Sérodiagnostic de la syphilis

1. Abdsalah
Sérodiagnostic de la
Syphilis
VDRL-TPHA
Par : S / Abdessemed

2. Abdsalah
INTRODUCTION
• Le diagnostic sérologique repose sur la
mise en évidence des anticorps induits
par l’infection et retrouvés dans le sérum.
• Le sérum est traité pour retirer
certaines substances qui peuvent gêner la
technique ce qui aboutit à une certaine
dilution
• Le patient doit être de préférence à jeun

3. Abdsalah
Les réactions sérologiques
Réaction à antigène
non tréponémique
(Ag cardiolipidique)
Réaction à antigène
tréponémique

4. Abdsalah
:
VDRL( veneral disease research laboratory)
Principe:
Réaction d’agglutination passive sur lame en
verre.
Antigène utilisé est d’origine cardiolipidique
constitué de microcristaux de cholestérol sur
lesquels sont adsorbés les molécules de
cardiolipide = Haptène de Wasserman.
Des particules de charbon sont piégés dans la
combinaison Ac-Ag pour faciliter la lecture.

5. Abdsalah
Matériel et réactifs
Sérum frais.
 Eau physiologique.
 Antigène VDRL près à l’emploi.
 Matériel:
Centrifugeuse
Micropipettes réglables ( 5-50µL)
Plaques en verre
Portoir pour tubes à hémolyse
Agitateur rotatif de Kline
Container de déchets contaminés
Eau de Javel

6. Abdsalah
Mode opératoire:
Réaction qualitative Réaction quantitative
( dépistage) (dépistage positif)
Deux types de réactions

7. Abdsalah
Réaction qualitative
Distribuer 50µL de sérum sur chaque puit
de la plaque en verre.
 Ajouter 16µL d’Antigène VDRL.
 Placer la plaque sur l’agitateur de Kline
pendant 8mn.
 Lire immédiatement au microscope.

8. Abdsalah
Puits
Témoin + Témoin - Témoin
Ag VDRL
Sérum
inconnu
Sérum 50 µl de S + 50 µl de S - 50µL d’eau
physiologique
50 µl de
sérum
inconnu.
Antigène
VDRL 16µl 16µl 16µl 16µl
Placer sur un plateau rotatif (agitateur de kline) pendant 8
minutes.
Lecture
+ - -

9. Abdsalah
Pas d‘agglutination
Agglutination : +
Lecture

10. Abdsalah
Lecture
Agglutination : +++
Agglutination : ++

11. Abdsalah
Réaction quantitative
Lorsque la réaction qualitative est
positive on réalise la même réaction
avec une série de dilution du sérum au
(1/2, 1/4, 1/8, 1/16,1/32…) avec de l’eau
physiologique.
 Le titre d’anticorps est exprimé par
l’inverse de la dernière dilution donnant
une réaction positive nette.

12. Abdsalah
Puits
1 2 3 4 5
Eau
physiologique 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl
Dilution 1 / 2 1 / 4 1 / 8 1 / 16 1 / 32
Sérum à
analyser
En µl
50
reporter reporter
50
reporter 50 reporter 50 jeter 50µl
dans l’eau de
Javel
Ag VDRL 16µl 16µl 16µl 16µl 16µl
agitation pendant 8 minutes.
Lecture

13. Abdsalah
TPHA: ( Treponema pallidum
hemagglutination assay)
Principe:
 Réaction d’hemmagglutination passive réalisée
sur des microplaques.
 L’Antigène utilisé est un lysat de tréponema
pallidum adsorbé sur des hématies.
 Le dépistage consiste à tester le sérum à la
dilution de 1/80.
 Des dilutions sont effectuées pour le titre dans
le cas du dépistage positif.

14. Abdsalah
Matériel et réactifs
Sérum frais
Coffret de réactif pour TPHA:
o Hématies tests
o Hématies contrôles
o Diluant
o Témoin positif
o Témoin négatif

15. Abdsalah
o Centrifugeuse
o Micropipette réglable (5 -50 µL),( 50 –
200 µL)
o Pipette multicanaux
o Plaque de microtitration à fond en U
o Portoir pour tubes à hémolyse
o Container de déchets contaminés

16. Abdsalah
Mode opératoire:
Deux types de réactions
Réaction qualitative Réaction quantitative
( dépistage) (dépistage positif)

17. Abdsalah
Technique qualitative
• 1. chaque échantillon va utiliser 3 puits de la
plaque.
• 2. Déposer 190µl de diluant et 10 µl de sérum
dans le puit 1.
• 3. Avec une pipette, mixer le contenu du puit
1 et en transférer 25µl aux puits 2 et 3.
• 4. Homogénéiser complètement le réactif
TPHA et le contrôle TPHA. Ajouter 75 µl de
contrôle TPHA au puit 2 et 75 µl de réactif
TPHA au puit 3.

18. Abdsalah
• 5-Agiter doucement la plaque jusqu’ à
obtenir un mélange homogène de manière à
être sur d’éviter une contamination croisée.
• 6. incuber la plaque pendant 45 à 60
minutes à 18-25°C. Pendant l’incubation,
garder la µplaque bien à l’abri de sources de
chaleur, des rayons solaires et de toutes
vibrations.
• 7. Lire et consigner les résultats ; les
résultats sont stables 24 heures si la
plaque est couverte et les précautions ci-
dessus respectées.

19. Abdsalah
Cupule
A B C
Diluant
en µl
190
Sérum
en µl
10 25 *
25 *
HS en µl
75
HNS en µl 75
Lecture + + +

20. Abdsalah
Puit 1 : voile uniforme
couvrant tout le puit
→ Fortement positif.
Puit 2 : voile couvrant
le 2/3 du puit →
Moyennement positif.
Puit 3 : voile couvrant
le 1/3 du puit →
Faiblement positifs.
Puit 4 : Anneau très
serré
à bord nets (absence
de voile) → Négatif.
Lecture des résultats

21. Abdsalah
Résultats Cupules échantillons Cupules de contrôle
Fortement positif Aspect de voile couvrant
uniformément le fond de la
cupule
Pas d’agglutination ; aspect
de bouton compact
Faiblement positif Aspect de voile couvrant
approximativement 1/3 du
fond de la cupule
Pas d’agglutination ; aspect
de bouton compact
indéterminé Aspect de voile montant
clairement un anneau
central distinct (voile non
uniforme)
Pas d’agglutination ; aspect
de bouton compact
Négatif Aspect de bouton compact
montrant clairement un
petit anneau central clair
Pas d’agglutination ; aspect
de bouton compact
Non spécifique Réaction positive Réaction positive
Interprétation des résultats

22. Abdsalah
Technique quantitative
• 1. Chaque échantillon va utiliser 8 puits de
la plaque labellisés de A à H.
• 2. Déposer 25µl de diluant dans les puits de
B à H uniquement.
• 3. Transférer 25µl de sérum dilué au 1/20
dans les puits A et B uniquement.
• 4. Prendre 25 µl du sérum dilué du puit B et
effectuer des doubles dilutions du sérum
des puits B et H inclus et éliminer les 25 µl
de sérum du puit H.

23. Abdsalah
• Ajouter 75µl de réactif TPHA au puit A à
H inclus.
• 6. Agiter doucement la plaque jusqu’à
obtenir un mélange homogène.
• 7. Incuber la plaque pendant 45 à60
minutes à 18-25°C. pendant l’incubation,
garder la plaque bien à l’abri des sources de
chaleur, des rayons solaires et de toutes
vibrations.
• 8. Lire et consigner les résultats ; les
résultats sont stables 24 heures si la
plaque est couverte et les précautions ci-
dessus respectées.

24. Abdsalah
Cupule
A B C D E F G H
Diluant
en µl
25 25 25 25 25 25 25
Sérum
1/20 en µ
l
25 25 * 25* 25* 25* 25* 25* 25**
HS en µl 75 75 75 75 75 75 75 75
Dilution 1 / 80 1 / 160 1 / 320 1 / 640 1 / 1280 1 / 2560 1 / 5120 1 / 10240
Lecture + + + + + - - -
Titre retenu 1280 ( dernière cupule présentant une hémagglutination nette ).
* : reporter 25 µl dans la cupule suivante à gauche.
**: jeter 25 µl dans l'eau de javel.
25

25. Abdsalah
Absorption non spécifique
• 1. Déposer 100µl de l’échantillon dans un
petit tube et ajouter 400µl de contrôle
TPHA.
• 2. Bien mélanger le tube
• 3. Centrifuger le tube 15 minutes à 1000
rpm et tester le surnageant par la
méthode qualitative.

26. Abdsalah
• 4. Remarque : l’échantillon est
maintenant à 1/5 ; ceci doit être pris en
compte lors de la préparation des
dilutions.
• 5. Si le résultat est de nouveau non
spécifique, l’échantillon doit être testé
par une autre technique telle que le
FTA-ABS.

27. Abdsalah