispiele von bereits in Lipasen-katalysierte Racematspaltungen im organischen Medium eingesetzten Substraten auf Cyclohexanolbasis. Dargestellt ist das bevorzugt umgesetzte Enantiomer. Es wurden ebenfalls sterisch anspruchsvollere Verbindung wie beispielsweise rac-41 und rac-42 (Abb. 2.30) in die Lipasen-katalysierte Transacylierung eingesetzt. In der CRL-katalysierten Acylierung von rac-41 mit Vinylacetat als Acyldonor und Diisopropylether als Solvens konnte nach 22 h bei 50 % Umsatz (+)-41 mit einem ee-Wert von 83 % und das entstandene Acetat mit einem ee-Wert von 94 % (E = 72) erhalten werden.193 Die Acylierung von rac-42 wird ebenfalls von der Candida rugosa Lipase katalysiert und verläuft mit noch höherer Selektivität. Der zurückbleibende
- 93. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 79 Alkohol kann mit 93 % ee und das erhaltene Acetat mit 94 % ee erhalten werden (E = 110).194 In Analogie zu den Tramadol-Analoga ist in der Verbindung 42 ein tertiäres Stickstoffatom vorhanden. Das cyclohexanolische Substrate, die wie das Tramadol Dimethylaminomethyl-substituiert sind, ebenfalls von Hydrolasen als Substrate akzeptiert werden, konnten KANERVA et al. zeigen. NMe2 Lipase PS NMe2 NMe2 + Vinylacetat OH Diethylether OCOR OH (−)-(1R,2R) (+)-(1S,2S) 38 %, 99 % ee 49 %, 96 % ee CAL-B NMe2 (Novozym 435) NMe2 NMe2 + Vinylacetat OH OCOR OH Diethylether (+)-(1R,2S) (−)-(1S,2R) 42 %, 98 % ee 34 %, 96 % ee Abb. 2.31: Lipasen-katalysierte Transacylierungen von 2-Dimethylaminomethyl- cyclohexanolen im organischen Medium. KANERVA et al. gelang die Lipasen-katalysierte Acylierung von verschiedenen 2-Dialkylaminomethyl-cyclohexanolen mit hoher Selektivität. Sowohl für die cis- als auch für die trans-konfigurierte Dimethylaminomethyl-substituierte Verbindung wurden E-Werte größer 200 erreicht (Abb. 2.31).195 Im Falle der cis-konfigurierten Verbindung verläuft die Novozym 435-katalysierte Acylierung äußerst langsam, die Lipase PS-katalysierte Reaktion verläuft hingegen mit hoher Aktivität und Selektivität. Von GOTOR et al. ist das am Stickstoffatom unsubstituierte racemische trans- 2-Aminocyclohexanol in die CAL-katalysierte Acylierung eingesetzt worden.196 Allerdings wurde bevorzugt eine Acylierung am Stickstoffatom beobachtet, die mit mittelmäßiger bis guter Selektivität verlief. Eine Enzym-katalysierte Acylierung am Sauerstoffatom konnte mit hoher Selektivität erreicht werden, indem die N-Benzyloxycarbonyl geschützte Verbindung in die Pseudomonas cepacia Lipase (BCL) katalysierte Transacylierung eingesetzt wurde (Abb. 2.32).
- 94. 80 THEORETISCHER TEIL H N O Ph NHCbz NHCbz BCL O + Vinylacetat OH 1,4-Dioxan OCOMe OH (−)-(1R,2R) (+)-(1S,2S) 31 %, 99 % ee 63 %, 49 % ee H N O Ph NHCbz NHCbz CAL + O Vinylacetat OH MTBE OCOMe OH (−)-(1R,2S) (+)-(1S,2R) 43 %, 96 % ee 43 %, 96 % ee Abb. 2.32: Lipasen-katalysierte Transacylierungen von N-Benzyloxycarbonyl geschützten 2-Aminocyclohexanolen im organischen Medium. In diesem Fall ließ sich das entsprechende cis-konfigurierte Isomer in der CAL- katalysierten Transacylierung mit hoher Aktivität und Selektivität umsetzten (Abb. 2.32).197 Racemische 2-Methylamino-cyclohexanole lassen sind ebenfalls unter diesen Bedingungen mit sehr guten Ergebnissen in die enzymatische Racematspaltung einsetzten, wenn die freie Valenz am Stickstoff mit einer Butoxycarbonyl-Gruppe (Boc) geschützt wird.198 Von SEKAR et al. wurden Untersuchungen zur Umkehrreaktion im wäßrigen Medium durchgeführt. Es wurden Acetate von N-Aryl-substituierten 2-Aminocyclohexanolen in die PLE-katalysierten Hydrolyse eingesetzt, die ebenfalls hochselektiv verlaufen.199 NAEMURA et al. berichten von Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltungen von cis- und trans-1-Phenylcyclohexan-1,2-diol.200 Verbindungen, die dem Tramadol ebenfalls strukturell ähnlich sind. Interessanterweise zeigen die Enzyme Candida rugosa Lipase und Schweineleber-Esterase eine entgegengesetzte Enantiopräferenz hinsichtlich der cis-konfigurierten Verbindung: In der Hydrolyse des Acetats wird so von der PLE bevorzugt das (+)-Enantiomer bevorzugt zum 1R,2R- konfigurierten (+)-Diol umgesetzt, von der CRL hingegen das (−)-Enantiomer (Abb. 2.33). Obwohl in der PLE-katalysierten Hydrolyse das (+)-Diol nur mit einem ee-Wert
- 95. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 81 von 84 % erhalten worden ist, konnte die enantiomerenreine Verbindung durch anschließende Umkristallisation erhalten werden. Ph Ph Ph PLE OH OH OH (±) - Phosphatpuffer- + OAc Lösung (pH 8.0) OH OAc H 1 % EtOH H H (+)-(1R,2R) (−)-(1S,2S) 46 %, 84 % ee 46 %, 85 % ee Ph Ph Ph CRL OH OH OH (±) - Phosphatpuffer- + OAc Lösung (pH 7.5) OH OAc H Cosolvens H H (−)-(1S,2S) (+)-(1R,2R) 46 %, 27 % ee 46 %, 26 % ee Abb. 2.33: Enzymatische Racematspaltungen von 1-Phenylcyclohexan-1,2-diolen. Hinsichtlich der trans-konfigurierten Verbindung zeigen beide Enzyme die gleiche Enantiopräferenz, beide Enzyme hydrolysieren das (−)-1S,2R-Enantiomer schneller.
- 96. 82 THEORETISCHER TEIL 2.4.2.1 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4- dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl- ester (rac-18) Ausgehend von den Ergebnissen zur enzymatischen Hydrolyse des (±)-Buttersäure- 3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylesters (rac-15) wurde für das Substrat rac-18 wiederum das Butyrat als Acylrest gewählt, welches nach den zuvor gemachten Aussagen für Lipasen und Esterasen gleichermaßen ein geeignetes Substrat darstellen sollte. Ebenfalls werden, auch zu einer besseren Vergleichbarkeit mit den bisherigen Ergebnissen, die Standardreaktionsbedingungen beibehalten. Auf den bisherigen Erfahrungen in der Enzym-katalysierten Racematspaltung aufbauend wurde darauf verzichtet, eine große Anzahl von Enzymen zu untersuchen. Vielmehr wurden die Enzyme eingesetzt, die bereits gute katalytische Eigenschaften hinsichtlich der Tramadol-Analoga als Substrate gezeigt hatten. Eins dieser Enzyme ist die Schweineleber-Esterase, die sich als Enzym zur kinetischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga bewährt hat, daher wurde rac-18 in die PLE-katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.34). Me2N OH OMe O O OH O PLE OMe Pr (−)-18 Pr O Phosphatpuffer- + Me2 N Lösung 10 % Cosolvens OH rac-18 RT OMe HO Me2N (+)-12 Abb. 2.34: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18. Die PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 verlief mit hoher Aktivität des Enzyms hinsichtlich der Hydrolyse des Substrates. So wurde nach 5.75 Stunden ein Umsatz von ca. 40 % erreicht und anschließend die Reaktion durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach anschließender Säulenchromatographie mit Essigsäureethylester und Methanol im Verhältnis 1 : 1 an Kieselgel konnte der 1R,3S,6R-konfigurierte Alkohol (+)-12 in 30 % Ausbeute mit
- 97. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 83 94 % ee isoliert werden. Der 1S,3R,6S-konfigurierte Ester (−)-18 konnte in 47 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 86 % erhalten werden (Tabelle 2.22). Zur Angabe der Ausbeuten ist zu beachten, daß aufgrund des erreichten Umsatzes von ca. 40 % die maximal zu erreichende Ausbeute des Alkohols bei 40 % und die des Esters bei 60 % liegt. Tabelle 2.22: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 (1.6 U/ml; Phosphat- puffer, pH 8.0; 10 % tert-Butanol) Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (−)-18 Ester (−)-18 (+)-12 Alkohol (+)-12 5.75 h 86 % 47 % 94 % 30 % 89 Die beobachtete Selektivität der Reaktion läßt sich durch einen E-Wert von 89 ausdrücken. Die in der Hydrolyse des Esters rac-18 erzielte Selektivität ist direkt sehr hoch. Wie aus Abb. 2.35 hervorgeht liegt der nicht umgesetzte Ester (−)-18 ab einem Umsatz von ca. 53 % enantiomerenrein vor und kann daher in hohen Ausbeuten erhalten werden. Auch der gebildete Alkohol (+)-12 kann bis zu einem Umsatz von ca. 40 % in der enzymatischen Hydrolyse mit guten ee-Werten isoliert werden. Es ist daher möglich beide Enantiomere in guter Ausbeute und mit guten bis sehr guten Enantiomerenüberschüssen zu erhalten. Je nachdem, welches Enantiomer gewünscht ist, kann die Reaktion bei einem Umsatz von ca. 40 % gestopt und der (+)-Alkohol isoliert werden. Oder die Reaktion wird erst bei einem Umsatz von ca. 55 % aufgearbeitet und der (−)-Ester mit hohen Enantiomerenüberschüssen erhalten, der dann noch anschließend zum (−)-Alkohol hydrolysiert werden muß.
- 98. 84 THEORETISCHER TEIL Abb. 2.35: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (−)-18 (S) und Produkt (+)-12 (P) bei einer Selektivität von E = 89. Wie zu erwarten war, ist die zu erzielende Selektivität in der Hydrolyse eines Esters von einem sekundären Alkohol, wie rac-18, höher als die Selektivität in der Hydrolyse eines phenolischen Esters, wie z.B. bei rac-15. Interessanterweise wird bei der PLE-katalysierten Hydrolyse des Phenylesters rac-15 das (−)-1S,2S-konfigurierte Enantiomer schneller hydrolysiert und im Fall der PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 das (+)-1R,3S,6R-konfigurierte Enantiomer. Diese Substratspezifität läßt sich durch ein Selektivitätsmodel veranschaulichen. Da aufgrund der mikroheterogenen Zusammensetzung der PLE keine Röntgenstrukturanalyse dieses Enzyms existiert, wurden die Strukturen von über hundert Substraten verglichen, um daraus Rückschlüsse auf die dreidimensionale Struktur des aktiven Zentrums zu ziehen. Daraus wurden trotz der komplizierten Zusammensetzung der PLE Selektivitätsmodelle zur Erklärung von Substratspezifität und Selektivität entworfen. So wurden bereits in den 80er Jahren Modelle zur Vorhersage der Selektivität der PLE entworfen.201,202 1990 entwickelten JONES et al. daraus ein Würfelmodell, das schematisch den Aufbau des aktiven Zentrums der PLE wiedergeben soll (Abb. 2.36).204 Durch weitere Untersuchungen wurde es in den folgenden Jahren modifiziert.203,204,205 Mit Hilfe dieses deduktiven Modells gelang es, Voraussagen über potentielle neue Substrate zu treffen. Es werden jedoch nur
- 99. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 85 Hydrolysen von Carbonsäuremethylestern bzw. Dicarbonsäuredimethylestern berücksichtigt.204 PB Ser HL: große, hydrophobe Tasche HS HS: kleine, hydrophobe Tasche HL PF: vordere, polare Tasche PB: hintere, polare Tasche PF Ser: Serin-Rest Abb. 2.36: Modell für das aktive Zentrum der PLE nach JONES et al. Um die Substratspezifität der PLE hinsichtlich der Hydrolyse der Substrate rac-15 und rac-18 erklären zu können, sind im Abb. 2.37 in der oberen Reihe die bevorzugt umgesetzten Enantiomeren zur Vereinfachung als Alkohole nochmals dargestellt. Me2N OH OH OH OMe HO (−)-8 (+)-12 Me2N OH OH MeO NMe2 OH NMe2 OH Abb. 2.37: Von der PLE bevorzugt umgesetzte Enantiomere. In der unteren Reihe in Abb. 2.37 sind beide Moleküle so gedreht, daß die vom Serin des Enzyms angegriffene Hydroxylgruppe in die Richtung des Serinrestes im Kastenmodell nach JONES et al. zeigt. Die für die Selektivität der PLE notwendige Dimethylaminomethyl-Gruppe80 beider Moleküle kann so in Wechselwirkung mit der vorderen polaren Tasche treten. Der wenig flexible Cylohexylring mit dem Aromaten befindet sich in der großen, hydrophoben Tasche. Die räumliche Anordnung dieser Gruppen ist in beiden Molekülen gleich, was die Selektivität der PLE hinsichtlich beider Moleküle zu erklären vermag.
- 100. 86 THEORETISCHER TEIL Die Candida rugosa Lipase zeigte in der Hydrolyse des Phenylesters rac-15 von allen eingesetzten Enzymen die höchste Selektivität und auch größte Aktivität hinsichtlich des Substrats. Zudem sind große, cyclische sekundäre Alkohole Standardsubstrate für dieses Enzym (s. Kap. 2.3.2). Daher wurde rac-18 in die CRL- katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.38). Als erstes Reaktionsmedium wurde zum Vergleich mit der PLE-katalysierten Reaktion das wäßrige Einphasensystem ausgewählt. O OH OMe Pr O O OH Me2N CRL OMe (+)-18 Pr O Phosphatpuffer- Lösung + Me2N RT Me2N OH rac-18 OMe HO (−)-12 Abb. 2.38: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18. Die CRL zeigt, verglichen mit der PLE, eine etwas größere Aktivität hinsichtlich des Substrats rac-18. So wurde nach 4.75 Stunden ein Umsatz von ca. 49 % erreicht. Nach Aufarbeitung und anschließender Säulenchromatographie mit Diisopropylether und Methanol im Verhältnis 1 : 1 an Kieselgel konnte der 1S,3R,6S-konfigurierte Alkohol (−)-12 in 41 % Ausbeute mit 95 % ee isoliert werden. Der 1R,3S,6R- konfigurierte Ester (+)-18 konnte in 41 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 86 % erhalten werden (Tabelle 2.23). Bei der Chromatographie der Reaktionsprodukte sind die isolierten Ausbeuten in dem Laufmittel Diisopropylether und Methanol ein wenig besser als in dem Laufmittel Essigsäureethylester und Methanol. Die Selektivität der CRL-katalysierten Hydrolyse im wäßrigen Einphasensystem läßt sich zusammenfassend durch einen E-Wert von 133 ausdrücken. Sie verläuft damit selektiver als die entsprechende PLE-katalysierte Reaktion.
- 101. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 87 Tabelle 2.23: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem (4.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert- Butanol) Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12 4.75 h 93 % 41 % 95 % 41 % 133 Aus den Drehwerten der Produkte geht hervor, daß die CRL interessanterweise eine zur PLE entgegengesetzte Enantiopräferenz zeigt. Während in der PLE-katalysierten Hydrolyse bevorzugt das (+)-Enantiomer hydrolysiert wird, setzt das Enzym CRL bevorzugt das (−)-Enantiomer um. Das die Enzyme PLE und CRL hinsichtlich eines Substrats wie rac-15 die gleiche Enantiopräferenz zeigen und bei einem strukturell verwandten Substrat wie rac-18 eine entgegengesetzte, ist in ähnlicher Form ebenfalls von NAEMURA et al. beobachtet worden. Wie aus Abb. 2.33 auf Seite 81 hervorgeht zeigen PLE und CRL hinsichtlich des cis-1-Phenylcyclohexan-1,2-diol ebenfalls eine entgegengesetzte Enantiopräferenz, wohingegen bei der entsprechenden trans-konfigurierten Verbindung beide Enzyme das gleiche Enantiomer bevorzugt umsetzten (Abb. 2.39).200 OH OH OH OH cis-konfiguriertes Racemat trans-konfiguriertes Racemat entgegengesetzte Enantiopräferenz gleiche Enantiopräferenz Abb. 2.39: Relative Enantiopräferenzen der Enzyme PLE und CRL hinsichtlich der beiden isomeren 1-Phenylcyclohexan-1,2-diole. Um den Einfluß einer möglichen Grenzflächenaktivierung, wie es schon beim Substrat rac-15 zu beobachten war, zu untersuchen, wurde das wäßrig-organische Zweiphasensystem als Reaktionsmedium für die CRL-katalysierte Hydrolyse von rac-18 verwendet.
- 102. 88 THEORETISCHER TEIL Um eine möglichst große Grenzfläche zu erhalten, wurde die Reaktion in einer feinen Emulsion aus Phosphatpuffer und tert-Butyl-methylether (MTBE) durchgeführt. Nach ca. 6 Stunden wurde ein Umsatz von ca. 45 % beobachtet. Eine Verlängerung der Reaktionszeit auf 72 Stunden führte zu keiner weiteren Hydrolyse. Die Reaktions- lösung wurde dann aufgearbeitet und nach Chromatographie mit Diisopropylether und Methanol im Verhältnis 1 : 1 an Kieselgel konnte der 1S,3R,6S-konfigurierte Alkohol (−)-12 in 39 % Ausbeute enantiomerenrein (≥98 % ee) erhalten werden. Von dem 1R,3S,6R-konfigurierte Ester (+)-18 konnte in 40 % Ausbeute auch ebenfalls die enantiomerenreine Verbindung (≥98 % ee) erhalten werden (Tabelle 2.24). Die Enantiomer-Differenzierung der Candida rugosa Lipase unter diesen Reaktions- bedingungen ist also so hoch, daß das nicht favorisierte Enantiomer praktisch nicht umgesetzt wird, selbst bei einer Verlängerung der Reaktionszeit auf 72 Stunden. Es kann also eine nahezu perfekte kinetische Racematspaltung beobachtet werden, was sich durch einen E-Wert von größer 200 ausdrückt. Ein Wechsel bei der Katalyse mit CRL vom Ein- zum Zweiphasensystem führte wie schon beim Phenylester rac-15 zu einer Steigerung der Selektivität in der enzymatischen Hydrolyse. Tabelle 2.24: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem (4.4 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.5; MTBE; 1 : 1) Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12 72 h ≥98 % 40 % ≥98 % 39 % >200 Zusammenfassend sind somit Reaktionsbedingungen gefunden worden, die optimale Voraussetzungen für eine Enzym-katalysierte Hydrolyse von rac-18 im präparativen Maßstab bieten. Die Selektivität der Reaktion ist so hoch, daß neben einer Reaktionsführung in einem satzweisen Verfahren (batch) auch eine kontinuierliche Reaktionsführung (CSTR) möglich ist. Eine kontinuierliche Reaktionsführung zeichnet sich allgemein gegenüber dem Satz- oder Chargen-Betrieb durch höhere Raum-Zeit-Ausbeuten und besser kontrollierbare Reaktionsbedingungen aus. Ebenso reduzieren sich die produktspezifischen
- 103. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 89 Enzymkosten.206 Nachteil eines kontinuierlichen Verfahrens ist, daß der ee-Wert des isolierten nicht umgesetzten Substrates bei gleichem Umsatz nicht so hoch ist, wie in einem satzweisen Verfahren. Dies ist der Fall, da ein Teil des kontinuierlich zugeführten racemischen Substrates wieder direkt den Reaktor verläßt und so den ee-Wert der erhaltenen Produkte herabsenkt.207 Von RAKELS et al. ist der Verlauf des ee-Wertes des nicht umgesetzten Substrates in einem satzweisen und einem kontinuierlichen Reaktor über den Verlauf des Umsatzes für verschiedene E-Werte theoretisch berechnet und aufgetragen worden (Abb. 2.40). Hierbei fällt auch auf, daß in einem kontinuierlichen Verfahren selbst bei einer hohen Selektivität von E = 100 gegen Ende der Reaktion der zurückbleibende Ester nicht enantiomerenrein anfällt. (A) satzweiser Reaktor (B) kontinuierlicher Reaktor Abb. 2.40: Verlauf des Enantiomerenüberschusses des zurückbleibenden Substrats als Funktion des Umsatzes in einer kinetischen Racematspaltung für verschiedene E-Werte (E = 5, 10, 25, 100). Diese reaktionstechnischen Voraussetzungen erfordern eine hohe Selektivität in der Enzym-katalysierten Reaktion, damit eine kontinuierlichen Reaktionsführung als Verfahren einsetzbar ist. Die CRL-katalysierte Hydrolyse von rac-18 im wäßrig- organischen Zweiphasensystem wird diesen erhöhten Ansprüchen gegenüber einem satzweisen Verfahren gerecht.
- 104. 90 THEORETISCHER TEIL Für ein mögliches Verfahren zur Darstellung von Tramadol-Analoga in einem präparativen Maßstab stellt die Art der Aufarbeitung der Reaktionsmischung von Alkohol und Ester in den bisher vorgestellten Reaktionen einen entscheidenden Nachteil dar. Kontinuierliche Extraktion und Chromatographie stellen für eine Synthese im Labormaßstab die üblichen Methoden zur Trennung dar, doch in einem größeren Maßstab sind sie nicht kosteneffizient durchführbar und somit nur schwer umzusetzen. Daher wird eine effiziente Methode zur Aufarbeitung benötigt, die auch in einen größeren Maßstab übertragbar ist. Bei Untersuchungen zu dem racemischen Substrat Buttersäure-3-dimethyl- aminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22), die in Kap. 2.4.2.6 beginnend auf Seite 120 vorgestellt werden, ist in Kooperation mit der GRÜNENTHAL GmbH eine solche Methode gefunden worden. Bei dieser Methode gelingt die Trennung, indem direkt am Ende der Reaktion selektiv der Ester aufgrund seiner Polarität bei pH 7.0 aus der wäßrigen Reaktionslösung mit Diethylether oder auch MTBE extrahiert wird. Der Alkohol läßt sich noch nicht bei diesem pH-Wert extrahieren. Erst nachdem mit Na2CO3 ein pH-Wert von ca. 10 eingestellt worden ist, ist auch die Löslichkeit des Alkohols soweit herabgesetzt, daß er mit Dichlormethan aus der Reaktionslösung extrahiert werden kann. Der Unterschied in der Polarität von Ester und Alkohol läßt sich durch genügend große Unterschiede im log P-Wert208 von Alkohol und Ester zeigen. Messungen zum log P-Wert sind für das Substrat (±)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl- ester (rac-22) und den korrespondierenden Alkohol durchgeführt worden und werden in Kap. 2.4.2.6 beginnend auf Seite 120 näher diskutiert. Insgesamt stellt diese Aufarbeitung eine einfache und effiziente Methode dar mittels der auf ein chromatographisches Trennverfahren verzichtet werden kann. Um die Effizienz der Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltung mit Aufarbeitung durch Extraktion bei verschiedenen pH-Werten zu demonstrieren, wurde der Ester rac-18 in die CRL-katalysierte Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem eingesetzt. Anschließend wurde die Aufarbeitung durch Extraktion bei verschiedenen pH-Werten auf das Zweiphasensystem übertragen. Nachdem ein Umsatz von ca. 50 % in der enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-18 erreicht war, wurde die Reaktionslösung mit MTBE und Diethylether extrahiert. Der nicht umgesetzte Ester (+)-18 konnte so in 51 % Ausbeute mit einem
- 105. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 91 ee-Wert von ≥98 % isoliert werden. Anschließend wurde die verbliebene Reaktionslösung von Lösungsmittelresten befreit und auf pH 10 eingestellt. Der Alkohohl (−)-12 konnte daraufhin mit Dichlormethan in 46 % Ausbeute mit 97 % ee extrahiert werden (Tabelle 2.25). Somit konnten mittels dieser Methode sowohl Ester als auch Alkohol in sehr guten Ausbeuten und Reinheiten extrahiert werden. Die ebenfalls hohen Enantiomerenüberschüsse in Alkohol und Ester zeigen, daß eine partielle Racemisierung während der Aufarbeitung nicht beobachtet werden kann. Tabelle 2.25: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 wäßrig-organischen Zweiphasensystem im 1.5 mmol Maßstab mit extraktiver Aufarbeitung (6.7 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.2; MTBE; 1 : 1) Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12 48 h ≥98 % 51 % 97 % 46 % >200 Insgesamt konnte somit eine effiziente Enzym-katalysierte kinetische Racemat- spaltung von rac-18 durchgeführt werden. Die CRL-katalysierte Hydrolyse dieses Esters verläuft mit einer nahezu perfekten Selektivität und ermöglicht so den einfachen Zugang zu beiden Enantiomeren des Alkohols 12. Für eine Darstellung des Alkohols (+)-12 ist die Hydrolyse des nicht umgesetzten Esters notwendig. Dies bedeutet einen zusätzlichen Reaktionsschritt, der dadurch umgangen werden kann, daß zur Darstellung von (+)-12 die PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 durchgeführt wird. Da die Enzyme CRL und PLE eine entgegengesetzte Enantio- präferenz hinsichtlich dieses Substrates zeigen, wird von der PLE bevorzugt das (+)-Enantiomer zum Alkohol (+)-12 hydrolysiert. Somit ermöglicht eine geeignete Wahl des Enzym die Darstellung beider enantiomerer Alkohole mit hohen ee-Werten. Neben einem chromatographischen Trennverfahren steht auch die Methode der Extraktion bei verschiedenen pH-Werten zur einfachen Aufarbeitung der Reaktionsmischung aus Alkohol und Ester zur Verfügung. Diese Methode hat den Vorteil einfach, effizient und leicht in einen größeren Maßstab, wie einen späteren Produktionsprozeß, übertragbar zu sein.
- 106. 92 THEORETISCHER TEIL In der Enzym-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 zeigte die Candida antarctica Lipase Typ B bemerkenswerte katalytische Eigenschaften. Diese Ergebnisse werden in Kap. 2.4.2.9 beginnend aus Seite 144 diskutiert. Aufgrund der in der Novozym 435-katalysierten Transacylierung von rac-14 beobachteten Aktivität und Selektivität dieses Enzyms, wurde diese Katalysatorpräparation auch in die enzymatische Hydrolyse von rac-18 eingesetzt. Allerdings konnte nach einer Reaktionszeit von 45 Stunden kein Umsatz in dem Versuch zur Novozym 435- katalysierten Hydrolyse von rac-18 beobachtet werden (Tabelle 2.26). Die gesamte Reaktionszeit über war das immobilisierte Enzym im wäßrigen Medium unlöslich. Eine mögliche Erklärung für die hohe Aktivität dieser Enzympräparation im organischen Medium und die im Gegensatz dazu niedrige Aktivität im wäßrigen Medium, liegt darin, daß diese auf einem makroporösen Acrylharz immobilisierte Präparation speziell für die Synthese von Estern konzipiert ist.126 Zusätzlich können Stofftransportprobleme am heterogenen Katalysator nicht ausgeschlossen werden. Tabelle 2.26: Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 (CAL-B; Phosphatpuffer, pH 7.5; 10 % tert-Butanol) Reaktionszeit Umsatz ee Ester 18 ee Alkohol 12 E 45 h 0% - - - Daraufhin wurde eine lyophilisierte Form der CAL-B, mit dem Handelsnamen Chirazyme L2, in die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-18 eingesetzt. Aber auch diese Enzympräparation zeigte eine relativ niedrige Aktivität in der enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-18. So konnte in der Chirazyme L2- katalysierten Reaktion lediglich ein Umsatz von 7 % zum Alkohol (−)-12 nach 46 % Stunden beobachtet werden (Tabelle 2.27). Aufgrund der niedrigen Aktivität dieser Lipasen im wäßrigen Medium wurden keine weiteren Versuche zu einer CAL-B- katalysierten Hydrolyse von rac-18 unternommen.
- 107. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 93 Tabelle 2.27: Chirazyme L2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 (CAL-B; Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol) Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-18 ee Alkohol (−)-12 E 46 h 7% 8% n. b. - Die Enantiomeren des Alkohols 12 sind bisher nicht in der Literatur beschrieben, so daß zur Bestimmung der Absolutkonfiguration kein Drehwert zum Vergleich zur Verfügung steht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Absolutkonfiguration der Enantiomere des Alkohols 12 daher auf der Basis zugeordnet, daß alle bisher hergestellten (αR,βR)-Tramadol-Analoga mit tertiärer Hydroxylgruppe eine positiven Drehsinn des Drehwerts zeigen.184 Die Bestimmung der Absolutkonfigurationen der Ester 18, 46 und 47 erfolgte in Analogie zu der des Alkohols 12. 2.4.2.2 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6- Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) Nachdem in der enzymatischen Hydrolyse von rac-18 sehr gute Ergebnisse erzielt worden sind, wurde die Umkehrreaktion, die Enzym-katalysierte Transacylierung von rac-12 im organischen Medium, ebenfalls untersucht. Ein Verfahren zur enzymatischen Acylierung im organischen Medium neben dem hydrolytischen Verfahren würde weiterhin den Vorteil bieten, hydrolyselabile oder hydrophobe und daher im wäßrigen Milieu unlösliche Verbindungen einsetzten zu können. Dieser Gesichtspunkt ist vor allem für zukünftige Tramadol-Analoga von Bedeutung. Daher ist neben der enzymatischen Hydrolyse ebenfalls ein Verfahren zur Enzym-katalysierten Acylierung von rac-12 untersucht worden (Abb. 2.41). Begonnen wurden diese Untersuchungen mit der Burkholderia cepacia Lipase (BCL), welche auch nach den in Kap. 2.3.2 gemachten Vorbemerkungen eine geeignete Lipase zur Umsetzung sekundärer Alkohole sein sollte. So ist beispielsweise von
- 108. 94 THEORETISCHER TEIL KANERVA et al. das cis-2-Dimethylaminomethyl-cyclohexanol mit sehr guten Resultaten in die Lipase PS-katalysierte Transacylierung eingesetzt worden.195 Me2N OH OMe O O OH Lipase R (−)-Ester OMe HO Vinylester + Me2N organisches Lösungsmittel OH rac-12 RT OMe HO Me2N (+)-12 Abb. 2.41: Lipasen-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-12. Als erste Reaktionsbedingungen zur BCL-katalysierten Acylierung von rac-12 wurde Isopropenylacetat als Acylierungsmittel und Toluol und Acylierungsreagenz als Lösungsmittel ausgewählt (Tabelle 2.28). In beiden Versuchen konnte allerdings nach nahezu 3 Wochen keine Ester detektiert werden. Da diese Lipase eigentlich in der Acylierung von rac-12 aktiv sein sollte, deuten diese Ergebnisse vielmehr auf ungeeignete Reaktionsbedingungen hin. Tabelle 2.28: Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat (40 U/ml) Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (Äquiv.) Isopropenylacetat (6) 20 d 3% Toluol Isopropenylacetat als Solvens 20 d 3% Daher wurde Vinylpropionat als Acyldonor gewählt, das eine etwas längere Alkylkette trägt und somit für eine Lipase ein geeigneteres Acylierungsmittel darstellen sollte. Des weiteren wurde die Enzymkonzentration in der Reaktionsmischung verdreifacht. Die Lösungsmittel Toluol und Acylierungsreagenz wurden beibehalten. Unter diesen
- 109. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 95 leicht veränderten Bedingungen konnte anschließend in beiden Lösungsmitteln eine BCL-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-12 beobachtet werden (Tabelle 2.29). Allerdings ist die beobachtete Aktivität der BCL hinsichtlich des Substrats rac-12 gering. So konnte nach 8 Tagen lediglich ein Umsatz von 11 % bzw. 5 % erzielt werden. Die Reaktion im Lösungsmittel Vinylpropionat wurde daraufhin abgebrochen, da keine wesentliche Steigerung des Umsatzes zu erwarten war. Mit einer Selektivität von E = 22 ist zudem für einen sekundären Alkohol eine relativ niedrige Selektivität beobachtet worden. Nach den in der CRL-katalysierten Hydrolyse erzielten Ergebnissen, wurde eine wesentliche höhere Selektivität in der Acylierung von rac-12 erwartet. Im Lösungsmittel Toluol war eine etwas größere Reaktionsgeschwindigkeit zu beobachten und daher wurde sie erst nach insgesamt 13 Tagen bei einem Umsatz von 12 % abgebrochen. Die in dieser Reaktion erzielte Selektivität von E = 38 ist größer als in Vinylpropionat als Solvens und im angestrebten Bereich von E ≥ 30. Insgesamt ist die Aktivität des Enzym BCL unter den verwendeten Reaktionsbedingungen aber sehr niedrig. Tabelle 2.29: BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat (120 U/ml) Reaktions- Mittel bedingungen 8d E-Wert 13 d E-Wert E-Wert (Äquiv.) Umsatz 11 % 12 % Vinylpropionat (5), ee Ester (−)-46 94 % 34 95 % 43 38 Toluol ee Alkohol (+)-12 8% 12 % Umsatz 5% n. b. Vinylpropionat ee Ester (−)-46 91 % 22 n. b. - 22 als Solvens ee Alkohol (+)-12 4% n. b. Nach den guten Ergebnissen in der Hydrolyse des korrespondierenden Esters wurde daraufhin die Candida rugosa Lipasen-katalysierte Acylierung von rac-12 untersucht. In drei verschiedenen parallelen Ansätzen wurde der Alkohol rac-12 in die CRL- katalysierte Acylierung mit Vinylpropionat in den Lösungsmitteln Diisopropylether,
- 110. 96 THEORETISCHER TEIL Toluol und Acylierungsmittel eingesetzt (Tabelle 2.30). Diisopropylether und Toluol sind Standardlösungsmittel für die Enzym-katalysierte Transacylierung. Die Verwendung des Acylierungsmittels nicht nur als Reagenz sondern auch als Solvens erbrachte in der enzymatischen Acylierung der Tramadol-Analoga mit aromatischer Hydroxylgruppe sehr gute Ergebnisse. Daher wurden diese drei Lösungsmittel zum Vergleich ausgewählt. Tabelle 2.30: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat (37 U/ml) Reaktionsbedingung 3d 6d 8d 11 d 16 d (Äquiv.) (%) (%) (%) (%) (%) Umsatz 0 2 2 3 - Vinylpropionat (5), ee Ester (−)-46 n. b. n. b. n. b. 90 - Diisopropylether ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. n. b. 2 - Umsatz 37 57 58 58 - Vinylpropionat (5), ee Ester (−)-46 94 91 96 89 - Toluol ee Alkohol (+)-12 56 97 98 ≥98 - Umsatz 23 41 48 53 58 Vinylpropionat 88 84 86 82 79 ee Ester (−)-46 als Solvens ee Alkohol (+)-12 25 52 68 85 ≥90 In dem Solvens Diisopropylether ist die geringste Aktivität des Enzyms CRL hinsichtlich des Substrats rac-12 zu erkennen. Entsprechend der Aktivität des Enzyms im Lösungsmittel Diethylether ist auch die Selektivität mit E = 19 sehr gering (Tabelle 2.31). Ether, wie auch der Diethylether im Falle der phenolischen Substrate rac-8 und rac-11, sind damit nach den bisherigen Ergebnissen keine geeigneten Lösungsmittel für eine Lipasen-katalysierte Transacylierung von Tramadol-Analoga. Dies Ergebnis steht in Einklang mit den von JUNGEN gemachten Untersuchungen zur MPEG/PLE-katalysierten Transacylierung racemischer Alkohole in verschiedenen Lösungsmitteln. Im Lösungsmittel MTBE wurden durchweg niedrige Aktivitäten und Selektivitäten erhalten.85
- 111. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 97 Im Falle der Lösungsmittel Toluol und Vinylpropionat ist die Aktivität der CRL viel größer. So werden nach 6 Tagen Umsätze von 57 % bzw. 41 % erreicht. Das die Reaktion im Lösungsmittel Toluol nach diesen 6 Tagen kaum noch voranschreitet, kann durch die hohe Selektivität der Reaktion erklärt werden, da ab einem Umsatz von 50 % die größte Menge des schneller reagierenden Enantiomers verbraucht ist und sich die Reaktionsgeschwindigkeit dann nur noch nach dem langsamer reagierenden Enantiomer richtet. Die hohe Selektivität der Reaktion wird durch einen mittleren E-Wert von 109 belegt (Tabelle 2.31). Die Schwankungen des E-Werts, der eigentlich über den gesamten Reaktionsverlauf konstant bleiben sollte, läßt sich durch die Meßgenauigkeit der Bestimmung der ee-Werte erklären. Bei hohen E-Werten führen schon sehr kleine Änderungen des ee-Werts zu Schwankungen im E-Wert. Dies läßt sich auch am Verlauf der E-Werte in dem Lösungsmittel Vinylpropionat erkennen. Da hier der E-Wert der Reaktion geringer ist, fallen die Schwankungen innerhalb der Reaktionsdauer auch viel geringer aus. Insgesamt ist die Selektivität der CRL-katalysierten Acylierung im Solvens Vinylpropionat mit einem E-Wert von 23, trotz der akzeptablen Reaktionsgeschwindigkeit zu niedrig, um sie präparativ interessant erscheinen zu lassen (Tabelle 2.31). Tabelle 2.31: E-Werte der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat Reaktionsbedingungen 3d 6d 8d 11 d 16 d Mittel (Äquiv.) Vinylpropionat (5), - - - 19 - 19 Diisopropylether Vinylpropionat (5), 56 89 >200 89 - 109 Toluol Vinylpropionat 19 19 26 27 25 23 als Solvens Ein Nebenprodukt der enzymatischen Transacylierung ist der bereits erwähnte Acetaldehyd, der aus dem primär entstehenden Vinylalkohol gebildet wird (vgl. Kap 2.3.2.2 beginnend ab Seite 39). Gerade von der Lipase aus Candida rugosa ist bekannt, daß sie durch Acetaldehyd deaktiviert werden kann.139,140,141 Von mehreren
- 112. 98 THEORETISCHER TEIL Autoren wird in diesem Fall eine Steigerung der Aktivität und Selektivität der CRL berichtet, wenn statt Vinylacetat Isopropenylacetat verwendet wird.139,141b),142,209 Dieser Argumentation folgend wurde Isopropenylacetat als Acylierungsreagenz in die CRL-katalysierte Transacylierung von rac-12 eingesetzt. Als Lösungsmittel wurden Toluol, das zu der höchsten Selektivität mit Vinylpropionat geführt hat, und Isopropenylacetat verwendet (Tabelle 2.32). Tabelle 2.32: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat (37 U/ml) Reaktionsbedingung 2d 5d 14 d 20 d (Äquiv.) Umsatz 19 % 34 % 47 % 58 % Isopropenylacetat (6), ee Ester (−)-47 n. b. ≥98 % 94 % 94 % Toluol ee Alkohol (+)-12 n. b. 60 % 70 % 88 % Umsatz 3% 5% 13 % 16 % Isopropenylacetat n. b. 10 % 24 % 24 % ee Ester (−)-47 als Solvens ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. 4% 6% Im Lösungsmittel Toluol zeigt die CRL eine wesentlich höhere Aktivität als im Acylierungsmittel als Solvens. Qualitativ deckt sich diese Beobachtung mit den Ergebnissen, die mit dem Acylierungsreagenz Vinylpropionat erzielt wurden. Allerdings ist die Reaktion in Isopropenylacetat sehr langsam, da nach fast 3 Wochen lediglich ein Umsatz von 16 % erreicht wurde. Die Reaktion verläuft mit einem E-Wert von 2 außerdem nahezu unselektiv (Tabelle 2.33). Die Selektivität der CRL-katalysierten Transacylierung mit Isopropenylacetat verläuft in den ersten 5Tagen bis zu einem Umsatz von ca. 45% mit nahezu perfekter Selektivität (E >200) und fällt danach ab. Die Reaktion im Lösungsmittel Toluol verläuft mit Isopropenylacetat als Acylierungsmittel langsamer als mit Vinylpropionat. Die in beiden Reaktionen im Mittel erzielten Selektivitäten sind im gleichen Rahmen sehr gut. Dies deutet daraufhin, daß unter diesen Reaktionsbedingungen (Toluol, Reaktionszeiten von 3 bis 5 Tagen) mit Vinylpropionat und Isopropenylacetat keine Deaktivierung der CRL durch Acetaldehyd vorliegt.
- 113. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 99 Tabelle 2.33: E-Werte der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat Reaktionsbedingungen 2d 5d 14 d 20 d Mittel (Äquiv.) Isopropenylacetat (6), n. b. >200 67 94 120 Toluol Isopropenylacetat n. b. n. b. 2 2 2 als Solvens Aufgrund der erzielten Ergebnisse in der CRL-katalysierten Transacylierung wurde ebenfalls versucht eine PLE-katalysierte Transacylierung von rac-12 zu erreichen (Abb. 2.42). Beim Alkohol rac-12 handelt es sich um einen sekundären Alkohol, der im Vergleich zum Phenol rac-8 ein geeigneteres Substrat für Schweineleber- Esterase darstellen sollte. O OH OMe R O Me2N OH PLE OMe (+)-Ester HO Vinylester + Me2N organisches Lösungsmittel Me2N OH rac-12 OMe RT HO (−)-12 Abb. 2.42: PLE-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-12. Native PLE zeigt im Gegensatz zu Lipasen allerdings praktisch keine Aktivität in der Transacylierung von Alkoholen mit Vinylestern im organischen Medium. Es wurde daher MPEG/PLE (vgl. Kap. 2.1) als Katalysatorpräparation in die Transacylierung von rac-12 eingesetzt. Als Lösungsmittel wurde Toluol verwendet, da in diesem Lösungsmittel die CRL eine hohe Aktivität zeigte, als Acylierungsmittel wurden sowohl Vinylacetat als auch Isopropenylacetat eingesetzt (Tabelle 2.34).
- 114. 100 THEORETISCHER TEIL Tabelle 2.34: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 (6.4 U/ml) Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (Äquiv.) Vinylpropionat (5), 20 d 3% Toluol Isopropenylacetat (5), 20 d 0% Toluol Unter diesen Reaktionsbedingungen fand, wie schon zuvor beim Phenol rac-8, keine PLE-katalysierte Reaktion in einem nennenswerten Umfang statt. Um weitere Reaktionsmedien im Hinblick auf mögliche günstige Eigenschaften für eine PLE/MPEG-katalysierte Reaktion von rac-12 zu testen, wurden drei weitere Lösungsmittel untersucht. Mit Vinylpropionat als Acylierungsmittel wurde Dichlormethan, MTBE und das Acylierungsmittel Vinylpropionat als Solventien in die PLE/MPEG-katalysierte Acylierung von rac-12 eingesetzt (Tabelle 2.35). Außerdem wurde in diesen Reaktionen die sechsfache Menge an Katalysator im Vergleich zu den vorherigen Reaktionen eingesetzt. Tabelle 2.35: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat (41.3 U/ml) Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (Äquiv.) Vinylpropionat (5), 21 d 2% Dichlormethan Vinylpropionat (5), 4d 1% MTBE Vinylpropionat (200) 21 d 3%
- 115. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 101 Trotz dieser wesentlich gesteigerten Katalysatormenge konnte wiederum nur eine minimale Menge an Acylierungsprodukt detektiert werden. Interessanterweise wurde im Acylierungsmittel als Solvens die größte Menge an gebildeten Ester 46 beobachtet. Um eine Deaktivierung des Enzyms durch Nebenprodukte ausschließen zu können, wurde eine neue Katalysatorspezies aus PLE und Rinderserumalbumin (BSA) für die Acylierung von Tramadol-Analoga eingesetzt. Von GAIS et al. konnte nämlich gezeigt werden, daß die Aktivität der PLE von verschiedenen Carbonyl-Nebenprodukten (Acetaldehyd, Aceton, Carbonsäuren aus der Hydrolyse des Acyldonors) beträchtlich beeinflußt wird.84,85 Um einer Reaktion dieser Carbonyl-Verbindungen mit Lysin-Resten des Enzyms entgegenzuwirken, wurden Rinderserumalbumin und verschiedene aminhaltige Harze in der Colyophilisierung mit PLE benutzt.83 Diese Verbindungen sollten statt des Enzyms mit den Carbonyl-Nebenprodukten reagieren und so die Aktivität der PLE erhöhen. Außerdem sollte die Nebenreaktion der PLE-katalysierte Hydrolyse des Acyldonors durch geringe, zugesetzte Mengen an Wasser eingeschränkt werden Für eine Acylierung von rac-12 wurde ein Colyophilisat aus PLE, BSA und MPEG (PLE/BSA/MPEG) gewählt und eingesetzt, welches bei Standardsubstraten eine hohe Aktivität im organischen Medium zeigt.83 Als Acylierungsmittel wurde Vinylpropionat für die Reaktionen gewählt und diesmal das Lösungsmittel variiert. Es wurden Dichlormethan und Toluol verwendet. Zum Lösungsmittel Toluol wurde hierbei ein Wasserzusatz von 0.25 % gegeben (Tabelle 2.36). Der Wasserzusatz wurde gemacht, da Wasser auch für die Enzymkatalyse in organischen Lösungsmitteln von entscheidender Bedeutung ist. Es dient als "Schmiermittel"150 zur Einstellung verschiedener Proteinkonformationen.85 In völlig wasserfreien Systemen können Enzyme ihre Aktivität daher nicht entfalten. Vielfach reicht allerdings schon eine sehr geringe Wassermenge (<1 %) zur Enzymkatalyse in organischen Medien aus. Beeinflußt wird das System auch durch das Additiv MPEG, daß die effektive Wasserkonzentration in der Enzymumgebung verringert210,211 und so als "Puffer" für den Wassergehalt des Enzyms dient.212 Von JUNGEN ist in der Katalyse mit MPEG/PLE in Toluol als Lösungsmittel die höchste Reaktions-
- 116. 102 THEORETISCHER TEIL geschwindigkeit bei einem Zusatz von 0.2 Vol% Wasser beobachtet worden.85 Daher wurde für diesen Versuch mit dem Katalysator PLE/BSA/MPEG ein Wasserzusatz von 0.25 % gewählt. Tabelle 2.36: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (Äquiv.) PLE/BSA/MPEG (24.4 U/ml), 11 d 0% Vinylpropionat (5), Dichlormethan PLE/BSA/MPEG (20.0 U/ml), H2O (0.25 %), 11 d 0% Vinylpropionat (5), Toluol Im Laufe der Reaktionszeit änderte sich die Farbe des PLE/BSA-Katalysators von weiß in ein dunkles rot-braun. Dies ist ein typisches Merkmal dafür, daß der Zusatz BSA mit Carbonyl-Nebenprodukten reagiert. Diese Nebenprodukte können nur aus der enzymatischen Hydrolyse des Vinylesters stammen. Eine derartige Nebenreaktion in größerem Umfang ist ebenfalls von Ruppert84 wie auch anderen213 beobachtet worden. O +E R1 OH + H2O A O +E O + [R1-CO-E] R1 O B + R2-OH O + H2O O R2 + E + R2-OH R1 O R1 OH C Abb. 2.43: Hydrolyse des Acyldonors als Nebenreaktion der Transacylierung.
- 117. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 103 In Abb. 2.43 ist das zu dieser Nebenreaktion gehörige Reaktionsschema wiedergegeben. Nach der irreversiblen Bildung des Acyl/Enzym-Komplexes, kann dieser die Nebenreaktion mit Wasser eingehen (A) oder den gewünschten Reaktionsweg, die Reaktion mit dem racemischen Alkohol, beschreiten (B). Je nach Wassermenge kann die unerwünschte Nebenreaktion sogar dominieren. Des weiteren kann der gebildete Ester enzymatisch hydrolysiert werden (C) was die enzymatische Transacylierung quasi-reversibel macht. In beiden Reaktionsansätzen konnte aber kein Umsatz in der Acylierung von rac-12 detektiert werden. Insgesamt deuten somit die erzielten Ergebnisse in den Versuchen zur PLE-katalysierten Transacylierung darauf hin, daß Tramadol-Analoga, sowohl mit aromatischer als auch mit sekundärer Hydroxylfunktion, keine geeigneten Substrate für eine PLE-katalysierte Reaktion im organischen Medium darstellen.
- 118. 104 THEORETISCHER TEIL 2.4.2.3 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)- Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexylester (rac-19) Der racemische Alkohol rac-13 ist eine pharmakologisch wirksame Verbindung, die eine dem Tramadol ähnliche analgetische Aktivität besitzt. Das Hydrochlorid des (±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diols (rac-13⋅HCl) befindet sich in einem fortgeschrittenem Stadium der klinischen Entwicklung von der GRÜNENTHAL GmbH. Die Verbindung zeigt ein solch gutes pharmakologisches Profil, das eine direkte Vermarktung des Racemats ohne eine weitere Derivatisierung erhofft werden kann (Abb. 2.44).184 OH OH OMe ⋅HCl Me2N Abb. 2.44: Hydrochlorid von rac-13, dessen Vermarktung von der GRÜNENTHAL GmbH angestrebt wird. Die Substanz zeigte eine mittlere analgetische Aktivität in der Wirkstärke des O-Desmethyltramadols (rac-8) bei außerordentlich hoher Bioverfügbarkeit. Dies stellt einen Fortschritt gegenüber der bisherigen Therapie dar. Dazu ist die Halbwertszeit im Körper dieser Substanz sowie die des O-Desmethyl-Metaboliten gegenüber vergleichbaren Substanzen, wie dem Tramadol, verlängert.184 Der Wirkstoff rac-13⋅HCl zeigt, ähnlich wie das Tramadol, eine dreifaches Wirkprofil. So existiert neben der µ-opioiden Wirkung auch Inhibierung der Wiederaufnahme der Neurotransmitter Noradrenalin (NA) und Serotonin (5HT), was zu einer Inhibierung der spinalen Schmerzleitung führt.184 Interessanterweise zeigen die Enantiomeren eine synergistische Wirkung, ähnlich wie auch beim Tramadol, dies kann die weitere Entwicklung und später geplante Vermarktung des Racemats ermöglichen. Trotzdem werden natürlich die einzelnen Enantiomeren für eine pharmakologische Begutachtung benötigt.
- 119. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 105 Obwohl es sich bei dieser Verbindung um ein 1,3-diaxial substituiertes Molekül handelt, sollte versucht werden, die sehr guten Resultate in der Enzymkatalyse des (1SR,3RS,4RS)-konfigurierten Epimers auf diese neue Verbindung zu übertragen (Abb. 2.45). O Pr O OH O OMe Pr O OH Me2N Hydrolase OMe 19 Phosphatpuffer- + Me2N Lösung Me2N RT OH rac-19 HO OMe 13 Abb. 2.45: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-19. Um ein Enzym zu identifizieren, daß die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-19 mit hoher Aktivität und Selektivität zu finden, wurden acht Hydrolasen unter den bisherigen Standardbedingungen, wäßriges Einphasensystem (pH 7.0, pH 8.0 im Falle der PLE) mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens, in die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-19 eingesetzt. Es konnte nach ein bis drei Tagen Reaktionszeit in keinem Fall eine Hydrolyse des Substrates in einem nennenswerten Umfang festgestellt werden (Tabelle 2.37). In allen Fällen konnte das eingesetzte Edukt nahezu vollständig zurückerhalten werden (91 – 100 % Ausbeute).
- 120. 106 THEORETISCHER TEIL Tabelle 2.37: Enzymscreening zur Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrigen Einphasensystem (Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol) Enzym Reaktionszeit Umsatz Cholesterolesterase 24 h 1% (CE; 11.0 U/ml) Candida rugosa Lipase 29 h 0% (CRL; 4.6 U/ml) Chirazyme L-2 45 h 0% (CAL-B; 38.8 U/ml) Burkholderia cepacia Lipase 45 h 0% (BCL; 0.05 U/ml) Burkholderia cepacia Lipase 46 h 0% (BCL, 30 U/ml) Porcine pancreatic Lipase 23 h 1% (PPL; 16.8 U/ml) Chromobacterium viscosum Lipase 69 h 0% (CVL, 0.18 U/mg) Schweineleber-Esterase 41 h 0% (PLE, 6.5 U/ml), pH 8.0 Da sich in der CRL-katalysierten Hydrolyse von Tramadol-Analoga neben dem wäßrigen Einphasensystem das wäßrig-organische Zweiphasensystem als ein geeignetes Reaktionsmedium herausgestellt hat, wurde rac-19 ebenfalls unter den Reaktionsbedingungen eines Zweiphasensystems eingesetzt (Tabelle 2.38). Es konnte allerdings auch in diesem Fall keine nennenswerte enzymatische Aktivität beobachtet werden. Tabelle 2.38: Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem (9.2 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; MTBE; 1 : 1) Reaktionszeit Umsatz ee Ester 19 ee Alkohol 13 E 69 h 1% n. b. n. b. -
- 121. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 107 Insgesamt stellen die hier eingesetzten Enzyme eine repräsentative Auswahl der standardmäßig in der organischen Synthese eingesetzten Hydrolasen dar. Die in Kap. 2.3.2 hervorgehobenen Enzyme sind ebenfalls in dieser Auswahl vertreten. Daher ist es nicht wahrscheinlich, daß bei dem Versuch weitere Enzyme in die Hydrolyse von rac-19 einzusetzen ein Enzym gefunden wird, daß diese Reaktion katalysiert und zudem noch die in Kap. 2.3.2 gemachten Voraussetzungen erfüllt. Da unter den zur Hydrolyse von rac-19 verwendeten Enzymen und Reaktions- bedingungen die zuvor eingesetzten Tramadol-Analoga als Substrate akzeptiert wurden, ist die Konsequenz, daß rac-19 kein geeignetes Substrat für eine enzymatische Hydrolyse darstellt. Ein naheliegender Grund warum dieser 1,3-diaxial substituierte Ester nicht von den getesteten Enzymen als Substrat akzeptiert wird, kann der sterischen Anspruch der tertiären Hydroxylgruppe, die sich in direkter Nähe zu der vom Enzym anzugreifenden Estergruppe befindet, sein. Um dennoch eine Enzym-katalysierte Racematspaltung erzielen zu können, wurde daher zunächst versucht eine enzymatische Transacylierung des korrespondierenden Alkohols rac-13 zu erreichen.
- 122. 108 THEORETISCHER TEIL 2.4.2.4 Versuche zur enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexan-1,3-diol (rac-13) Nachdem sich der 1,3-diaxial substituierte Ester rac-19 als kein geeignetes Substrat für eine enzymatische Hydrolyse herausgestellt hatte, wurde die enzymatische Transacylierung des Alkohols rac-13 auch in der Hoffnung untersucht, daß zumindest der Alkohol aufgrund seines geringeren Raumbedarfs als Substrat akzeptiert werden würde und einer enzymatischen Reaktion zugänglich ist (Abb. 2.46). OH OH OMe OH OH Me2N Lipase OMe 13 Vinylester + Me2N organisches O NMe2 Lösungsmittel rac-13 RT R O OH OMe 19 Abb. 2.46: Enzymatische Transacylierung des Alkohols rac-13. Obwohl es sich bei dem Grundkörper des Alkohols rac-13, ein substituiertes Cyclohexan-1,3-diol, um eine für chirale Auxiliare interessante Zwischenstufe handelt, sind bis heute nur wenige Publikationen zu einer enzymatischen Racematspaltung erschienen. Daß eine Acylierung von Cylohexan-1,3-diol selbst möglich ist, wurde bereits 1992 von BHATTACHARYA et al.214 sowie später 1996 MATTSON et al.215 gezeigt. Von beiden ist jeweils die cis /trans-Mischung der Epimeren in die Hydrolasen katalysierte Acylierung im organischen Medium eingesetzt worden. Von BHATTACHARYA et al. wurde eine Mischung verschiedener Proteasen aus Streptomyces griseus (Pronase) mit äquimolaren Mengen p-Nitrophenylacetat in Pyridin zur Acylierung verwendet. Es wurde eine 1 : 1 Mischung der cis- und trans-kofigurierten Monoacetate in 42 % Ausbeute erhalten. MATTSON et al. verwendeten immobilisierte Candida antarctica Lipase Typ B (Novozym 435) mit S-Ethylthiooctanoat216 als Acylierungsmittel. Unter diesen Reaktionsbedingungen konnte sogar eine Diacylierung beobachtet werden.
- 123. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 109 Die Absolutkonfiguration des am langsamten reagierenden Isomers wurde zu (1S,3S) bestimmt.214 Beim Cyclohexan-1,3-diol sind die Hydroxylgruppen allerdings nicht wie beim Alkohols rac-13 in axialer Position fixiert, so daß bei diesem Substrat die Acylierung einer 1,3-diaxialen Spezies als unwahrscheinlich anzunehmen ist. Von GOTOR et al. ist ein Beispiel einer enzymatischen Acylierung eines höher substituierten Cyclohexan-1,3-diol-Derivats veröffentlicht worden.217 Die von einer Lipase aus Chromobacterium viscosum katalysierte Acylierung des (3S,5S)- 5-Ethynyl-4-methyl-cyclohex-4-ene-1,3-diols in Vinylacetat als Solvens verläuft mit einer hohen Aktivität und führt mit 100 %Umsatz zu dem an 5 Position acylierten Monoacetat (Abb. 2.47). Somit wird die am wenigsten sterisch gehinderte Hydroxylgruppe acyliert. CVL O Vinylacetat HO OH O OH 100 % Umsatz Abb. 2.47: Enzymatische Transacylierung von cis-5-Ethynyl-4-methyl-cyclohex-4- ene-1,3-diol mit Vinylacetat. Um eine enzymatische Acylierung des Alkohols rac-13 zu erreichen, wurde dieses Substrat zunächst unter für Transacylierungen im allgemeinen geeigneten Bedingungen mit Vinylpropionat in Toluol eingesetzt. Als Katalysatoren wurden vier verschiedene Lipasen verwendet (Tabelle 2.39). In keinem Fall konnte eine Enzym- katalysierte Reaktion beobachtet werden. Im Fall des epimeren Alkohols rac-12 konnte unter diesen Reaktionsbedingungen ein E-Wert von 109 in der CRL- katalysierten Transacylierung erreicht werden.
- 124. 110 THEORETISCHER TEIL Tabelle 2.39: Enzymscreening zur enzymatischen Transacylierung des Alkohols rac-13 in Toluol Reaktionsbedingungen Reaktions- Umsatz Enzym (Äquiv.) zeit Candida rugosa Lipase Vinylpropionat (5) 72 h 0% (CRL; 37 U/ml) Porcine pancreatic Lipase Vinylpropionat (5) 72 h 0% (PPL; 67 U/ml) Cholesterolesterase Vinylpropionat (5) 72 h 0% (CE; 35 U/ml) Novozym 435 Vinylpropionat (5) 72 h 1% (CAL-B) Im Fall des Novozym 435 konnten Spuren des gewünschten Propionsäureesters von 13 detektiert werden. Daher wurde dies Enzym unter verschiedenen Reaktions- bedingungen in die Transacylierung des Alkohols rac-13 eingesetzt. Es wurden Dichlormethan und das Acylierungsmittel Vinylpropionat als Lösungsmittel verwendet (Tabelle 2.40). Eine Enzym-katalysierte Reaktion war aber auch unter diesen Bedingungen nicht zu beobachten. Tabelle 2.40: Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 (CAL-B) Umsatz nach Umsatz nach Reaktionsbedingungen 2.75 d 6d Vinylpropionat (5), 1% 1% Toluol Vinylpropionat (5), 0% 0% Dichlormethan Vinylpropionat 1% 1% als Solvens Isopropenylacetat (5), 1% 1% Toluol
- 125. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 111 In Anlehnung an die von GOTOR et al. publizierten Bedingungen zur enzymatischen Acylierung des cis-5-Ethynyl-4-methyl-cyclohex-4-ene-1,3-diols,217 wurde daraufhin die Chromobacterium viscosum Lipase in Vinylpropionat als Solvens in die Acylierung von rac-13 eingesetzt. Zusätzlich wurde noch Triethylamin als Additiv zugesetzt (Tabelle 2.41). In verschiedenen Fällen wurde bei der Verwendung von Triethylamin von einem positiver Effekt dieses Additivs auf das Ergebnis der enzymatischen Acylierung berichtet.213,218 Durch die Zugabe einer organische Base werden Säurespuren in der Reaktionsmischung neutralisiert, wodurch eine Aktivierung des Enzyms erreicht wird. Tabelle 2.41: Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Zusatz von Triethylamin Reaktionsbedingungen Umsatz Umsatz Enzym (Äquiv) nach 5 d nach 12 d Novozym 435 Vinylpropionat als Solvens 2% 4% (CAL-B) Triethylamin (1.4) Chromobacterium viscosum Vinylpropionat als Solvens Lipase (CVL, 0.7 U/ml) 0% 1% Triethylamin (1.4) Burkholderia cepacia Lipase Vinylpropionat als Solvens 0% 0% (BCL, 80 U/ml) Triethylamin (1.4) Aus Tabelle 2.41 geht hervor, das eine Acylierung des Alkohols rac-13 nicht erreicht werden kann. Weder das von GOTOR et al. beschriebene Enzym CVL katalysiert diese Reaktion, noch führt der Zusatz Triethylamin zu einer Aktivierung der Enzyme in einem zu wünschenden Umfang. Entsprechend den Ergebnissen in den Versuchen zur enzymatischen Hydrolyse wurde das 1,3-diaxiale Diol rac-13 auch unter den Reaktionsbedingungen einer Transacylierung im organischen Medium nicht von den getesteten Hydrolasen als Substrat akzeptiert. Das Ziel eine Enzym-katalysierte Racematspaltung mit diesem Substrat durchzuführen scheint daher nicht erreichbar zu sein. Eine mögliche Erklärung sind die sterischen Wechselwirkungen der beiden 1,3-diaxial angeordneten Hydroxylgruppen.
- 126. 112 THEORETISCHER TEIL Allerdings kann auch im allgemeinen eine enzymatische Reaktion an einer axial konfigurierten Hydroxylgruppe erschwert sein. So konnten nämlich TANIKAGA et al. im Falle verschiedener 3-substituierter Cyclohexanole keine enzymatische Acylierung beobachten, wenn sich die Hydroxylgruppe in axialer Position im Cyclohexylring befand, wohingegen bei den gleichen Substraten mit equatorialer Hydroxylgruppe eine enzymatische Racematspaltung möglich war (Abb. 2.48).219 OH OH Lipase PS R + Vinylacetat R (1S,3S) (1R,3R) Lipase PS R OH + OH R OAc Vinylacetat R Benzol, 30 °C (−)-(1R,3S) (1R,3S) (1S,3R) R = Ph, SPh, Bn, SO2Ph Abb. 2.48: Unterschiedliche Reaktivitäten der Lipase PS hinsichtlich equatorialen und axialen Hydroxylgruppen. Im Falle der von MATTSON et al. beschrieben Racematspaltung einer Mischung von cis- und trans-Cyclohexan-1,3-diol, war das zurückbleibende, am langsamsten reagierende Isomer ebenfalls (+)-(1S,3S)-konfiguriert.215 Im Falle der enzymatischen Racematspaltung von N-substituierten cis- 2-Aminocylhexanolen, konnte von GOTOR et al. ebenfalls keine CAL-B-katalysierte Acylierung beobachtet werden, wenn die Hydroxylgruppe axial fixiert war.197 Eine entsprechende Acylierung des trans-konfigurierten Epimers verlief hochselektiv.196 Der Unterschied in der Reaktivität beider Substrate wurde von den Autoren ebenfalls durch die geometrische Anordnung der axialen Hydroxylgruppe erklärt. Da demzufolge der Alkohol rac-13 aufgrund seiner geometrischen Anordnung keiner enzymatischen Reaktion zugänglich ist, bietet sich die Möglichkeit an, die Verbindung so zu Modifizieren, daß sie als Substrat akzeptiert werden kann.
- 127. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 113 2.4.2.5 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3- (6-dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) Nachdem sich gezeigt hatte, daß weder der 1,3-diaxial substituierte Ester rac-19 noch der korespondierende Alkohol rac-13 aufgrund der geometrischen Anordnung der Hydroxylgruppe als Substrat in eine Enzym-katalysierte Racematspaltung eingesetzt werden können, wurde nach einer geeigneten Modifizierung des Alkohols rac-13 gesucht, um ihn einer enzymatischen Reaktion zugänglich zu machen. O Pr O OH Hydrolase OH OH OMe OMe Phosphatpuffer- Me2N Lösung Me2N rac-19 13 Abb. 2.49: Versuch zur enzymatische Hydrolyse des Esters rac-19. Eine erste Alternative zur enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-19 ist die Möglichkeit den Alkohol rac-13 in ein cyclisches Carbonat (rac-48) unter Einbindung der tertiären Hydroxylgruppe zu überführen und anschließend eine enzymatische Racematspaltung dieser Verbindung durchzuführen (Abb. 2.50). Das solche cyclischen Carbonate als Substrate in eine Hydrolasen-katalysierte Reaktion eingesetzt werden können, ist bereits von MATSUMOTO et al. sowie GUIBE-JAMPEL et al. demonstriert worden.220 O OH OH O O OMe OMe Hydrolase Phosphatpuffer- Me2N Me2N Lösung rac-13 rac-48 Abb. 2.50: Enzym-katalysierte Racematspaltung des Carbonats rac-48 als alternative Route zur Darstellung der einzelnen Enantiomeren von 13. Von BURK et al. wird eine effiziente Methode zur Überführung von 1,3-Diolen in cyclische Carbonate beschrieben. Nachdem es ihnen nicht gelang ein 1,3-Diol mit
- 128. 114 THEORETISCHER TEIL verschiedenen bekannten Methoden unter Verwendung von Kohlenstoffmonoxid, Phosgen, Trichloracetylchlorid und 1-1´-Carbonyldiimidazol die gewünschte Verbindung zu erhalten, ist ihnen diese Reaktion schließlich erfolgreich unter Verwendung von Bis-(trichlormethyl)-carbonat (Triphosgen221) gelungen.222 Es wurde daher versucht rac-13 unter den von BURK et al. beschriebenen Reaktions- bedingungen in das Carbonat rac-48 zu überführen (Abb. 2.51). 0.5 Äquiv. O Triphosgen OH OH O O 10 Äquiv. Pyridin OMe (⋅HCl) OMe Me2N Dichlormethan Me2N − 76 °C rac-13 (⋅HCl) rac-48 Abb. 2.51: Versuch zur Darstellung des Carbonats rac-48 durch Acylierung mit Triphosgen. Rac-13 wurde sowohl als Hydrochlorid als auch als freie Base in diese Reaktion eingesetzt. Aufgrund der Giftigkeit des während der Reaktion freigesetzten Phosgens wurde keine Reaktionskontrolle durchgeführt. Nach Chromatographie der erhaltenen Reaktionsmischungen konnten neben dem zurückgewonnenen Edukt nur jeweils nicht näher charakterisierte Zersetzungsprodukte erhalten werden. Dies ist wahr- scheinlich darauf zurückzuführen, daß aufgrund der hohen Reaktivität des Triphosgens bzw. Phosgens eine Acylierung am Stickstoff als Nebenreaktion auftritt. Die am Stickstoff acylierte Spezies kann anschließend eine N-Dealkylierung eingehen. Diese Nebenreaktion wurde versucht zu unterdrücken, indem rac-13 als Hydrochlorid eingesetzt wurde. Eine Prozedur zur Überführung von rac-13 in das cyclische Carbonat unter milderen Reaktionsbedingungen wurde von KUTNEY et al. beschrieben. Sie beschreiben die Überführung eines cyclischen 1,2-diols in das entsprechende Carbonat unter Verwendung von 1-1´-Carbonyldiimidazol in Toluol.223 Daraufhin wurde versucht rac-13 mittels dieses Reagenzes unter den von KUTNEY et al. publizierten Bedingungen in rac-48 zu überführen (Abb. 2.52).
- 129. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 115 O 4 Äquiv. OH OH O O OMe 1,1´-Carbonyldiimidazol OMe Me2N Toluol, Rückfluß Me2N 5h rac-13 rac-48 Abb. 2.52: Versuch zur Darstellung des Carbonats rac-48 durch Acylierung mit 1,1´-Carbonyldiimidazol. Rac-13 wurde wieder sowohl als Hydrochlorid als auch als freie Base eingesetzt. Die Reaktion wurde abgebrochen nachdem jeweils kein Edukt mehr detektiert werden konnte. Die rohen Produktmischungen wurden mittels Massenspektroskopie untersucht und es konnte ein Fragment mit einer Masse von 305 detektiert werden, dem M+ von rac-48 zugeordnet wurde. Nach Chromatographie (EE : MeOH = 2 : 1 über Kieselgel) konnte allerdings keine gewünschtes Produkt erhalten werden. Da das Vorhandensein von 48 in der rohen Produktmischung nachgewiesen wurde, ist zu vermuten, daß das Carbonat 48 unter den Bedingungen der Chromatographie nicht stabil ist. Es wird daher angenommen, daß selbst wenn rac-48 ohne Chromatographie dargestellt werden könnte, es aufgrund seiner mangelnden Stabilität kein geeignetes Substrat für eine enzymatische Hydrolyse darstellt. Diese Route zur Darstellung der einzelnen Enantiomeren von 13 mittels eines cyclischen Carbonats (rac-48) als Substrat für eine enzymatische Racematspaltung, wurde daraufhin nicht weiter verfolgt. Um trotzdem eine Möglichkeit zur Enzym-katalysierten Racematspaltung von rac-13 aufzuzeigen, wurde auf die bereits vorgestellte Methode der Enzym-katalysierten Racematspaltung von Phenylestern zurückgegriffen (siehe Abb. 2.55, S. 116). Dazu ist es notwendig rac-13 durch O-Demethylierung in das entsprechende Phenol zu überführen und dies dann selektiv an der aromatischen Hydroxylgruppe zu verestern. Die Etablierung der phenolischen Hydroxylgruppe erfolgte analog zur Darstellung des Phenols rac-8 durch Reaktion mit Diisobutylaluminiumhydrid (DiBAl-H) in Toluol unter Rückfluß in guter Ausbeute (88 %).91 Eine Dealkylierung am Stickstoff war nicht zu beobachten (Abb. 2.53).
- 130. 116 THEORETISCHER TEIL OH OH OH OH OMe DiBAl-H OH Toluol Me2N Rückfluß Me2N rac-13 rac-20, 88 % Abb. 2.53: Darstellung des Phenols rac-20 durch O-Demethylierung mit DiBAl-H. Zur selektiven Darstellung des Phenylesters rac-21 erfolgte nach einer Methode von RICE et al (s. Kap. 2.2, S. 16).95 Dazu wurde das Phenol rac-20 mit 10 Äquivalenten Buttersäureanhydrid in Gegenwart eines Überschusses an wäßriger NaHCO3- Lösung in sehr guter Ausbeute (93 %) zu rac-21 umgesetzt (Abb. 2.54). OH OH OH OH OH NaHCO3-Lösung O Pr 10 Äquiv. Buttersäure- Me2N Me2N O anhydrid rac-20 RT, 30 Min. rac-21, 93 % Abb. 2.54: Selektive Darstellung des Esters rac-21. Mit rac-21 steht nun ein Substrat zur Verfügung, das nach den Untersuchungen zur enzymatischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga mit aromatischer Hydroxylgruppe als Substrat akzeptiert werden sollte. Der Ester rac-21 wurde daraufhin in die Enzym-katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.55). OH OH O Pr OH OH Enzym Me2N O O Pr Phosphatpuffer- (+)-21 Me2N O Lösung + RT Me2N rac-21 OH HO OH (−)-20 Abb. 2.55: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21. Im Rahmen der Untersuchungen zur enzymatischen Hydrolyse des Phenylesters rac-15 hatte sich gezeigt, das in der Schweineleber-Esterase-katalysierten Reaktion
- 131. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 117 und in der Candida rugosa Lipase-katalysierten Reaktion gute Ergebnisse erzielt worden sind. Daher wurde rac-21 in die von diesen Enzymen katalysierte Hydrolyse zunächst unter Standardbedingungen, wäßrige Phosphatpufferlösung mit 10 % tert- Butanol als Cosolvens, eingesetzt (Tabelle 2.42). Es wurde ebenfalls das Enzym Cholesterolesterase, welches aus Candida rugosa erhalten wird, in die Hydrolyse von rac-21 unter den genannten Bedingungen eingesetzt. Tabelle 2.42: Enzym-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem (Phosphatpuffer; 10 % tert-Butanol) Reaktions- ee Ester ee Phenol Reaktionsbedingungen Umsatz E-Wert zeit (+)-21 (−)-20 Cholesterolesterase 16.8 h 64 % 71 % 11 % 2 (CE; 3.3 U/ml) pH 7.0 Schweineleber-Esterase 3.3 h 82 % 20 % 6% 1.3 (PLE; 4.9 U/ml), pH 8.0 Candida rugosa Lipase 18.5 h 40 % 31 % 17 % 2 (CRL; 4.6 U/ml), pH 7.0 Aus Tabelle 2.42 geht hervor, daß der Phenylester rac-21 im Gegensatz zu dem Ester der sekundären Hydroxylgruppe (rac-19) ein Substrat für eine enzymatische Racematspaltung ist. Alle drei eingesetzten Enzyme zeigen eine hohe Aktivität in der Hydrolyse dieses Esters. Die Aktivität der getesteten Enzyme ist im Bereich der Aktivität hinsichtlich des Esters rac-15. Die unter diesen Standardbedingungen eines Enzymscreenings erzielte Selektivitäten sind allerdings für alle Enzym sehr schlecht. Im Rahmen der Untersuchungen zum Phenylesters rac-15 wurden unter gleichen Bedingungen höhere Selektivitäten in der CRL- und PLE-katalysierten Hydrolyse erzielt. Die höchste Selektivität in der Hydrolyse des Phenylesters rac-15 wurde in der CRL-katalysierten Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem beobachtet. Daher wurde der Phenylester rac-21 ebenfalls in die CRL-katalysierte Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem eingesetzt (Tabelle 2.43).
- 132. 118 THEORETISCHER TEIL Tabelle 2.43: CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrig- organischen Zweiphasensystem (4.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; MTBE; 1 : 1) Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E 46 h 57 % 89 % 28 % 5 Die unter diesen Bedingungen erzielte Selektivität, ausgedrückt in einem E-Wert von 5, ist zwar höher als die, die im wäßrigen Einphasensystem beobachtet wurde, sie ist allerdings für eine kinetische Racematspaltung dieses Esters zu gering. Somit ist wie im Falle des Esters rac-15 auch mit dem Esters rac-21 in der CRL- katalysierte Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem die höchste Selektivität beobachtet worden. Insgesamt konnte die prinzipielle Möglichkeit zu einer Enzym-katalysierten Racematspaltung des 1,3-diaxial substituierten Alkohols rac-13 aufgezeigt werden und so wiederum die Anwendbarkeit der Methode einer Enzym-katalysierten Racematspaltung von phenolischen Estern demonstriert werden. Die bisher in der enzymatischen Hydrolyse des Phenylesters rac-21 erzielte Selektivität ist mit einem E-Wert von 5 sehr gering. Allerdings wurden in den ersten Versuchen zur enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-15 auch ähnlich niedrige Selektivitäten beobachtet, die dann optimiert werden konnten. Daher kann eine Optimierung der Reaktionsbedingungen (Enzym, Cosolvens, Kettenlänge des Esters u.a.) hier möglicherweise auch zu einer Steigerung der Selektivität führen. Außerdem stehen zur Steigerung des Enantiomerenüberschusses der Produkte einer enzymatischen Racematspaltung noch anwendungstechnische Möglichkeiten offen. So kann das gewünschte enantiomerenangereicherte Produkt wieder in eine enzymatische Reaktion eingesetzt werden.5,6 Diese Strategie ist bereits von vielen Autoren untersucht worden224, so daß hier bereits Wege zur Vereinfachung und zur Optimierung aufgezeigt worden sind.225 Beispielsweise sind hierzu von CHEN et al. Untersuchungen zur Vorhersage des günstigsten Umsatzes gemacht worden.106 In der konkurrierenden klassischen oder thermodynamischen Racematspaltung von rac-13 mit Weinsäurederivaten können sehr gute Ergebnisse erzielt werden.184 Diese
- 133. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 119 Methode ist zur Trennung der Enantiomeren in einem präparativen Maßstab geeignet. Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Phenols 20 erfolgte durch Vergleich der Drehwerte mit denen, die bereits für die Enantiomeren der Hydrochloride des O-methylierten Alkohols 13 publiziert sind.98 Die Bestimmung der Absolutkonfiguration des Esters 21 erfolgte in Analogie zu der des Phenols 20.
- 134. 120 THEORETISCHER TEIL 2.4.2.6 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3- dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl- ester (rac-22) Der racemische Alkohol 2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan- 1,4-diol (rac-14) ist die interessanteste Verbindung, der Rahmen dieser Arbeit diskutierten Substrate, da das (+)-(1S,2R,4R)-Enantiomer eine wichtige Vorstufe des Wirkstoffs (+)-50, dem para-Fluorbenzylether von (+)-14, ist. Dieser Wirkstoff ist ein vielversprechender Entwicklungskandidat der GRÜNENTHAL GmbH97, der in der präklinischen Entwicklung weit vorangeschritten ist. Aufgrund des stark unterschiedlichen pharmakologischen Profils der einzelnen Enantiomeren ist eine Vermarktung der enantiomerenreinen Verbindung (+)-50 geplant (Abb. 2.56).184 F OH OMe ⋅HCl O Me2N (+)-50⋅HCl Abb. 2.56: (+)-(1S,2R,4R)-2-Dimethylaminomethyl-4-(4-fluoro-benzyloxy)-1- (3-methoxy-phenyl)-cyclohexanol hydrochlorid ein vielversprechender Entwicklungskandidat der GRÜNENTHAL GmbH. Diese Substanz zeigt eine sehr starke analgetische Aktivität, die über die von Morphin hinausgeht. Somit könnte ein Einsatz in der Therapie gegen sehr starke Schmerzen erfolgen. Aufgrund einer sehr hohen Wirkstärke von (+)-50 ist hierzu nur die Verabreichung geringster Mengen nötig. Dabei ist auch eine orale Einnahme möglich, was einen Fortschritt zu der bisherigen Therapie darstellt. Eine weitere Verbesserung ist, daß die häufig als Nebenwirkung auftretende Atemdepression gegenüber vergleichbaren Wirkstoffen, wie dem Morphin, vermindert ist.184 Interessanterweise zeigt dieser Wirkstoff, wie das Tramadol, eine µ-opioide und eine nicht-opioide Wirkung. Doch während beim Tramadol die Inhibierung der Wiederaufnahme der Neurotransmitter Noradrenalin (NA) und Serotonin (5HT) hauptsächlich über das (−)-Enantiomer erfolgt, zeigt in diesem Falle das (+)-50 neben der µ-opioiden Wirkung auch die Wirkung der Wiederaufnahmehemmung.
- 135. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 121 Das Wirkprofil des Racemats Tramadol konnte somit in einem Enantiomer eines neuen Wirkstoffs vereint werden.184 Das entsprechende (−)-Enantiomer zeigt ebenfalls eine analgetische Aktivität, die aber nicht an die Wirkstärke von (+)-50 heranreicht. Zudem verursacht es starke Nebenwirkungen (Herz-Kreislauf-Beschwerden), die im Falle des (+)-50 weniger stark ausgeprägt sind. Durch die Fluor-Substitution am Aromaten wird eine verlangsamte Metabolisierung im Körper erreicht.184 Erst kürzlich ist über das nicht fluorsubstituierte (+)-4-Benzyloxytramadol ist mit ausgewählten pharmakologischen Daten berichtet worden.46i) Diese zeigen ebenfalls eine im Vergleich zum Tramadol gesteigerte Affinität zum µ–Opioidrezeptor. Obwohl in diesem Fall die Verwendung eines einzelnen Enantiomers geplant ist, werden natürlich beide einzelnen Enantiomeren für eine pharmakologische Begutachtung benötigt. Wie der isomere Alkohol rac-12 ist auch rac-14 aufgrund der equatorial angeordneten sekundären Hydroxylgruppe ein Substrat, daß sich für eine Hydrolasen-katalysierte Racematspaltung anbietet. Ausgehend von den bisherigen Ergebnissen zur enzymatischen Hydrolyse von Tramadol-Analoga wurde wiederum das Butyrat als Acylrest gewählt und unter den bisherigen Standardbedingungen, wäßriges Einphasensystem mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens, in die enzymatische Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.57). OH OMe Pr O Me2N O OH (+)-22 Enzym OMe Pr O Phosphatpuffer- Me2N Lösung + O 10 % Cosolvens rac-22 Me2N OH RT OMe HO (−)-14 Abb. 2.57: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22.
- 136. 122 THEORETISCHER TEIL Als erstes Enzym wurde die Lipase aus Burkholderia cepacia als Katalysator in die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-22 eingesetzt (Tabelle 2.44). Nach 22 Stunden Reaktionszeit konnte kein Produkt mittels DC-Reaktionskontrolle detektiert werden, daraufhin wurde die Reaktionstemperatur auf 35 ºC für die restliche Reaktionszeit erhöht. Nach insgesamt 48 Stunden Reaktionszeit konnte immer noch kein Umsatz beobachtet werden, daraufhin wurde die Reaktion abgebrochen. In der BCL-katalysierten Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat wurde ebenfalls eine nur geringe Aktivität dieses Enzyms festgestellt (Tabelle 2.29). Eine Erklärung könnte sich aus dem aktiven Zentrum dieser Lipase ergeben: von KAZLAUSKAS et al. wurden die aktiven Zentren verschiedener Lipasen untersucht, hierbei zeigte sich, daß die BCL226 verglichen mit der CRL227 über eine viel schmalere Tasche zur Bindung des Alkohols verfügt.228 Dies mag der Grund dafür sein, daß dies Enzym die relativ großen Moleküle der Tramadol-Analoga nur mit geringer Aktivität akzeptiert. Tabelle 2.44: Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 (20 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.5; 10 % tert-Butanol) Reaktions- ee Ester ee Alkohol Enzym Umsatz E-Wert zeit 22 14 Burkholderia cepacia 48 h 0% n. b. n. b. - Lipase In der Transacylierung des korrespondierenden Alkohols rac-14 zeigte die Enzympräparation Novozym 435 (CAL-B) sehr gute Aktivität und auch Selektivität (s. Kap. 2.4.2.9 beginnend ab S. 144). Daraufhin wurde das Novozym 435 auch in die Hydrolyse des Esters rac-22 eingesetzt (Tabelle 2.45). Wie schon bei der Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 zuvor ist die Aktivität dieser immobilisierten Candida antarctica Lipase auch in der Hydrolyse des Esters rac-22 gering. Erst nach einer Reaktionszeit von 10 Tagen ist ein Umsatz von 35 % bei einer moderaten Selektivität, ausgedrückt in einem E-Wert von 24, erzielt worden. Die CAL-B hydrolysiert bevorzugt den (−)-Ester zum Alkohol (−)-14. Damit zeigt sie die gleiche Enantiopräferenz wie zuvor beim Substrat rac-18, bei dessen Lipasen- katalysierter Hydrolyse bevorzugt der Alkohol (−)-12 gebildet wird.
- 137. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 123 Tabelle 2.45: CAL-B-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-22 mit verschiedenen Enzympräparationen (Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol) Reaktions- ee Ester ee Alkohol Enzym Umsatz E-Wert zeit (+)-22 (−)-14 Novozym 435 10 d 35 % 67 % 85 % 24 (CAL-B) Chirazyme L2 45 h 7% 9% ≥98 % >200 (CAL-B, 58 U/ml) Eine höhere Aktivität in der Candida antarctica Lipase des Esters rac-22 wurde von einer lyophilisierten Form unter dem Namen Chirazyme L2 erwartet (Tabelle 2.45). Allerdings konnte nach 45 Stunden lediglich ein Umsatz von 7 % erzielt werden. Ein Umsatz, der in der gleichen Zeit auch in der Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 erreicht worden war. Eine Verlängerung der Reaktionszeit würde sicherlich zu höheren Umsätzen führen, aber eine Reaktionszeit von bis zu 10 Tagen erscheint für einen möglichen zukünftigen Produktionsprozeß nicht zweckmäßig. Interessanterweise ist die Selektivität dieser Reaktion bis zum erreichten Umsatz außerordentlich hoch. Es wurde praktisch nur der (−)-Ester hydrolysiert. Diese hohe Selektivität wird als E > 200 ausgedrückt. Bei einem höheren Umsatz wäre dieser E-Wert aussagekräftiger, da bei niedrigen Umsätzen kleine Schwankungen in der Bestimmung des ee-Werts des Alkohols zu hohen Schwankungen im E-Wert führen können, außerdem kann es bei Abweichungen von den Voraussetzungen zum E- Wert zu einem Abfall der Selektivität mit Fortschreiten der Reaktion kommen. Die Candida rugosa Lipase hat in der Hydrolyse von rac-18 und Transacylierung von rac-12 sehr gute Aktivitäten und Selektivitäten gezeigt. Zunächst wurde die CRL in die Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem mit 10 % tert- Butanol als Cosolvens eingesetzt (Tabelle 2.46). Nach 24 Stunden konnte bei einem Umsatz von 27 % ein ee-Wert von 92 % im Alkohol (−)-14 bei einem ee-Wert im Ester von 38 % erzielt werden. Dies entspricht einem E-Wert von 34. Wie schon bei der Hydrolyse des Esters rac-18 wird von dem Enzym CRL, wie zuvor auch von der CAL-B, das (−)-Enantiomer des Substrats bevorzugt umgesetzt. Die erzielte Selektivität ist niedriger als die, die in der Hydrolyse der isomeren Verbindung rac-18
- 138. 124 THEORETISCHER TEIL erzielt wurde. Für eine Hydrolyse in einem größeren präparativen Maßstab wäre die Selektivität aber hoch genug. In Abb. 2.22 auf S. 58 ist die Abhängigkeit der ee- Werte von Substrat (+)-22 und Produkt (−)-14 bei einer Selektivität von E = 34 dargestellt. Aus dieser Abbildung geht hervor, daß ab einem Umsatz von ca. 60 % der nicht umgesetzte Ester enantiomerenrein vorliegt. Tabelle 2.46: CRL-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-22 in verschiedenen Reaktionssystemen (Candida rugosa Lipase; 4.5 U/ml) Reaktions- ee Ester ee Alkohol Reaktionsbedingungen Umsatz E-Wert zeit (+)-22 (−)-14 Einphasensystem (Phosphatpuffer, pH 7.0; 24 h 27 % 38 % 92 % 34 10 % tert-Butanol) Zweiphasensystem (Phosphatpuffer, pH 7.5; 5d 34 % 37 % 69 % 8 MTBE; 1 : 1) Nach der Hydrolyse im wäßrigen Einphasensystem, wurde die CRL-katalysierte Hydrolyse im organisch-wäßrigen Zweiphasensystem als Reaktionsmedium durchgeführt (Tabelle 2.46). Bisher zeigte die CRL im Zweiphasensystem bei meist ähnlicher Aktivität eine höhere Selektivität. Im Fall des Substrates rac-22 ist die Reaktionsgeschwindigkeit im organisch-wäßrigen Zweiphasensystem erheblich niedriger als im Einphasensystem. Zum Erreichen eines Umsatzes von 34 % werden 5 Tage benötigt. Diese Verlängerung der Reaktionszeit kann durch eine für das Substrat rac-22 weniger günstiger Konformation des Enzyms, welche die Diffusion des Esters in das aktive Zentrum und die anschließende Bildung des Acyl-Enzyms erschwert, hervorgerufen werden. Die Selektivität der Hydrolyse im Zweiphasen- system ist ebenfalls erheblich niedriger als die im Einphasensystem. Dies würde sich durch eine für das Substrat rac-22 weniger günstiger Konformation des Enzyms ebenfalls erklären lassen. Zur Vorhersagbarkeit der Selektivität in Lipasen-katalysierten Reaktionen entwickelten KAZLAUSKAS et al. einfache empirische Modelle (Abb. 2.58). Mit diesen Modellen läßt sich die Selektivität hinsichtlich des bevorzugt reagierenden Enantiomers für sekundäre229 und primäre230 Alkohole vorhersagen, wobei die
- 139. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 125 Substituenten am Stereozentrum nur aufgrund ihrer Größe unterschieden werden.231 Durch gezielte Veränderung von Substraten konnte gezeigt werden, daß die Selektivität durch Erhöhung des Größenunterschieds der Substituenten gesteigert wird. Die Anwendung dieses Models auf große, höher substituierte Verbindungen muß aber nicht immer gelingen, da es nicht für solche Verbindungen im Detail belegt worden ist. HO HO H H M L M L sekundäre Alkohole primäre Alkohole Abb. 2.58: Empirische Selektivitätsmodelle nach KAZLAUSKAS et al. Das jeweils gezeigte Enantiomer wird schneller in einer Lipasen-katalysierten Reaktionen umgesetzt (L = großer Substituent, M = kleiner Substituent). Im Fall des Esters 22 wird von der CRL bevorzugt das (−)-(1R,2S,4S)-konfigurierte Enantiomer umgesetzt. Dies läßt sich mit dem KAZLAUSKAS Modell in Einklang bringen (Abb. 2.59). Zum Vergleich sind in Abb. 2.59 neben dem Alkohol (−)-14 die von der CRL bevorzugten Enantiomere (−)-41193 und (+)-42194 abgebildet. Auf alle drei Enantiomere läßt sich das Selektivitätsmodell nach KAZLAUSKAS et al. anwenden. OH OH OH OMe NMe2 N OMe OH MeO (−)-14 (−)-41 (+)-42 Me2N OH OMe HO (−)-14 Abb. 2.59: Von der CRL entsprechend dem von KAZLAUSKAS et al. entwickelten Modell bevorzugt umgesetzte Enantiomere.
- 140. 126 THEORETISCHER TEIL In weiteren Untersuchungen zur Candida rugosa Lipase wurde das aktive Zentrum dieses Enzyms von KAZLAUSKAS et al. mit dem anderer verglichen.228 Das aktive Zentrum der CRL wird durch eine weite Öffnung beschrieben, die es ermöglicht auch große sekundäre Alkohole als Substrate zu akzeptieren.227 Des weiteren ist eine tunnelartige Tasche in direkter Nähe zum aktiven Zentrum, die den Acylrest aufnehmen kann. Im Vergleich zu dem aktiven Zentrum der CRL verfügt die CE über eine ähnliche weite Öffnung, die es diesem Enzym ermöglicht ebenfalls große sekundäre Alkohole umzusetzen.232 Diese Betrachtungen führten zu der Überlegung die Cholesterolesterase in die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-22 einzusetzen (Abb. 2.60). OH OMe Pr O Me2N O OH CE OMe (+)-22 Pr O Phosphatpuffer- Me2N Lösung (pH 7.0) + O 10 % Cosolvens Me2N OH rac-22 RT OMe HO (−)-14 Abb. 2.60: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22. Die CE-katalysierte Hydrolyse wurde unter den Reaktionsbedingungen des wäßrigen Einphasensystems bei pH 7 mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens durchgeführt. Das Enzym zeigte eine gute Aktivität in der Hydrolyse, daher wurde die Reaktion bereits nach 2.5 Stunden abgebrochen und aufgearbeitet (Tabelle 2.47). Nach dieser Reaktionszeit lag der gebildete Alkohol (−)-14 bei einem Umsatz von 21 % enantiomerenrein vor, der noch nicht umgesetzte Ester hatte 30 % ee. Die Cholesterolesterase hydrolysiert bevorzugt das (−)-Enantiomer und zeigt somit die gleiche Enantiopräferenz wie die CRL. Die in der CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 erreichte Selektivität von E größer 200 ist wesentlich höher als die zuvor beobachteten Selektivitäten. Für ein repräsentatives Beispiel ist der erreichte Umsatz allerdings zu niedrig. Die Reaktion wurde daher wiederholt und nach 19.5 Stunden bei einem Umsatz von 38 % abgebrochen. Bei diesem Umsatz lag der gebildete Alkohol (−)-14 nur noch mit einem ee-Wert von 93 % vor (Tabelle 2.47).
- 141. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 127 Tabelle 2.47: CE-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-22 (9 U/ml; Phosphat- puffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol) Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 2.5 h 21 % 30 % ≥98 % >200 19.5 h 38 % 67 % 93 % 55 Für eine Selektivität von E > 200 hätte er enantiomerenrein vorliegen müssen. Die Selektivität der Reaktion bei einem Umsatz von 38 % läßt sich daher auch nur mit einem E-Wert von 55 beschreiben. Ein geringer Abfall der Selektivität der Reaktion bei höheren Umsätzen wurde auch schon in der PLE-katalysierten Hydrolyse von rac-15 beobachtet (Tabelle 2.9, S 52). Eine Änderung des E-Werts im Verlauf der Reaktion stellt in der Regel eine Abweichungen von den gemachten Voraussetzungen zum E-Wert dar. Bei sehr hohen Selektivitäten ist außerdem zu beachten, daß geringe Schwankungen im gemessenen ee-Wert zu einen großen Differenz im E-Wert führt. Die CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 wurde daraufhin wiederholt und mit dem bereits vorgestellten Verfahren zur Gewinnung der Produkte durch Extraktion bei verschiedenen pH-Werten aufgearbeitet. Zum Aufarbeitung der Reaktion nach 22.5 Stunden wurde die Reaktionslösung mit Diethylether bei pH 7 extrahiert. Es konnte (+)-22 in 53 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 91 % isoliert werden. Nachdem die verbliebene wäßrige Phase durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10 eingestellt wurde, konnte (−)-14 in 45 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 91 % durch Extraktion mit Dichlormethan erhalten werden (Tabelle 2.48).
- 142. 128 THEORETISCHER TEIL Tabelle 2.48: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 mit extraktiver Aufarbeitung (6.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol) Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (+)-22 Ester (+)-22 (−)-14 Alkohol (−)-14 22.5 h 91 % 53 % 91 % 45 % 67 Es konnte eine Selektivität von 67 bei einem Umsatz von ca. 46 % beobachtet werden. Sowohl der nicht umgesetzte Ester (+)-22 als auch der Alkohol (−)-14 liegen mit einem ee-Wert von 91 % vor. Dies Ergebnis stellt eine gute Ausgangsbasis zur Gewinnung der einzelnen Enantiomeren von 14 dar. Würde die Reaktion früher abgebrochen, kann der Alkohol (−)-14 mit hohen ee-Werten erhalten werden (vgl. Tabelle 2.47). Würde man die Reaktion später bei einem Umsatz größer 50 % abbrechen, könnte der enantiomerenreine Ester (+)-22 erhalten werden. Mit dieser präparativen Reaktion konnte demonstriert werden, daß die CE- katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 ein geeignetes Verfahren zur Darstellung der Enantiomeren von 14 darstellt. In der Katalyse mit dem Enzym wurde die höchste Selektivität in der Hydrolyse des Esters rac-22 beobachtet. Somit stellt dieses Enzym einen interessanten Katalysator nicht nur in der Racematspaltung von Tramadol-Analoga dar. Für eine enzymatische Hydrolyse von Tramadol-Analoga in einem präparativen Maßstab kann die geringe Löslichkeiten der entsprechenden Ester unvorteilhaft sein, da dadurch nur geringe Konzentrationen verwendet werden können, die ein erhöhtes Lösungsmittelaufkommen mit den sich daraus ergebenen Konsequenzen notwendig macht. Günstiger für einen Prozeß sind hohe Substratkonzentrationen. Es wurde daher erwogen, das Hydrochlorid des Esters rac-22 in die CE-katalysierte Hydrolyse einzusetzen, da die Hydrochloride von Tramadol-Analoga im allgemeinen sehr gut wasserlöslich sind. Die Verwendung von basischen Verbindungen in Form ihrer Hydrochloride in der Enzym Katalyse ist bisher selten. Eines der wenigen Beispiele hierzu stammt von HUTCHINSON et al., die einen phenolischen Ester mit einem tertiären Amin auch als Hydrochlorid in die PLE-katalysierte Hydrolyse eingesetzt haben (Abb. 2.17 rechts, S. 45)170.
- 143. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 129 Die CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 in Form seines Hydrochlorids wurde mit der gleichen Substratkonzentration (0.014 mol/l) durchgeführt, die auch bei der Verwendung der freien Base als Substrat gewählt wurde (Tabelle 2.49). Das Hydrochlorid des Esters zeigte keinerlei Schwierigkeiten bei der Löslichkeit im wäßrigen Milieu. Ein Cosolvens wäre zur Löslichkeitsvermittlung nicht notwendig, wurde aber zur besseren Vergleichbarkeit mit den zuvor durchgeführten Katalysen mit dem Enzym beibehalten. Eine um ein vielfaches höhere Substratkonzentration wäre wahrscheinlich durch die Verwendung des Hydrochlorids des Substrats möglich. Dies wurde aber zunächst nicht untersucht. Tabelle 2.49: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl (9 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol) Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 19.5 h 43 % 86 % 94 % 89 In Tabelle 2.49 ist das Ergebnis der CE-katalysierten Reaktion zusammengefaßt. Verglichen mit dem zuvor erzielten Ergebnis in der Hydrolyse der freien Base (Tabelle 2.48) ist kein signifikanter Unterschied zu erkennen. Mit einer Selektivität von E = 89 verläuft die Reaktion weiterhin mit hoher Aktivität und Selektivität des Katalysators. Dies ist ein sehr wichtiges Resultat, denn der Einsatz der Substrate in Form ihrer Hydrochloride bringt einige Vorteile: Hydrochloride sind einfach zu handhaben, sie sind lagerstabil, sie sind im wäßrigen Medium sehr gut löslich, und die Hydrochloridfällung stellt eine weitere Möglichkeit zur Aufreinigung des Substrats dar. Eine Darstellung von (+)-14 zur Synthese des gewünschten Produkts (+)-50 durch eine CE-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids des Esters rac-22 stellt zwar eine technisch durchführbare Reaktion dar, ist allerdings umständlich, da der nicht umgesetzte Ester (+)-22 erst noch in einem zusätzlichen Reaktionsschritt hydrolysiert werden müßte. Einfacher wäre eine enzymatische Hydrolyse die direkt zu (+)-14 als Produkt führen würde. Da im Falle des Substrats rac-18 die Enzyme CRL und PLE eine entgegengesetzte Enantiopräferenz zeigten, wurde diese Eigenschaft der Katalysatoren ebenfalls für
- 144. 130 THEORETISCHER TEIL das Substrat rac-22 erhofft, denn dies würde zu dem Ziel eines Hydrolyseproduktes (+)-14 in der PLE-katalysierten Hydrolyse führen. Daher wurde der Ester rac-22 anschließend als Substrat in die PLE-katalysierte Hydrolyse im wäßrigen Einphasensystem mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens eingesetzt (Abb. 2.61). Das Ergebnis dieser Reaktion ist in Tabelle 2.50 zusammen- gefaßt. Me2N OH OMe Pr O O (−)-22 OH PLE OMe Pr O Phosphatpuffer- + Me2N Lösung (pH 8.0) O 10 % Cosolvens OH rac-22 OMe RT HO Me2N (+)-14 Abb. 2.61: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22. Die Aktivität der PLE hinsichtlich der Hydrolyse des Substrats rac-22 ist niedriger als in der Hydrolyse des isomeren Esters rac-18. Die gleiche Verschiebung in der Aktivität hinsichtlich dieser beiden Substrate konnte zuvor schon in der Katalyse der CRL beobachtet werden. Interessanterweise erfolgt die PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 mit einem E-Wert von 34. Die gleiche Selektivität wurde zuvor auch in der CRL-katalysierten Hydrolyse beobachtet. Somit ist die Selektivität dieser Reaktion zwar gut, bleibt aber hinter der Selektivität der Katalyse der CE zurück. Tabelle 2.50: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 (3 U/ml; Phosphat- puffer, pH 8.0; 10 % tert-Butanol) Reaktionszeit Umsatz ee Ester (−)-22 ee Alkohol (+)-14 E 16.5 h 18 % 22 % 93 % 34
- 145. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 131 In der CRL-katalysierten Hydrolyse wurde bevorzugt das (−)-(1R,2S,4S)-konfigurierte Enantiomer umgesetzt. In der PLE-katalysierten Hydrolyse wird hingegen das (+)-(1S,2R,4R)-Enantiomer bevorzugt hydrolysiert. Damit zeigt die Schweineleber- Esterase eine zu den anderen getesteten Enzymen entgegengesetzte Enantiopräferenz. Dieses konnte zuvor auch an dem isomeren Substrat rac-18 beobachtet werden. Somit kann, wie erhofft, der enantiomerenangereicherte Alkohol (+)-14 als direktes Reaktionsprodukt in einer enzymatischen Racematspaltung erhalten werden. Im Hinblick auf eine Synthese des gewünschten Produkts (+)-50 stellt dies eine Vereinfachung dar. Zur Visualisierung der Enantiopräferenz der PLE wurden in Abb. 2.62 die bevorzugt umgesetzten Enantiomere (+)-12 und (+)-14 dem Kastenmodell nach JONES et al. angepaßt dargestellt. PB Ser HL: große, hydrophobe Tasche HS: kleine, hydrophobe Tasche HL HS PF: vordere, polare Tasche PB: hintere, polare Tasche PF Ser: Serin-Rest OH OH MeO MeO OH NMe2 OH NMe2 (+)-12 (+)-14 OH OH OMe OMe HO HO Me2N Me2N Abb. 2.62: Von der PLE entsprechend dem Kastenmodell nach JONES et al. bevorzugt umgesetzte Enantiomere. Wie aus Abb. 2.62 hervorgeht, zeigt die Hydroxylgruppe des Moleküls (+)-12 genau in Richtung der Hydroxylgruppe am Serin-Rest, dagegen zeigt die Hydroxylgruppe von (+)-14 ein wenig von dem Serin-Rest weg in eine andere Richtung. Dies kann die
- 146. 132 THEORETISCHER TEIL Ursache für die Unterschiedliche Aktivität des Enzym hinsichtlich der beiden Substrate sein und erklären, warum rac-18 schneller als rac-22 umgesetzt wird. In beiden Molekülen zeigen die Dimethylaminomethylgruppen in Richtung der vorderen, polaren Tasche. Kommerziell verfügbare PLE ist in der Regel eine Mischung verschiedener Isoenzyme. Analytisch können diese Isoenzyme durch isoelektrische Fokussierung aufgetrennt werden.128a),129 Obwohl 1988 von JONES et al. noch keine wesentlichen Unterschiede in Selektivität und Substratspezifität in der Katalyse der Isoenzyme erkannt werden konnten233, wurde hingegen in neueren Arbeiten von MATTSON et al. signifikante Unterschiede in den katalytischen Eigenschaften der einzelnen Isoenzyme aufgezeigt.130 Da Isoenzym-angereicherte Fraktionen der PLE kommerziell verfügbar sind (z.B. bei ROCHE DIAGNOSTICS als Chirazyme E1 und Chirazyme E2), wurde ebenfalls ein möglicher Einfluß der Isoenzymzusammen- setzung der PLE untersucht. Hierzu wurde das Isoenzym-angereicherte Chirazyme E1 in die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-22 eingesetzt. Mit diesem Enzym wurden zuvor in der GRÜNENTHAL GmbH enzymatische Hydrolysen durchgeführt. Hierbei konnte in systematischen Untersuchungen ein günstiger Einfluß von 16 % Aceton als Cosolvens auf die Hydrolyse von Tramadol-Analoga gefunden werden.184 Auf diese Ergebnisse zurückgreifend wurde ebenfalls ein Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens für die Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 gewählt (Tabelle 2.51). Tabelle 2.51: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 unter Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens mit extraktiver Aufarbeitung (1.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.014 M Substrat) Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14 42 h 27 % 74 % 97 % 23 % 85 Die Reaktion wurde nach einer Reaktionszeit von 42 Stunden bei einem Umsatz von ca. 24 % abgebrochen und nach der Methode der Extraktion bei verschiedenen pH-Werten aufgearbeitet. Wie zuvor sind die isolierten Ausbeuten sehr gut, da die
- 147. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 133 Gesamtausbeute 97 % beträgt. Die Trennung erfolgt aufgrund der unterschiedlichen Hydrophobizität der Verbindungen. Ausgedrückt werden kann dies anhand von ausreichend großen Unterschiede im log P-Wert (Tabelle 2.52). Dabei handelt es sich in diesem Fall um den Logarithmus des Verteilungskoeffizienten zwischen Wasser und Cyclohexan. Tabelle 2.52: Log P-Werte (Wasser / Cyclohexan) für rac-14 und rac-22 bei verschiedenen pH-Werten pH rac-14 rac-22 7.0 -2.691 0.557 7.4 -2.297 0.946 8.0 -1.724 1.498 10.0 -0.680 2.333 12.0 0.633 2.360 Die Selektivität der Chirazyme E1 Präparation in der Hydrolyse des Esters rac-22 ist sehr hoch. Der Alkohol (+)-14 konnte mit einem ee-Wert von 97 % und der Ester (−)-22 mit einem ee-Wert von 27 erhalten werden. Insgesamt ist also die Selektivität mit einem E-Wert von 85 größer als die der PLE-katalysierten Reaktion. Damit stellt das Isoenzym-angreicherte Chirazyme E1 einen geeigneteren Katalysator als die gesamte Isoenzym-Mischung PLE dar. Zudem scheint dieses Ergebnis die von MATTSON et al. gemachte Aussage, daß die einzelnen Isoenzyme signifikante Unterschiede hinsichtlich der Selektivität zeigen, zu belegen. Da allerdings im Rahmen dieser Arbeit keine Untersuchungen zur Zusammensetzung der einzelnen Enzym-Katalysatoren und ihrer Selektivität gemacht wurden, konnte dieser Gesichtspunkt nicht weiter vertieft werden. Im Hinblick auf eine mögliche Anwendung dieses Verfahrens wurde der Esters rac-22 auch in Form des Hydrochlorids dieser Verbindung in die Chirazyme E1- katalysierte Hydrolyse unter Verwendung von 16 % Aceton als Cosolvens eingesetzt. Der Verlauf des Umsatzes sowie der ee-Werte von Substrat und Produkt ist durch Entnahme einzelner Proben über einen Zeitraum von 23 Stunden verfolgt worden (Abb. 2.63). Es ist zu erkennen, daß bis zu einem Umsatz von 12 % der Alkohol
- 148. 134 THEORETISCHER TEIL (+)-14 nahezu enantiomerenrein vorliegt (E > 200) und daß danach der ee-Wert fällt. Entsprechend dem Gegebenheiten einer kinetischen Racematspaltung steigt der ee-Wert des Esters (−)-22 mit dem Umsatz. Nach 22.5 Stunden liegt der Alkohol mit einem ee-Wert von 95 % und der Ester mit einem ee-Wert von 28 % vor, dies entspricht einem E-Wert von 50 (Tabelle 3.50, obere Zeile). Danach wurde die Reaktionsmischung mit der Methode der Extraktion bei unterschiedlichen pH-Werten aufgearbeitet (Tabelle 3.50, untere Zeile). 100 90 E = 50 80 70 ee-Wert (%) 60 ee-Wert Ester ee-Wert Alkohol 50 40 30 E = 50 20 10 0 0 5 10 15 20 Umsatz (%) Abb. 2.63: Verlauf der ee-Werte von Alkohol (+)-14 und Ester (−)-22 in der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl. Wie aus Tabelle 2.53 hervorgeht, konnte der Alkhohl nur mit einem ee-Wert von 91 % erhalten werden und somit ergibt sich ein E-Wert von 27. Da der ee-Wert des Alkohols nach 22.5 Stunden in der Reaktionslösung noch bei 95 % lag und bei der Extraktion des Alkohols (+)-14 noch Reste des zuvor nur unvollständig extrahierten Esters (−)-22 erhalten wurden, ist anzunehmen, daß der Abfall in dem ee-Wert des Alkohols während der Aufarbeitung erniedrigt worden ist. Während der Extraktion bei pH 10 sind vermutlich Teile des (−)-Ester zum (−)-Alkohol hydrolysiert, was einen
- 149. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 135 Abfall des ee-Wertes von (+)-14 zur Folge hat. Somit beschreibt der aus der Reaktionslösung bestimmte E-Wert von 50 die Selektivität der kinetischen Racematspaltung zutreffender. Die im Vergleich zur Hydrolyse der freien Base des Esters rac-22 geringere Selektivität läßt sich durch die geänderten Reaktions- bedingungen erklären. In der Hydrolyse des Hydrochlorids wurde eine Substratkonzentration von 0.200 mol/l gewählt, die um ein vielfaches höher ist, als die in der Hydrolyse der freien Base mit 0.014 mol/l. Um eine vergleichbare Reaktionsgeschwindigkeit in der Hydrolyse des Hydrochlorids zu erreichen, ist die Enzymmenge um etwa den gleichen Faktor von 1.6 U/ml auf 22.8 U/ml erhöht worden. Aus Tabelle 2.51 und Tabelle 2.53 läßt sich abschätzen, daß die Reaktionsgeschwindigkeit tatsächlich in etwa gleich groß ist. Insgesamt hat die Erhöhung der Substrat- und Enzymkonzentration zu einer kleinen Verringerung der Selektivität in der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse geführt. Tabelle 2.53: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl unter Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens mit extraktiver Aufarbeitung (22.8 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.200 M Substrat) Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14 (22.5 h) (26 %) (95 %) (50) 24 h 28 % 65 % 91 % 18 % 27 Da das Hydrochlorid des Esters rac-22 auch in der Konzentration von 0.231 mol/l ohne den Zusatz von Aceton als Cosolvens gut löslich ist, entsteht die Frage, ob überhaupt ein Cosolvens in der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse von rac-22⋅HCl notwendig ist. Um diese Fragestellung zu untersuchen, wurden zwei parallele Reaktionen durchgeführt. In einer Reaktion wurde unter sonst identischen Bedingungen (22.8 U/ml Chirazyme E1; Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.200 M rac-22⋅HCl) 16 % Aceton als Cosolvens verwendet, in der anderen kein Cosolvens. Aus beiden Reaktionen wurden Proben entnommen, die dann extrahiert und analysiert wurden. Die Reaktionsgeschwindigkeiten der Reaktionen lassen sich in Abb. 2.64 erkennen, in welcher der Verlauf des Umsatzes über die Zeit dargestellt
- 150. 136 THEORETISCHER TEIL ist. Beide Zeit-Umsatz Kurven zeigen nach ca. 50 Stunden Reaktionszeit einen Rückgang im Umsatz. Dies wurde durch einen systematischen Fehler, wahrscheinlich bei der Extraktion der Probe oder durch eine weitere Temperatur- schwankung, verursacht. Es ist deutlich zu erkennen, daß die Reaktion ohne Zusatz von Aceton als Cosolvens mit höherer Reaktionsgeschwindigkeit verläuft. Beispielsweise wird in der Katalyse ohne Cosolvens bereits nach 7.5 Stunden ein Umsatz von 21 % erreicht. Zum Vergleich wird dieser Umsatz in der Katalyse mit Aceton als Cosolvens erst nach 175 Stunden (1 Woche) beobachtet. Dieser Unterschied in der Aktivität des Enzyms wird wahrscheinlich durch eine Inhibition des Enzyms durch das Cosolvens Aceton verursacht. 45 40 E = 31 E = 27 E = 27 Umsatz = 41 % E =157 35 E = 30 30 mit 16 % Aceton als Cosolvens Umsatz (%) ohne Cosolvens 25 E > 200 20 E > 200 15 E > 200 Umsatz = 21 % 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Reaktionszeit (h) Abb. 2.64: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse von rac-22⋅HCl mit und ohne Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens. Im Vergleich zu den zuvor vorgestellten Reaktionen verlaufen beide Reaktionen mit eine niedrigeren Reaktionsgeschwindigkeit. Dies ist auf einen technischen Defekt zurückzuführen, der die Reaktionstemperatur im Vergleich zu den vorherigen Versuchen herabsetzte. Neben dem Einfluß des Acetons auf die Aktivität der Enzymkatalyse ist auch ein Einfluß des Cosolvens auf die Selektivität der
- 151. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 137 Chirazyme E1-katalysierten Reaktionen zu beobachten. Ein direkter Vergleich der Selektivitäten beider Reaktionen in Abb. 2.64 ist aber aufgrund des niedrigen Umsatzes in der Reaktion mit Cosolvens kaum möglich, da ein Vergleich der E-Werte nur bei gleichem Umsatz aussagekräftig ist. Bei Erfüllung aller in Kap. 2.3.1.1 gemachten Voraussetzungen ist der E-Wert über den Verlauf der Reaktion konstant. Im Verlauf der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten enzymatischen Hydrolysen von Tramadol-Analoga konnte allerdings häufiger ein langsames Abfallen des E-Wertes mit dem Fortschreiten einer Reaktion beobachtet werden. Aus Abb. 2.64 geht hervor, daß in der Reaktion mit dem Cosolvens Aceton nach 175 Stunden ein E-Wert größer 200 bei einem Umsatz von 21 % beobachtet wird. In der Reaktion ohne Cosolvens ist bei dem gleichen Umsatz von 21 % der E-Wert allerdings auch größer 200, dieser Umsatz wird nur schon viel früher nach 7.5 Stunden erreicht. Somit verlaufen beide Reaktionen in ihrem Anfang hochselektiv. In der Reaktion ohne Cosolvens ist danach allerdings ein starker Abfall in der Selektivität mit dem Umsatz der Reaktion zu beobachten. Bei 40 % Umsatz läßt sich die Selektivität nur noch durch einen E-Wert von 27 beschreiben. Hier ist ein direkter Vergleich mit der Reaktion mit einem Zusatz von Aceton als Cosolvens nicht mehr möglich. Eine von der GRÜNENTHAL GmbH beobachtete Abhängigkeit der Chirazyme E1- katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl vom Acetonzusatz ist in Tabelle 2.55 auf S. 142 dargestellt. Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Alkohols 14 erfolgte durch Vergleich des Drehwerts, der bereits für die Verbindung (+)-50⋅HCl, das Hydrochlorid des para-Fluorbenzylethers zum Alkohol (+)-14, publiziert ist.97 Hierbei erfolgte die Bestimmung der Absolutkonfiguration des (+)-50⋅HCl durch Röntgen- strukuranalyse.184 Die Bestimmung der Absolutkonfigurationen der Ester 22, 23, 24 und 45 erfolgte in Analogie zu der des Alkohols 14.
- 152. 138 THEORETISCHER TEIL 2.4.2.7 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3- dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl- ester (rac-23) Da bisher keine Racematspaltung über diastereomere Salzbildung mit dem Alkohol rac-14 gelungen ist, stellt die Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung bisher das einzige Verfahren zur Gewinnung der Enantiomeren von 14 in einem präparativen Maßstab dar. Somit ist die GRÜNENTHAL GmbH bei diesem Substrat auf eine enzymatische Methode zur Gewinnung der einzelnen Enantiomeren angewiesen. Zugleich ist die Verbindung (+)-50 auch eine in der präklinischen Forschung weit vorangeschrittene Verbindung. Dies macht die Entwicklung einer enzymatischen Methode zur Synthese von (+)-14 notwendig, welche die Bereitstellung von Kilogrammmengen in einem Technikumsmaßstab zu leisten vermag. Ein endgültiger Produktionsprozeß für die Verbindung (+)-50 sollte zur dritten klinischen Testphase bekannt sein. Im Hinblick auf einen technisch durchführbaren enzymatischen Prozeß stellt sich die Frage, ob eine Veresterung von rac-14 mit der Buttersäurechlorid zur Darstellung von rac-22 unter dem Aspekt einer möglichen Geruchsbelästigung realisierbar ist. Die technische Durchführbarkeit dieser Reaktion und der anschließenden enzymatischen Hydrolyse ist in jedem Fall gegeben.184 Aufgrund dieser Vorbehalte wurde die Möglichkeit einer Variation des Acylrestes des Substrats in Erwägung gezogen. In Vorversuchen zeigte sich, daß Valerian- säurechlorid ebenfalls sehr penetrant unangenehm riecht und somit auch nicht in Frage kommt. Aus wirtschaftlicher Sicht läßt sich eine Verlängerung des Acylrestes bis zur Hexansäure (C6) vertreten. Eine Verkürzung des Acylrestes ist ebenfalls eine weitere Möglichkeit. Aufgrund der schlechten Erfahrungen in der Synthese des Acetats rac-24 wurde dieser Ansatz zunächst aber nicht verfolgt, sondern vielmehr das Capronat von rac-14 dargestellt und dessen Eigenschaften als Substrat in der PLE-katalysierten Hydrolyse untersucht (Abb. 2.65).
- 153. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 139 Me2N OH OMe C5H11 O O (−)-23 OH Chirazyme E1 OMe C5H11 O Phosphatpuffer- + Me2N Lösung (pH 7.0) O 16 % Cosolvens OH rac-23 RT OMe HO Me2N (+)-14 Abb. 2.65: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-23. Die Reaktionsbedingungen der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-23 wurden entsprechend den zuvor durchgeführten Hydrolysen gewählt. Es wurde die freie Base als Substrat eingesetzt. Durch den längeren Acylrest ist das Substrat rac-23 hydrophober als beispielsweise das Butyrat rac-22. Als eine Konsequenz war eine herabgesetzte Löslichkeit des Substrats zu beobachten. Zu Beginn der Reaktion war die Reaktionslösung stark getrübt und klärte sich dann langsam mit Voranschreiten des Umsatzes. Die Aktivität des Katalysators und damit auch die Reaktionsgeschwindigkeit war moderat. Nach 24 Stunden, bei einem Umsatz von ca. 46 %, wurde mit der Methode der Extraktion bei verschiedenen pH- Werten aufgearbeitet. Bei einem pH-Wert von 7.0 konnte durch Spuren von Hexan- säure (Capronsäured) verunreinigter und daher penetrant ziegenähnlich riechender Ester (−)-23 mit einem ee-Wert von 92 % in 54 % Ausbeute isoliert werden. Anschließend wurde bei pH 10 der Alkohol (+)-14 einem ee-Wert von 77 % in 46 % Ausbeute erhalten (Tabelle 2.54). Die Selektivität der Reaktion läßt sich durch E = 24 beschreiben und verläuft somit mit geringerer Selektivität als die Hydrolyse des Butyrats rac-22. d capra (lat.) = Ziege.
- 154. 140 THEORETISCHER TEIL Tabelle 2.54: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-23 unter Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens (3.1 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0) Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14 24 h 92 % 54 % 77 % 46 % 24 Unter anwendungstechnischen Aspekten ist der ziegenähnliche Geruch der Hexansäure ein ausschlaggebender Nachteil, da keine Verbesserung gegenüber dem Geruch der Buttersäure erzielt worden ist. Hier könnte die Verwendung des Propionats als Acylrest den Mittelweg zwischen mangelnder Stabilität des Substrats (Acetat) und Geruchsbelästigung (Butyrat und höhere Ester) darstellen. Der zu beobachtende Einfluß des Acylrests auf die Selektivität der Enzym- katalysierte Hydrolyse ist ebenfalls eine Nachteil der Verwendung des Substrats rac-23. Da das Enzym Schweineleber-Esterase bevorzugt kurzkettige wasserlösliche Ester wie Acetate hydrolysiert, stellt das Substrat rac-23 durch seinen großen Acylrest ein eher ungeeignetes Substrat dar. 2.4.2.8 Darstellung von (+)-14 durch enzymatische Racematspaltung im präparativen Maßstab Zur Bereitstellung erster größerer Mengen an (+)-14 im Halbkilogramm-Maßstab für die präklinische Entwicklung des Wirkstoffs (+)-50 in der GRÜNENTHAL GmbH wurde dort eine optimierte Laborsynthese entwickelt und eingesetzt. Ein solches Verfahren stellt eine besondere Herausforderung an die Effizienz der Enzym-katalysierten Racematspaltung und die Aufarbeitungsmethode dar. Aufgrund der Robustheit der enzymatischen Hydrolyse als Methode zur Darstellung enantiomerenangereicherter Verbindungen wurde daher von der GRÜNENTHAL GmbH eine PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 durchgeführt (Abb. 2.66). Es wurden 200 g Hydrochlorid des Esters rac-22 mit 1.5 g Chirazyme E1 im wäßrigen Einphasensystem aus Phosphatpuffer (pH 7.0) und 16 % Aceton als Cosolvens umgesetzt.184 Bei einem Umsatz von ca. 52 % wurde zur Aufarbeitung die auch in
- 155. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 141 einem Kilogramm-Maßstab einfach und effizient durchzuführenden Methode der Extraktion von Ester und Alkohol bei jeweils unterschiedlichen pH-Werten verwendet. Diese Methode hat den Vorteil auf chromatographische Trennverfahren verzichten zu können, da solche Verfahren in einem späteren Produktionsprozess nur schwer umzusetzen ist. Weiterhin wurde während der Durchführung darauf verzichtet den pH-Wert durch Zugabe von Natronlauge konstant zu halten. Dies führte während der Reaktion zu einer Schwankung des pH-Werts im Phosphatpuffers um 0.5. Me2N OH OMe Pr O O OH (−)-22 Chirazyme E1 OMe Pr O Phosphatpuffer- Me2N Lösung (pH 7.0) + O ⋅HCl 16 % Aceton OH RT OMe rac-22⋅HCl HO Me2N (+)-14 Abb. 2.66: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl. Des weiteren wurde als Substrat in der enzymatischen Hydrolyse nicht mehr die freie Base des Esters rac-22 eingesetzt, da diese in höheren Konzentrationen nicht mehr im wässrigen Medium löslich ist. Stattdessen wurde das Hydrochlorid der Verbindung eingesetzt, welches eine sehr viel größere Löslichkeit hat. Die Isoenzym- angereicherte PLE-Präparation Chirazyme E1 wurde als Katalysator wegen der Enantiopräferenz für das (+)-Enantiomer eingesetzt, so daß der benötigte (+)-Alkohol direkt als Reaktionsprodukt erhalten wird. Weiterhin verfügt das Chirazyme E1 gegenüber der PLE über eine höhere Selektivität hinsichtlich des Substrates rac-22. Auch stellt allgemein eine lyophilisierte Form des Enzyms, wie beim Chirazyme E1, einen einfach zu handhabenden Katalysator dar. Ebenfalls wurde Aceton als Cosolvens verwendet. In der GRÜNENTHAL GmbH konnte eine deutliche Abhängigkeit des ee-Wertes des gebildeten Alkohols (+)-14 von der zugesetzten Menge an Aceton beobachtet werden (Tabelle 2.55).184
- 156. 142 THEORETISCHER TEIL Tabelle 2.55: Abhängigkeit der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl vom Acetonzusatz bei einer Reaktionszeit von 48 Stunden (Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.5 g Substrat) Aceton- ee Ester Gehalt ee Alkohol Gehalt E zusatz (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14 16 % 94 % 56 % 96 % 44 % 174 9% 98 % 51 % 90 % 49 % 86 0% 98 % 50 % 73 % 50 % 28 Insgesamt konnte in diesem Versuch der nicht umgesetzte Ester (−)-22 in 99 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 72 % und der gebildete Alkohol (+)-14 in 96 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 93 % isoliert werden (Tabelle 2.56). Durch anschließende Kristallisation des Alkohols konnte dessen ee-Wert auf >99 % gesteigert werden.184,234 Tabelle 2.56: Von der GRÜNENTHAL GmbH durchgeführte Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl unter Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens mit extraktiver Aufarbeitung (Phosphatpuffer, pH 7.0; 200 mM Substrat) Enzym Reaktions- Umsatz Ester (−)-22 Alkohol (+)-14 E zeit Ausbeute ee Ausbeute ee Chirazyme E1 15 h 52 % 99 % 72 % 96 % 93 % 59 (22.4 U/ml) Eine geringe Steigerung der Selektivität der Reaktion läßt sich beobachten, wenn man nach der Hälfte der Reaktionszeit nochmals Enzym zugibt. Hiermit konnte gezeigt werden, daß eine enzymatische Laborsynthese, wie sie im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurde, in eine Multigramm-Maßstab zur Darstellung erster Kilogramm-Mengen übertragen werden kann. Als besonders wirkungsvoll ist dabei die Aufarbeitung durch Extraktion bei verschiedenen pH-Werten zu betrachten.
- 157. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 143 Sie stellt einen Schlüsselschritt für die Aufarbeitung der enzymatische Hydrolyse dar. Diese Methode hat sich im Halbkilogramm-Maßstab in der GRÜNENTHAL GmbH etabliert und würde sich auch in einen späteren Produktionsprozeß einsetzten lassen. Eine alternative Möglichkeit zu einer effizienten Trennung von Ester und Alkohohl bei einer enzymatischen Racematspaltung stellt die von THEIL et al. vorgestellte Extraktion nach Lipasen-katalysierter Fluoracylierung dar.235 Dies Verfahren basiert auf der Verteilung zwischen organischer und fluoriger Phase und erlaubt eine Isolierung der Produkte aus dem Reaktionsgemisch, die auch in einem industriellen Großmaßstab angewendet werden kann. O CAL-B OH CF3(CF2)7(CH2)2CO2CH2CF3 O (CF2)7CF3 OH + Ph MeCN, Rt Ph Ph Extraktion mit n-C6F14 O O (CF2)7CF3 OH Ph Ph 47 %, 98 % ee 48 %, > 98 % ee fluorige Phase (n-C6F14) org. Phase (MeOH) Abb. 2.67: Lipasen-katalysierte kinetische Racematspaltung von Phenylethanol und anschließender extraktiver Trennung mit Hilfe eines fluorig-organischen Zweiphasensystems. In einer CAL-B-katalysierten Transacylierung wird hierzu das schneller reagierende (R)-Enantiomer des Phenylethanols mit einem hochfluorierten Acylrest acyliert (Abb. 2.67). Der mit diesem „Teflon-Schwanz“236 ausgestatte Ester kann anschließend selektiv n-Perfluorhexan extrahiert werden. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, daß sich in der fluorigen Phase auch noch der Überschuß an fluorierten Acylierungsmittel befindet, dessen Abtrennung noch nötig sein kann.
- 158. 144 THEORETISCHER TEIL 2.4.2.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2- Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) Nachdem mit der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 bereits ein Verfahren zur Darstellung des Alkohols (+)-14 und damit zur Synthese des gewünschten Produkts (+)-50 zur Verfügung steht, wurde die Enzym-katalysierte Transacylierung von rac-14 unter dem Aspekt untersucht, eine Möglichkeit zur Racematspaltung neuer hydrophober und daher im wäßrigen Milieu unlöslicher Tramadol-Analoga zu schaffen. Ein Verfahren zur enzymatischen Acylierung im organischen Medium bietet neben dem bereits etablierten hydrolytischen Verfahren den Vorteil alternativer Reaktionsbedingungen. Da in der Lipasen-katalysierten Hydrolyse bevorzugt (−)-14 gebildet wurde, wird in der Umkehrrektion, der Enzym- katalysierte Transacylierung von rac-14 im organischen Medium, ebenfalls (−)-14 bevorzugt acyliert und es kann wie in der PLE-katalysierten Hydrolyse das gewünschte (+)-Enantiomer des Alkohols als Produkt isoliert werden (Abb. 2.68). Me2N OH OMe R O O (−)-Ester OH Lipase OMe HO Vinylester organisches + Me2N Lösungsmittel OH rac-14 RT OMe HO Me2N (+)-14 Abb. 2.68: Lipasen-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14. Zunächst wurde die Candida rugosa Lipase als Katalysator in die Transacylierung des Alkohols rac-14 eingesetzt. Als Acyldonoren wurden Vinylacetat und Isopropenylacetat in Toluol und Acyldonor als Lösungsmittel verwendet. Die Ergebnisse dieser Reaktionen sind in Tabelle 2.57 zusammengefaßt. Wie schon zuvor in der CRL-katalysierten Hydrolyse der korrespondierenden Ester rac-22 und rac-18 zu beobachten war, ist die Aktivität der CRL hinsichtlich des Alkohols rac-12
- 159. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 145 höher als hinsichtlich des Alkohols rac-14. Die in den CRL-katalysierten Transacylierungen des Alkohols rac-14 beobachteten Reaktionsgeschwindigkeiten sind gering, ebenso die beobachteten Selektivitäten. Die CRL empfiehlt sich daher eher als Katalysator für die Substrate 12 und 18. Interessanterweise wird in CRL- katalysierten Acylierung mit Isopropenylacetat in Toluol der höchste Umsatz bei höchster Selektivität erzielt. Dies Ergebnis unterstützt die These, daß während der Reaktion gebildetes Acetaldehyd das Enzym deaktiviert. In einem solchen Fall bietet sich die Verwendung von Isopropenylacetat als Acylierungsmittel an. Tabelle 2.57: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat und Isopropenylacetat (37 U/ml) Reaktionsbedingungen nach E-Wert (Äquiv.) 16 d Umsatz 18 % Vinylacetat (6), ee Ester (−)-24 44 % 5 Toluol ee Alkohol (+)-14 72 % Umsatz 11 % Vinylacetat ee Ester (−)-24 47 % 4 als Solvens ee Alkohol (+)-14 48 % Umsatz 25 % Isopropenylacetat (6), ee Ester (−)-24 68 % 14 Toluol ee Alkohol (+)-14 87 % Umsatz 12 % Isopropenylacetat ee Ester (−)-24 77 % 10 als Solvens ee Alkohol (+)-14 35 % Eine in der jüngeren Literatur häufig mit großem Erfolg zur Acylierung sekundärer Alkohole verwendete Enzympräparation ist das Novozym 435, welches eine auf einem makroporösen Acrylharz immobilisierte Candida antarctica Lipase Typ B ist.126 Daraufhin wurde das Novozym 435 in die Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat in den Lösungsmitteln Toluol und Dichlormethan eingesetzt (Tabelle
- 160. 146 THEORETISCHER TEIL 2.58). Die Aktivität dieses Enzyms hinsichtlich des Substrats rac-14 ist verglichen mit den zuvor durchgeführten enzymatischen Transacylierung außerordentlich hoch. Bereits nach 48 Stunden werden Umsätze von 70 % bzw. 79 % erreicht. Die Selektivität in beiden Reaktionen ist auch sehr hoch. In dem polaren Lösungsmittel Dichlormethan wird ein E-Wert von 99 erzielt. Tabelle 2.58: Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat (10 mg immobilisierte CAL-B) Reaktionsbedingungen nach E-Wert (Äquiv.) 48 h Umsatz 70 % Vinylacetat (6), ee Ester (−)-24 90 % 38 Toluol ee Alkohol (+)-14 67 % Umsatz 79 % Vinylacetat (6), ee Ester (−)-24 90 % 99 Dichlormethan ee Alkohol (+)-14 ≥98 % Auf Basis dieser guten Ergebnisse, wurde daraufhin Vinylpropionat als Acylierungsmittel in die Novozym 435-katalysierte Transacylierung eingesetzt. Um den Einfluß des Lösungsmittels auf das Ergebnis der Transacylierung zu untersuchen, wurden als Lösungsmittel Toluol, Toluol mit einem Zusatz von 0.2 % Wasser, Dichlormethan und Acylierungsmittel eingesetzt (Tabelle 2.59). Von JUNGEN ist zuvor in der Katalyse mit MPEG/PLE in Toluol als Lösungsmittel die höchste Reaktionsgeschwindigkeit bei einem Zusatz von 0.2 Vol% Wasser beobachtet worden.85 Diesem Ergebnis zufolge wurde die Verwendung des Zusatzes an Wasser zum Lösungsmittel in der CAL-B Katalyse untersucht. Alle Reaktionslösungen waren zu Beginn der Reaktion klar und farblos. Nach 24 Stunden zeigten alle Reaktionen eine milchige Trübung. In der Reaktion mit H2O-Zusatz war zusätzlich noch ein weißer Niederschlag zu erkennen. Nach 24 Stunden wurden alle Reaktionen bei einem Umsatz von 50 % abgebrochen. In Toluol als Lösungsmittel wurde eine hohe Selektivität von E = 90 beobachtet. Verglichen mit dem Acylierungsmittel Vinylacetat ist hier eine Steigerung in der Selektivität der Novozym 435-katalysierten Acylierung erreicht worden. Ein Zusatz von 0.2 % Wasser zum Lösungsmittel Toluol führt
- 161. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 147 sowohl zu einer Erniedrigung der Aktivität des Enzyms hinsichtlich des Substrats rac-14 als auch zu einer Erniedrigung der Selektivität der Reaktion. Von RUPPERT84 und JUNGEN85 wurde zuvor eine Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit und der Selektivität der PLE-katalysierten Transacylierung geschildert. Dieses konnte nicht auf die CAL-B katalysierte Transacylierung übertragen werden. Ein anzunehmender Grund hierfür ist eine aufgrund der hohen Aktivität des Enzym verstärkte Hydrolyse des Acyldonors als Nebenreaktion. Diese „Nebenaktivität“ des Enzyms führt zu dem scheinbar geringeren Umsatz hinsichtlich des umgesetzten Substrats rac-14. Tabelle 2.59: Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat (10 mg immobilisierte CAL-B) Reaktionsbedingungen nach E-Wert (Äquiv.) 24 h Umsatz 51 % Vinylpropionat (5), ee Ester (−)-45 92 % 89 Toluol ee Alkohol (+)-14 95 % Umsatz 35 % Vinylpropionat (5), ee Ester (−)-45 89 % 30 Toluol mit Zusatz von H2O (0.2 %) ee Alkohol (+)-14 56 % Umsatz 50 % Vinylpropionat (5), ee Ester (−)-45 98 % >200 Dichlormethan ee Alkohol (+)-14 86 % Umsatz 52 % Vinylpropionat ee Ester (−)-45 97 % 192 als Solvens ee Alkohol (+)-14 88 % In den Lösungsmitteln Dichlormethan und Acylierungsmittel werden außerordentlich hohe Selektivitäten in der enzymatischen Acylierung von rac-14 erzielt. In dem Lösungsmittel Dichlormethan werden mit Vinylpropionat als Acylierungsmittel höhere Selektivitäten als mit Vinylacetat erzielt, dies wurde zuvor auch in Toluol beobachtet.
- 162. 148 THEORETISCHER TEIL In der Reaktion des achiralen Acylierungsreagenzes mit dem Enzym wird der Acyl/Enzym-Komplex gebildet. Da sich im diesem Komplex die Acylgruppe direkt im aktiven Zentrum befindet, beeinflußt die Struktur des Carbonsäureteils des Enolesters die Steuerung der Enantiomeren-Diskriminierung beim Angriff des chiralen Nucleophils (Abb. 2.69).237 Untersuchungen zum Einfluß der Kettenlänge von Enolestern auf das Ergebnis von Transacylierungen lassen den Schluß zu, daß die optimale Kettenlänge sowohl vom verwendeten Enzym als auch von der Struktur des Substratalkohols abhängt. Dies macht eine individuelle Optimierung der enzymatischen Transacylierung für jedes Substrat notwendig. Abb. 2.69: Einfluß des Acyldonors auf die Steuerung der Enantiomeren- Diskriminierung eines Enzyms.237a) Insgesamt stellt die Novozym 435 katalysierte Transacylierung von rac-14 eine interessante Alternative zur Gewinnung der Enantiomeren von 14 dar. Aktivität und Selektivität des Enzyms sind hervorragend. Um das vorhandene Potential dieses Katalysators zu erschließen, wurde die Katalysatormenge halbiert und der Einfluß auf die Transacylierung in den Lösungsmitteln Toluol und Vinylpropionat untersucht (Tabelle 2.60). Zusätzlich wurde in einer weiteren Reaktion ein Zusatz von Triethylamin zum Lösungsmittel Toluol gemacht. Interessanterweise zeigten alle Reaktion, mit Ausnahme der Reaktion unter Zusatz von Triethylamin, nach ca. 48 Stunden eine milchige Trübung. Wie aus Tabelle 2.60 hervorgeht, erreichen alle drei Reaktionen nach 7.6 Stunden einen Umsatz von ca. 50 % und bleiben nahezu bei diesem Umsatz bis zum Reaktionsende nach 47.75 Stunden stehen. Da die Reaktionsgeschwindigkeit des langsamer reagierenden Enantiomers im Vergleich zu dem des schneller reagierenden vernachlässigbar gering ist, spricht dies für eine hohe Enantiomeren-Diskriminierung des Enzyms. Entsprechend sind die E-Werte aller drei Reaktionen auch hoch (Tabelle 2.61).
- 163. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 149 Tabelle 2.60: Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat (5 mg immobilisierte CAL-B) Reaktionsbedingungen 7.6 h 23.3 h 47.75 h (Äquiv.) Umsatz 51 % 53 % 53 % Vinylpropionat (5), ee Ester (−)-45 88 % 91 % 91 % Toluol ee Alkohol (+)-14 91 % 98 % ≥98 % Umsatz 50 % 53 % 52 % Vinylpropionat ee Ester (−)-45 92 % 93 % 92 % als Solvens ee Alkohol (+)-14 93 % ≥98 % ≥98 % Vinylpropionat (5), Umsatz 54 % 55 % 56 % Triethylamin (0.25), ee Ester (−)-45 92 % 93 % 91 % Toluol ee Alkohol (+)-14 ≥98 % ≥98 % ≥98 % Der erzielte E-Wert im Lösungsmittel mit nur 5 mg Katalysator entspricht dem der mit 10 mg erhalten wurde. Somit ist hier eine Reduzierung der Katalysatormenge problemlos möglich. In Vinylpropionat als Solvens ist der erzielte E-Wert zwar ein wenig geringer als mit der doppelten Katalysatormenge, aber noch in der zuvor erzielten Größenordnung, so daß hier eine Reduzierung der Enzymmenge noch vertretbar ist.
- 164. 150 THEORETISCHER TEIL Tabelle 2.61: E-Werte der Novozym 435-katalysierten Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat (5 mg immobilisierte CAL-B) Reaktionsbedingungen 7.6 h 23.3 h 47.75 h Mittel (Äquiv.) Vinylpropionat (5), 49 97 111 84 Toluol Vinylpropionat 81 144 125 119 als Solvens Vinylpropionat (5), 125 144 111 131 Triethylamin (0.25), Toluol Interessanterweise wird im Lösungsmittel Toluol unter Zusatz von Triethylamin eine höhere Selektivität als in reinem Toluol erzielt. Durch einen Zusatz von Triethylamin kann eine Steigerung der Selektivität erreicht werden. Diese Beobachtung ist auch bereits von verschiedenen Autoren publiziert worden.218a),213 Das Triethylamin dient im organischen Medium zur Pufferung der als Nebenprodukt entstandenen Carbonsäure. In Abb. 2.43 auf Seite 102 ist das zu dieser Nebenreaktion gehörige Reaktionsschema wiedergegeben. Die Carbonsäure entsteht durch die Neben- reaktion des Acyl/Enzym-Komplexes mit in Spuren im Reaktionsmedium vor- handenem Wasser und führt so zu einer Hydrolyse des Acylierungsreagenzes. In Abwesenheit des Triethylamins als Base kann die gebildete Carbonsäure an der Enzym-Oberfläche gebunden werden und kann durch ionische Wechselwirkungen die elektrostatische Umgebung beeinflussen, wodurch wiederum kleine Konformationsänderungen im Protein möglich sind, welche die Aktivität und Selektivität des Enzyms verändern.218a) In der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 wurde ein günstiger Einfluß des Acyldonors Isopropenylacetat auf die Enzymkatalyse beobachtet, da während der Reaktion kein Acetaldehyd freigesetzt wird. In der Novozym 435- katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Isopropenylacetat wird ebenfalls nach 24 Stunden ein Umsatz von ca. 50 % beobachtet (Tabelle 2.62). Erreicht wurde dieser Umsatz, wie nach Tabelle 2.60 anzunehmen ist, schon nach 8 Stunden. Die mit diesem Acylierungsreagenz in dem Lösungsmittel Toluol erzielte
- 165. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 151 Selektivität ist höher als die, die mit Vinylacetat und Vinylpropionat in Toluol beobachtet wurde. Es empfiehlt sich auch in der Novozym 435-katalysierten Transacylierung die Verwendung von Isopropenylacetat als Acylierungsmittel. Tabelle 2.62: Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Isopropenylacetat (10 mg immobilisierte CAL-B) Reaktionsbedingungen Nach E-Wert (Äquiv.) 24 h Umsatz 51 % Isopropenylacetat (5), ee Ester (−)-24 94 % 170 Toluol ee Alkohol (+)-14 ≥98 % Es wurde der Versuch durchgeführt eine PLE-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 zu erreichen. Nach den Ergebnissen in der PLE/MPEG- und PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 ist allerdings kein Erfolg zu erwarten, zumal die PLE wie die CRL rac-18 in der Hydrolyse als Substrat gegenüber rac-22 bevorzugt. So konnte in der PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 auch kein nennenswerter Umsatz unter verschiedenen Reaktionsbedingungen beobachtet werden (Tabelle 2.63). Tabelle 2.63: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 (6.4 U/ml) Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (Äquiv.) Vinylpropionat (5), 20 d 2% Toluol Isopropenylacetat (5), 20 d 0% Toluol Für eine Acylierung von rac-14 wurde auch das Colyophilisat aus PLE, BSA und MPEG (PLE/BSA/MPEG) eingesetzt, welches bei Standardsubstraten eine hohe Aktivität im organischen Medium zeigt.83 In der PLE/BSA/MPEG-katalysierten
- 166. 152 THEORETISCHER TEIL Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat in Toluol wurde eine stark erhöhte Katalysatorkonzentration verwendet (Tabelle 2.64). Die Farbe des PLE/BSA- Katalysators änderte sich im Laufe der Reaktionszeit von weiß in ein dunkles rot- braun. Dies belegt die enzymatische Hydrolyse des Acylierungsmittels zu Carbonyl- Nebenprodukten wie Essigsäure. Eine enzymatische Acylierung des Substrates rac-14 war allerdings auch mit dieser stark erhöhten Katalysatormenge nicht möglich. Tabelle 2.64: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 (2000 U/ml) Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (Äquiv.) Vinylacetat (5), 11 d 0% Toluol In der PLE-katalysierten Hydrolyse des korrespondierenden Esters rac-23 wurde eine isoenzymangereicherte Fraktion der Schweineleber-Esterase (Chirazyme E1) mit großem Erfolg eingesetzt. Dies Enzympräparation führte zu einer Erhöhung der Aktivität und Selektivität im Vergleich zu der kompletten Isoenzymmischung (PLE). Daraufhin wurde rac-14 auch in die Chirazyme E1-katalysierte Transacylierung mit Vinylpropionat in Toluol eingesetzt (Tabelle 2.65). Nach 48 Stunden konnte ein minimaler Umsatz beobachtet werden, der allerdings hochselektiv verlief. Tabelle 2.65: Versuch zur Chirazyme E1-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 (33 U/ml; 5 Äquiv. Vinylpropionat in Toluol) Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-45 ee Alkohol (−)-14 E 47.75 h 2% ≥98 % 3% - Zusammenfassend konnte gezeigt werden, daß die Enzym-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 eine effiziente Methode zur Darstellung der einzelnen Enantiomere darstellt. In Novozym 435 katalysierten Reaktionen wird in
- 167. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 153 der Regel eine hohe Aktivität des Enzyms CAL-B beobachtet, so daß die Reaktionszeiten denen der Hydrolyse im wäßrigen Milieu entsprechen. Die mit dieser Enzympräparation erzielten Selektivitäten sind sehr hoch. Somit ist die enzymatische Transacylierung durchaus geeignet, die Bereitstellung enantiomerenreiner Verbindungen in einem größeren Maßstab zu leisten. Gerade für unpolare Substrate, die nicht im wässrigen Medium löslich sind, sind die Bedingungen der Enzym- katalysierten Transacylierung ideal geeignet, eine Racematspaltung durchzuführen. So konnte beispielsweise die GRÜNENTHAL GmbH eine kinetische Racematspaltung eines neuen Tramadol-Analogons (rac-52 in Abb. 2.70) aufbauend auf den im Rahmen dieser Arbeit erreichten Ergebnissen erzielen. Das in Abb. 2.70 dargestellte Naphtyl-Derivat zu rac-14 ist im wäßrigen Milieu in Form eines Buttersäureesters unlöslich und es konnte keine PLE-katalysierte Hydrolyse beobachtet werden. Im organischen Medium konnte allerdings unter den vorgestellten Reaktionsbedingungen eine effiziente CAL-B-katalysierte Racematspaltung zur Darstellung des gewünschten (+)-Enantiomers erreicht werden.184 Me2N OH OMe R O OH O CAL-B (−)-Ester OMe HO Vinylester organisches + Me2N OH Lösungsmittel OMe rac-52 RT HO Me2N (+)-52 Abb. 2.70: Durch die GRÜNENTHAL GmbH durchgeführte CAL-B-katalysierte Trans- acylierung von rac-52, eines Naphtyl-Derivats zu rac-14.
- 168. 154 THEORETISCHER TEIL 2.4.3 Substrate auf der Basis tertiärer Hydroxylfunktionen Tertiäre Alkohole und deren Ester sind wahrscheinlich aufgrund von sterischen Hinderungen im allgemeinen keine Substrate für Hydrolasen-katalysierte Racematspaltungen. Bis heute sind nur einige wenige Beispiele für Hydrolasen- katalysierte Umsetzungen dieser Substrate bekannt.134,238,239,240 O´HAGEN et al. konnten 1992 zeigen, daß aktivierte Ester tertiärer Alkohole, die eine Acetylengruppe am stereogenen Zentrum enthalten, von der Candida rugosa Lipase akzeptiert und mit mittleren Selektivitäten hydrolysiert werden. Erklärt wurde dies dadurch, daß die Acetylengruppe in der Lage ist die Bindungsstelle des Wasserstoffs, im Falle von sekundären Alkoholen, zu belegen.238 Daß die Schweineleber-Esterase ebenfalls Ester tertiärer Alkohole, die eine Acetylengruppe am stereogenen Zentrum tragen, mit hoher Selektivität hydrolysiert, zeigten COOPE et al. am Beispiel eines tertiären Buttersäureesters des Quinuclidinols unter Zusatz von Methanol als Cosolvens.134 KONIGSBERGER et al. erweiterten diese Substratgruppe um aktivierte Ester von Trifluormetlyl-substituierten Cyanhydrinen, die mit sehr guten Selektivitäten von der CRL umgesetzt wurden.239 Um die vom Enzym anzugreifende Estergruppe möglichst nah an den Chiralitätszentren zu lokalisieren und so eine möglichst große Enantiomer- Differenzierung des Enzyms zu erhalten, wurde in eigenen Vorarbeiten Ester rac-43 unter Einbezug der tertiären Hydroxylgruppe synthetisiert. Der Ester rac-43 wurde anschließend zwei PLE-katalysierten Hydrolysen mit tert-Butanol und Methanol als Cosolvens unterworfen, die aber nur jeweils 3 % Hydrolyseprodukt nach 100 h bzw. 26 h ergaben (Abb. 2.71).80
- 169. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 155 O Pr O O OMe Pr O PLE Me2N OMe 43 Phosphatpuffer- Lösung (pH 8.0) + Me2N OH 10 % Cosolvens OMe rac-43 RT Me2N 7 Abb. 2.71: Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-43. Diese Ergebnisse legen nahe, daß Ester der tertiären Hydroxylgruppe vom Tramadol keine Substrate für das Enzym PLE sind, da sie sterisch sehr anspruchsvoll und elektronisch nicht aktiviert sind. 2.4.3.1 Versuche zur Enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)- Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy- phenyl)-cyclohexylester (rac-25) In Vorversuchen zur Darstellung des (±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl- 3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) zeigte sich, daß die Reaktivität der tertiären Hydroxylgruppe ausgesprochen hoch ist. Eine Veresterung der tertiären Hydroxylgruppe gelang durch Reaktion von Buttersäureanhydrid mit Pyridin in Dichlormethan bei Raumtemperatur in quantitativer Ausbeute. Da unter diesen Reaktionsbedingungen auch die sekundäre Hydroxylgruppe acyliert wird, kann nach Aufarbeitung der Diester rac-25 erhalten werden. Aufgrund des einfachen Zugangs zu dieser Verbindung, wurde untersucht, ob sie gegebenenfalls ein Substrat für eine enzymatische Hydrolyse darstellt. Da sich anhand des Esters rac-19 gezeigt hatte, daß keine enzymatische Hydrolyse der sekundären Estergruppe möglich ist, bietet der Diester rac-25 die Möglichkeit einer enzymatischen Hydrolyse der tertiären Estergruppe (Abb. 2.72).
- 170. 156 THEORETISCHER TEIL O O Pr O O Pr O O OMe Pr O O Pr Enzym Me2N OMe 25 Phosphatpuffer- Me2N Lösung + 10 % Cosolvens rac-25 O RT Pr O OH OMe Me2N 19 Abb. 2.72: Versuch zur enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-25. Der Diester rac-25 wurde daraufhin in die Enzym-katalysierte Hydrolyse im wäßrigen Einphasensystem eingesetzt. Als Enzym wurden die CE und die CRL unter Verwendung von 10 % tert-Butanol als Cosolvens und die PLE unter Verwendung von 16 % Aceton eingesetzt (Tabelle 2.66). Die Enzyme CE und CRL wurden aufgrund ihrer großen hydrophoben Taschen im aktiven Zentrum ausgewählt, die PLE wegen der von COOPE et al. erzielten Ergebnisse in der Hydrolyse eines tertiären Buttersäureesters. Tabelle 2.66: Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 Enzym Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz Cholesterolesterase Phosphatpufferlösung, 25 h 0% (CE; 13.1 U/ml) pH 7.0; 10 % tert-Butanol Candida rugosa Lipase Phosphatpufferlösung, 44 h 0% (CRL; 9.3 U/ml) pH 7.0; 10 % tert-Butanol Schweineleber-Esterase Phosphatpufferlösung, 42 h 1% (PLE; 4.9 U/ml) pH 7.0; 16 % Aceton
- 171. ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 157 Wie aber in Tabelle 2.66 zu ersehen ist, konnte mit allen drei Enzymen, unter den jeweiligen Bedingungen, keine Hydrolyse des Diesters rac-25 beobachtet werden. In allen Reaktionen wurde die eingesetzte Menge Esters rac-25 nach Extraktion nahezu vollständig zurückerhalten werden. Ein Ergebnis, das nach den Resultaten in der Hydrolyse des Esters rac-43 und dem Kenntnisstand der Literatur erwartet werden konnte. Der Diester rac-25 ist somit aufgrund von sterischen Hinderungen keine Substrat für eine Hydrolasen-katalysierte Racematspaltung. Im Umkehrschluß bedeutet dies aber auch, daß keine Enzym-katalysierte Acylierung der tertiären Hydroxylgruppe zu erwarten ist. Daß die tertiäre Hydroxylgruppe in der Transacylierung nicht interferiert, ist eine wichtige Voraussetzung dafür, daß die hydroxysubstituierten Tramadol- Analoga direkt in Enzym-katalysierte Racematspaltung eingesetzt werden können. Von FANG et al. ist, um der sterischen Hinderung von tertiären Alkoholen zu begegnen und sie so einer Enzym-katalysierten Reaktion leichter zugänglich zu machen, eine einfache Modifikation durchgeführt worden. Die tertiären Alkohole wurden zunächst in die entsprechenden ß-Alkoxy Alkohole überführt und anschließend deren primäre Alkoholfunktionalität von Lipasen mit zufriedenstellender Aktivität und mäßiger Selektivität acyliert (Abb. 2.73).241 Diese Modifikation könnte zur enzymatischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga eingesetzt werden, bei denen nur eine tertiäre Hydroxylgruppe für eine Hydrolasen-katalysierte Reaktion zur Verfügung steht. OH BSL oder O OH O O CRL oder O PPL Isopropenyl- acetat MTBE 33-78 % ee E = 2.5 - 9.4 Abb. 2.73: Enzymatische Racematspaltung von modifizierten tertiären Alkoholen.
- 172. 158 THEORETISCHER TEIL 2.5 Zusammenfassung Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von Methoden zur Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga. Unter Nutzung dieser Methoden sollten beide Enantiomere von neuen Molekülen auf Tramadol-Basis dargestellt werden. In Untersuchungen zur Enzym-katalysierten Racematspaltung von Tramadol (rac-7), konnte, den Erwartungen entsprechend, gezeigt werden, daß Verbindungen mit lediglich einer tertiären Hydroxylgruppe im allgemeinen keine Substrate für Enzym- katalysierte Reaktionen sind. Dies ist Voraussetzung dafür, daß Tramadol-Analoga mit weiteren reaktiven Hydroxylgruppen im Molekül direkt in Enzym-katalysierte Racematspaltung eingesetzt werden können, ohne daß Nebenreaktionen an der tertiären Hydroxylgruppe zu erwarten sind. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Enzym-katalysierten Racematspaltung von Tramadol-Analoga mit phenolischer Hydroxylgruppe durch- geführt. In dieser Gruppe von Substraten konnte am Beispiel des O-Desmethyl- tramadols (rac-8) gezeigt werden, daß sich gute Ergebnisse in der Lipasen- katalysierten Hydrolyse erzielen lassen, die dazu geeignet sind die Enantiomere dieser Verbindung in einem präparativen Maßstab darzustellen. So konnte in der CRL-katalysierte Hydrolyse des entsprechenden Buttersäureesters (rac-15) im wäßrig-organischen Zweiphasensystem das gebildete Phenol (−)-8 mit einem ee-Wert von 90 % in 27 % Ausbeute isoliert werden (E = 34). Dies ist innerhalb der durchgeführten Untersuchungen zur Enzym-katalysierten kinetischen Racemat- spaltung von Tramadol-Analoga mit phenolischer Hydroxylgruppe die höchste erzielte Selektivität. Offenkettige, phenolische Tramadol-Analoga, wie das untersuchte 3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11), werden zwar als Substrate in der Enzym-katalysierten Hydrolyse akzeptiert, jedoch sind die zu beobachtenden Selektivitäten so gering, daß keine geeignete Methode zur Trennung der Enantiomeren gefunden werden konnte. Die zu geringe Enantiomeren-Differenzierung tritt wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Flexibilität dieser Moleküle gegenüber den cyclischen Verbindungen auf.
- 173. ZUSAMMENFASSUNG 159 Zusammenfassend zeigen die durchgeführten Untersuchungen zu Substraten auf Tramadol-Basis mit phenolischer Hydroxylgruppe, daß die Enzym-katalysierte Racematspaltung hier prinzipiell einen Zugang zu den einzelnen Enantiomeren dar zu stellen vermag. Dies ist insbesondere beachtlich, da viele analgetisch aktive Moleküle über eine aromatische Hydroxylgruppe verfügen, sonst aber über keine funktionelle Gruppe, die für eine Racematspaltung genutzt werden könnte. Als zweite Gruppe von Verbindungen wurden Tramadol-Analoga untersucht, die eine zusätzliche sekundäre Hydroxylgruppe im Cyclohexylgerüst tragen. Zu diesen Verbindungen gehören aktuelle, analgetisch aktive Entwicklungskandidaten der GRÜNENTHAL GmbH, wie z.B. das Hydrochlorid des enantiomerenreinen para- Fluorbenzylethers (+)-50. In Untersuchungen zu dem Cyclohexanol-Tramadol-Analogon (1RS,3SR,6RS)- 6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) konnte gezeigt werden, daß dieses Substrat sowohl in der Hydrolyse als auch in der Transacylierung mit sehr hohen Selektivitäten in Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltungen umgesetzt werden kann. So konnte anhand der Enzym- katalysierten Hydrolyse des entsprechenden Buttersäureesters (rac-18) eine äußerst effiziente kinetische Racematspaltung demonstriert werden. Die CRL-katalysierte kinetische Racematspaltung dieses Esters verläuft mit einer nahezu perfekten Selektivität (E > 200) und mittels extraktiver Aufarbeitung können der Alkohol (−)-12 und der nicht umgesetzte Ester (+)-18 in sehr hohen Ausbeuten erhalten werden. OH Me2N OH OMe OMe HO Me2N O OH HO (+)-12 PLE OMe CRL (−)-12 + Pr O O + Me2N OH Me2N OH OMe OMe rac-18 Pr O O O Me2N Pr (−)-18 (+)-18 Abb. 2.74: Enzym-katalysierten Hydrolysen von rac-18 zur Darstellung beider Enantiomere.
- 174. 160 THEORETISCHER TEIL Einen einfachen Zugang zu dem enantiomeren Alkohol (+)-12 ermöglicht die PLE- katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 (E = 89). Da das Enzym PLE eine zur CRL entgegengesetzte Enantiopräferenz zeigt, wird der Alkohol (+)-12 erhalten werden (Abb. 2.74). Somit ermöglicht eine geeignete Wahl des Enzym die Darstellung beider enantiomerer Alkohole mit hohen ee-Werten. Auch in der alternativen enzymatischen Reaktionsführung im organischen Medium, der Lipasen-katalysierten Acylierung, verläuft die CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit überaus hoher Selektivität (E = 120). Die erzielten Ergebnisse zeigen, daß die Enzym-katalysierte Transacylierung im organischen Medium des Alkohols rac-12 eine interessante Alternative, auch in einem präparative Maßstab, zur Hydrolyse im wäßrigen Medium darzustellen in der Lage ist. OH OH Me2N OMe OMe Pr O Pr O Me2N O (−)-22 O (+)-22 OH PLE OMe CRL + + Pr O CE Me2N OH OH Me2N O OMe OMe rac-22 HO HO Me2N (+)-14 (−)-14 Abb. 2.75: Enzym-katalysierten Hydrolysen von rac-22 zur Darstellung beider Enantiomere. Auch im Fall der zum rac-12 epimeren Verbindung (1RS,2RS,4SR)-2-Dimethyl- aminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) konnte gezeigt werden, daß dieses Cyclohexanol-Tramadol-Analoga hochselektiven enzymatischen Racematspaltungen zugänglich ist. Es konnte demonstriert werden, daß wie im Falle der Verbindung rac-12 die PLE-katalysierte Hydrolyse (Chirazyme E1, E = 85) mit einer zur CRL (E = 34) und CE (E = 89) entgegengesetzten Enantiopräferenz verläuft (Abb. 2.75). Die gezielte Darstellung beider Enantiomere durch eine geeignete Wahl des Enzym ist ebenfalls bei diesem Substrat möglich. In der enzymatischen Transacylierung des Alkohols rac-14 konnte gezeigt werden, daß mit einer immobilisierten CAL-B als Katalysator außerordentlich gute Ergebnisse erzielt werden (E > 200). Die CAL-B zeigt in der Regel bei
- 175. ZUSAMMENFASSUNG 161 ausgezeichneter Selektivität eine so hohe Aktivität, daß Reaktionszeiten im Bereich von enzymatischen Hydrolysen erreicht werden. Somit ist die Enzym-katalysierte Transacylierung von rac-14 dazu geeignet ist, die Bereitstellung enantiomerenreiner Verbindungen in einem größeren Maßstab zu leisten. Gerade für unpolare Substrate, die nicht im wässrigen Medium löslich sind, sind die Bedingungen der Enzym- katalysierten Transacylierung ideal geeignet, eine Racematspaltung durchzuführen. Insgesamt konnte gezeigt werden, daß sich mit Ausnahme des 1,3-diaxial substituierten 6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diols (rac-13) Cyclohexanol-Tramadol-Analoga nahezu ideal in der Enzym-katalysierten Racematspaltung verhalten. Bei der Verbindung 13 sind wahrscheinlich sterische Hinderungen des Moleküls für die nicht Reaktivität verantwortlich, die aber als spezielle Ausnahme dieser Verbindung zu betrachten sind. Die Enzym-katalysierte Hydrolyse von Cyclohexanol-Tramadol-Analoga stellt ein effizientes Verfahren zur Synthese enantiomerenreiner Verbindungen dar. Bei diesem Verfahren konnte eine einfache und effiziente Aufarbeitung durch Extraktion von Ester und Alkohol bei verschiedenen pH-Werten etabliert werden. Es wurde aufgezeigt, daß beide Enantiomere der gewünschten Verbindung je nach Wahl des geeigneten Enzyms durch Enzym-katalysierte Racematspaltung dargestellt werden können. Im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen konnten verschiedene Möglichkeiten zu der Optimierung Enzym-katalysierter Racematspaltungen von Tramadol-Analoga aufgezeigt werden: • Zur Steigerung der Substratkonzentration von Tramadol-Analoga im wässrigen Medium ist es gelungen statt der freien Basen deren Hydrochloride, die eine wesentlich höhere Löslichkeit haben, als Substrate einzusetzen. • Durch die Wahl der Butyratgruppe als Acylrest kann in enzymatischen Hydrolysen ein geeignetes Substrat geschaffen werden, welches sowohl von Lipasen als auch Esterasen mit guter Selektivität umgesetzt wird. • Anhand der CRL-katalysierten Hydrolyse von Tramadol-Analoga konnte gezeigt werden, daß bei in einem Wechsel vom wässrigen Einphasensystem zum wässrig- organischen Zweiphasensystem als Reaktionsmedium eine Steigerung der Selektivität von Lipasen-katalysierten Reaktionen möglich ist.
- 176. 162 THEORETISCHER TEIL • Als eine einfache, effiziente und ökonomische Methode zur Aufarbeitung von enzymatischen Hydrolysen konnte die Extraktion von Ester und Alkohol bei verschiedenen pH-Werten etabliert werden, wodurch auf aufwendige chromatographische Trennverfahren verzichtet werden kann. • In der Enzym-katalysierten Transacylierung konnte durch die Verwendung von Isopropenylacetat als Acylierungsmittel, welches kein Acetaldehyd bildet, eine Steigerung der Aktivität und Selektivität gegenüber konventionellen Vinylestern beobachtet werden. • Es konnte gezeigt werden, daß im besonderen die Enzyme PLE, CRL und CAL-B zu einer kinetischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga geeignet sind. Sie zeigen eine hohe Aktivität und Selektivität. Zudem sind diese Enzyme gut untersucht und über einen größeren Zeitraum in ähnlicher Präparation und Qualität kommerziell verfügbar. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß sich verschiedene Tramadol-Analoga als gute Substrate für Enzym-katalysierte kinetische Racemat- spaltungen eignen. Im allgemeinen können sowohl in der Hydrolyse als auch in der Transacylierung gute Aktivitäten der Enzyme bei genügender Selektivität beobachtet werden. Es konnte daher in dieser Arbeit gelingen, die Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltungen als Methode zur Darstellung einzelner Enantiomere von verschiedenartigen neuen Tramadol-Analoga in einem präparativen Maßstab zu etablieren. Beachtenswert ist hierbei, daß die vom Enzym anzugreifende Hydroxylgruppe mehrere C-Atome von den Stereozentren der Verbindungen entfernt lokalisiert ist.
- 177. AUSBLICK 163 2.6 Ausblick Aufbauend auf den zur Hydrolyse und Transacylierung von Tramadol-Analoga entwickelten Verfahren und gesammelten Erfahrungen, sollten weitere synthetisch wertvolle Substrate gesucht werden, die mit anderen Methoden nur schwer enantiomerenrein zugänglich sind. Hier bieten sich biologisch aktive Moleküle an, die neben einer aromatischen Hydroxylgruppe über keine weiteren funktionellen Gruppen verfügen, die für eine Racematspaltung genutzt werden können. Im besonderen bieten sich hier weitere Tramadol-Analoga an, die statt über eine sekundäre Hydroxylgruppe über eine Aminogruppe im Cyclohexylring verfügen. Hinweise auf eine analgetische Aktivität dieser Gruppe von Verbindungen sind ebenfalls vorhanden (Abb. 2.76).184 OH OH OMe OMe H2N H2N Me2N Me2N Abb. 2.76: Neue interessante Tramadol-Analoga mit zusätzlicher Aminogruppe. Aus Arbeiten von GOTOR et al. geht hierzu hervor, daß es allgemein möglich ist, Amine als Substrate in CAL-B-katalysierten Transacylierungen hochselektiv zu acylieren.242 Auch N-selektive Lipasen-katalysierte Acylierungen von cyclischen Aminoalkoholen sind ebenfalls von GOTOR et al. beschrieben worden.243 Unter dem Gesichtspunkt der Etablierung eines präparativen Verfahrens zur Enzym- katalysierten Transacylierung im organischen Medium, nicht nur von Tramadol- Analoga, wäre die Entwicklung einer Methode zur Aufarbeitung der Reaktion, welche auf chromatographische oder destillative Trennschritte verzichtet, von großem Vorteil.
- 178. 3 Experimenteller Teil
- 179. ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 165 3.1 Allgemeine Vorbemerkungen 3.1.1 Eingesetzte Computerprogramme Visualisierung von E-Werten „Enantiomeric Ratio“ Copyright © 1994, 1995: K. Faber, H. Hönig, Technical University of Graz. Konvertierung in das Portable Document Format (PDF) „Adobe Acrobat“ Copyright © 1987 - 1999: Adobe Systems Inc. Chemische Strukturen „ChemDraw“ Copyright © 1985 - 2000: CambridgeSoft, Cambridge. 3.1.2 Analytische Methoden und Geräte Gaschromatographie (GC) Umsatz- und Reinheitsbestimmungen wurden mit Kapillar-GC-Geräten von VARIAN (Varian 3800 mit 2 Split/Splitness-Injektionssystem), CHROMPACK (CP 9000) und CARLO ERBA (Mega 5360) durchgeführt. Die Peakdetektion erfolgte über einen Flammenionisationsdetektor (FID) bei einer Detektionstemperatur von 330 ºC. Es wurden folgende Bedingungen gewählt: CP-Sil-8 Säulenspezifikation: 95 % Methylpolysiloxan, 5 % Phenylpolysiloxan Säulenlänge: 30 m Innerer Säulendurchmesser: 0.32 mm Filmdicke: 0.25 µm Trägergas und -druck: H2, 75 kPa (Varian 3800) bzw. 100 kPa (Mega 5360)
- 180. 166 EXPERIMENTELLER TEIL Es wurden dabei folgende Standardprogramme bei einer Injektionstemperatur von 250 ºC verwendet: 100 ºC (5 Min.) → 250 ºC (20 ºC/Min.; 5 Min.) → 300 ºC (30 ºC/Min.; S1 15 Min.) 50 ºC (5 Min.) → 150 ºC (30 ºC/Min.; 2 Min.) → 250 ºC (20 ºC/Min.; S2 2 Min.) → 300 ºC (30 ºC/Min.; 15 Min.) Die in der vorliegenden Arbeit angegebenen Werte wurden unter Annahme eines Fehlerbereichs von 0.5 % auf ganze Zahlen gerundet. Abgeleitete Größen wurden mit den Originaldaten berechnet. Gaschromatographische Bestimmungen der Enantiomerenüberschüsse erfolgte durch vorherige Trennung an folgenden chiralen stationären Phasen: CP-Chirasil-Dex-CB (CHROMPACK) Säulenspezifikation: Permethyl-β-Cyclodextrin Säulenlänge: 25 m Innendurchmesser: 0.25 mm Filmdicke: 0.25 µm Trägergas und -druck: H2, 100 kPa Lipodex-γ-6-Me (MACHEREY-NAGEL) Säulenspezifikation: 2,3-O-Dipentyl-6-O-methyl-γ-Cyclodextrin Säulenlänge: 25 m Innendurchmesser: 0.25 mm Filmdicke: 0.15 µm Trägergas und -druck: H2, 100 kPa
- 181. ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 167 Lipodex-E (MACHEREY-NAGEL) Säulenspezifikation: Octakis-(2,6-di-O-pentyl-3-O-butyryl)-γ- Cyclodextrin Säulenlänge: 25 m Innendurchmesser: 0.25 mm Filmdicke: 0.15 µm Trägergas und -druck: H2, 100 kPa Massenspektroskopie (MS) Gerät: Varian MAT 212 S, Erfassung mit Varian MAT SS 200. Falls nicht anders vermerkt, wurde als Standardbedingung Elektronenionisation (EI, 70 eV) oder chemische Ionisation (CI, Methan, 100 eV) verwendet. Die Angabe von Massen der Fragmentionen (m/z) erfolgte als dimensionslose Zahl. Es wurden nur Signale mit hoher Intensität oder besonders charakteristische Signale aufgeführt. GC-MS-Analysen Geräte: Gaschromatograph: Varian Modell 3700, Massenspektrometer: Varian MAT 112 S. Ionisation: 70 eV (EI) oder MeOH, 40 eV (CI). Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Geräte zur analytischen HPLC: Millipore Waters 600E Systemcontroller; UV/VIS- Detektion (λ = 190-400 nm) mit einem Waters 996 Photodiode Array Detektor; RI- Detektion mit einem Waters 410 Differential Refraktometer; Waters 510 Pumpen; RP-Säule 18 der Firma MERCK (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 25 mm). Geräte zur präparativen HPLC: Merck Novaprep 200; UV-Detektion (λ = 273 nm); RP-Säule 18 der Firma MERCK (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 25 mm, Filmdicke 10 µm) und eine VARIAN Anlage mit UV-Detektion (λ = 273 nm); RP- Säule 18 der Firma MERCK (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 25 mm, Filmdicke 10 µm) oder RP-Select B-LiChrosor b® der Firma MERCK (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 25 mm, Filmdicke 7 µm). Geräte zur analytischen HPLC an chiraler stationärer Phase: Millipore Waters 600 E Systemcontroller; UV/VIS-Detektion (λ = 190-400 nm) mit einem Waters 996 Photodiode Array Detektor; Waters 510 Pumpen; Chiralcel OD-Vorsäule; Chiralcel
- 182. 168 EXPERIMENTELLER TEIL OD-H Säule der Firma BAKER-DAICEL (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 46 mm, derivatisierte Cellulose auf Silicagel) und Millipore Waters 600 E Systemcontroller; UV-Detektion (λ = 273 und 254 nm) mit einem Waters Lamda-Max 481; Chiralcel OD-H Säule der Firma BAKER-DAICEL (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 46 mm, derivatisierte Cellulose auf Silicagel). NMR-Spektroskopie Geräte: Varian VXR 300 (300 MHz, 75 MHz), Varian Gemini 300 (300 MHz, 75. MHz), Varian Inova 400 (400 MHz, 100 MHz), Varian Unity (500 MHz, 125. MHz). Alle Spektren wurden bei 20 ºC aufgenommen. Als interner Standard diente Tetramethylsilan (TMS). Chemische Verschiebungen δ wurden in ppm bezogen auf TMS (δ = 0.00 ppm) und Kopplungskonstanten J in Hz angegeben. Die Aufspaltungs- muster wurden generell nach erster Ordnung interpretiert, wobei folgende Abkürzungen zur Beschreibung benutzt wurden: s = Singulett; d = Dublett; t = Triplett; q = Quartett; m = Multiplett; dm = Multiplett eines Dubletts; tm = Multiplett eines Tripletts; br = breit. 13 Die C-NMR-Spektren sind 1H-breitband-entkoppelt. Die Substitutionsmuster der 13 C-NMR-Signale wurden den J-modulierten Spinecho-Spektren (APT) und mit u = C, CH2 und d = CH, CH3 angegeben. Zur genauen Zuordnung wurden HETCOR- Spektren gemessen. FT-Infrarotspektroskopie (IR) Gerät: Perkin-Elmer FTIR 1760 S. Die Proben wurden als KBr-Presslinge (KBr) oder als kapillare Filme (kapillar) präpariert. Die Spektren wurden im Bereich von 4000 – 700 cm-1 aufgenommen. Die Lage der Absorptionsbanden (∼ wurde in cm-1 angegeben; bei der Charakterisierung ν) wurden nur Banden mit Intensität >40 % aufgelistet, wobei die Abkürzungen s (stark, Absorption >80 %), m (mittelstark, Absorption 60 – 80 %) und w (schwach, Absorption 40 – 60 %) verwendet wurden. Elementaranalyse Gerät: Heraeus CHNO-Rapid. Eine Substanzprobe wurde für ∆C,H,N <0.4 % als authentisch betrachtet.
- 183. ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 169 Polarimetrie Gerät: Perkin-Elmer-Polarimeter PE 241. Die Messung der Drehwerte erfolgte bei 20 ºC in einer Mikroküvette (Länge 10 cm) mit der Natriumdoppellinie (λ = 589.0 und 589.6 nm). Die Angabe der spezifischen Drehung [α ] 20 erfolgte in (grd⋅dm3)/(dm⋅g), D die Angabe der Konzentration c in (g/dm3). Autotitrator Gerät: STAT-Titrino 718 der Firma METROHM. Das Gerät wurde im pH-STAT Modus mit NaOH-Maßlösungen (1 N und 0.1 N) der Firma MERCK betrieben. Ultrafiltration Gerät: Ultrafiltrationszelle Amicon Modell 2800 mit einer Membran PM 30 (Ausschlußgrenze: >30 kDa) von MILLIPORE. Gefriertrocknung Gerät: Christ Alpha 2-4. Schmelzpunkte Gerät: Büchi-Schmelzpunktapparatur SMP-20. Die Schmelzpunkte wurden unkorrigiert angegeben. Siedepunkte Die Siedepunkte wurden unkorrigiert angegeben. Dünnschichtchromatographie Es wurden DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 der Firma MERCK mit einer Schichtdicke von 0.25 mm verwendet. Die Detektion erfolgte durch UV-Fluoreszenzlöschung bei λ = 254 nm sowie durch Anfärben mit einer Lösung aus Eisessig / dest. H2O / konz. H2SO4 / p-Anisaldehyd (in einem Volumenverhältnis von 75 : 2 : 1.5 : 1) und an- schließendem Erhitzen. Präparative Säulenchromatographie Es wurde Kieselgel 60, 0.062 - 0.100 mm, der Firma MERCK verwendet.
- 184. 170 EXPERIMENTELLER TEIL 3.1.3 Lösungsmittel und Reagenzien Die verwendeten Lösungsmittel wurden mit den laborüblichen Methoden getrocknet und absolutiert. Die Reagenzien wurden, wenn nicht ausdrücklich anders erwähnt, in handelsüblicher Qualität ohne weitere Aufreinigung eingesetzt. Diisobutyl- aluminiumhydrid wurde von der SCHERING AG zur Verfügung gestellt, der ich an dieser Stelle ebenfalls für die Unterstützung dieser Arbeit danken möchte. Methanol Die Trocknung erfolgte, indem Methanol mit Magnesium-Spänen zur Reaktion gebracht und anschließend destilliert wurde. Diisopropylether Die Entfernung von Peroxiden aus Diisopropylether sowie dessen Vortrocknung wurde durch Säulenfiltration über basischem Aluminiumoxid erreicht. Dies erfolgte vor jedem Gebrauch, zusätzlich wurde vor jedem Gebrauch und insbesondere vor jedem Einengen mit essigsaurer Kaliumiodidlösung auf Peroxide getestet.e Transacylierungsreagenzien Essigsäure-vinylester (Vinylacetat), Essigsäure-isopropenylester (Isopropenylacetat) und Propionsäure-vinylester (Vinylpropionat) wurden über NaCO3 destilliert, um Spuren von Säure zu entfernen, bevor sie in die Enzym-katalysierte Transacylierung eingesetzt wurden. 3.1.4 Verwendete Proteine Pferdeleber-Esterase (HLE, EC 3.1.1.1) SIGMA; Aktivität: 0.74 U/mg Lyophilisat (Buttersäureethylester, pH 8.0, 25 ºC). Schweineleber-Esterase (PLE, EC 3.1.1.1) a) BOEHRINGER MANNHEIM; 30 mg Enzym in 3 ml 3 M (NH4)2SO4, pH 6. Aktivität >120 U/mg Protein (100 mM Buttersäureethylester, pH 7.0, 25 ºC). e Autorenkollektiv, Organikum, 17. Aufl., VEB-Verlag Berlin 1988.
- 185. ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 171 b) ROCHE DIAGNOSTICS; 306 mg Enzym in 30.6 ml3 M (NH4)2SO4, pH 6. Aktivität 130 U/mg Protein (100 mM Buttersäureethylester, pH 7.0, 25 ºC). c) ROCHE DIAGNOSTICS; Chirazyme E1 (lyophilisierte PLE, Fraktion 1). Aktivität: 33.0 U/m g Lyophilisat (100 mM Buttersäureethylester, pH 7.0, 25 ºC). Burkholderia cepacia Lipase (BCL, EC 3.1.1.3) wurde bezogen als Pseudomonas cepacia Lipase (PCL): a) FLUKA; Aktivität: 40 U/mg (Glycerin-trioleat, pH 8.0, 40 ºC). b) SIGMA; Aktivität: 0.09 U/mg (Glycerin-triester, pH 7.0; 37 ºC). Candida antarctica Lipase (CAL-B, EC 3.1.1.3) a) BOERINGER MANNHEIM; Chirazyme L-2 (lyophilisierte CAL, Typ B, CAL-B). Aktivität: 1.0 MU/6.452 g Lyophilisat (100 mM Glycerin-tributyrat, pH 7.0, 25 ºC). b) NOVO NORDISK; Novozym 435 (immobilisierte CAL, Typ B, CAL-B). Aktivität: ca. 7 U/mg (Veresterung 1-Propanol mit n-Dodecansäure, 60 ºC) Diese Lipase wurde mittels rekombinater DNA-Technik in dem Wirt-Organismus Aspergillus oryzae produziert und anschließend auf einem makroporösen Acrylharz immobilisiert.126 Novozym 435 wurde freundlicherweise von NOVO NORDISK zur Verfügung gestellt. c) FLUKA; Aktivität: 3.2 U/mg (CAL) Lyophilisat; bezogen als Bestandteil eines Lipasen-Screening Grundkits. Candida rugosa Lipase (CRL, EC 3.1.1.3) wurde bezogen als Candida cylindracea Lipase (CCL): FLUKA; Aktivität: 37 U/mg Lyophilisat (Glycerin-trioleat, pH 8.0, 40 ºC). FLUKA; Aktivität: 25.9 U/mg Lyophilisat (Glycerin-trioleat, pH 8.0, 40 ºC). FLUKA; Aktivität: 2.4 U/mg Lyophilisat (Glycerin-trioleat, pH 8.0, 40 ºC); bezogen als Bestandteil eines Lipasen-Screening Grundkits. Cholesterolesterase (CE, EC 3.1.1.13) BOERINGER MANNHEIM; aus Candida rugosa (ehemals Candida cylindracea). Aktivität: 52 KU/2.96 g Lyophilisat (Cholesterol oleate, 25 ºC). Chromobacterium viscosum Lipase (CVL, EC 3.1.1.3) SIGMA; Aktivität: 3.58 U/mg Lyophilisat (Olivenöl, pH 7.7; 37 ºC). Porcine pancreatic Lipase (PPL, EC 3.1.1.3) wurde bezogen als Lipase aus hog pancreas: FLUKA; Aktivität: 16.8 U/mg (Olivenöl, pH 8.0; 37 ºC).
- 186. 172 EXPERIMENTELLER TEIL Acetylcholinesterase (AChE, EC 3.1.1.7) SIGMA; Typ V-S aus Electrophorus electricus (electric eel); Aktivität: 970 U/mg (Acetylchlolin, pH 8, 37 ºC). Aus einem Lipasen-Screening Grundkit (FLUKA) wurden eingesetzt: - Rhizomucor miehei bezogen als Mucor miehei Lipase (EC 3.1.1.3; 1.3 U/mg) - Rhizopus arrhizus Lipase (EC 3.1.1.3; 2 U/g) - Rhizopus niveus Lipase (EC 3.1.1.3; 2.6 U/g) - Aspergillus niger Lipase (EC 3.1.1.3; 1 U/mg) Das Colyophilisat aus PLE/BSA/MPEG (1.5 % Proteingehalt) wurde freundlicherweise von Herrn Dr. V. Jadhav zur Verfügung gestellt. Dieser Katalysator wurde wie in Kap. 3.2.1 auf S. 174 beschrieben aus 6 ml (60 mg) PLE/(NH4)2SO4- Suspension (PLE, 180 U/mg), 2 g MPEG5000 und 2 g BSA durch Gefriertrocknung hergestellt.83 Die spezifische Aktivität dieses Colyophilisats betrug 2.22 U/mg Colyophilisat oder 148 U/mg PLE (Aktivitätsbestimmung nach Kap. 3.2.2, S. 174). Bei der Einordnung der Lipasen ergeben sich einige taxonomische Besonderheiten. Mehrere Lipasen wurden nach Klonierung und Sequenzierung neu identifiziert und klassifiziert. So wurde 1992 die Candida cylindracea Lipase neu zur Candida rugosa Lipase, 1995 die Pseudomonas cepacia Lipase neu zur Burkholderia cepacia Lipase und die Mucor miehei Lipase neu zur Rhizomucor miehei Lipase klassifiziert.6,101 Zudem ergab die Klonierung und Sequenzierung der Lipasen aus Rhizopus arrhizus und Rhizopus niveus eine nahezu 100% Identität dieser Enzyme.101 Ein unterschiedliches Substratspektrum dieser Enzyme ist somit nicht zu erwarten. Um eine einheitliche Nomenklatur zu Verwenden, werden die Enzyme dementsprechend in dieser Arbeit durchgehend nach ihrer aktuellen Klassifizierung benannt und nicht ungedingt so, wie sie bezogen wurden. Des weiteren werden in dieser Arbeit auch einige von Herstellern eingeführte Eigennamen von Proteinen verwendet, um bestimmte Eigenschaften dieser Enzympräparationen zu verdeutlichen. So wird im folgenden der Begriff Chirazyme E1 statt PLE verwendet, um zu zeigen, daß es sich um lyophilisierte PLE der Fraktion 1 handelt. Ebenso soll der verwendete Begriff Novozym 435
- 187. ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 173 verdeutlichen, daß es sich um eine immobilisierte Candida antarctica Lipase des Typs B handelt. Aktivitätsangaben verschiedener Proteine in dieser Arbeit beziehen sich auf die vom Hersteller angegebenen Methode der Aktivitätsbestimmung. Aktivitätsbestimmungen mit Tramadolderivaten als Substrat wurden nicht durchgeführt. Alle Proteine wurden für nicht länger als 6 Monate bei 2 ºC gelagert. 3.1.5 Besondere Arbeitstechniken Alle Reaktionen mit feuchtigkeits- oder luftempfindlichen Reagenzien wurden in ausgeheizten Schlenkkolben unter Argon-Schutzgasatmosphäre mittels Spritzen- technik durchgeführt. Ester von Tramadol-Analoga sind im allgemeinen nicht im wäßrigen Einphasensystemen löslich und neigen dazu an Glasflächen Kolloide zu bilden. Alle Substrate der Enzym-katalysierten Hydrolysen wurden daher vorher in dem jeweiligen Cosolvens gelöst und dann langsam zur Phosphatpuffer-Lösung gegeben. Nach anfänglicher Trübung während der Zugabe entstanden klare, homogene Lösungen. Aufgrund der Dimethylaminomethyl-Seitenkette reagieren alle eingesetzten Substrate schwach basisch, so daß sich während der Zugabe des Substrats zur Phosphatpuffer-Lösung der pH-Wert änderte. Es wurde daher vor Zugabe des Enzyms der pH-Wert der Lösung mit verdünnter Salzsäure wieder auf den gewünschten Wert eingestellt. Enzym-katalysierte Transacylierungen wurden in unbehandelten Schnapp- deckelgläschen durchgeführt, da diese durch ihre günstigen Oberflächeneigenschaften nicht zu einem Festkleben des Enzyms an der Glasoberfläche führten. Mit Wasser gesättigte Lösungsmittel wurden bei 20 ºC mit dest. Wasser gesättigt. Proben zur Reaktionskontrolle wurden zur Trocknung und zur Abtrennung von Proteinen über eine mit NaSO4 und Celite gefüllte Pasteurpipette filtriert.
- 188. 174 EXPERIMENTELLER TEIL 3.2 Darstellung und Analytik der MPEG/PLE Präparationen 3.2.1 Darstellung von MPEG/PLE84,85 3 ml PLE/(NH4)2SO4-Suspension (entspricht 30 mg natives Protein) wurden durch Ultrafiltration unter Eiskühlung durch eine PM 30-Membran (Ausschlußgrenze: >30 kDa) mit 1 L dest. Wasser unter 1.0 bar N2-Überdruck entsalzt. Der Rückstand wurde mit ca. 250 ml dest. Wasser aufgenommen. Die leicht getrübte Suspension wurde unter Rühren mit 1000 mg MPEG5000 versetzt, für 3 h gerührt, in flüssigem Stickstoff gefroren und für 60 h bei Raumtemperatur im Hochvakuum (0.01 mbar, RT) lyophilisiert. Das so gefriergetrocknete Colyophilisat aus MPEG/PLE (3 % Proteingehalt) wurde als weißer, flockiger Feststoff mit einer Ausbeute von 100 % erhalten. 3.2.2 Standardtest zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE86 O O PLE + O Rt, pH 8 OH OH Abb. 3.1: Enzymatische Verseifung von Buttersäureethylester. 90 ml Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M, pH 8.00) wurden mit 3 ml Buttersäureethylester (22.7 mmol) versetzt und heftig gerührt, so daß eine feine Emulsion entstand. Die Mischung wurde auf pH 8.00 eingestellt. Nach Zugabe von ca. 1 mg Enzym (entspricht 100 µl PLE/(NH4)2SO4-Suspension oder 34 mg MPEG/PLE; ca. 100 - 200 U) wurde der pH-Wert durch einen Autotitrator mit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten und der Verbrauch an NaOH-Lösung über 2 Stunden verfolgt. Anhand des Verbrauchs an 1 N NaOH-Lösung ließ sich die Enzymaktivität bestimmen (Zur Programmierung des Autotitrators siehe Kap. 3.7.1, S. 271). Hierzu wurde der Verbrauch an NaOH-Lösung gegen die Zeit aufgetragen und der Verbrauch pro Minute anhand von zwei Meßpunkten im linearen Bereich des Diagramms bestimmt.
- 189. DARSTELLUNG UND ANALYTIKDER MPEG/PLE PRÄPARATIONEN 175 Die Enzymaktivität ist definiert als: Formel 3.1: 1 U = 1 µmol hydrolysierter Buttersäureethylester/(Min⋅mg Protein) Die Proteinmenge wurde im Falle der MPEG/PLE direkt eingewogen, im Falle der PLE/(NH4)2SO4-Suspension mit einer Eppendorf-Pipette (Genauigkeit: 100 µl ±0.8 %) abgemessen. Tabelle 3.1: Standardaktivität verschiedener Enzympräparationen Enzympräparation Standardaktivität PLE/(NH4)2SO4-Suspension 120 – 180 U Colyophilisat MPEG/PLE 110 – 150 U/mg PLE Colyophilisat PLE/BSA/MPEG 148 U/mg PLE Chirazyme E1 (lyophilisierte PLE) 26 – 30 U
- 190. 176 EXPERIMENTELLER TEIL 3.3 Darstellung der Substrate zur enzymatischen Racematspaltung 3.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 3.3.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Freisetzung der racemischen Basen (AAV 1)91 Zur Freisetzung der Base aus ihrem Hydrochlorid wurde dieses in einer Emulsion aus Wasser (0.5 ml/mmol) und Dichlormethan (0.4 ml/mmol) suspendiert. Unter Rühren wurde langsam 40 %ige Natronlauge (0.13 bis 0.20 ml/mmol) zugetropft und für ca. 30 Min. nachgerührt bis der gesamte Feststoff reagiert hatte. Nach Phasentrennung wurde dreimal mit Dichlormethan (jeweils 1 ml/mmol) nachextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet. Nach Einengen im Rotationsverdampfer wurde die freie Base in der Regel als farbloses, Sirup ähnliches Öl erhalten, das vorsichtig im Hochvakuum von Lösungsmittelresten befreit wurde. Alle freien Basen haben die Eigenschaft bei der Entfernung von Lösungsmittelresten unter vermindertem Druck stark zu schäumen, daher ist diese Operation mit besonderer Sorgfalt und gegebenenfalls unter gelindem Erwärmen zur Erhöhung der Viskosität der Lösung durchzuführen. 3.3.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester von Phenolen244 (AAV 2) Zu einer Mischung von 1.2 Äq. Säureanhydrid und 0.1 Äq. Pyridin in Dichlormethan wurde unter Rühren das Phenol gegeben. Die Reaktionslösung wurde für 2 - 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem durch DC-Kontrolle kein Edukt mehr detektiert werden konnte, wurde die Reaktionsmischung über Nacht mit ges. NaHCO3-Lösung gerührt, um überschüssiges Säureanhydrid zu hydrolysieren. Nach Phasentrennung wurde dreimal mit Diethylether (2 ml/mmol) nachextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet, im Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum von Lösungsmittelresten befreit.
- 191. DARSTELLUNG DER SUBSTRATEZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 177 3.3.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester von Hydroxysubstituierten-Tramadolen (AAV 3) Das Hydrochlorid oder die freie Base des sekundären Alkohols wurde in abs. Tetrahydrofuran oder Diethylether (3.15 ml/mmol) suspendiert. Anschließend wurden bei der angegebenen Temperatur vorsichtig 2.5 Äq. Kalium-tert-butylat im Falle des Hydrochlorids oder 1.0 Äq. Kalium-tert-butylat im Falle der freien Base zugegeben (exotherme Reaktion, gegebenenfalls Kühlen). Es entstand in allen Fällen eine klare, schwach gelbe bis dunkelgelbe Lösung. Danach wurde noch eine halbe Stunde nachgerührt und anschließend unter Eiskühlung bei 5 ºC über einen Zeitraum von 10 Min. 1.0 - 1.5 Äq. Säurechlorid in Tetrahydrofuran oder Diethylether (0.47 ml/mmol) zugetropft. Zur Vervollständigung der Reaktion wurde die Lösung noch eine Stunde bei der angegeben Reaktionstemperatur gerührt und danach über Nacht bei Raumtemperatur. Anschließend wurde die hellgelbe Reaktionslösung mit einem Überschuß ges. NaHCO3-Lösung für weitere 20 Stunden kräftig gerührt, um überschüssiges Säurechlorid zu hydrolysieren. Nach Phasentrennung wurde dreimal mit Dichlormethan (1.25 ml/mmol) nachextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurde der Ester als farbloses bis gelbliches, sirupöses Öl erhalten, das im Hochvakuum von Lösungsmittelresten befreit wurde. 3.3.1.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung von Hydrochloriden aus den racemischen Basen (AAV 4) Die Base wird in einer Mischung aus trockenem Aceton (1.40 ml/mmol) und Ethanol (0.28 ml/mmol) gelöst. Anschließend wird zur Vermeidung von Nebenreaktionen, wie Eliminierungen, schonend durch Zugabe von 1 Äq. Wasser und 1 Äq. Trimethylchlorsilan das Hydrochlorid ausgefällt, abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet.
- 192. 178 EXPERIMENTELLER TEIL 3.3.2 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung 3.3.2.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy- phenyl)-cyclohexanol (rac-7) Die Base rac-7 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden 10 g (33.3 mmol) rac-7⋅HCl in 16 ml dest. Wasser und 12 ml Dichlormethan suspendiert und mit 4.4 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 8.70 g (33.0 mmol, 99 %) rac-7 als farbloser Sirup erhalten. OH 10 5 6 1 9 11 O 3 7 15 4 2 14 N 12 13 8 rac-7: MW = 263.4 g⋅mol-1 H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7.2 ppm (dd, 1 H, 3J = 8 Hz, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 1 7.2 (s, 1 H, 10-H), 7.0 (d, 3J = 8 Hz, 1 H, 12-H), 6.8 (dm, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 3.8 (s, 3 H, 15-H), 2.4 (dd, 3J=4 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 7´-H), 2.1 - 2.0 (m, 7 H, 8-H, 7-H), 1.9 - 1.5 (m, 8 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H). 13 C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 159.5 ppm [u] (C-11), 152.0 [u] (C-9), 128.9 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.2 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 76.9 [u] (C-1), 61.6 [u] (C-7), 55.2 [d] (C-15), 47.7 [d] (C-8), 44.8 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.9 [u] (C-4), 22.3 [u] (C-5). 13 Die Zuordnung der C-NMR-Signale war durch einen Vergleich mit Literaturdaten eindeutig möglich.245
- 193. DARSTELLUNG DER SUBSTRATEZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 179 3.3.2.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy- cyclohexyl)-phenol (rac-8)91 Zu 5.2 g (19.8 mmol) rac-7, gelöst in 9 ml abs. Toluol, wurden bei Raumtemperatur 40 ml 20 %ige Diisobutylaluminiumhydrid-Lösung (39.6 mmol) in abs. Toluol zugetropft, wobei es zu einer leicht exothermen Reaktion und einer Gasentwicklung kam. Anschließend wurde für 15 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden unter Eiskühlung 11.3 ml Ethanol so zugetropft, daß eine Innentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Danach wurde 15 Min. nachgerührt. Ebenfalls unter Eiskühlung wurden daraufhin 11.3 ml eines Ethanol/Wasser-Gemisches (1 : 1) wieder so zugetropft, daß eine Innentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Anschließend wurde die Reaktionslösung mit ca. 20 ml Toluol verdünnt und danach noch eine Stunde bei Raumtemperatur nachgerührt. Der ausgefallene Feststoff wurde abfiltriert und mit fünf Volumenteilen Essigsäureethylester bei 60°ºC für 30 Min. nachextrahiert. Nach Filtration wurden die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 4.592 g (18.4 mmol, 93 %) eines farblosen Öls erhalten, welches farblose Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 139 ºC bildete. OH 10 5 6 1 9 11 OH 3 7 4 2 14 N 12 13 8 rac-8: MW = 249.4 g⋅mol-1 H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7.5 ppm (s, 1 H, 10-H), 7.2 (dd, 3J = 8 Hz, 3J = 8 Hz, 1 1 H, 13-H), 6.8 (m, 2 H, 12-H, 14-H), 2.4 (dd, 3J = 4 Hz, 2J = 14 Hz, 1 H, 7´-H), 2.2 - 1.4 (m, 15 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H). 13 C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 157.0 ppm [u] (C-11), 151.0 [u] (C-9), 129.4 [d] (C-13), 116.0 [d] (C-14), 113.3 [d] (C-12), 113.0 [d] (C-10), 78.3 [u] (C-1), 61.7 [u] (C-7), 47.6 [d] (C-8), 44.4 [u] (C-2), 41.0 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.7 [u] (C-4), 22.2 [u] (C-5).
- 194. 180 EXPERIMENTELLER TEIL MS (EI, 70 eV) m/z (%): 249 (M+, 18), 121 (3), 58 (100), 45 (6). MS (CI, Isobutan, 100 eV) m/z (%):306 ([M + C4H9]+, 4), 250 ([M + H]+, 100), 249 (M+, 10). IR (KBr): ∼ = 3201 (s), 2985 (s), 2863 (s), 2834 (s), 2789 (s), 2425 (w), 1280 (s), ν 1252 (m), 1215 (s), 1166 (m), 1118 (m), 1098 (m), 1079 (m), 1033 (w), 10006 (w), 988 (s), 963 (m), 905 (w), 865 (m), 846 (m), 763 (m), 707 (m) cm-1. C15H23NO2 (249.2 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 72.25 71.98 H 9.30 9.10 N 5.62 5.56 3.3.2.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2- dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) Die Base rac-11 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden 5.0 g (19.3 mmol) rac-11⋅HCl in 19 ml dest. Wasser und 2 ml Dichlormethan suspendiert und mit 10 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 4.188 g (18.8 mmol, 97 %) rac-11 als farbloser Sirup erhalten, welcher farblose, weiße Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 98 ºC bildete. OH 8 1 7 9 4 OH 3 5 2 12 N 10 11 6 rac-11: MW = 223.3 g⋅mol-1 H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 8.3 – 8.1 (br s, 1 H, 9-OH), 7.21 (s, 1 H, 8-H), 7.06 (t, 1 3 J = 8 Hz, 1 H, 11-H), 6.82 (d, 3J = 8 Hz, 1 H, 10-H/12-H), 6.61 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 2 Hz, 1 H, 10-H/12-H), 2.67 (dd, 3J = 11 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H´), 2.31 (s, 6 H, 6-H),
- 195. DARSTELLUNG DER SUBSTRATEZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 181 2.23 (dd, 3J = 3 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H), 2.06 (m, 1 H, 2-H), 1.49 (s, 3 H, 4-H), 0.65 (d, 3J = 7 Hz, 3 H, 3-H). C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 156.5 ppm [u] (C-9), 149.4 [u] (C-7), 128.5 [d] 13 (C-11), 117.2 [d] (C-12), 113.9 [d] (C-10), 113.7 [d] (C-8), 78.4 [u] (C-1), 64.1 [u] (C-5), 45.6 [d] (C-6), 40.1 [d] (C-2), 21.8 [d] (C-4), 14.8 [d] (C-3). MS (EI, 70 eV) m/z (%): 223 (M+, 10), 181 (3), 138 (3), 121 (11), 107 (6), 95 (4), 93 (10), 91 (5), 86 (69), 77 (9), 71 (18), 65 (14), 58 (100), 45 (62). IR (KBr): ∼ = 3225 (s), 2981 (s), 2955 (s), 2884 (s), 2838 (s), 2802 (s), 2653 (s), ν 2567 (m), 1615 (m), 1585 (s), 1507 (s), 1485 (s), 1467 (s), 1282 (s), 1255 (s), 1240 (s), 1260 (s), 1176 (m), 1162 (w), 1123 (s), 1103 (w), 1077 (w), 876 (s), 841 (s), 793 (s), 743 (m), 707 (s), 688 (w), 545 (w), 531 (w), 487 (w) cm-1. C13H21NO2 (223.3 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 69.92 69.73 H 9.48 9.56 N 6.27 6.23 3.3.2.4 Darstellung von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1- (3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) Die Base rac-12 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden 3.293 g (10.4 mmol) rac-12⋅HCl in 5 ml dest. Wasser und 20 ml Dichlormethan suspendiert und mit ca. 3.0 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 2.883 g (10.3 mmol, 99 %) rac-12 als farbloser, zäher Sirup erhalten, der unter gelindem Erwärmen in einen Achatmörser überführt wurde und dort anschließend erstarrte. 2.273 g (8.1 mmol, 79 %) wurden so als farblose Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 49 ºC gewonnen und 0.552 g (2.0 mmol, 19 %) als farbloser Sirup zurückbehalten.
- 196. 182 EXPERIMENTELLER TEIL OH 5 10 6 1 9 11 HO O 3 7 15 4 2 14 N 12 13 8 rac-12: MW = 279.4 g⋅mol-1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 ppm (t, 1 H, 13-H), 7.10 (s, 1 H, 10-H), 7.01 (d, 1 3 J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.75 (ddd, 3J = 9 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 4.12 (m, 1 H, 5-H), 3.80 (s, 3 H, 15-H), 2.50 – 2.75 (br s, 1 H, 1-OH), 2.38 (dd, 2J = 14 Hz, 3 J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.25 – 1.20 (m, 14 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.6 [u] (C-11), 150.7 [u] (C-9), 129.1 [d] (C-13), 117.2 [d] (C-14), 111.6 [d] (C-12), 110.8 [d] (C-10), 78.6 [u] (C-1), 67.5 [d] (C-5), 60.7 [u] (C-7), 55.2 [d] (C-15), 50.0 [u] (C-6), 47.8 [d] (C-8), 44.3 [d] (C-2), 35.7 [u] (C-4), 26.3 [u] (C-3). MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 64), 234 (5), 135 (11), 107 (4), 84 (3) 58 (100). IR (in CHCl3): ∼ = 3371 (s), 3079 (s), 2945 (s), 2860 (s), 2831 (s), 2784 (s), 1600 (s), ν 1583 (s), 1484 (s), 1463 (s), 1432 (s), 1365 (m), 1315 (m), 1287 (s), 1255 (s), 1206 (m), 1158 (s), 1096 (s), 1074 (s), 1048 (s), 1012 (m), 979 (m), 959 (m), 861 (m), 844 (m), 829 (w), 782 (s), 756 (s), 730 (m), 704 (s), 666 (m), 569 (w) cm-1. C16H25NO3 (279.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 68.79 68.44 H 9.02 9.38 N 5.01 4.93
- 197. DARSTELLUNG DER SUBSTRATEZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 183 3.3.2.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1- (3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13) Die Base rac-13 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden 2.422 g (7.7 mmol) rac-13⋅HCl in 10 ml dest. Wasser und 30 ml Dichlormethan suspendiert und mit ca. 1.5 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 2.092 g (7.5 mmol, 98 %) rac-13 als weißer Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 106 ºC erhalten. OH OH 10 5 6 1 9 11 O 3 7 15 4 2 14 N 12 13 8 rac-13: MW = 279.4 g⋅mol-1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.99 ppm (s, 1 H, 1-OH), 7.26 (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 1 13-H), 7.09 (s, 1 H, 10-H), 6.99 (s, 1 H, 14-H), 6.75 (m, 1 H, 12-H), 5.15 (s, 1 H, 5-OH), 4.06 (s, 1 H, 5-H), 3.82 (s, 3 H, 15-H), 2.47 (m, 2 H, 7-H, 3-H), 2.15 (d, 1 H, 7-H´), 2.12 (s, 6 H, 8-H), 2.05 (m, 1 H, 4-H), 1.97 (ddd, 4J = 2.75 Hz, 3J = 2.75 Hz, 2 J = 14.6 Hz, 1 H, 6-H), 1.92 (m, 1 H, 2-H), 1.75 (dd, 1 H, 2J = 14.6 Hz, 3J = 3.05 Hz, 6-H´), 1.60 – 1.65 (m, 2 H, 4-H´, 3-H´). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.6 ppm [u] (C-11), 150.2 [u] (C-9), 129.1 [d] (C-13), 117.0 [d] (C-14), 111.5 [d] (C-12), 110.8 [d] (C-10), 79.0 [u] (C-1), 67.0 [d] (C-5), 61.3 [u] (C-7), 55.1 [d] (C-15), 47.8 [d] (C-8), 44.9 [u] (C-6), 44.0 [d] (C-2), 33.6 [u] (C-4), 21.8 [u] (C-3). MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 17), 135 (5), 58 (100), 45 (4). IR (KBr): ∼ = 3375 (s), 3046 (m), 2969 (s), 2942 (s), 2874 (s), 2826 (s), 1598 (s), ν 1488 (s), 1461 (s), 1438 (s), 1406 (w), 1377 (w), 1326 (m), 1285 (s), 1263 (s), 1246 (s), 1206 (m), 1177 (m), 1158 (s), 1113 (m), 1083 (w), 1044 (s), 1011 (m), 986 (m), 971 (m), 956 (m), 926 (w), 883 (s), 852 (s), 835 (m) 789 (s), 706 (s), 597 (m) cm-1.
- 198. 184 EXPERIMENTELLER TEIL C16H25NO3 (279.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 68.79 68.65 H 9.02 9.25 N 5.01 4.93 3.3.2.6 Darstellung von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-1- (3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) Die Base rac-14 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden 1.802 g (5.7 mmol) rac-14⋅HCl in 10 ml dest. Wasser und 30 ml Dichlormethan suspendiert und mit ca. 0.9 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 1.578 g (5.5 mmol, 99 %) rac-14 als farbloser, zäher Sirup erhalten, der unter gelindem Erwärmen in einen Achatmörser überführt wurde und dort anschließend erstarrte. 1.300 g (4.7 mmol, 82 %) wurden so als farblose Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 44 ºC gewonnen und 0.278 g (1 mmol, 17 %) als farbloses sirupöses Öl zurückbehalten. OH 10 5 6 1 9 11 O HO 3 7 15 4 2 14 N 12 13 8 rac-14: MW = 279.4 g⋅mol-1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.25 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.13 (s, 1 H, 1 10-H), 7.01 (s, 1 H, 12-H), 6.78 (ddd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 3.81 (s, 3 H, 15-H), 3.75 (m, 1 H, 4-H), 2.7 - 2.9 (br s, OH), 2.42 (dd, 2J = 14 Hz, 3 J = 4.5 Hz, 1 H, 7-H´), 2.22 – 1.60 (m, 14 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.7 ppm [u] (C-11), 151.0 [u] (C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.5 [d] (C-14), 111.7 [d] (C-12), 111.3 [d] (C-10), 76.2 [u] (C-1), 71.2 [d] (C-4), 61.5 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.5 [d] (C-2), 39.7 [u] (C-6), 37.2 [u] (C-3), 31.9 [u] (C-5).
- 199. DARSTELLUNG DER SUBSTRATEZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 185 IR (KBr): ∼ = 3391 (s), 2945 (s), 2860 (s), 2829 (s), 2781 (s), 1604 (s), 1584 (s), ν 1483 (s), 1464 (s), 1431 8s), 1369 (w), 1287 (s), 1253 (s), 1167 (m), 1135 8w), 1074 (m), 1041 (s), 990 (s), 960 (m), 853 (w), 828 (w), 782 (m), 703 (m) cm-1. MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 11), 234 (2), 135 (2), 58 (100), 45 (2). C16H25NO3 (279.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 68.79 68.82 H 9.02 8.81 N 5.01 4.99 3.3.3 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse 3.3.3.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15) Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 2.00 g (8.0 mmol) rac-8 mit einer Mischung aus 1.52 g (9.6 mmol) Buttersäureanhydrid und 0.06 g (0.8 mmol) Pyridin in 20 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf(rac-15)= 0.31; Rf (rac-8) = 0.10) wurden 2.401 g (7.5 mmol, 94 %) eines weiß-grauen kristallinen Feststoffs mit einem Schmelzpunkt von 54 ºC erhalten. OH 10 5 6 1 9 11 16 18 O 15 7 17 4 3 2 14 N 12 O 13 8 rac-15: MW = 319.4 g⋅mol-1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.3 ppm (m, 1 H, 13-H), 7.2 (s, 1 H, 10-H), 6.9 (m, 1 2 H, 12-H, 14-H), 2.5 (t, 3J = 5 Hz, 2 H, 16-H), 2.4 (dd, 3J = 4 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H,
- 200. 186 EXPERIMENTELLER TEIL 7´-H), 2.1 - 1.4 (m, 17 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H), 1.0 (t, 3J = 5 Hz, 3 H, 18-H). C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 172.1 ppm [u] (C-15), 152.2 [u] (C-11), 150.8 [u] 13 (C-9), 128.8 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 119.0 [d] (C-12), 118.6 [d] (C-10), 76.9 [u] (C-1), 61.5 [u] (C-7), 47.7 [d] (C-8), 44.7 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 36.2 [u] (C-16), 27.9 [u] (C-3), 26.8 [u] (C-4), 22.2 [u] (C-5), 18.4 [u] (C-17), 13.7 [d] (C-18). MS (EI, 70 eV) m/z (%): 319 (M+, 9), 58 (100). IR (KBr): ∼ = 3400 (w), 3091 (m), 2975 (s) 2945, 2856 (s), 2829 (s), 1755 (s), 1608 ν (m), 1588 (m), 1461 (m), 1445 (m), 1434 (s), 1417 (s), 1383 (m), 1156 (s), 1156 (s), 1096 (s), 808 (m), 708 (m) cm-1. C19H29NO3 (319.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 71.44 71.03 H 9.15 9.19 N 4.38 4.35 3.3.3.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 2.490 g (10.0 mmol) rac-8 mit einer Mischung aus 1.318 g (12.9 mmol) Essigsäureanhydrid und 0.08 g (1.0 mmol) Pyridin in 40 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf(rac-16)= 0.26; Rf (rac-8) = 0.10) wurden 2.881 g (9.9 mmol, 99 %) eines weißen kristallinen Feststoffs mit einem Schmelzpunkt von 84 ºC erhalten.
- 201. DARSTELLUNG DER SUBSTRATEZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 187 OH 10 5 6 1 9 11 O 15 16 7 4 3 2 14 N 12 O 13 8 rac-16: MW = 291.4 g⋅mol-1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.3 ppm (m, 3 H, 13-H, 10-H, 12-H/14-H), 6.93 (m, 1 1 H, 12-H/14-H), 5.8 – 6.4 (br s, 1 H, 1-OH), 2.38 (dd, 3J = 4 Hz, 2J = 14 Hz, 1 H, 7´-H), 2.29 (s, 3 H, 16-H), 2.25 – 1.25 (m, 16 H, 2-H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H). 13 C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 169.3 ppm [u] (C-15), 152.0 [u] (C-11), 150.5 [u] (C-9), 128.7 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 118.9 [d] (C-12), 118.4 [d] (C-10), 77.3 [u] (C-1), 61.5 [u] (C-7), 47.7 [d] (C-8), 44.7 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.8 [u] (C-4), 22.2 [u] (C-5), 21.1 [d] (C-16). MS (EI, 70 eV) m/z (%): 291 (M+, 31), 121 (3), 58 (100) 45 (8). IR (KBr): ∼ = 3076 (w), 3007 (w), 2981 (w), 2947 (s), 2924 (s), 2856 (m), 2828 (m), ν 2786 (m), 1755 (s), 1609 (w), 1588 (w), 1482 (w), 1459 (m), 1436 (m), 1377 (m), 1293 (w), 1268 (w), 1213 (s), 1154 (m), 1140 (w), 1094 (w), 1085 (w), 1022 (m), 991 (m), 965 (m), 938 (w), 889 (w), 839 (w), 806 (w), 784 (w), 710 (w) cm-1. C17H25NO3 (291.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 70.07 69.91 H 8.65 8.13 N 4.81 4.71 3.3.3.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1- hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 1.786 g (8.0 mmol) rac-11 mit einer Mischung aus 1.52 g (9.6 mmol) Buttersäureanhydrid und 0.06 g (0.8 mmol) Pyridin in 20 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und
- 202. 188 EXPERIMENTELLER TEIL Säulenchromatographie (EE : MeOH = 2 : 1, 1 % Triethylamin über Kieselgel, Rf (rac-17)= 0.58) wurden 1.995 g (6.8 mmol, 85 %) eines farblosen Öls erhalten. OH 8 1 7 9 14 16 4 O 13 5 3 2 12 15 N 10 O 11 6 rac-17: MW = 293.4 g⋅mol-1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 (s, 1 H, Ar), 7.22 (s, 1 H, Ar), 7.15 (s, 1 H, Ar), 1 6.87 (m, 1 H, 11-H), 2.57 (dd, 3J = 11 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H´), 2.44 (t, 3J = 7 Hz, 2 H, 14-H), 2.22 (s, 6 H, 6-H), 2.14 (dd, 3J = 3 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H), 1.94 (m, 1 H, 2-H), 1.69 (m, 2 H, 15-H), 1.40 (s, 3 H, 4-H), 0.96 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 16-H), 0.70 (d, 3J = 7 Hz, 3 H, 3-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 170.8 ppm [u] (C-13), 149.5 [u] (C-9), 149.3 [u] (C- 7), 127.3 [d] (C-11), 122.0 [d] (C-12), 118.3 [d] (C-10), 118.1 [d] (C-8), 76.2 [u] (C-1), 63.0 [u] (C-5), 44.7 [d] (C-6), 39.3 [d] (C-2), 35.2 [u] (C-14), 20.9 [d] (C-4), 17.4 [u] (C-15), 14.8 [d] (C-3), 12.6 [d] (C-16). MS (EI, 70 eV) m/z (%): 293 (M+, 4), 86 (7), 84 (12), 71 (4), 58 (100), 45 (7). IR (kapillar): ∼ = 2971 (s), 2877 (m), 2827 (m), 2784 (m), 1759 (s), 1608 (m), 1586 ν (m), 1466 (s), 1370 (m), 1236 (m), 1153 (s), 1098 (w), 1080 (w), 1029 (m), 947 (m), 838 (w), 704 (m) cm-1. C17H27NO3 (293.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 69.59 69.52 H 9.28 8.93 N 4.77 4.67
- 203. DARSTELLUNG DER SUBSTRATEZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 189 3.3.3.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino- methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 3.265 g (10.3 mmol) rac-12⋅HCl, gelöst in 33 ml abs. THF, mit 2.950 g (26.3 mmol) Kalium- tert-butylat über einen Zeitraum von 10 Min. mit 1.66 ml (1.703 g, 16.0 mmol) Buttersäurechlorid, gelöst in 3 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1:1 über Kieselgel, Rf (rac-18) = 0.41; Rf (rac-12) = 0.18) wurden 2.915 g (8.3 mmol, 81 %) eines klaren sirupösen Öls erhalten. O OH 18 10 5 6 1 9 11 19 16 O O 17 3 7 15 4 2 14 N 12 13 8 rac-18: MW = 349.5 g⋅mol-1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.26 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.14 (s, 1 H, 1 10-H), 7.03 (s, 1 H, 12-H), 6.75 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 5.21 (m, 1 H, 5-H), 3.82 (s, 3 H, 15-H), 2.42 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.30 – 1.40 (m, 18 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 0.91 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.8 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.6 [u] (C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 78.4 [u] (C-1), 71.1 [d] (C-5), 60.5 [u] (C-7), 55.1 [d] (C-15), 47.7 [d] (C-8), 46.0 [u] (C-6), 44.1 [d] (C-2), 36.4 [u] (C-17), 32.2 [u] (C-4), 25.9 [u] (C-3), 18.5 [u] (C-18), 13.6 [d] (C-19). MS (EI, 70 eV) m/z (%): 350 ([M+H]+, 9), 349 (M+, 38), 262 (7), 135 (8), 58 (100), 45 (3). IR (kapillar): ∼ = 2947 (s), 2864 (m), 2831 (s), 2784 (m), 1730 (s), 1600 (m), 1583 ν (m), 1484 (s), 1462 (s), 1432 (m), 1383 (m), 1358 (m), 1306 (m), 1288 (s), 1256 (s),
- 204. 190 EXPERIMENTELLER TEIL 1186 (s), 1093 (m), 1048 (s), 1018 (m), 978 (m), 963 (m), 864 (w), 847 (w), 784 (m), 756 (m) 704 (w) cm-1. C20H31NO4 (349.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 68.74 68.44 H 8.94 8.77 N 4.01 4.30 3.3.3.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino- methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei –10 ºC, dazu wurden 3.50 g (12.5 mmol) rac-13, gelöst in 102 ml abs. Diethylether und auf –10 ºC gekühlt, mit 1.408 g (12.5 mmol) Kalium-tert-butylat und 1.203 g (11.3 mmol) Buttersäurechlorid, gelöst in 8 ml abs. Diethylether, versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 4.235 g eines gelben, öligen Rohprodukts erhalten. Nach Säulenchromatographie (Diisopropyl- ether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.29) wurden 1.904 g (5.4 mmol, 44 %) rac-19 als sirupöses Öl und 1.787 g einer Mischfraktion aus rac-13 (Rf = 0.16) und rac-19 erhalten. Nach erneuter Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel) wurden weitere 0.593 g (1.7 mmol, 14 %) rac-19 und 0.582 g Mischfraktion erhalten. O 18 19 16 O OH 17 10 5 6 1 9 11 O 3 7 15 4 2 14 N 12 13 8 rac-19: MW = 349.5 g⋅mol-1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 ppm (t, 1 3 J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.12 (s, 1 H,.10-H), 7.02 (d, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 6.75 (dd, 3J = 8 Hz, 3J = 3 Hz, 1 H, 12-H), 5.17 (m, 1 H, 5-H), 3.80 (s, 3 H, 15-H), 2.29 – 3.36 (m, 2 H, 17-H), 2.11 (s, 6 H, 8-H), 2.08 – 1.63 (m, 11 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 18-H), 0.96 (t, 3J = 7.5 Hz, 3 H, 19-H).
- 205. DARSTELLUNG DER SUBSTRATEZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 191 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.7 ppm [u] (C-16), 159.7 [u] (C-11), 149.0 [u] 13 (C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.7 [d] (C-14), 112.0 [d] (C-12), 111.6 [d] (C-10), 76.1 [u] (C-1), 70.5 [d] (C-5), 61.1 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 46.6 [d] (C-8), 43.4 [u] (C-6), 43.0 [d] (C-2), 37.0 [u] (C-17), 29.6 [u] (C-4), 22.4 [u] (C-3), 18.9 [u] (C-18), 14.0 [d] (C-19). MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 16), 135 (6), 58 (100). IR (kapillar): ∼ = 3584 (m), 3079 (s), 2944 (m), 2873 (m), 2766 (m), 1733 (s), 1601 ν (m), 1584 (m), 1485 (m), 1461 (s), 1432 (m), 1381 (w), 1287 (s) 1255 (s), 1201 (s), 1188 (s), 1166 (s), 1104 (m), 1088 (m), 1049 (m), 985 (w), 960 (w) 860 (w), 825 (w), 782 (w), 734 (w), 702 (w) cm-1. C20H31NO4 (349.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 68.74 68.35 H 8.94 9.08 N 4.01 4.30 3.3.3.6 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-3-(6-Dimethylaminomethyl-1,3- dihydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-20)91 Zu 1.790 g (6.4 mmol) rac-13, gelöst in 8 ml abs. Toluol, wurden bei Raumtemperatur 42 ml Diisobutylaluminiumhydrid-Lösung (1 M, 42.0 mmol) in abs. Toluol zugetropft, wobei es zu einer leicht exothermen Reaktion und einer starken Gasentwicklung kam. Anschließend wurde die Reaktionslösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur und danach für weitere 24 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden unter Eiskühlung 5.0 ml Ethanol so zugetropft, daß eine Innentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Danach wurde 15 Min. nachgerührt. Ebenfalls unter Eiskühlung wurden anschließend 10.0 ml eines Ethanol/Wasser-Gemisches (1 : 1) wieder so zugetropft, daß eine Innentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Nach Filtration wurde die
- 206. 192 EXPERIMENTELLER TEIL organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 1.653 g (5.6 mmol, 88 %) eines farblosen Feststoffs mit einem Schmelzpunkt von 74 ºC erhalten, welcher noch Spuren rac-13 enthielt. Eine chromatographische Abtrennung dieser Verunreinigung war nicht möglich, daher wurde im folgenden die in Spuren verunreinigte Substanz eingesetzt. OH OH 10 5 6 1 9 11 OH 3 7 4 2 14 N 12 13 8 rac-20: MW = 265.4 g⋅mol-1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.18 ppm (mt, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.1 – 6.8 (br s, 1 1 H, 11-OH), 6.98 (s, 1 H, 10-H), 6.80 (s, 1 H, 14-H), 6.64 (dd, 1 H, 3J = 8 Hz, 4 J = 2 Hz, 12-H), 6.0 – 6.1 (br s, 2 H, 1-OH, 5-OH), 4.05 (m, 1 H, 5-H), 2.50 – 1.45 (m, 15 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 157.0 ppm [u] (C-11), 150.0 [u] (C-9), 129.6 [d] (C-13), 116.3 [d] (C-14), 113.9 [d] (C-10), 112.5 [d] (C-12), 79.4 [u] (C-1), 67.8 [d] (C-5), 61.6 [u] (C-7), 48.1 [d] (C-8), 45.1 [u] (C-6), 44.1 [d] (C-2), 33.6 [u] (C-4), 22.3 [u] (C-3). MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 16), 135 (6), 58 (100). IR (kapillar): ∼ = 3584 (m), 3079 (s), 2944 (m), 2873 (m), 2766 (m), 1733 (s), 1601 ν (m), 1584 (m), 1485 (m), 1461 (s), 1432 (m), 1381 (w), 1287 (s) 1255 (s), 1201 (s), 1188 (s), 1166 (s), 1104 (m), 1088 (m), 1049 (m), 985 (w), 960 (w) 860 (w), 825 (w), 782 (w), 734 (w), 702 (w) cm-1.
- 207. DARSTELLUNG DER SUBSTRATEZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 193 3.3.3.7 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylamino- methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21)95 1.190 g (4.5 mmol) rac-20 wurde zu einer Lösung aus 50 ml dest. Wasser und 6.42 g NaHCO3 (76.4 mmol) bei Raumtemperatur gegeben. Nach einer Stunde hatte sich eine klare Lösung gebildet, zu der innerhalb von 15 Minuten tropfenweise 6.65 ml (6.40 g, 40.5 mmol) Buttersäureanhydrid unter starker Gasentwicklung gegeben wurden. Anschließend wurde noch 15 Min. bei Raumtemperatur zur Vervollständigung der Reaktion gerührt und danach dreimal mit jeweils 15 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 1.446 g braunes, sirupöses Rohprodukt erhalten. Nach Säulenchromatographie (EE : MeOH = 2 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.33; Rf (rac-13) = 0.26) konnten 1.417 g (4.2 mmol, 93 %) rac-21 als schwach hellbrauner Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 79 ºC erhalten werden. OH OH 10 5 6 1 9 11 16 18 O 15 3 7 17 4 2 14 N 12 O 13 8 rac-21: MW = 335.4 g⋅mol-1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.27 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.20 ( br s, 1 H, - 1 H), 7.09 (m, 1 H, -H), 6.88 (dd, 3J = 9 Hz, 4J = 2 Hz, 1 H, -H), 4.01 (mt, 3J = 3 Hz, 1 H, 5-H), 2.5 – 1.5 (m, 19 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 16-H, 17-H), 0.97 (t, 3 J = 7 Hz, 3 H, 18-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.2 ppm [u] (C-15), 151.0 [u] (C-11), 150.3 [u] (C-9), 129.3 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 119.7 [d] (C-12), 118.7 [d] (C-10), 78.7 [u] (C-1), 67.2 [d] (C-5), 61.4 [u] (C-7), 47.5 [d] (C-8), 46.1 [u] (C-6), 44.0 [d] (C-2), 36.5 [u] (C-16), 33.6 [u] (C-4), 22.1 [u] (C-3), 18.8 [u] (C-17), 14.0 [d] (C-18). MS (EI, 70 eV) m/z (%): 265 (M+, 14), 121 (3), 58 (100) 45 (6).
- 208. 194 EXPERIMENTELLER TEIL IR (KBr): ∼ = 3371 (m), 3169 (s9, 2946 (s), 2830 (s), 2786 (m), 1615 (m) 1585 (m), ν 1481 (s), 1424 (s), 1369 (w), 1352 (m), 1305 (m), 1293 (s), 1278 (s) 1251 (s), 1221 (m), 1165 (m), 1108 (s), 1075 (s), 1033 (m), 1007 (m), 984 (s), 952 (s), 904 (m), 874 (m), 863 (m), 841 (s), 782 (s), 734 (m), 703 (s), 579 (w), 469 (w) cm-1. 3.3.3.8 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylamino- methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 2.761 g (8.7 mmol) rac-14⋅HCl, gelöst in 28 ml abs. THF, mit 1.500 g (13.4 mmol) Kalium- tert-butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 1.410 ml (1.447 g, 13.6 mmol) Buttersäurechlorid, gelöst in 2 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.39; Rf (rac-14) = 0.14) wurden 2.396 g (6.9 mmol, 79 %) eines klaren sirupösen Öls erhalten. OH 10 5 6 1 9 11 17 O 19 16 O 3 7 15 4 2 14 18 N 12 13 O 8 rac-22: MW = 349.5 g⋅mol-1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.18 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.05 (s, 1 H, 1 10-H), 6.93 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (ddd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 4.78 (m, 1 H, 4-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.35 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.25 – 1.50 (m, 18 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 0.89 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.5 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.8 [u] (C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.1 [d] (C-10), 76.1 [u] (C-1), 73.3 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.4 [d] (C-2), 39.4 [u] (C-6), 36.9 [u] (C-17), 33.3 [u] (C-3), 27.9 [u] (C-5), 18.9 [u] (C-18), 14.0 [d] (C-19).
- 209. DARSTELLUNG DER SUBSTRATEZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 195 MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 8), 135 (2), 58 (100), 45 (3). IR (kapillar): ∼ = 3077 (w), 2960 (s), 2873 (m), 2831 (m), 2783 (m) 1728 (s), 1601 ν (m), 1583 (m), 1483 (s), 1462 (s), 1432 8s), 1384 (m), 1356 (w), 1287 (s), 1254 (s), 1184 (s), 1093 (m), 1047 (s), 1013 (s), 997 (s), 964 (w), 784 (m), 703 (m) cm-1. C20H31NO4 (349.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 68.74 68.68 H 8.94 9.01 N 4.01 4.43 3.3.3.9 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylamino- methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23) Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei 0 ºC, dazu wurden 1.700 g (5.4 mmol) rac-14⋅HCl, gelöst in 20 ml abs. Diethylether auf 0 ºC gekühlt, mit 1.510 g (13.45 mmol) Kalium-tert-butylat und mit 1.090 g (8.1 mmol) Hexansäurechlorid, gelöst in 2.6 ml abs. Diethylether, versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 2.370 g eines gelben, zähflüssigen Rohprodukts erhalten. Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.57; Rf (rac-14) = 0.19) und anschließender präparativer HPLC (EE : MeOH = 1 : 1 über RP-Säule 18) konnten 1.562 g (4.1 mmol, 77 %) rac-23 als trübes, sirupöses Öl erhalten werden, welches nach NMR- und GC-Analytik noch Spuren des Diesters der Hexansäure und rac-14 enthielt. OH 10 5 6 1 9 11 21 19 17 O 16 O 3 7 15 4 2 14 20 18 N 12 13 O 8 rac-23: MW = 377.5 g⋅mol-1
- 210. 196 EXPERIMENTELLER TEIL H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.19 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.05 (s, 1 H, 1 10-H), 6.93 (s, 1 H, 14-H), 6.70 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 2.5 Hz, 1 H, 12-H), 6.08 (br s, 1 H, 1-OH), 4.78 (m, 1 H, 4-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.4 – 1.5 (m, 19 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 1.25 (m, 4 H, 19-H, 20-H), 0.83 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 21-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.7 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.6 [u] (C-9), 129.4 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.2 [d] (C-10), 76.0 [u] (C-1), 73.2 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 47.9 [d] (C-8), 43.2 [d] (C-2), 39.4 [u] (C-6), 34.9 [u] (C-17) 33.3 [u] (C-3), 31.6 [u] (C-19), 27.9 [u] (C-5), 25.1 [u] (C-18), 22.7 [u] (C-20), 14.3 [d] (C-21). MS (EI, 70 eV) m/z (%): 377 (M+, 10), 135 (3), 58 (100). MS (CI, Isobutan, 100 eV) m/z (%): 434 ([M + C4H9]+, 3), 378 ([M + H]+, 100), 262 (4). IR (kapillar): ∼ = 2955 (s), 2861 (s), 2832 (m), 2783 (m), 1729 (s), 1601 (m),1583 ν (m), 1484 (s), 1464 (s), 1432 (s), 1380 (m), 1355 (m), 1317 (m), 1288 (s), 1251 (s), 1176 (s), 1137 (m), 1097 (m), 1049 (m), 1034 (s), 1014 (s), 783 (m), 736 (w), 703 (m) cm-1. C22H35NO4 (377.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden C 69.99 70.15 H 9.34 9.49 N 3.71 3.61
- 211. DARSTELLUNG DER SUBSTRATEZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 197 3.3.3.10 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylamino- methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24) Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei 0 ºC, dazu wurden 1.700 g (5.4 mmol) rac-14⋅HCl, gelöst in 20 ml Diethylether auf 0 ºC gekühlt, mit 1.510 g (13.45 mmol) Kalium-tert-butylat und mit 0.630 g (8.0 mmol) Essigsäurechlorid, gelöst in 2.6 ml Diethylether, versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 1.816 g eines gelben, öligen Rohprodukts erhalten. Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.46; Rf (rac-14) = 0.19) wurden 1.292 g einer gelblich öligen Mischung aus rac-24 und eines Diesters (Rf = 0.51) aus rac-14 und Essigsäure (Verhältnis nach den Signalen der Protonen der Methoxygruppe (15-H) im 1H-NMR: 4 : 1) erhalten. Ein Versuch zur weiteren Aufreinigung durch präparative HPLC (Acetonitril : Wasser = 3 : 1 über RP-Select B-LiChrosor b-Säule) führte zur Zersetzung von rac-24. Eine weitere Aufreinigung von rac-24 war somit nicht möglich. Im folgenden wurde daher die nach Säulenchromatographie erhaltene Mischung eingesetzt. OH 10 5 6 1 9 11 O 17 16 O 3 7 15 4 2 14 N 12 13 O 8 rac-24: MW = 263.4 g⋅mol-1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.18 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.10 (s, 1 H, 1 10-H), 6.90 (s, 1 H, 12-H), 6.70 (md, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 4.77 (m, 1 H, 4-H), 3.75 (s, 3 H, 15-H), 2.34 (md, 2J = 14 Hz, 1 H, 7-H´), 2.30 – 1.45 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 170.9 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.8 [u] (C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.8 [d] (C-12), 111.1 [d] (C-10), 76.0 [u] (C-1), 73.7 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.2 [d] (C-8), 43.3 [d] (C-2), 39.4 [u] (C-6), 33.3 [u] (C-3), 27.9 [u] (C-5), 21.8 [d] (C-17).
- 212. 198 EXPERIMENTELLER TEIL 3.3.3.11 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-3-butyryloxy-4- dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) Zu einer Mischung von 1.750 g (6.3 mmol) rac-13 und 0.250 g (0.5 mmol) Pyridin in 5 ml Dichlormethan wurden unter Rühren 1.090 g (6.9 mmol) Buttersäureanhydrid gegeben. In einer schwach exothermen Reaktion verfärbte sich die Reaktionslösung hierbei schwach gelb. Die Reaktionslösung wurde für 26 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, bis durch DC-Kontrolle kein Edukt mehr detektiert werden konnte. Anschließend wurde die schwach gelbe Reaktionslösung mit einem Überschuß ges. NaHCO3-Lösung für weitere 20 Stunden kräftig gerührt. Nach Phasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit dest. Wasser gewaschen und über NaSO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurde ein gelbliches, Sirup ähnliches Öl erhalten, das im Hochvakuum von Pyridinresten befreit wurde. Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.48) wurden 1.916 g (4.6 mmol, 67 %) rac-25 erhalten. O O 18 22 21 16 O O 20 23 19 17 1 10 5 6 9 11 O 3 7 15 4 2 14 N 12 13 8 rac-25: MW = 419.6 g⋅mol-1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 6.76 (m, 3 H, 1 10-H, 12-H, 14-H), 5.18 (m, 1 H, 5-H), 3.80 (s, 3 H), 15-H), 3.09 (dd, 2J = 15 Hz, 4 J = 3 Hz, 1 H, 6-H´), 2.46 – 2.30 (m, 4 H, 6-H, 7-H´,17-H/21-H), 2.22 (t, 3J = 7 Hz, 2 H, 17-H/21-H), 2.09 (s, 6 H, 8-H), 1.95 – 1.60 (m, H, 2-H, 3-H, 4-H, 7-H, 18-H, 22-H), 1.01 (t , 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H/23-H), 0.95 (t , 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H/23-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.6 ppm [u] (C-16), 171.9 [u] (C-20), 159.1 [u] (C-11), 143.0 [u] (C-9), 128.8 [d] (C-13), 117.9 [d] (C-14), 112.4 [d] (C-12), 111.4 [d] (C-10), 84.0 [u] (C-1), 69.0 [d] (C-5), 59.0 [u] (C-7), 55.2 [d] (C-15), 45.8 [d] (C-8),
- 213. DARSTELLUNG DER SUBSTRATEZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 199 44.8 [d] (C-2), 37.5 [u] (C-17), 36.4 [u] (C-21), 28.8 [u] (C-4), 18.5 [u] (C-18), 18.2 [u] (C-22), 13.9 [d] (C-19), 13.7 [d] (C-23). MS (CI, Isobutan, DEP, 100 eV) m/z (%): 477 ([M + C4H9]+, 2), 420 ([M + H]+, 100), 375 (11), 355 (13), 332 (63), 287 (73), 275 (15), 199 (44), 187 (23), 113 (13), 97 (10), 85 (24), 83 (21), 81 (30), 79 (14), 71 (31). IR (kapillar): ∼ = 2963 (s), 2943 (s), 2874 (m), 2819 (m), 2765 (m), 1733 (s), 1605 ν (m), 1585 (m), 1490 (m), 1461 (s), 1433 (s), 1382 (m), 1362 (m), 1292 (s), 1256 (s), 1191 (s), 1154 (s), 1097 (s), 1049 (m). 1029 (m), 991 (m), 973 (m),849 (w), 803 (w), 778 (w), 700 (w) cm-1. Die Synthese von rac-25 erfolgte ebenfalls gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur in THF mit einer Ausbeute von 96 %. 3.3.4 Darstellung der racemischen Ester zur Bestimmung des Umsatzes in der enzymatischen Transacylierung 3.3.4.1 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Essigsäure-4-dimethylamino- methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-47) Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g (0.25 mmol) rac-12, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert- butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.031 g (0.39 mmol) Essigsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.30; Rf (rac-12) = 0.18) wurden 0.054 g (0.17 mmol, 68 %) eines klaren, gelblichen Öls erhalten.
- 214. 200 EXPERIMENTELLER TEIL O OH 5 10 6 1 9 11 16 O O 17 7 15 3 14 4 2 N 12 13 8 rac-47: MW = 321.4 g⋅mol-1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.17 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.06 (s, 1 H, 1 10-H), 6.95 (d, 3J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.69 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 5.12 (m, 1 H, 5-H), 3.73 (s, 3 H, 15-H), 2.32 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.26 – 1.10 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 169.0 ppm [u] (C-16), 158.4 [u] (C-11), 149.1 [u] (C-9), 127.9 [d] (C-13), 115.9 [d] (C-14), 110.3 [d] (C-12), 109.6 [d] (C-10), 77.0 [u] (C-1), 69.9 [d] (C-5), 59.4 [u] (C-7), 54.1 [d] (C-15), 46.7 [d] (C-8), 44.9 [u] (C-6), 43.1 [d] (C-2), 31.2 [u] (C-4), 24.8 [u] (C-3), 20.3 [d] (C-17). MS (EI, 70 eV) m/z (%): 321 (M+, 8), 135 (4), 86 (11), 84 (18), 58 (100), 47 (4). IR (kapillar): ∼ = 2946 (m), 2830 (w),1730 (s),1601 (w), 1584 (w), 1483 (w), 1462 ν (m), 1431 (w), 1287 (m), 1250 (s), 1157 (w), 1034 (m), 785 (w), 733 (m) cm-1. 3.3.4.2 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylamino- methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-46) Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g (0.25 mmol) rac-12, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert- butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.036 g (0.39 mmol) Propionsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.36; Rf (rac-12) = 0.18) wurden 0.060 g (0.18 mmol, 71 %) eines klaren, schwach gelblichen sirupösen Öls erhalten.
- 215. DARSTELLUNG DER SUBSTRATEZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 201 O OH 18 5 10 6 1 9 11 16 O O 17 3 7 15 4 2 14 N 12 13 8 rac-46: MW = 335.4 g⋅mol-1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.17 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.07 (s, 1 H, 1 10-H), 6.96 (d, 3J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.69 (md, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 5.13 (m, 1 H, 5-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.33 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.26 – 1.30 (m, 16 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H), 1.01 (t, 3J = 8 Hz, 3 H, 18-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.7 ppm [u] (C-16), 159.4 [u] (C-11), 150.1 [u] (C-9), 129.0 [d] (C-13), 117.0 [d] (C-14), 111.5 [d] (C-12), 110.7 [d] (C-10), 78.0 [u] (C-1), 70.6 [d] (C-5), 60.9 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.2 [d] (C-8), 46.3 [u] (C-6), 44.5 [d] (C-2), 32.6 [u] (C-4), 38.3 [u] (C-17), 26.3 [u] (C-3), 9.6 [d] (C-18). MS (EI, 70 eV) m/z (%): 335 (M+, 12), 279 (3), 135 (5), 84 (11), 58 (100). IR (kapillar): ∼ = 2944 (s), 2862 (m), 2831 (m), 2783 (m), 1732 (s), 1601 (m), 1584 ν (m), 1483 (m), 1462 (s), 1429 (m), 1351 (w), 1286 (m), 1255 (s), 1193 (s), 1158 (m), 1083 (m), 1048 (m), 1023 (m), 785 (m), 732 (w), 702 (w) cm-1. 3.3.4.3 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylamino- methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24) Die Synthese erfolgte, indem 0.070 g (0.25 mmol) rac-14, gelöst in 1 ml Dichlormethan, mit 2.3 ml (25 mmol) Vinylacetat und 500 mg Novozym 435 versetzt und bei Raumtemperatur gerührt wurden. Die Rührgeschwindigkeit wurde dabei nicht zu hoch gewählt, um den immobilisierten Katalysator nicht zu beeinträchtigen. Nach 96 h konnte kein Edukt 14 mehr detektiert werden. Die Reaktionslösung wurde vom Katalysator abfiltriert, mit 2 ml Dichlormethan versetzt und für weitere 15 h mit 5 ml ges. NaHCO3-Lösung gerührt, um während der Reaktion entstandene Essigsäure zu neutralisieren. Nach Phasentrennung wurde dreimal mit je 5 ml Dichlormethan
- 216. 202 EXPERIMENTELLER TEIL nachextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.080 g (0.25 mmol, 99 %) gelbliches Öl erhalten. OH 10 5 6 1 9 11 O 17 16 O 3 7 15 4 2 14 N 12 O 8 13 rac-24: MW = 321.4 g⋅mol-1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.16 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.03 (s, 1 H, 1 10-H), 6.91 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 4.78 (m, 1 H, 4- H), 3.71 (s, 3 H, 15-H), 2.33 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.20 – 1.55 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 169.4 ppm [u] (C-16), 158.3 [u] (C-11), 149.3 [u] (C-9), 127.9 [d] (C-13), 116.0 [d] (C-14), 110.5 [d] (C-12), 109.7 [d] (C-10), 74.6 [u] (C-1), 72.2 [d] (C-4), 59.9 [u] (C-7), 54.0 [d] (C-15), 46.7 [d] (C-8), 41.9 [d] (C-2), 38.0 [u] (C-6), 31.9 [u] (C-3), 26.5 [u] (C-5), 20.4 [d] (C-17). MS (EI, 70 eV) m/z (%): 322 (3), 321 (M+, 11), 135 (3), 118 (3), 86 (57), 84 (91), 58 (100), 49 (16), 47 (16). IR (kapillar): ∼ = 2951 (s), 2862 (w), 2831 (m), 2781 (w), 1730 (s), 1602 (s), 1584 ν (s), 1483 (s), 1463 (s), 1431 (m), 1366 (m), 1317 (w), 1286 (s), 1252 (s), 1171 (m), 1094 (w), 1034 (s), 998 (m), 962 (w), 913 (m), 786 (m), 733 (s), 704 (m) cm-1.
- 217. DARSTELLUNG DER SUBSTRATEZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 203 3.3.4.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylamino- methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-45) Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g (0.25 mmol) rac-14, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert- butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.036 g (0.39 mmol) Propionsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.33; Rf (rac-14) = 0.14) wurden 0.055 g (0.16 mmol, 66 %) eines klaren, schwach gelblichen sirupösen Öls erhalten. OH 10 5 6 1 9 11 17 O 16 O 3 7 15 4 2 14 18 N 12 O 8 13 rac-45: MW = 335.4 g⋅mol-1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.17 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.05 (s, 1 H, 1 10-H), 6.93 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 4.77 (m, 1 H, 4- H), 3.72 (s, 3 H, 15-H), 2.50 – 1.55 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 7-H´, 8-H, 17- H), 1.07 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 18-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 174.2 ppm [u] (C-16), 159.7 [u] (C-11), 150.7 [u] (C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.8 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 76.0 [u] (C-1), 73.4 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.4 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.3 [d] (C-2), 39.4 [u] (C-6), 33.2 [u] (C-3), 28.2 [u] (C-17), 27.8 [u] (C-5), 9.5 [d] (C-18). MS (EI, 70 eV) m/z (%): 335 (M+, 10), 135 (3), 86 (37), 84 (57), 58 (100), 49 (7). IR (kapillar): ∼ = 2947 (s), 2861 (w), 2831 (m), 2782 (w), 1728 (s), 1602 (s), 1584 ν (s), 1483 (s), 1728 (s), 1602 (s), 1584 (s), 1483 (s), 1463 (s), 1430 (s), 1352 (w), 1287 (m), 1255 (m), 1193 (s), 1084 (s), 1047 (s), 1020 (s), 997 (m), 962 (w), 911 (w), 785 (m), 734 (s), 704 (m) cm-1.
- 218. 204 EXPERIMENTELLER TEIL 3.3.5 Versuche zur Darstellung von (±)-(1RS,5RS,8RS)-8- Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-2,4-dioxa-bicyclo-[3.3.1]- nonan-3-on (rac-48) 3.3.5.1 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit Bis- (trichlormethyl)-carbonat222,246 1.150 g (3.6 mmol) rac-13⋅HCl und 2.888 g (36.5 mmol) Pyridin wurden in 20 ml abs. Dichlormethan gelöst und auf −76 ºC gekühlt. Zu der klaren Lösung wurde über einen Zeitraum von 10 Min. bei −76 ºC eine Lösung von 0.520 g (1.75 mmol) Bis- (trichlormethyl)-carbonatf (Triphosgen) in 8 ml abs. Dichlormethan mittels Spritzen- technik gegeben. Anschließend wurde noch 1.5 Stunden bei −76 ºC gerührt, dabei verfärbte sich die Lösung schwach gelb und es bildete sich ein weißer Feststoff. Nachdem die Lösung über einen Zeitraum von 1 Stunde auf Raumtemperatur erwärmt wurde, wurde ein Überschuß an ges. NaHCO3-Lösung zugegeben und für weitere 10 Stunden gerührt. Nach Phasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4 getrocknet, und das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt. Es konnten 1.284 g einer Rohmischung erhalten werden, welche noch Pyridin enthielt. Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rohmischung: Rf (Pyridin) = 0.68, Rf (1) = 0.34, Rf (2) = 0.28, Rf (rac-13) = 0.10) konnte allerdings nur eine Mischung von nicht näher charakterisierten Zersetzungsprodukten und 0.334 g rac-13 erhalten werden. Ein analoger Versuch mit rac-13 als Edukt führte zum gleichen Ergebnis. f S. B. Damle, Safe handling of diphosgene and triphosgene, Chem. & Eng. News 1993, 71, 4.
- 219. DARSTELLUNG DER SUBSTRATEZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 205 3.3.5.2 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit 1,1´-Carbonyldiimidazol223,247 500 mg (1.8 mmol) rac-13 wurden in 15 ml abs. Toluol gelöst und mit 1.162 g (7.2 mmol) 1,1´-Carbonyldiimidazol versetzt. Die Reaktionslösung wurde anschließend für 5 Stunden unter Rückfluß erhitzt und danach für weitere 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Reaktionslösung mit einem Überschuß ges. NaHCO3-Lösung für weitere 10 Stunden kräftig gerührt. Nach Phasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt. Nach Säulenchromatographie (EE : MeOH = 2 : 1 über Kieselgel) konnten drei nicht näher charakterisierte Fraktionen (66 mg (Rf = 0.75); 15 mg (Rf = 0.75 und Rf = 0.47); 0.47 mg (Rf = 0.47)) erhalten werden und 138 mg einer Hauptfraktion (Rf = 0.30). Die spektroskopischen Daten dieser Fraktion lassen folgende Struktur vermuten: O 17 N N 16 O 1 10 5 6 9 11 19 18 O 4 3 15 2 12 14 13 49: MW = 298.3 g⋅mol-1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 8.05 ppm (s, 1 H, 17-H), 7.33 (t, J = 2 Hz, 1 H, 1 Ar/Im), 7.15 (t, J = 8 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.97 (t, J = 1 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.87 (dd, J = 8 Hz, J = 1 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.82 (t, J = 2 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.71 (dd, J = 8 Hz J = 3 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.08 (m, 1 H, 2-H), 5.32 (m, 1 H, 5-H), 3.71 (s, 3 H, 15-H), 2.82 (dm, J = 17 Hz, 1 H, Cy), 2.58 (dm, J = 17 Hz, 1 H, Cy), 2.33 (m, 2 H, Cy), 1.96 (m, 2 H, Cy). (Ar: Proton am Arylring, Im: Proton am Imidazolring, Cy: Proton am Cyclohexylring)
- 220. 206 EXPERIMENTELLER TEIL C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.8 ppm [u] (C-11), 148.4 [u] (C-9), 142.5 [u] 13 (C-1), 137.3 [n. b.] (C-2), 133.1 [u] (C-16), 130.8 [d] (C-17), 129.6 [d] (C-13), 124.1 [d] (C-17/19), 117.8 [d] (C-14), 117.3 [d] (C-17/19), 112.7 [d] (C-12), 111.3 [d] (C-10), 75.2 [d] (C-5), 55.5 [d] (C-15), 33.0 [u] (C-6), 26.9 [u] (C-4), 23.5 [u] (C-3). Vor Säulenchromatographie: MS (EI, 70 eV) m/z (%): 305 (M+[rac-48], 22), 298 (M+[rac-49], 20), 186 (83), 121 (17), 58 (100). Ein analoger Versuch mit rac-13⋅HCl als Edukt führte zum gleichen Ergebnis, hier konnte allerdings neben rac-49 auch rac-13 in geringen Mengen isoliert werden.
- 221. ÜBERPRÜFUNG DER HYDROLYSESTABILITÄTDER ESTERSUBSTRATE 207 3.4 Überprüfung der Hydrolysestabilität der Estersubstrate 3.4.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Überprüfung der Hydrolysestabilität der racemischen Substrat Ester (AAV 5) Der racemische Ester (ca. 0.1 bis 0.2 mmol) wurde in 1 ml (10 Vol%) des organischen Cosolvens gelöst und unter kräftigem Rühren langsam zu 9 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M) gegeben. Die Mischung wurde anschließend auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Danach wurde die Reaktionslösung für mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur ohne Enzym gerührt. Im Anschluß wurde die Reaktionslösung mit Dichlormethan extrahiert, getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und dünnschicht- und gaschromatographisch untersucht. 3.4.2 Hydrolysestabilität des Esters rac-15 Die Stabilität des Esters rac-15 gegen Autohydrolyse wurde bereits in eigenen Vorarbeiten untersucht80. 3.4.3 Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und rac-25 Die Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und rac-25 wurde in unabhängigen Versuchen nach AAV 5 überprüft. Dazu wurde die in Tabelle 3.1 angegebene Menge Substrat in 1 ml tert-Butanol und 9 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und über die in Tabelle 3.1 angegebene Zeit bei Raumtemperatur gerührt. Nach Aufarbeitung konnte nur der jeweilige Ester nach GC-Analytik nachgewiesen werden.
- 222. 208 EXPERIMENTELLER TEIL Tabelle 3.2: Überprüfung der Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und rac-25 Substrat Substratmenge Reaktionszeit Hydrolyseprodukt (GC) rac-17 50 mg 24 h nein rac-18 50 mg 46 h nein rac-19 50 mg 65 h nein rac-22 50 mg 46 h nein rac-21 50 mg 24 h nein rac-25 50 mg 95 h nein 3.4.4 Hydrolysestabilität des Esters rac-23 Die Hydrolysestabilität des Esters rac-23 wurde nach AAV 5 überprüft. Dazu wurden 50 mg (0.16 mmol) rac-23 in 1.48 ml Aceton (16 %Vol) und 7.78 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und für vier Tage bei Raumtemperatur gerührt. Nach Aufarbeitung konnte keine Hydrolyse durch GC-Analytik nachgewiesen werden. 3.4.5 Hydrolysestabilität des Esters rac-16 Die Hydrolysestabilität des Esters rac-16 wurde nach AAV 5 überprüft. Dazu wurden in zwei verschiedenen parallelen Ansätzen jeweils 50 mg (0.17 mmol) rac-16 in 1 ml tert-Butanol und 9 ml wäßriger Phosphatpufferlösung bei dem in Tabelle 3.3 angegeben pH-Wert gelöst und über die in Tabelle 3.3 angegebene Zeit bei Raumtemperatur gerührt.
- 223. ÜBERPRÜFUNG DER HYDROLYSESTABILITÄTDER ESTERSUBSTRATE 209 Tabelle 3.3: Überprüfung der Hydrolysestabilität des Esters rac-16 bei verschiedenen pH-Werten pH-Wert Reaktionszeit Hydrolyseprodukt (GC) 7.0 2h 0.1 % rac-8 8.0 2h 1.2 % rac-8 8.0 16 h 15.0 % rac-8 3.4.6 Hydrolysestabilität des Esters rac-24 Die Hydrolysestabilität des Esters rac-24 wurde nach AAV 5 überprüft. Dazu wurden 50 mg (0.16 mmol) rac-24 (enthält Diessigsäurester von rac-24) in 1.48 ml Aceton (16 %Vol) und 7.78 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und für vier Tage bei Raumtemperatur gerührt. Nach Aufarbeitung konnten 40 mg einer Mischung aus drei Komponenten erhalten werden: rac-14, rac-24 und Diessigsäurester von rac-24. Nach GC-Analytik wies die Mischung 2 % rac-14 auf.
- 224. 210 EXPERIMENTELLER TEIL 3.5 Bestimmung von Umsätzen und Enantiomerenverhältnissen Die Umsätze der enzymkatalysierten Reaktionen wurden gaschromatographisch (GC) oder flüssigchromatographisch an chiraler stationärer Phase (HPLC) ermittelt. Die ermittelten Umsätze werden auf ganze Zahlen gerundet angegeben. Die Retentionszeiten der Verbindungen sind in Tabelle 3.4 und Tabelle 3.6 aufgeführt. Tabelle 3.4: Trennbedingungen zur gaschromatographischen Analyse der Reaktionsmischung zur Umsatzbestimmung an achiraler Phase Temperatur- Retentionszeiten Reaktionsmischung programm (Min.) rac-8, rac-15 S1 (CP9000) tR (8) = 10.7 tR (15) = 11.8 rac-8, rac-16 S1 (CP9000) tR (8) = 10.7 tR (16) = 10.9 rac-11, rac-17 S1 (CP9000) tR (11) = 9.4 tR (17) = 10.6 rac-12, rac-18 S1 (CP9000) tR (12) = 11.4 tR (18) = 12.8 rac-12, rac-18 S1 (Varian 3800) tR (12) = 12.4 tR (18) = 14.6 rac-12, rac-47 S1 (Varian 3800) tR (12) = 12.4 tR (47) = 13.1 rac-12, rac-46 S1 (Varian 3800) tR (12) = 12.4 tR (46) = 13.8 rac-13, rac-19 S1 (Varian 3800) tR (13) = 12.3 tR (19) = 13.6 rac-20, rac-21 S1 (Varian 3800) tR (20) = 12.0 tR (21) = 13.0 rac-14, rac-22 S1 (Varian 3800) tR (14) = 12.8 tR (22) = 14.5 rac-14, rac-23 S1 (Varian 3800) tR (14) = 12.8 tR (23) = 16.2 rac-14, rac-24 S1 (Varian 3800) tR (14) = 12.4 tR (24) = 13.0 rac-14, rac-45 S1 (Varian 3800) tR (14) = 12.5 tR (45) = 13.8 Die Enantiomerenverhältnisse wurden entweder gaschromatographisch oder flüssigchromatographisch an chiralen stationären Phasen ermittelt. Die ermittelten ee-Werte werden auf ganze Zahlen gerundet angegeben. Die Retentionszeiten der
- 225. BESTIMMUNG VON UMSÄTZENUND ENANTIOMERENVERHÄLTNISSEN 211 einzelnen Enantiomere unter den jeweiligen Trennbedingungen sind in Tabelle 3.5 und Tabelle 3.6 angegeben. Tabelle 3.5: Trennbedingungen zur gaschromatographischen Bestimmung von Enantiomerenverhältnissen Ver- Chirale Retentionszeit Temperatur-Programma) bindung Phase (Min.) 100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.; CP-Chirasil- tR ((+)-8) = 72.9 rac-8 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.) Dex-CB tR ((−)-8) = 73.5 → 200 ºC (10 ºC/Min.) 110 ºC (5 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.; CP-Chirasil- tR ((+)-15) = 59.1 rac-15 5 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.) → Dex-CB tR ((−)-15) = 59.6 200 ºC (10 ºC/Min.) 100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.; CP-Chirasil- tR ((+)-16) = 67.7 rac-16 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.) Dex-CB tR ((−)-16) = 68.1 → 200 ºC (10 ºC/Min.) 140 ºC (2 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; CP-Chirasil- tR ((+)-12) = 21.6 rac-12 2 Min.) → 180 ºC (10 ºC/Min.; 2 Min.) → Dex-CB tR ((−)-12) = 22.1 200 ºC (10 ºC/Min.) 100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.; Lipodex γ- tR ((+)-18) = 192.0 rac-18 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.) 6-Me tR ((−)-18) = 194.0 → 200 ºC (10 ºC/Min.) 100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.; Lipodex γ- tR ((+)-47) = 116.4 rac-47 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.) 6-Me tR ((−)-47) = 117.6 → 200 ºC (10 ºC/Min.) 100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.; Lipodex γ- tR ((+)-46) = 171.6 rac-46 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.) 6-Me tR ((−)-46) = 175.4 → 200 ºC (10 ºC/Min.)
- 226. 212 EXPERIMENTELLER TEIL Fortsetzung Tabelle 3.5: 140 ºC (2 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; CP-Chirasil- tR ((+)-14) = 22.8 rac-14 2 Min.) → 180 ºC (10 ºC/Min.; 2 Min.) → Dex-CB tR ((−)-14) = 23.5 200 ºC (10 ºC/Min.) 100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.; Lipodex γ- tR ((−)-22) = 71.8 rac-22 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.) 6-Me tR ((+)-22) = 76.3 → 200 ºC (10 ºC/Min.) Lipodex γ- 140 ºC (2 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; tR ((−)-24) = 70.3 rac-24 6-Me 2 Min.) → 170 ºC (10 ºC/Min) tR ((+)-24) = 74.5 Lipodex γ- 140 ºC (2 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; tR ((−)-45) = 71.8 rac-45 6-Me 2 Min.) → 170 ºC (10 ºC/Min) tR ((+)-45) = 76.3 a) Trägergas H2 mit 100 kPa Vordruck; Split 1:40. Tabelle 3.6: Trennbedingungen zur Bestimmung von Enantiomerenverhältnissen durch HPLC Analyse an Chiralcel OD-H Phase Flow Retentionszeitena) Verbindung Laufmittel-Verhältnis (mL / Min.) (Min.) n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-8) = 19.1 rac-8 0.75 970 : 30 : 1 tR ((−)-8) = 20.3 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-15) = 9.9 rac-15 0.75 970 : 30 : 1 tR ((−)-15) = 11.0 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-16) = 10.1 rac-16 0.75 970 : 30 : 1 tR ((−)-16) = 12.1 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-11) = 36.2 rac-11 0.75 990 : 10 : 1 tR ((−)-11) = 46.0 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-17) = 13.7 rac-17 0.75 990 : 10 : 1 tR ((−)-17) = 16.5
- 227. BESTIMMUNG VON UMSÄTZENUND ENANTIOMERENVERHÄLTNISSEN 213 Fortsetzung Tabelle 3.6: n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-12) = 21.0 rac-12 0.75 970 : 30 : 1 tR ((−)-12) = 29.5 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-18) = 11.8 rac-18 0.75 970 : 30 : 1 tR ((−)-18) = 17.7 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-13) = 20.7 rac-13 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-13) = 24.0 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-19) = 16.1 rac-19 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-19) = 22.9 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-20) = 26.5 rac-20 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-20) = 29.3 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-21) = 13.9 rac-21 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-21) = 15.2 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-14) = 26.8 rac-14 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-14) = 39.9 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-22) = 13.5 rac-22 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-22) = 19.4 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-23) = 13.2 rac-23 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-23) = 18.3 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-24) = 21.1 rac-24 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-24) = 26.3 n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-45) = 16.3 rac-45 0.75 950 : 50 : 1 tR ((−)-45) = 20.0 a) Die Detektion erfolgte bei λ = 273 und 254 nm.
- 228. 214 EXPERIMENTELLER TEIL 3.6 Enzym-katalysierte Racematspaltungen im wäßrigen und organischen Medium 3.6.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 3.6.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrigen Einphasen System (AAV 6) Der racemische Ester (0.5 bis 2 mmol) wurde in 4 ml (10 Vol%) des organischen Cosolvens gelöst und unter kräftigem Rühren langsam zu 36 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M) gegeben. Dabei entstand häufig zuerst eine Trübung durch Emulsionsbildung, die aber rasch verschwand und eine klare Lösung hinterließ. Aufgrund der Basizität der Substrate wurde die Mischung anschließend auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Danach wurde die Reaktionslösung für 24 Stunden ohne Enzym gerührt. Nachdem durch DC- und GC-Reaktionskontrolle überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte, wurde das Enzym zugegeben. Danach wurde der Ansatz bei Raumtemperatur über den gesamten Reaktionszeitraum kräftig gerührt. Der pH-Wert der Reaktionslösung wurde durch einen pH-STAT Autotitrator mit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten. Der Verbrauch an NaOH-Lösung wurde über die gesamte Reaktionsdauer verfolgt. Zur GC-Reaktionskontrolle wurden 0.5 ml-Proben entnommen. Die Proben wurden mit ca. 0.5 ml dest. Wasser verdünnt und zweimal mit ca. 1.5 ml Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde abgetrennt und zum Trocknen durch eine mit Na2SO4 gefüllte Pasteurpipette gegeben. Zum Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung in einem Perforator mit Dichlormethan für ein bis zwei Tage kontinuierlich extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden anschließend mit Na2SO4 getrocknet, im Rotationsverdampfer eingeengt und unter vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit. 3.6.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrig- organischen Zweiphasen System (AAV 7) Der racemische Ester (0.5 bis 1 mmol) wurde in 5 ml MTBE gelöst und unter kräftigem Rühren langsam zu einer Emulsion aus 20 ml wäßriger Phosphatpuffer- Lösung (0.1 M) und 15 ml MTBE gegeben. Es entstand in allen Fällen eine klare
- 229. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 215 Emulsion, die anschließend aufgrund der Basizität der Substrate auf den gewünschten pH-Wert eingestellt wurde. Danach wurde die Reaktionslösung für 24 Stunden ohne Enzym gerührt. Nachdem durch DC- und GC-Reaktionskontrolle überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte, wurde das Enzym zugegeben. Danach wurde der Ansatz bei Raumtemperatur über den gesamten Reaktionszeitraum heftig gerührt, so daß eine feine Emulsion entstand. Der pH-Wert der Reaktionslösung wurde durch einen pH-STAT Autotitrator mit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten. Der Verbrauch an NaOH-Lösung wurde über die gesamte Reaktionsdauer verfolgt. Zur GC-Reaktionskontrolle wurden 0.5 ml-Proben entnommen. Die Proben wurden mit ca. 0.5 ml dest. Wasser verdünnt und dreimal mit ca. 1.5 ml Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde abgetrennt und zum Trocknen durch eine mit Na2SO4 gefüllte Pasteurpipette gegeben. Zum Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung in einem Perforator mit Dichlormethan für 48 Stunden kontinuierlich extrahiert. Anschließend wurde die organische Phase mit Na2SO4 getrocknet, im Rotationsverdampfer eingeengt und unter vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit. 3.6.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Transacylierung in organischen Lösungsmitteln (AAV 8) Das racemische Substrat (0.25 mmol) und das Acylierungsmittel wurden in 5 ml des organischen Lösungsmittels gelöst. Die Reaktionslösung wurde für 24 Stunden ohne Enzym bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem durch DC- und GC- Reaktionskontrolle überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte, wurde das Enzym zugegeben und die Mischung für einige Minuten kräftig gerührt, um das Enzym möglichst fein zu verteilen. Danach wurde der Ansatz über den restlichen Reaktionszeitraum langsam gerührt. Zur GC- Reaktionskontrolle wurden 500 µl-Proben entnommen und zur Abtrennung von Proteinen und eventuell vorhandenem MPEG mit 1.5 ml Dichlormethan über eine mit Na2SO4 und Celite gefüllte Pasteurpipette filtriert.
- 230. 216 EXPERIMENTELLER TEIL 3.6.2 Berechnung des E-Werts Folgende Formeln wurden zur Berechnung der E-Werte benutzt6,106,108: ln [1 − c(1+ eeP )] Formel 3.2: E= , für c < 50 % ln [1− c(1− ee P )] ln [(1− c)(1− ee S )] Formel 3.3: E= , für c > 50 % ln [(1− c)(1+ ee S )] ee S Formel 3.4: Umsatz ber = ee S + ee P 1− ee S ee P (1− ee S ) ln ln (ee + ee ) 1 + (eeS /ee P ) S E= = P Formel 3.5: 1 + ee S ee P (1+ ee S ) ln ln 1 + (eeS /ee P ) ee P + ee S ) (mit: c = Umsatz, ee P = ee-Wert des Produkts, ee S = ee-Wert des Substrats) Alle E-Werte in dieser Arbeit wurden aus dem ee-Wert des Substrats und dem ee-Wert des Produkts berechnet. Dazu wurde Formel 3.5, die sich aus Formel 3.4 eingesetzt in Formel 3.2 oder Formel 3.3 ergibt, verwendet.6 Von einer Berechnung des E-Werts aus dem gemessenen Umsatz und nur einem ee-Wert wurde abgesehen.
- 231. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 217 3.6.3 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2- dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15) 3.6.3.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem unter Zusatz von Aceton als Cosolvens Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden 0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 8 ml Aceton und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 100 µl (1.0 mg) PLE/(NH4)2SO4- Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die Reaktion wurde nach 5 Minuten durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.248 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8 erhalten werden. Tabelle 3.7: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 unter Zusatz von Aceton als Cosolvens Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 5 Min 52 % 27 % 46 % 4 3.6.3.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden 1.135 g (3.6 mmol) des Esters rac-15 in 8 ml tert-Butanol und 72 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 400 µl (4.0 mg) PLE/(NH4)2SO4- Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die Reaktion wurde nach 2 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 52 % durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf ((+)-15) = 0.31; Rf ((−)-8) = 0.10) konnten 0.532 g (1.67 mmol, 47 %) (+)-15 und 0.428 g (1.72 mmol, 49 %) (−)-8 isoliert werden.
- 232. 218 EXPERIMENTELLER TEIL Tabelle 3.8: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute E zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Phenol (−)-8 2h 62 % 47 % 47 % 49 % 13 3.6.3.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem zur Darstellung von (+)-15 Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden 1.120 g (3.5 mmol) des Esters rac-15 in 8 ml tert-Butanol und 72 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 400 µl (4.0 mg) PLE/(NH4)2SO4- Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die Reaktion wurde nach 3 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 85 % durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach Säulenchromatographie (CHCl3 : i-Propanol = 2 : 1 über Kieselgel, Rf ((−)-8) = 0.22; Rf ((+)-15) = 0.01) konnten 0.560 g (2.25 mmol, 64 %) (−)-8 und 0.113 g (0.35 mmol, 10 %) (+)-15 isoliert werden. (+)-15: [α ] 20 = + 10.74º (c = 0.7, MeOH) D (−)-8: [α ] 20 = − 3.43º (c = 1.5, MeOH) D Tabelle 3.9: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute E zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Phenol (−)-8 3h ≥ 98 % 10 % 27 % 64 % 7
- 233. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 219 3.6.3.4 Versuch zur AChE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden 0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 0.6 mg Acetylcholinesterase (AChE; 970 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 7.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.297 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8 erhalten werden. Tabelle 3.10: Versuch zur AChE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-15 Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 7.5 h 3% n. .b. n. .b. - 3.6.3.5 CAL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 10 mg Candida antarctica Lipase (CAL; 3.2 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 3.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.310 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8 erhalten werden. Tabelle 3.11: CAL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 3.75 h 8% 3% 3% 1.1
- 234. 220 EXPERIMENTELLER TEIL 3.6.3.6 Mucor miehei Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 20 mg Lipase aus Mucor miehei (1.3 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 19.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.245 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8 erhalten werden. Tabelle 3.12: Mucor miehei Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 19.5 h 25 % 11 % 30 % 2.1 3.6.3.7 HLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Horse liver esterase (HLE; 0.74 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 4 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.284 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8 erhalten werden. Tabelle 3.13: HLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 4h 31 % 17 % 51 % 4
- 235. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 221 3.6.3.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 50 mg Cholesterolesterase (CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 24 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.231 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8 erhalten werden. Tabelle 3.14: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 24 h 90 % 72 % 39 % 5 3.6.3.9 PPL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 50 mg Porcine pancreatic Lipase (PPL; 16.8 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 2.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.259 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8 erhalten werden. Tabelle 3.15: PPL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 2.5 h 66 % 19 % 78 % 10
- 236. 222 EXPERIMENTELLER TEIL 3.6.3.10 BCL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 40 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 22 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.318 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8 erhalten werden. Tabelle 3.16: BCL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 22 h 35 % 75 % 67 % 11 3.6.3.11 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem mit roher CRL Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 50 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 3 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.284 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8 erhalten werden.
- 237. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 223 Tabelle 3.17: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E 3h 64 % 98 % 45 % 10 3.6.3.12 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem mit roher CRL Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.0, dazu wurden 0.316 g (1.0 mmol) des Esters rac-15 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 45 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 3.25 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 51 % durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf ((+)-15) = 0.31; Rf ((−)-8) = 0.10) konnten 0.203 g (0.64 mmol, 64 %) (+)-15 und 0.076 g (0.30 mmol, 30 %) (−)-8 isoliert werden. (+)-15: [α ] 20 = + 17.90º (c = 1.3, MeOH) D (−)-8: [α ] 20 = − 11.45º (c = 2.0, MeOH) D Tabelle 3.18: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem mit roher CRL Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute E zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Alkohol (−)-8 3.25 h 75 % 64 % 85 % 30 % 27
- 238. 224 EXPERIMENTELLER TEIL 3.6.3.13 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem mit aufgereinigter CRL Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.0, dazu wurden 0.319 g (1.0 mmol) des Esters rac-15 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 3 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 5.25 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 33 % durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf ((+)-15) = 0.31; Rf ((−)-8) = 0.10) konnten 0.186 g (0.58 mmol, 58 %) (+)-15 und 0.068 g (0.27 mmol, 27 %) (−)-8 isoliert werden. Tabelle 3.19: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem mit aufgereinigter CRL Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute E zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Alkohol (−)-8 5.25 h 58 % 58 % 90 % 27 % 34 3.6.4 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure- 3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 3.6.4.1 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem mir roher CRL Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.291 g (1 mmol) des Esters rac-16 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 40 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 7.25 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
- 239. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 225 und aufgearbeitet. Es konnten 0.286 g einer Mischung aus Ester (+)-16 und Phenol (−)-8 erhalten werden. Tabelle 3.20: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-16 ee Phenol (−)-8 E 7.25 h 45 % 4% 26 % 2 3.6.4.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem bei pH 7.0 Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.291 g (1 mmol) des Esters rac-16 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 100 µl (1.0 mg) PLE/(NH4)2SO4- Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 1.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.179 g einer Mischung aus Ester (+)-16 und Phenol (−)-8 erhalten werden. Tabelle 3.21: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 bei pH 7.0 Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-16 ee Phenol (−)-8 E 1.75 h 36 % 35 % 52 % 4 3.6.4.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem bei pH 8.0 Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden 0.291 g (1 mmol) des Esters rac-16 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 80 µl (0.8 mg) PLE/(NH4)2SO4- Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 45 Minuten durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
- 240. 226 EXPERIMENTELLER TEIL abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.229 g einer Mischung aus Ester (+)-16 und Phenol (−)-8 erhalten werden. Tabelle 3.22: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 bei pH 8.0 Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-16 ee Phenol (−)-8 E 0.75 h 31 % 50 % 74 % 10 3.6.5 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethyl- aminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8) 3.6.5.1 Versuche zur enzymatischen Transacylierung des Phenols rac-8 unter Verwendung verschiedener Lipasen Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in sieben verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.056 g (0.25 mmol) des Phenols rac-8 mit 50 mg (0.50 mmol) Vinylpropionat und der in Tabelle 3.23 aufgeführten Menge Lipase in 5 ml Diethylether versetzt.
- 241. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 227 Tabelle 3.23: Versuche zur Lipasen-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 Enzymmenge Umsatz nach Enzym 14 d (GC) Porcine pancreatic Lipase 100 mg 0% (PPL; 16.8 U/mg) Burkholderia cepacia Lipase 15 mg 0% (BCL, 40 U/mg) Candida rugosa Lipase 60 mg 2% (CRL; 2.4 U/mg) Rhizopus niveus Lipase 50 mg 0% (2.6 U/g) Candida antarctica Lipase 5 mg 0% (CAL; 3.2 U/mg) Rhizopus arrhizus Lipase 50 mg 0% (2 U/g) Aspergillus niger Lipase 5 mg 0% (1 U/mg) 3.6.5.2 Versuch zur PPL-katalysierten Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.062 g (0.25 mmol) des Phenols rac-8 unter den in Tabelle 3.24 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit jeweils 100 mg Porcine pancreatic Lipase (PPL; 16.8 U/mg) umgesetzt. In allen Reaktionen entstand vor Enzymzugabe eine klare Lösung. Die PPL bildete eine Suspension, da das Enzym nicht löslich war. Nach 24 Stunden Reaktionszeit hatten sich alle Reaktionen aufgrund einer Braunfärbung des Enzyms dunkel verfärbt.
- 242. 228 EXPERIMENTELLER TEIL Tabelle 3.24: Versuche zur PPL-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 mit Vinylacetat Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC) 112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat 28 d 2% 5 ml Dichlormethan (H2O ges.) 112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat 28 d 1% 5 ml Trichlormethan (H2O ges.) 5.8 ml (63 mmol) Vinylacetat 12 d 6% 3.6.5.3 BCL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.062 g (0.25 mmol) des Phenols rac-8 unter den in Tabelle 3.25 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit jeweils 15 mg Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 40 U/mg) umgesetzt. In allen Reaktionen entstand eine Suspension, als das unlösliche Enzym zur klaren Reaktionslösung gegeben wurde. Tabelle 3.25: BCL-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-8 mit Vinylacetat Reaktionsbedingungen 28 d E-Wert Umsatz (GC) 3% 112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat ee Ester (−)-16 n. b. - 5 ml Diisopropylether ee Phenol (+)-8 n. b. Umsatz (GC) 18 % 5.8 ml (63 mmol) Vinylacetat ee Ester (−)-16 10 % 1.2 ee Phenol (+)-8 2%
- 243. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 229 3.6.5.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vier verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.062 g (0.25 mmol) des Phenols rac-8 unter den in Tabelle 3.26 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit jeweils 30 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 2.4 U/mg) umgesetzt. In allen Reaktionen entstand eine Suspension, als das unlösliche Enzym zur klaren Reaktionslösung gegeben wurde. Tabelle 3.26: CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat Reaktionsbedingungen 28 d E-Wert Umsatz (GC) 2% 112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat ee Ester (−)-16 n. b. - 5 ml Diisopropylether ee Phenol (+)-8 n. b. Umsatz (GC) 8% 112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat ee Ester (−)-16 n. b. - 5 ml MTBE ee Phenol (+)-8 n. b. Umsatz (GC) 36 % 5.8 ml (63 mmol) Vinylacetat ee Ester (−)-16 38 % 3 ee Phenol (+)-8 21 % Umsatz (GC) 66 % 112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat ee Ester (−)-16 33 % 2.5 5 ml Dichlormethan ee Phenol (+)-8 26 %
- 244. 230 EXPERIMENTELLER TEIL 3.6.5.5 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylbutyrat Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.062 g (0.25 mmol) des Phenols rac-8 unter den in Tabelle 3.27 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit jeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. In beiden Reaktionen entstand eine weiße Suspension, da sowohl das Enzym unlöslich war, als auch Anteile des Substrat sich nicht vollständig lösten. Tabelle 3.27: CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylbutyrat Reaktionsbedingungen 17 d E-Wert 143 mg (1.25 mmol) Umsatz (GC) 4% Vinylbutyrat ee Ester (−)-15 n. b. - 5 ml Dichlormethan ee Phenol (+)-8 n. b. Umsatz (GC) 15 % 5 ml (39 mmol) ee Ester (−)-15 28 % 2 Vinylbutyrat ee Phenol (+)-8 15 % 3.6.5.6 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.063 g (0.25 mmol) des Phenols rac-8 unter den in Tabelle 3.28 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit jeweils 45 mg MPEG/PLE (153 U/mg PLE, 3 % Proteingehalt) umgesetzt.
- 245. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 231 Tabelle 3.28: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC) 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat 21 d 0% 5 ml Dichlormethan 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat 21 d 0% 5 ml Trichlormethan 5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 4d 5% 3.6.6 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3- (3-dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 3.6.6.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden 0.147 g (0.5 mmol) des Esters rac-17 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 40 µl (0.4 mg) PLE/(NH4)2SO4- Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 25 Minuten durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.104 g einer Mischung aus Ester 17 und Phenol 11 erhalten werden. Tabelle 3.29: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 17 ee Phenol 11 E 25 Min. 69 % 7% 1% 1.1
- 246. 232 EXPERIMENTELLER TEIL 3.6.6.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen Einphasensystem mit roher CRL Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.147 g (0.5 mmol) des Esters rac-17 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 40 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 2.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.128 g einer Mischung aus Ester 17 und Phenol 11 erhalten werden. Tabelle 3.30: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 17 ee Phenol 11 E 2.5 h 17 % 1% 3% 1.1 3.6.7 Versuche zur Enzymatischen Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3- (3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) unter Verwendung verschiedener Lipasen Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in fünf verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.056 g (0.25 mmol) des Phenols rac-11 mit 125 mg (0.50 mmol) Vinyllaurat und der in Tabelle 3.31 aufgeführten Menge Lipase in 5 ml Diethylether versetzt.
- 247. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 233 Tabelle 3.31: Versuche zur Lipasen-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-11 Enzymmenge Umsatz nach Enzym 14 d (GC) Burkholderia cepacia Lipase 100 mg 0% (BCL, 40 U/mg) Candida rugosa Lipase 60 mg 0% (CRL; 2.4 U/mg) Candida antarctica Lipase 10 mg 0% (CAL; 3.2 U/mg) Rhizopus arrhizus Lipase 50 mg 0% (2 U/g) Aspergillus niger Lipase 5 mg 0% (1 U/mg) 3.6.8 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4- dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl- ester (rac-18) 3.6.8.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden 0.174 g (0.50 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 50 µl (0.5 mg) PLE/(NH4)2SO4- Suspension (PLE 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die Reaktion wurde nach 5.75 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 40 % durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach Säulenchromatographie (EE : MeOH : TEA = 50 : 50 : 1 an Kieselgel,
- 248. 234 EXPERIMENTELLER TEIL Rf ((−)-18) = 0.32; Rf ((+)-12) = 0.15) konnten 0.082 g (0.23 mmol, 47 %) (−)-18 und 0.042 g (0.15 mmol, 30 %) (+)-12 isoliert werden. (−)-18: [α ] 20 = − 6.01º (c = 1.50, MeOH) D (+)-12: [α ] 20 = + 21.70º (c = 0.80, MeOH) D Tabelle 3.32: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (−)-18 Ester (−)-18 (+)-12 Alkohol (+)-12 5.75 h 86 % 47 % 94 % 30 % 89 3.6.8.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.500 g (1.43 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war zu Beginn stark getrübt, am Ende der Reaktionszeit klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 4.75 Stunden bei Umsatz (GC) von ca. 49 % durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 an Kieselgel, Rf ((+)-18) = 0.36; Rf ((−)-12) = 0.18) konnten 0.216 g (0.62 mmol, 43 %) (+)-18 und 0.162 g (0.58 mmol, 41 %) (−)-12 isoliert werden. (+)-18: [α ] 20 = + 7.03º (c = 0.72, MeOH) D (−)-12: [α ] 20 = − 28.30º (c = 1.00, MeOH) D
- 249. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 235 Tabelle 3.33: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12 4.75 h 93 % 41 % 95 % 41 % 133 3.6.8.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.5, dazu wurden 0.349 g (1.0 mmol) des Esters rac-18 in 26 ml MTBE und 26 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 6 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 72 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 45 % durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1:1 an Kieselgel, Rf ((+)-18) = 0.36; Rf ((−)-12) = 0.18) konnten 0.140 g (0.40 mmol, 40 %) (+)-18 und 0.110 g (0.39 mmol, 39 %) (−)-12 isoliert werden. (+)-18: [α ] 20 = + 7.03º (c = 0.72, MeOH) D (−)-12: [α ] 20 = − 28.30º (c = 1.00, MeOH) D Tabelle 3.34: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12 72 h ≥98 % 40% ≥98 % 39 % >200
- 250. 236 EXPERIMENTELLER TEIL 3.6.8.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem mit extraktiver Aufarbeitung Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.2, dazu wurden 0.500 g (1.43 mmol) des Esters rac-18 in 25 ml MTBE und 25 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.2) gelöst und mit 13 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 25.9 U/mg) versetzt. Nach 48 Stunden bei einem Umsatz von ca. 50 % wurde zum Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung die Reaktionslösung zunächst einmal mit 40 ml MTBE extrahiert und anschließend dreimal mit je 30 ml Diethylether. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.254 g (0.73 mmol, 50.8 %) farbloser, öliger Ester (+)-18 mit einem ee-Wert von ≥98 % isoliert werden. Die verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10 eingestellt. Anschließend wurde viermal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.184 g (0.66 mmol, 46.1 %) Alkohol (−)-12 mit einem ee-Wert von 97 % erhalten. (+)-18: [α ] 20 = + 7.9º (c = 0.69, MeOH) D (−)-12: [α ] 20 = − 28.60º (c = 0.93, MeOH) D Tabelle 3.35: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 wäßrig-organischen Zweiphasensystem mit extraktiver Aufarbeitung Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12 48 h ≥98 % 51 % 97 % 46 % >200
- 251. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 237 3.6.8.5 Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.5, dazu wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 60 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos, das immobilisierte Enzym unlöslich. Die Reaktion wurde nach 45 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.200 g Ester rac-18 erhalten werden. Tabelle 3.36: Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester 18 ee Alkohol 12 E 45 h 0% - - - 3.6.8.6 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.245 g (0.70 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Chirazyme L-2 (CAL-B; 154 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 46 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.240 g einer Mischung aus Ester (+)-18 und Alkohol (−)-12 erhalten werden. Tabelle 3.37: Chirazyme L2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-18 ee Alkohol (−)-12 E 46 h 7% 8% n. b. -
- 252. 238 EXPERIMENTELLER TEIL 3.6.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethyl- aminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 3.6.9.1 Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-12 mit jeweils 5 mg Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 40 U/mg) unter den in Tabelle 3.38 aufgeführten Reaktionsbedingungen umgesetzt. Zu Beginn der Reaktion waren die Reaktionslösungen getrübt, da das Substrat nicht vollständig löslich war. Nach 24 Stunden waren die Reaktionen, die in Toluol durchgeführt wurden, klar. Tabelle 3.38: Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC) 145 mg (1.45 mmol) Isopropenylacetat, 20 d 3% 5 ml Toluol 5 ml (70 mmol) Isopropenylacetat 20 d 3% 3.6.9.2 BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-12 mit jeweils 15 mg Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 40 U/mg) unter den in Tabelle 3.39 aufgeführten Reaktionsbedingungen umgesetzt. Tabelle 3.39: BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat
- 253. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 239 Reaktions- Mittel 8d E-Wert 13 d E-Wert bedingung E-Wert 125 mg (1.25 mmol) Umsatz (GC) 11 % 12 % Vinylpropionat, ee Ester (−)-46 94 % 34 95 % 43 38 5 ml Toluol ee Alkohol (+)-12 8% 12 % Umsatz (GC) 5% n. b. 5 ml (49.95 mmol) ee Ester (−)-46 91 % 22 n. b. - 22 Vinylpropionat ee Alkohol (+)-12 4% n. b. 3.6.9.3 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-12 unter den in Tabelle 3.40 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit jeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. Zu Beginn der Reaktion waren die Reaktionslösungen getrübt, da Substrat und Enzym nicht vollständig löslich waren. Nach 24 Stunden war die Reaktion, die in Toluol durchgeführt wurde, klar.
- 254. 240 EXPERIMENTELLER TEIL Tabelle 3.40: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat 3d 6d 8d 11 d 16 d Reaktionsbedingung (%) (%) (%) (%) (%) 125 mg (1.25 mmol) Umsatz (GC) 0 2 2 3 - Vinylpropionat, ee Ester (−)-46 n. b. n. b. n. b. 90 - 5 ml Diisopropylether ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. n. b. 2 - 125 mg (1.25 mmol) Umsatz (GC) 37 57 58 58 - Vinylpropionat, ee Ester (−)-46 94 91 96 89 - 5 ml Toluol ee Alkohol (+)-12 56 97 98 ≥98 - Umsatz (GC) 23 41 48 53 58 5 ml (49.95 mmol) 88 84 86 82 79 ee Ester (−)-46 Vinylpropionat ee Alkohol (+)-12 25 52 68 85 ≥90 Tabelle 3.41: E-Werte der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat Reaktionsbedingungen 3d 6d 8d 11 d 16 d Mittel 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat, - - - 19 - 19 5 ml Diisopropylether 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat, 56 89 >200 89 - 109 5 ml Toluol 5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 19 19 26 27 25 23
- 255. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 241 3.6.9.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-12 unter den in Tabelle 3.42 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit jeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. Zu Beginn der Reaktion waren die Reaktionslösungen getrübt, da das Substrat nicht vollständig löslich war. Nach 24 Stunden war die Reaktion, die in Toluol durchgeführt wurde, klar. Tabelle 3.42: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat Reaktionsbedingung 2d 5d 14 d 20 d 145 mg (1.45 mmol) Umsatz (GC) 19 % 34 % 47 % 58 % Isopropenylacetat, ee Ester (−)-47 n. b. ≥98 % 94 % 94 % 5 ml Toluol ee Alkohol (+)-12 n. b. 60 % 70 % 88 % Umsatz (GC) 3% 5% 13 % 16 % 5 ml (70 mmol) n. b. 10 % 24 % 24 % ee Ester (−)-47 Isopropenylacetat ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. 4% 6% Tabelle 3.43: E-Werte der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat Reaktionsbedingungen 2d 5d 14 d 20 d Mittel 145 mg (1.45 mmol) n. b. >200 67 94 120 Isopropenylacetat, 5 ml Toluol 5 ml (70 mmol) Isopropenylacetat n. b. n. b. 2 2 2
- 256. 242 EXPERIMENTELLER TEIL 3.6.9.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 a) mit 7 mg MPEG/PLE Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-12 unter den in Tabelle 3.44 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit jeweils 7 mg PLE/MPEG (153 U/mg PLE, 3 % Proteingehalt) in 5 ml Toluol umgesetzt. Tabelle 3.44: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC) 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat 20 d 3% 125 mg (1.25 mmol) Isopropenylacetat 20 d 0% b) mit 45 mg PLE/MPEG Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-12 unter den in Tabelle 3.45 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit jeweils 45 mg PLE/MPEG (153 U/mg PLE, 3 % Proteingehalt) umgesetzt.
- 257. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 243 Tabelle 3.45: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC) 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat 21 d 2% 5 ml Dichlormethan 125 mg (1.25 mmol Vinylpropionat 4d 1% 5 ml MTBE 5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 21 d 3% 3.6.9.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei verschiedenen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-12 und 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat unter den in Tabelle 3.46 aufgeführten Reaktionsbedingungen und mit der dort angegebenen Menge an Colyophilisat aus PLE/BSA/MPEG (148 U/mg PLE, 1.5 % Proteingehalt) umgesetzt. In beiden Reaktionen entstanden klare Lösungen. Die Farbe des PLE/BSA- Katalysators änderte sich im Laufe der Reaktionszeit von weiß in ein dunkles rot- braun. Tabelle 3.46: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC) 55 mg PLE/BSA/MPEG in 5 ml Dichlormethan 11 d 0% 45 mg PLE/BSA/MPEG, 12 µl H2O in 6 ml Toluol 11 d 0%
- 258. 244 EXPERIMENTELLER TEIL 3.6.10 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)- Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexylester (rac-19) 3.6.10.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 unter Verwendung verschiedener Lipasen im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolysen erfolgten gemäß AAV 6 in sieben verschiedenen Ansätzen bei pH 7.0, dazu wurden jeweils 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-19 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit der in Tabelle 3.47 angegebenen Menge der jeweiligen Lipase versetzt. Die Reaktionen wurden nach der in Tabelle 3.47 angegebenen Reaktionszeit durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Die erhaltenen Ausbeuten sind in Tabelle 3.47 angegeben.
- 259. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 245 Tabelle 3.47: Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 unter Verwendung verschiedener Lipasen Enzym- Reaktions- Ausbeute Umsatz Enzym menge zeit Ester 19 (GC) Cholesterolesterase 25 mg 24 h 181 mg 1% (CE; 17.5 U/mg) Candida rugosa Lipase 5 mg 29 h 190 mg 0% (CRL; 37 U/mg) Chirazyme L-2 10 mg 45 h 195 mg 0% (CAL-B; 155 U/mg) Burkholderia cepacia Lipase 20 mg 45 h 200 mg 0% (BCL; 0.09 U/mg) Burkholderia cepacia Lipase 30 mg 46 h 194 mg 0% (BCL, 40 U/mg) Porcine pancreatic Lipase 40 mg 23 h 195 mg 1% (PPL; 16.8 U/mg) Chromobacterium viscosum 2 mg 69 h 200 mg 0% Lipase (CVL, 3.58 U/mg) 3.6.10.2 Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 7 bei pH 7.0, dazu wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-19 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 10 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) versetzt. Die Reaktion wurde nach 69 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.184 g Ester 19 erhalten werden.
- 260. 246 EXPERIMENTELLER TEIL Tabelle 3.48: Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 19 ee Alkohol 13 E 69 h 1% n. b. n. b. - 3.6.10.3 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-19 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 200 µl (2.0 mg) PLE/(NH4)2SO4- Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 41 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.191 g Ester 19 erhalten werden. Tabelle 3.49: Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 19 ee Alkohol 13 E 41 h 0% - - - 3.6.11 Versuche zur Enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 3.6.11.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Verwendung verschiedener Lipasen Die Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vier verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des
- 261. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 247 Alkohols rac-13 mit 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat und der in Tabelle 3.50 aufgeführten Menge Lipase in 5 ml Toluol versetzt. Tabelle 3.50: Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Verwendung verschiedener Lipasen Enzymmenge Umsatz nach Umsatz nach Enzym 3 h (GC) 72 h (GC) Candida rugosa Lipase 5 mg 0% 0% (CRL; 37 U/mg) Porcine pancreatic Lipase 20 mg 0% 0% (PPL; 16.8 U/mg) Cholesterolesterase 10 mg 0% 0% (CE; 17.5 U/mg) Novozym 435 10 mg 0% 1% (immobilisierte CAL-B) 3.6.11.2 Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 Die Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vier verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-13 unter den in Tabelle 3.51 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit jeweils 20 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt.
- 262. 248 EXPERIMENTELLER TEIL Tabelle 3.51: Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 Umsatz nach Umsatz nach Reaktionsbedingungen 66 h (GC) 6 d (GC) 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat, 1% 1% 5 ml Toluol 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat, 0% 0% 5 ml Dichlormethan 125 mg (1.25 mmol) Isopropenylacetat 1% 1% 5 ml Toluol 5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 1% 1% 3.6.11.3 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Zusatz von Triethylamin Die Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-13 mit 5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat und 50 mg (0.36 mmol) Triethylamin sowie der in Tabelle 3.52 aufgeführten Menge Lipase versetzt. Tabelle 3.52: Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Zusatz von Triethylamin Enzym- Umsatz nach Umsatz nach Enzym menge 5 d (GC) 12 d (GC) Novozym 435 30 mg 2% 4% (immobilisierte CAL-B) Chromobacterium viscosum Lipase 1 mg 0% 1% (CVL, 3.58 U/mg) Burkholderia cepacia Lipase 10 mg 0% 0% (BCL, 40 U/mg)
- 263. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 249 3.6.12 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6- dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 3.6.12.1 CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.170 g (0.51 mmol) des Esters rac-21 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung gelöst (pH 7.0) und mit 7.5 mg Cholesterolesterase (CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 16.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.107 g einer Mischung aus Ester (+)-21 und Phenol (−)-20 erhalten werden. Tabelle 3.53: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E 16.75 h 64 % 71 % 11 % 2 3.6.12.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden 0.184 g (0.55 mmol) des Esters rac-21 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 150 µl (1.5 mg) PLE/(NH4)2SO4- Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 16.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.116 g einer Mischung aus Ester (+)-21 und Phenol (−)-20 erhalten werden.
- 264. 250 EXPERIMENTELLER TEIL Tabelle 3.54: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E 3.25 h 82 % 20 % 6% 1.3 3.6.12.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.170 g (0.51 mmol) des Esters rac-21 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 18.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.141 g einer Mischung aus Ester (+)-21 und Phenol (−)-20 erhalten werden. Tabelle 3.55: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im Einphasensystem Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E 18.5 h 40 % 31 % 17 % 2 3.6.12.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 7 bei pH 7.0, dazu wurden 0.162 g (0.48 mmol) des Esters rac-21 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger Phosphatpufferlösung gelöst (pH 7.0) und mit 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) versetzt. Die Reaktion wurde nach 46 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.138 g einer Mischung aus Ester (+)-21 und Phenol (−)-20 erhalten werden.
- 265. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 251 Tabelle 3.56: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im Zweiphasensystem Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E 46 h 57 % 89 % 28 % 5 3.6.13 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3- dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl- ester (rac-22) 3.6.13.1 Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.5, dazu wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 20 mg Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 40 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Da nach 22 Stunden Reaktionszeit noch kein Produkt mit DC-Reaktionskontrolle detektiert werden konnte, wurden die Reaktionstemperatur auf 35 ºC für die restliche Reaktionszeit erhöht. Nach insgesamt 48 Stunden Reaktionszeit wurde durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.187 g Ester rac-22 erhalten werden. Tabelle 3.57: Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 48 h 0% - - -
- 266. 252 EXPERIMENTELLER TEIL 3.6.13.2 Novozym 435-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 20 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos; das immobilisierte Enzym unlöslich. Da nach 19 Stunden Reaktionszeit noch kein Produkt mit DC-Reaktionskontrolle detektiert werden konnte, wurden weitere 40 mg Novozym 435 zur Reaktionslösung gegeben. Nach insgesamt 10 Tagen Reaktionszeit wurde durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.200 g Ester rac-22 erhalten werden. Tabelle 3.58: Novozym 435-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 10 d 35 % 67 % 85 % 24 3.6.13.3 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Chirazyme L-2 (CAL- B; 154 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 45 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.181 g einer Mischung aus Ester (+)-22 und Alkohol (−)-14 erhalten werden.
- 267. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 253 Tabelle 3.59: Chirazyme L2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 45 h 7% 9% ≥98 % >200 3.6.13.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 7 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 25.9 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 24 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.180 g einer Mischung aus Ester (+)-22 und Alkohol (−)-14 erhalten werden. Tabelle 3.60: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 24 h 27 % 38 % 92 % 34 3.6.13.5 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 7 bei pH 7.5, dazu wurden 0.350 g (1.0 mmol) des Esters rac-22 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 7 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 25.9 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 5 Tagen durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
- 268. 254 EXPERIMENTELLER TEIL und aufgearbeitet. Es konnten 0.226 g einer Mischung aus Ester (+)-22 und Alkohol (−)-14 erhalten werden. Tabelle 3.61: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 5d 34 % 37 % 69 % 8 3.6.13.6 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß in zwei Reaktionen nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden jeweils 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert- Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit jeweils 20 mg Cholesterolesterase (CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktionen wurden nach 2.5 Stunden und 18.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.189 g und 0.185 g einer Mischung aus Ester (+)-22 und Alkohol (−)-14 erhalten werden. Tabelle 3.62: CE-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-22 Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 2.5 h 21 % 30 % ≥98 % >200 19.5 h 38 % 67 % 93 % 55
- 269. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 255 3.6.13.7 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem mit extraktiver Aufarbeitung Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Cholesterolesterase (CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Zum Abbruch der Reaktion nach 22.5 Stunden und zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung dreimal mit je 40 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.105 g (0.30 mmol, 53 %) (+)-22 mit einem ee-Wert von 91 % isoliert werden. Die verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10 eingestellt. Anschließend wurde dreimal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.071 g (0.25 mmol, 45 %) (−)-14 mit einem ee-Wert von 91 % erhalten. (+)-22: [α ] 20 = + 14.14º (c = 1.02, MeOH) D (−)-14: [α ] 20 = − 34.75º (c = 1.05, MeOH) D Tabelle 3.63: CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 mit extraktiver Aufarbeitung Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (+)-22 Ester (+)-22 (−)-14 Alkohol (−)-14 22.5 h 91 % 53 % 91 % 45 % 67
- 270. 256 EXPERIMENTELLER TEIL 3.6.13.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.221 g (0.57 mmol) des Esters rac-22⋅HCl in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung gelöst (pH 7.0) und mit 20 mg Cholesterolesterase (CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 19.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.166 g einer Mischung aus Ester (+)-22 und Alkohol (−)-14 erhalten werden. Tabelle 3.64: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E 19.5 h 43 % 86 % 94 % 89 3.6.13.9 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 75 µl (0.8 mg) PLE/(NH4)2SO4- Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 16.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.179 g einer Mischung aus Ester (−)-22 und Alkohol (+)-14 erhalten werden. Tabelle 3.65: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (−)-22 ee Alkohol (+)-14 E 16.5 h 18 % 22 % 93 % 34
- 271. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 257 3.6.13.10 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem unter Zusatz von Aceton als Cosolvens Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 6.4 ml (16 Vol%) Aceton und 33.6 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 1.9 mg Chirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg). Die Reaktionslösung war klar und farblos. Zum Abbruch der Reaktion nach 42 Stunden, bei einem Umsatz von ca. 22 %, und zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung zunächst zweimal mit je 30-40 ml MTBE und anschließend mit dreimal mit je 40 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.147 g (0.42 mmol, 74 %) (−)-22 mit einem ee-Wert von 27 % isoliert werden. Die verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10 eingestellt. Anschließend wurde fünfmal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.037 g (0.13 mmol, 23 %) (+)-14 mit einem ee-Wert von 97 % erhalten. Tabelle 3.66: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 unter Zusatz von Aceton als Cosolvens Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14 42 h 27 % 74 % 97 % 23 % 85
- 272. 258 EXPERIMENTELLER TEIL 3.6.13.11 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22 (rac-22⋅HCl) im wäßrigen Einphasensystem Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22 (rac-22⋅HCl) unter Zusatz von Aceton als Cosolvens 1.00 g (2.59 mmol) rac-22⋅HCl wurden zu einer Mischung aus 2 ml (16 Vol%) Aceton und 10.8 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M, pH 7.0) gegeben. Die Lösung wurde anschließend auf pH 7.0 eingestellt. Nachdem durch GC-Reaktionskontrolle überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte, wurden 9 mg Chirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg) zugegeben. Danach wurde der Ansatz bei Raumtemperatur über den gesamten Reaktionszeitraum kräftig gerührt. Der pH-Wert der Reaktionslösung wurde durch einen pH-STAT Autotitrator mit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten. Der Verbrauch an NaOH-Lösung wurde über die gesamte Reaktionsdauer verfolgt. Zur HPLC-Reaktionskontrolle wurden analog zur AAV 6 zehn 100 µl Proben entnommen. Nach 24 Stunden wurde zum Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung die Reaktionslösung zunächst viermal mit je 30-40 ml MTBE extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.591 g (1.69 mmol, 65 %) farbloser, öliger Ester (−)-22 mit einem ee-Wert von 28 % isoliert werden. Die verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10 eingestellt. Anschließend wurde fünfmal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.165 g einer Mischung aus 82 % (0.46 mmol, 18 %) Alkohol (+)-14 mit einem ee-Wert von 91 % und 18 % (0.10 mmol, 4 %) Ester (−)-22 (mit einem ee-Wert von 28 %) erhalten. (−)-22: [α ] 20 = − 4.62º (c = 0.96, MeOH) D (+)-14: [α ] 20 = + 26.40º (c = 0.32, MeOH) D
- 273. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 259 Tabelle 3.67: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl unter Zusatz von Aceton als Cosolvens Reaktions- Umsatz (HPLC) ee Ester (−)-22 ee Alkohol (+)-14 E zeit (%) (%) (%) 1h 2 2 ≥98 - 1.5 h 3 3 ≥98 - 3h 4 5 ≥98 - 4.25 h 7 7 ≥98 - 5.25 h 8 9 ≥98 - 7.25 h 10 11 ≥98 - 22.5 h 20 26 95 50 Tabelle 3.68: Ergebnis nach Aufarbeitung der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14 24 h 28 % 65 % 91 % 18 % 27 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22⋅HCl mit und ohne Zusatz von Aceton als Cosolvens In zwei parallelen Versuchen wurde 1.00 g (2.59 mmol) rac-22⋅HCl einmal zu einer Mischung aus 2 ml Aceton (16 Vol%) und 10.8 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M, pH 7.25) und ein zweitesmal zu 12.8 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M) gegeben. Die Lösungen wurden anschließend auf pH 7.25 eingestellt. Nachdem durch GC-Reaktionskontrolle überprüft worden war, daß keine nicht- enzymatische Reaktion stattgefunden hatte, wurde zu beiden Versuchen jeweils 9 mg Chirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg) zugegeben. Danach wurden die Ansätze über den gesamten Reaktionszeitraum kräftig gerührt. Aufgrund eines technischen Defekts fiel die Temperatur nach 8 Stunden für die restliche
- 274. 260 EXPERIMENTELLER TEIL Reaktionszeit drastisch ab. Zur HPLC-Reaktionskontrolle wurden analog zur AAV 6 100 µl Proben entnommen. Tabelle 3.69: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse von rac-22⋅HCl mit und ohne Zusatz von Aceton als Cosolvens mit Zusatz von Aceton ohne Zusatz von Aceton Umsatz ee Ester ee Alkohol Umsatz ee Ester ee Alkohol Zeit (HPLC) (−)-22 (+)-14 (HPLC) (−)-22 (+)-14 (h) (%) (%) (%) (%) (%) (%) 2.5 6 n. b. ≥98 8 n. b. ≥98 5 7 9 ≥98 18 21 ≥98 7.5 8 13 ≥98 21 31 98 22 16 20 ≥98 36 47 98 27 13 22 ≥98 38 59 90 30 17 23 ≥98 38 61 89 48 15 27 ≥98 36 65 88 103 17 30 ≥98 43 74 85 175 21 29 ≥98 42 75 85
- 275. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 261 Tabelle 3.70: E-Werte der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse von rac-22⋅HCl mit und ohne Zusatz von Aceton als Cosolvens Reaktionszeit mit Zusatz von Aceton ohne Zusatz von Aceton (h) E-Wert E-Wert 2.5 >200 >200 5 >200 >200 7.5 >200 134 22 >200 157 27 >200 34 30 >200 31 48 >200 30 103 >200 27 175 >200 27 3.6.14 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3- dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl- ester (rac-23) 3.6.14.1 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-23 im wäßrigen Einphasensystem mit Aufarbeitung durch kontinuierliche Extraktion Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.432 g (1.14 mmol) des Esters rac-23 in 6.4 ml (16 Vol%) Aceton und 33.6 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 3.8 mg Chirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg). Die Reaktionslösung war während der ersten Stunden der Reaktion stark getrübt, in Laufe der Reaktion verschwand diese Trübung. Nach 24 Stunden wurde zum Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung die Reaktionslösung zunächst dreimal mit je 30-40 ml MTBE und dann dreimal mit je 25 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.234 g
- 276. 262 EXPERIMENTELLER TEIL (0.62 mmol, 54 %) durch Spuren von Hexansäure penetrant ziegenähnlich riechender Ester (−)-23 mit einem ee-Wert von 92 % isoliert werden. Die verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10 eingestellt. Anschließend wurde fünfmal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.146 g (0.52 mmol, 46 %) (+)-14 als Öl mit einem ee- Wert von 77 % erhalten. (−)-23: [α ] 20 = − 6.70º (c = 1.93, MeOH) D (+)-14: [α ] 20 = + 25.83º (c = 0.9, MeOH) D Tabelle 3.71: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-23 unter Zusatz von Aceton als Cosolvens Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute E zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14 24 h 92 % 54 % 77 % 46 % 24 3.6.15 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2- Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) 3.6.15.1 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 Die Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vier verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.72 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit jeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. In allen Reaktionen entstand eine klare Lösung in der das unlösliche Enzym suspendiert war.
- 277. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 263 Tabelle 3.72: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 Reaktionsbedingungen 16 d E-Wert 108 mg (1.5 mmol) Umsatz (GC) 18 % Vinylacetat ee Ester (−)-24 44 % 5 5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 72 % Umsatz (GC) 11 % 5 ml (54 mmol) ee Ester (−)-24 47 % 4 Vinylacetat ee Alkohol (+)-14 48 % 125 mg (1.5 mmol) Umsatz (GC) 25 % Isopropenylacetat ee Ester (−)-24 68 % 14 5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 87 % Umsatz (GC) 12 % 5 ml (70 mmol) ee Ester (−)-24 77 % 10 Isopropenylacetat ee Alkohol (+)-14 35 % 3.6.15.2 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.73 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit jeweils 10 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt. Zu Beginn der Reaktion waren alle Reaktionslösungen klar und farblos. Nach 24 Stunden zeigten alle Reaktionen eine milchige Trübung.
- 278. 264 EXPERIMENTELLER TEIL Tabelle 3.73: Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat Reaktionsbedingungen 48 h E-Wert 129 mg (1.5 mmol) Umsatz (HPLC) 70 % Vinylacetat, ee Ester (−)-24 90 % 38 5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 67 % 125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 79 % Vinylacetat, ee Ester (−)-24 90 % 99 5 ml Dichlormethan ee Alkohol (+)-14 ≥98 % 3.6.15.3 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat a) mit 10 mg Novozym 435 Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.74 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit jeweils 10 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt. Zu Beginn der Reaktion waren alle Reaktionslösungen klar und farblos. Nach 24 Stunden zeigten alle Reaktionen eine milchige Trübung. In der Reaktion mit H2O-Zusatz war zusätzlich noch ein weißer Niederschlag zu erkennen.
- 279. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 265 Tabelle 3.74: Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat, katalysiert durch 10 mg Novozym 435 Reaktionsbedingungen 24 h E-Wert 125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 51 % Vinylpropionat, ee Ester (−)-45 92 % 89 5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 95 % 125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 35 % Vinylpropionat, ee Ester (−)-45 89 % 30 10 µl H2O, 5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 56 % 125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 50 % Vinylpropionat, ee Ester (−)-45 98 % >200 5 ml Dichlormethan ee Alkohol (+)-14 86 % Umsatz (HPLC) 52 % 5 ml (49.95 mmol) ee Ester (−)-45 97 % 192 Vinylpropionat ee Alkohol (+)-14 88 % b) mit 5 mg Novozym 435 Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vier verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.75 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit jeweils 5 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt. Zu Beginn der Reaktion waren alle Reaktionslösungen klar und farblos. Bis auf die Reaktion unter Zusatz von Triethylamin zeigten die anderen Reaktion nach ca. 48 Stunden eine milchige Trübung.
- 280. 266 EXPERIMENTELLER TEIL Tabelle 3.75: Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat, katalysiert durch 5 mg Novozym 435 Reaktionsbedingung 7.6 h 23.3 h 31.5 h 47.75 h 125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 51 % 53 % 52 % 53 % Vinylpropionat, ee Ester (−)-45 88 % 91 % 91 % 91 % 5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 91 % 98 % 95 % ≥98 % Umsatz (HPLC) 50 % 53 % 52 % 52 % 5 ml (49.95 mmol) ee Ester (−)-45 92 % 93 % 92 % 92 % Vinylpropionat ee Alkohol (+)-14 93 % ≥98 % ≥98 % ≥98 % 125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 54 % 55 % 56 % 56 % Vinylpropionat, ee Ester (−)-45 92 % 93 % 93 % 91 % 6 mg Triethylamin, ee Alkohol (+)-14 ≥98 % ≥98 % ≥98 % ≥98 % 5 ml Toluol Tabelle 3.76: E-Werte der Novozym 435-katalysierten Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat Reaktionsbedingungen 7.6 h 23.3 h 31.5 h 47.75 h Mittel 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat, 49 97 78 111 84 5 ml Toluol 5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 81 144 125 125 119 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat, 125 144 144 111 131 6 mg Triethylamin, 5 ml Toluol
- 281. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 267 3.6.15.4 Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Isopropenylacetat Die Enzym-katalysierten Transacylierung erfolgte gemäß AAV 8. Dazu wurde 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.77 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit 10 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt. Die Reaktionslösungen war über die gesamten Reaktionszeit klar und farblos. Tabelle 3.77: Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Isopropenylacetat Reaktionsbedingungen 24 h E-Wert 125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 51 % Isopropenylacetat, ee Ester (−)-24 94 % 170 5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 ≥98 % 3.6.15.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.78 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit jeweils 7 mg MPEG/PLE (153 U/mg PLE) in 5 ml Toluol umgesetzt. Tabelle 3.78: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 in Toluol Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC) 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat 20 d 2% 125 mg (1.25 mmol) Isopropenylacetat 20 d 0%
- 282. 268 EXPERIMENTELLER TEIL 3.6.15.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 Die Enzym-katalysierte Transacylierung erfolgte gemäß AAV 8, dazu wurden 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-14 und 108 mg (1.25 mmol) Vinylacetat mit 60 mg PLE/BSA/MPEG (148 U/mg PLE) in 6 ml Toluol umgesetzt. Es entstand eine klare Lösung. Die Farbe des PLE/BSA-Katalysators änderte sich im Laufe der Reaktionszeit von weiß in ein dunkles rot-braun. Tabelle 3.79: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-45 ee Alkohol (−)-14 E 11 d 0% - - - 3.6.15.7 Versuch zur Chirazyme E1-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 Die Enzym-katalysierte Transacylierung erfolgte gemäß AAV 8, dazu wurden 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-14 und 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat mit 5 mg Chirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg) in 5 ml Toluol umgesetzt. Tabelle 3.80: Versuch zur Chirazyme E1-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-45 ee Alkohol (−)-14 E 47.75 h 2% ≥98 % 3% -
- 283. ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IMWÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 269 3.6.16 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)- Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy- phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 3.6.16.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 im wäßrigen Einphasensystem Die Enzym-katalysierte Hydrolysen erfolgten gemäß AAV 6 in zwei verschiedenen Ansätzen bei pH 7.0, dazu wurden jeweils 0.200 g (0.48 mmol) des Esters rac-25 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit der in Tabelle 3.81 angegebenen Mengen des jeweiligen Enzyms umgesetzt. Nach der in Tabelle 3.81 angegebenen Reaktionszeit wurden die Reaktionen durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Tabelle 3.81: Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 Enzym- Reaktions- Ausbeute Umsatz Enzym menge zeit Ester 25 (GC) Cholesterolesterase 30 mg 25 h 165 mg 0% (CE; 17.5 U/mg) Candida rugosa Lipase 10 mg 44 h 195 mg 0% (CRL; 37 U/mg) 3.6.16.2 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden 0.200 g (0.48 mmol) des Esters rac-25 in 6 ml Aceton und 34 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 150 µl (1.5 mg) PLE/(NH4)2SO4- Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Nach 42 Stunden wurde die Reaktion durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.199 g Ester 25 erhalten werden.
- 284. 270 EXPERIMENTELLER TEIL Tabelle 3.82: Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 19 ee Alkohol 13 E 42 h 1% - - -
- 285. ANHANG ZUM EXPERIMENTELLENTEIL 271 3.7 Anhang zum experimentellen Teil 3.7.1 Programm zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE durch Verseifung von Buttersäureethylester Mode STAT Regelparameter Endpunkt pH 8.00 Regelbereich 0.5 Max. Rate 10.0 ml/Min. Min. Rate 25.0 µl/Min. Titrationsparameter Start V aus Start 0s Start pH aus Startrate aus Zeitintervall 60 s Titrationsrichtung + Meßeingang 1 Parameter Abbruchbedingungen Stoppzeit abs. 7000 s Stoppvolumen abs. 99.99 ml Stopprate aus Füllgeschwindigkeit max Statistik Status aus Auswertung U. Grenze 1 aus Fix-V1 bis Fix-V9 alle 600 s (→ C51 bis C59) Fix-Zeit 1 aus Überwachung Alle Unterpunkte aus Vorwahl Ident. abfragen aus Einmass abfragen alle (→ C00) Rate anzeigen aus Aktivierpuls aus c-fml C01=0.01 Formel RS1 = (C52 − C51) / (C00 ∗ C01) = 10 – 20 Min. [U] Report Kurve, voll, Liste
- 286. 4 Literatur 1 A. Liese, K. Seelbach, C. Wandrey, Industrial Biotransformations, Wiley-VCH, Weinheim, 2000. 2 V. Gotor, Organic Process Research & Development 2002, 6, 420. 3 P. A. Claon, C. C. Akoh, Enzyme Microb. Technol. 1994, 16, 835. 4 J. S. White, D. C. White, Source Book of Enzymes, CRC Press, New York, 1997. 5 H.-J. Gais, F. Theil in Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (K. Drauz, H. Waldmann, Hrsg.), 2. Auflage, Wiley-VCH, Weinheim, 2002. 6 U. T. Bornscheuer, R. J. Kazlauskas, Hydrolases in Organic Synthesis, Wiley-VCH, Weinheim, 1999. 7 S. M. Roberts, Biocatalysis for Fine Chemical Synthsis, Wiley, Chichester, 1999. 8 a) K. Faber, Biotransformations in Organic Media, 3. Auflage, Springer, Heidelberg, 1997. b) T. Bugg, An Introduction to Enzyme and Coenzyme Chemistry, Blackwell science, Oxford 1997. c) C.-H. Wong, G. M. Whitesides, Enzymes in Synthetic Organic Chemistry, Elsevier, Oxford, 1994. d) L. Alberghina, R. D. Schmid, R. Verger, Lipases: Structure, Mechanism and genetic engineering, VCH, Weinheim, 1981. 9 A. L. Margolin, Enzyme Microb. Technol. 1993, 15, 266. 10 a) H.-J. Gais, H. Hemmerle, Chemie in unserer Zeit 1990, 5, 239. b) J. Bosley, Biochem. Soc. Trans. 1997, 25, 174. c) N. J. Turner, J. R. Winterman, Tetrahedron Lett. 1995, 36, 1113. 11 A. S. Bommarius, M. Schwarm, K. Stingl, M. Kottenhahn, K. Huthmacher, K. Drauz, Tetrahedron: Asymmetry 1995, 6, 2851. 12 a) T. Zelinski, H. Waldmann, Angew. Chem. 1997, 109, 746. b) N. Khalaf, C. P. Govardhan, J. J. Lalonde, R. A. Persichetti, Y.-F. Wang, A. L. Margolin, J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 5494. c) N. L. St. Clair, M. A. Navia, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 7314. d) J. J. Lalonde, C. Govardhan, N. Khalaf, A. G. Martinez, K. Visuri, A. L. Margolin, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 6845. e) R. A. Persichetti, N. L. St. Clair, J. P. Griffith, M. A. Navia, A. L. Margolin, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 2732. f) A. L. Margolin, TIBTECH 1996, 14, 219.
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- 301. 287 5 Lebenslauf Name: Carsten Griebel Geburtstag: 12.11.1971 Geburtsort: Niebüll Staatsangehörigkeit: deutsch Familienstand: ledig Schulausbildung: 08/1978 – 06/1982 Grundschule Emmelsbüll-Horsbüll 08/1982 – 07/1989 Friedrich-Paulsen-Schule Niebüll, Gymnasium des Kreises Nordfriesland 08/1989 – 06/1991 Städtisches Mathematisch-Naturwissenschaftliches Gymnasium Mönchengladbach 06/1991 Allgemeine Hochschulreife (Abitur) Studium: 10/1991 – 03/1998 Diplomstudiengang Chemie an der Rheinisch- Westfälischen Technischen Hochschule Aachen 06/1994 Vordiplom 10/1997 – 03/1998 Diplomarbeit am Institut für Organische Chemie der RWTH-Aachen unter Anleitung von Prof. Dr. H.-J. Gais mit dem Titel: „Enzymatische Racematspaltungen von phenolischen Analgetika“ 03/1998 Abschluß: Diplom-Chemiker Promotion: 04/1998 – 02/2002 Dissertation bei Prof. Dr. H.-J. Gais am Institut für Organische Chemie der RWTH-Aachen mit Thema: „Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungen von Tramadol–Analoga und deren industrielle Anwendbarkeit“ 13.12.2002 Tag der mündlichen Prüfung