Este documento describe varios métodos modernos de diagnóstico de enfermedades de plantas. Explica que la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es uno de los métodos moleculares más efectivos, permitiendo detectar patógenos incluso cuando no muestran síntomas. También describe pruebas serológicas como ELISA e inmunocaptura. El documento concluye que si bien las técnicas moleculares son las más usadas, las pruebas serológicas son suficientes para la mayoría de patógenos excepto viro

1. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA
SELVA
FACULTAD DE AGRONOMIA
“DIAGNOSTICO POR METODOS MODERNOS”
CURSO : FITOPATOLOGIA TROPICAL
DOCENTE : CABEZAS HUAYLAS, Oscar
INTREGANTES : JARA ALVARADO, Alexander
GUTIERREZ TITTO, YakelYn
HUAMAN ALCEDO, David
RENGIFO PÉREZ, Claudia
TINGO MARIA – PERÚ
2015

2. INTRODUCCION
LAS ENFERMEDADES DE LAS PLANTAS TIENEN UNA NOTABLE
IMPORTANCIA EN LA AGRICULTURA MODERNA, NO SÓLO PORQUE
POSEEN EL POTENCIAL DE DESTRUIR ENTERAMENTE LAS COSECHAS
ADEMÁS AFECTAN LA CALIDAD Y DURABILIDAD DE LOS PRODUCTOS
COSECHADOS.
EL DESARROLLO ALCANZADO POR LA FITOPATOLOGÍA ENTRE LAS
CIENCIAS AGRÍCOLAS, ADQUIERE EN LA ACTUALIDAD RELEVANTE
IMPORTANCIA EN LA AGRICULTURA MODERNA, AL NIVEL DE PODER
DIAGNOSTICAR ENFERMEDADES DE PLANTAS AUN CUANDO ESTAS
NO PRESENTEN SINTOMAS; ASI COMO DIAGNOSTICO EN
SEMILLAS.
ENTRE LAS MAS CONOCIDAS TENEMOS LAS PRUEBAS
INMUNOSEROLÓGICAS Y LA REACCION DE CADENAS POLIMERASA
LAS CUALES PERMITEN EVALUAR MUCHAS MUESTRAS EN POCO
TIEMPO CON ALTO NIVEL DE CONFIANZA

3. DIAGNOSTICO POR
METODOS MODERNOS

4. IDENTIFICACION CON PRUEBAS SEROLOGICAS
Esta técnica consiste en el reconocimiento especifico del anticuerpo (antisuero) al
antígeno (partícula viral) que le dio origen. El antisuero es producido por sistema
linfático de un animal de sangre caliente, el cual al ser inyectado partículas virales
purificadas produce proteínas denominados inmunoglobulinas. Estas proteínas
llevadas en el suero sanguíneo son conocidas colectivamente como anticuerpos. La
serología es extremadamente sensible. Si se inyectara el virus purificado de la
mancha anillada de la papaya (PRSV) a un conejo esta producirá anticuerpos
específicos que sólo reconocerán a PRSV. (Cabezas, 2004).

5. REACCION ANTIGENO
ANTICUERPO

6. •Método por
precipitación:
Pueden ser en medios líquidos o en
geles. Estos métodos han
demostrado tener una notable
eficacia para individualizar y
purificar los antígenos dotados de
diferencias particulares. La unión
del Antigeno y Anticuerpo se
traduce por la formación de un
precipitado insoluble con la
condición que los reactivos se
encuentren a concentración
equivalente.

7. Consiste en hacer reaccionar
cantidades equivalentes de los
reactantes (Ag y Ac). La formación
de gránulos aglutinados o
agregados indican una reacción
positiva. Las reacciones de
aglutinación son menos
específicas pues tienen la
desventaja de depender
grandemente de los factores físico
químicos, tales como,
concentración de electrolitos, pH,
temperatura y el tiempo.
Método por
aglutinación:

8. Está basado en la prueba de aglutinación. Los Ac son
adheridos a partículas de látex. Al enfrentarse el látex
sensibilizado con el Ag específico se produce la agregación
entre estas esferas y los Ag. Esta prueba ha sido usada
principalmente en Virología, en Bacteriología la técnica ha
sido usada con éxito para detectar Ralstonia solanacearum
en papa y Xanthomonas albilineans en caña. El método es de
100 a 1000 veces más sensible que una aglutinación normal,
la reacción aparece más rápida, generalmente no es
necesario el microscopio para observar la reacción, se
necesita muy poco inmunosuero, no requiere la clarificación
de la savia.
Método del látex:

9. •Esta técnica se basa
en la conjugación de
anticuerpos
específicos con
moléculas teñidas con
productos, ejemplo,
la fluoresceína, que
produce un color
Técnica de Inmunofluorescencia:

10. Técnica inmunoenzimática ó Prueba de conjugados enzimaticos
(ELISA).
El ensayo se basa en la interacción específica de un antígeno
(patógeno) y un anticuerpo (proteínas inmuno-globulinas
producidas en un vertebrado superior, usualmente conejos).
La reacción se visualiza a través de la acción de un conjugado
enzima-anticuerpo sobre un sustrato.
Existen diferentes variantes de la técnica de ELISA, todas
basadas en el mismo principio. El tipo de técnica y anticuerpo
a emplear dependerá del objetivo de la aplicación (campo,
laboratorio), tipo de muestra (suelo, agua tejido) y nivel de
sensibilidad y rapidez requerida.
Su amplia utilización como técnica de rutina debido a su
sencillez y costo, está limitada en algunos casos por la
disponibilidad de anticuerpos comerciales.

12. IDENTIFICACION POR TECNICAS MOLECULARES
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):
Reacción en cadena de la
polimerasa (PCR): Es uno de los
métodos moleculares de mayor
eficiencia en el diagnóstico de
enfermedades vegetales. Es
utilizada en la detección de
patógenos en semillas, el
cultivo de tejidos, detección de
toxinas y residuos de pesticidas
(Flores-Olivas, et al ,1997).
La PCR es una técnica que
permite determinar
relaciones filogenéticos
entre especies y constituye
una buena herramienta de
análisis de la biología de las
poblaciones (Baró, 1998).

13. Aplicaciones del PCR (Cabezas, 2004)
- Se usa para detectar todo tipo de fitopatógenos (virus, viroides)
- Detección de patógenos en semilla
- Deteccion de toxinas
- Residuos de Pesticidas
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Esta técnica empleada el ADN para la detección e identificación de patógenos.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Es el método fácil y sencillo de
generar ilimitadas copias de cualquier fragmento de ADN.
Es fácil de automatizar y puede copiar una sola molécula de ADN varios millones
de veces en unas pocas horas.

14. Ventajas - No existe necesidad de cultivar los
organismos para su detección - La técnica es rápida y
versátil (2-3 hora) - Detecta moléculas simples en
mezclas complejas. - Es 80 a 100 veces mas sensible de
RLFP.
Desventajas - Para detectar virus y viroides
existe un costo adicional para la transcripción
reversa del ARN a ADNc, antes de ser
amplificado.

15. LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA SE BASA EN LA
REPETICIÓN DE UN CICLO FORMADO POR TRES ETAPAS:
2ª Hibridación
de los
iniciadores a la
zona 3
específica de
cada una de las
hebras.
1ª
Desnaturaliz
ación del
ADN doble
cadena.
3ª
Extensión
del cebador
por
actuación
de la DNA
polimerasa.

17. PCR con transcripción inversa (RT-
PCR)
La mayoría de los virus de las plantas
y todos los viroides tienen un
genoma ARN, lo que imposibilita
utilizar la metodología original de la
PCR para su detección. Debido a esto
la PCR se realiza precedida por la
transcripción inversa (RT), en la cual
el ARN es convertido a ADNc, por
medio de la enzima reverso
transcriptasa, en presencia de
cebadores. Luego de sintetizado el
ADNc, se procede a su amplificación
mediante el procedimiento clásico de
PCR.
PCR con inmunocaptura
La técnica consiste en la captura o inmovilización de las partículas
virales presentes en el extracto vegetal crudo sobre un soporte
sólido (microtubos) que ha sido previamente recubierto o tapizado
con anticuerpos específicos. Posteriormente, se añade la mezcla de
la RT-PCR.
Nested-PCR
La PCR anidada o nested-PCR
es otra variante que consiste
en someter la misma muestra
de ADN a dos reacciones
consecutivas de PCR, la
primera con iniciadores que
amplifican una región más
amplia, y la segunda con
iniciadores específicos
internos de la región
primeramente amplificada. La
PCR anidada resulta mucho
más sensible que una
reacción simple de PCR y su
empleo se extiende a
diferentes tipos de patógenos

18. PCR múltiple
La PCR múltiple fue
originalmente usada para co-
amplificar productos génicos
en una única PCR, utilizando
más de una pareja de
iniciadores.
. Este procedimiento está siendo
utilizado en la actualidad para la
detección de las diferentes
especies de Candidatus
Liberibacter causantes de HLB.
(Lochy et. Al)
PCR en tiempo real
Esta técnica se ha aplicado
exitosamente en la
detección cuantitativa de
numerosos patógenos, entre
ellos CTV y las bacterias
causantes de HLB. Sin
embargo, solo se justifica
en casos excepcionales,
debido a que por el
momento su costo es muy
elevado para su empleo en
el diagnóstico masivo.
(Lochy et. Al)
Hibridación de ácidos nucleicos
La hibridación de ácidos nucleicos (NASH) se encuentra entre
las técnicas más empleadas en los últimos años para la
detección de patógenos, especialmente cuando se procesa un
gran número de muestras

19. laboriosa que precisa de una gran cantidad de
ADN y una información previa sobre su
secuencia, además que usualmente involucra
el uso de radioisótopos, por lo que está
siendo des- plazada por los marcadores
basados en la reacción en cadena de la
polimerasa que ha contribuido a la
simplificación de la tecnología y reducción de
los costos (Chávez y González, 2000).
Técnica RAPD: Polimorfismo del ADN
amplificado al azar. Es una PCR que utiliza un
solo iniciador, cuyo tamaño es en general de
10 bases, e hibrida a secuencias repartidas
aleatoriamente sobre el ADN. Provee patrones
de bandas cuyo número y tamaño permiten el
análisis de variaciones moleculares (Strigmam
y Mackay, 1993 citados por Baró, 1998).
Técnica de microscopía óptica y
electrónica: El empleo de estas técnicas
se limita solamente a la observación
directa de las estructuras del patógeno en
cuestión (Pupiro y Malagón, 2003).
Otras Técnicas de
Diagnostico

20. Las técnicas de diagnóstico de enfermedades son esenciales
para poder combatirlas y controlarlas, en el mejor de los casos
erradicarlas.
A lo largo del tiempo estas han ido evolucionando y mejorado
para poder hacer las determinaciones más precisas y en menor
tiempo.
Las técnicas modernas de diagnóstico de enfermedades en
plantas más utilizadas son:
Las técnicas moleculares
Las pruebas serológicas
De los 3 métodos de diagnóstico modernos mencionados el
que se destaca por ser le mas usado es la reacción en cadena
de la polimerasa.
Pero por su disponibilidad, sencibilidad, y costo es suficiente
las pruebas serológicas escepto para viroides y fitoplasmas.
CONCLUSION

21. ALGUNAS PRUEBAS
USADAS
FRECUENTEMENTE