2. DNA dizi analizi, gen yapısı ve genetik kontrol
mekanizmaları hakkında bir çok bilgi edinmemizi
sağlamıştır.
Herhangi bir organizmadan çok miktarda saf DNA
elde edilmesini sağlayan rekombinant DNA
tekniklerinin gelişmesine paralel olarak DNA dizi
analizi yöntemleri de gelişme göstermiştir.
3. Bir genomun tamamlanan nükleotit dizisi, nihai
haritası demektir.Genomların çok uzun DNA
moleküllerinin dizi analizini olası hale getiren DNA
fragmentlerinin klonlanması için kullanılan
teknolojidir.
Kısa bir DNA fragmentinin çok sayıda kopyasının
bulundugu saf bir preparasyonla başlayarak, bir dizi
analizi yapan aletle bu fragmentin nükleotit dizisi
belirlenebilir.
5. DNA dizi analizi ya da "Sequencing" DNA'nın
nükleotid dizilerinin saptanması anlamına
gelmektedir.
İlk dizi analiz çalışmaları 1960’lı yılların başında 75-
80 nükleotitlik tRNA’larla başlanmıştır.
6. DNA dizi analizleri yada sekanslama DNA birincil
yapılarının tayininde ve nükleotid baz diziliminin
belirlenmesinde kullanılan yöntemdir. Analiz bir
nükleik asit dizisinin diğerine hibridizasyonuna
dayanır.
Bu hibridizasyon sırasında radyoaktif ya da
radyoaktif olmayan maddelerle işaretleme yapılır.
Sıklıkla gen mutasyonları (delesyon, insersiyon vb.)
tespiti yada rekombinant DNA oluşum yapılarının
tayininde kullanılır.
7. Kalıtsal hastalık taşıyan çiftlerde tüp bebek
embriyolarından alınan DNA’lar bu yöntemle analiz
edilerek taşıyıcı embriyolar elenip genetik hastalık
taşımayanların doğması sağlanmaktadır.
Yine aynı şekilde doku uygunluğu saptanmış
embriyolardan sağlıklı doğacaklardan elde edilen
kordon kanı ve kemik iliği hasta kardeşlerin
tedavisinde kullanılmaktadır.
9. Her iki teknik de üç temel basamaktan
oluşmaktadır.
• DNA’nın hazırlanması
• Reaksiyonlar
• Yüksek voltajlı jel elektroforezi
10. Her iki analiz sırasında da tek iplikli DNA parçaları
hazırlanır.DNA dizi analiz yöntemi sırasındaki temel
fark DNA fragmentlerinin üretilme biçiminden
kaynaklanır.
Jel elektroforezi yüksek çözünürlükteki DNA
moleküllerini ayrıştırdığı için her iki metotta da
kullanılır.
11. Sanger Dizi Analiz Yöntemi
Dideoksi yada zincir sonlanması reaksiyonları olarak
da bilinir. Tehlikeli kimyasallardan uzak ve daha hızlı
bir yöntem olduğundan Maxam-Gilbert yöntemine
tercih edilir.
12. Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır ve
günümüzün en yaygın kullanılan DNA dizi analizi
tekniğidir.
Bu yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni
sentezlenecek iplik için kalıp olarak kullanılır.
13.
14. Bu yöntem için:
Tek iplikli kalıp DNA’ya
dNTP’lere
ddNTP
DNA polimeraz
Serbest OH grubu içeren primere ihtiyaç vardır
15. İŞLEYİŞ
Prosedür PCR nın işleyişine benzer
•DNA tek zincir haline getirilir.Reaksiyona girecek olan karışımda bol miktarda
dört çeşit normal nükleotid
•dATP
•dGTP
•dCTP
•dTTP bulunur.
•Karışımda aynı zamanda diziyi rastgele sonlandırmak için farklı renkte flouresan
kimyasallarla işaretlenmiş dideoxynukleotidler vardır.
•ddATP
•ddGTP
•ddCTP
•ddTTP
•DNA polymerase I ise sentezde zincirin uzaması aşamasında gereklidir.
16. ddNTP ’ ler dideoksinükleosittrifosfatlardır. OH
grubu taşımayan modifiye nükleotit substratlardır.
Bunlar riboz şekerinin ikinci karbon atomuna ek
olarak üçüncü karbon atomunda da deoksi halde
olduğundan fosfodiester bağının oluşumu engellenir
yeni nükleotitler yapıya katılmaz. DNA zincir
uzaması sonlanır.
17. İlk olarak reaksiyon sonunda oluşacak ürünlerin
rahat görüntülenebilmesi için DNA molekülü
işaretlenir. İşaretleme işlemi için genelde
• S35
• P33
• P32 kullanılır.
İşaretleme ya gama pozisyonunda yapısında
bulunduran nükleotitleri kullanarak yada alfa
pozisyonunda işaretli dNTP’leri kullanarak yapılır.
18. DNA polimeraz, primer kalıp DNA ve dNTP’ler
ortama konulup işaretli nükleotitin yapıya katılması
sağlanır.
Kullanılan ddNTP’lerin konsantrasyonu diğer
maddelerden daha düşük olmalıdır.
İşaretleme primere de yapılabilir. İşaretlemeden
sonra zincir sonlanması reaksiyonlarına geçilir.
19. Karışım dört kısma ayrılarak dört tüpe konulur. Her
tüpe gerekli enzim faktörleriyle birlikte düşük
derişimli farklı ddNTP’ler konulur ve inkübe edilir.
ddNTP’ler ve dNTP’ler aynı karışıma konduğunda
aralarında bir yarışma olur.substrat olarak dNTP’ler
kullanıldığı sürece uzama devam eder. Sentezin
herhangi bir noktasında yapıya dideoksi girdiğinde
reaksiyon durur.
20.
21. Her tüpte aynı anda birbirinden bağımsız birçok
reaksiyon olmuştur.
Sonuçta primer sonundan başlayıp pramatüre
sonlanmaların olduğu bölgelere kadar çeşitli
uzunlukta DNA parçaları oluşur.
22. Oluşan ürünlerin ayrıştırılabilmesi için yüksek
rezülasyonlu denatüre edici poliakrilamid jel
elektroforezi kullanılır.
Elektroforez sonunda jel kurutularak otoradyografi
ile fotoğrafı çekilir.
Otoradyogramdan elde edilen basamak şeklindeki
bantlar radyoaktif izotop taşıyan tek zincirli DNA
moleküllerine aittir. Birbirine en yakın iki bant
arasında tek bir nükleotitlik fark vardır.
24. Elektroforezde mobilitesi en hızlı olan bant
primere en yakındır yani radyoaktif elemente en
yakın bant en küçük DNA fragmentidir. Bu fragment
hangi ddNTP ile oluşturulmuş ise işaretten sonra
gelen ilk bazdır.
25. Her baz için ayrı fluoresans boya ile işaretlenmiş olan
ddNTP’ler kullanılır.
DNA parçacıkları jelde ilerlerken bir lazerin yanından
geçerler. Lazerle karşılaşan floresans boyanın yaptığı ışıma
dedektör aracılığı ile okunur.
28. İlk bantta en yakın ikinci bazı verir. Böylece
aşağıdan yukarı doğru çıktıkça hareketi azalan
bantların hangi ddNTP ile oluşturulduğu belirlenir.
Sonuçta otoradyogramda ki bu bant verilerden
yararlanılarak 53 yönüne doğru olan baz dizilimi
saptanmış olur.
32. DNA dizi analizinde çeşitli polimerazlar
kullanılabilmektedir:
• Klenow Fragment/E.Coli DNA polimeraz
• Reverse Transkriptaz
• Bakteriofaj T7 DNA polimeraz
• Taq DNA polimeraz
• Sequenazlar
33. Kalıp DNA
Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde hem
çift, hem de tek zincirli DNA kullanılabilir.
Yöntemin birinci aşamasında polimeraz zincir
reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction, PCR)
tekniği ile elde edilen ve çoğaltılan DNA parçası
kalıp DNA olarak adlandırılır.
34. PCR ürünü kalıp DNA, önce reaksiyon artıklarından
arındırılmalıdır. Bu çok özen gösterilmesi gereken bir
aşamadır. Eğer kalıp DNA yeterince temizlenemezse
bir sonraki sonlanma reaksiyonuna aktarılacak olan
kimyasallar ile primer artıkları reaksiyonun
hassasiyetini bozacaktır (Sambrook et al., 1989).
35. Enzimler
Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde bir
çok tipde DNA polimeraz enzimi
kullanılabilmektedir. Bu enzimlerin ortak
özellikleri özgül ve hassas olmalarıdır.
36. E.coli Klenow Fragmenti DNA
Polimeraz I
İlk geliştirilen yöntemde kullanılan bu enzimin iki
büyük dezavantajı vardır.
Birincisi enzimin kontrolsüz olarak çoğaltma
reaksiyonlarını yarıda kesmesidir. Özellikle uzun
okumalarda bu problem iyice belirginleşmektedir.
37. Bu enzim standart olarak 250-300 nükleotitlik bir
dizi analizi edebilir çok uzun zincirlerde etkisini
gösteremez,
İkincisi Homopolimerik bölgeleri etkin olarak
çoğaltamaz (Homopolimer DNA segmentlerinin
uçlarına ilave edilen poli A, poli T’lerden) İkincil
yapının olması durumunda da etkili değillerdir
(Dyad simetri)
38. Ters Transkriptaz
Ters transkriptaz (Reverse transcriptase)
enziminin her ne kadar çok yaygın bir kullanım alanı
olmasa da özellikle homopolimerik bölgelerde etkin
çözüm verir. Homopolimerik bölgeler (A/T veya
G/T ) bakımından zenginse tercih edilmektedir.
Enzim özellikle bu tip bölgelerde Klenow
fragmentinden daha etkin ve kullanışlıdır .
39. Sekuenaz Enzimleri
Sekuenaz (SequenasesTM) enzimleri T7
bakteriofajın’dan elde edilirler. Enzimin 3’-
5’ekzonükleaz aktivitesi inhibe edilmiştir. Bu özelliği
ddNTP’lerin bağlanmasını kolaylaştırdığından
çoklukla tercih edilmektedir.
İnhibe edilen bu özelliği sayesinde enzim tek
yönlü ve hızlı çalışır.
40. (Bu enzimin tamamiyle modifiye bir formu olan
Sequenaz ver 2’de üç kat daha fazla aktivitesi olan bir
enzimdir. Plimerizasyon oranı 300 dür. Bir
reaksiyonda yaklaşık 3000 nükleotit sentezi
yapılabilmektedir. Burada sınırlayıcılar poliakrilamid
jellerdir. Bu avantajlardan yararlanabilmek için iki
kademeli dizilenme reaksiyonu yapılır.)
Kalıp DNA’ nın uzun olduğu deneylerde yüksek
özgül aktivitesi ve dayanıklılığı ile tercih edilir .
41. Taq DNA Polimeraz
Özelilikle tek zincirli DNA dizisinin saptanmasında
tercih edilir. Sıcağa dayanıklı olduğu için yaygın
kullanılan enzim türüdür.
42. Özellikle 95 0C’ da aktif olması nedeni ile
homopolimerik bölgelerde bile çok etkindir .
Tag polimeraz Klenow’un yapamadığı tüm
işlevleri yapabilmektedir ve özellikle G/C
bakımından zengin bölgelerde daha etkindir.
43. Maxam –Gilbert Kimyasal
Degredasyon Yöntemi
Çok yönlü sekans olarak da bilinen bu yöntem de
bazı kimyasallarla DNA özgül baz dizilerinden
kesilerek değişik uzunlukta fragmentler elde edilir.
Bu metotta bir sekans jelinden kırk klon analizi
yapılabilmektedir.
44. Yine de çok fazla tercih edilmeyen metottur. Ana
mantık DNA’daki bazların tahrip edilip hasar görmüş
bölgelerden piperidin ile fosfodiester bağlarının
kırılmasıdır.
45. İlk olarak DNA parçası bir ucundan işaretlenir.
İşaretleme sonrası DNA dört parçaya ayrılır.
Her bir örneğe bazlardan birini tahrip edilebilecek
kimyasallar eklenir. Genelde ilk pürin ve
pürimidinlerin ayrımı ardından bazların ayrımı
şeklinde olur.
Dimetilsülfat ile müdahale pürünlerin hydrozin ile
müdahale de pürimidinlerin arasındaki glikozit
bağlarının kırılması sağlanır.
46. Piperidin de fosfodiester bağlarının kırınımını
katalizler.
Dimetilsülfat, piperidine guanini bağlarken
Dimetil sülfat, piperidine formikasit guainin ve
adenini bağlıyor
Hidrozin ve piperidin birlikte timin ve sitozini
bağlarken
Hidrozin piperidin ve 1.5 M‘lık NaCl yalnızca
sitozini bağlar.
47. Yukarıdaki kimyasalların uygulanmasıyla oluşan
çeşitli uzunluktaki fragmentler yüksek voltajlı
elektroforez sonunda X-ray duyarlı film ile k
kaplanarak otoradyograma alınır. otoradyografik
bantlar 5>3 yönünde en alttan en üste doğru
okunduğunda bize 5>3 yönündeki baz dizilimini
verir.
50. Sanger-Coulson Zincir Sonlanma Yönteminde
Kullanılan Kimyasallar ve Primerler
Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde istenilen
DNA kalıbının çoğaltılması ve dizi analizinin yapılabilmesi
için özgül oligonükleotitlere yani primerlere ihtiyaç vardır.
Primer çiftleri kullanılacak kalıp DNA’nın genomik
DNA’dan eldesinde, çoğaltılmasında kullanılır. Ayrıca
primerler yöntemin son aşaması olan sonlanma
reaksiyonunda polimeraz enzimi için uygun 3’ ucu sağlar.
Her iki reaksiyondaki primer çifti aynı olabileceği gibi farklı
primerler de kullanılabilir.
51. Gen bölgesinin elde edilmesinde kullanılan primer çifti dizi
analizi yapılacak bölgenin daha dışından seçilip dizi analizi
reaksiyonunda kullanılan primer ise bu primerlerin arasında
ve dizinin analizi yapılacak bölgesine daha yakın olmalıdır.
Sekanslama reaksiyonunda tek bir primer kullanılır ve
böylece reaksiyon yönü tayin edilmiş olur .
52. Kulanım alanları
1. Hastalığa yatkınlığın önceden belirlenmesi
2. Kişiye özel ilaç tasarımlarının yapılabilmesi.
3. Gen tedavisi ve gene özgü ilaç üretimi
4. Yeni enerji kaynaklarının bulunması
5. Adli tıp çalışmalarında kullanılması
6. Genetik testlerde kullanılması
7. Tarımda sağlıklı ve çok daha verimli çiftlik
hayvanlarının geliştirilmesi
8. Besin değeri yüksek ürünler geliştirilmesi
9. Islah çalışmalarında zaman kazanılması vb. birçok
uygulama alanı vardır.
54. Klonlama temelde üç ana başlığa ayrılarak incelenebilir:
•Moleküler klonlama
•Çoğaltımsal klonlama
•Terapi Amaçlı klonlama
55. Gen klonlaması çalışmaları bugün çok çeşitli
amaçlar için genetik ve biyolojik araştırmalarda
kullanılmaktadır.
Bir genin vektöre yerleştirilmesi ve bu vektörün
bakteri hücrelerine transformasyonu sonucunda
hücrelerin bölünmesi sırasında vektörün de
içerdiği genin birçok kopyasını oluşturması işlemine
gen klonlaması adı verilmektedir.
56. Moleküler klonlama
Bu teknik, herhangi bir DNA parçasının, plazmid ya
da fajmid gibi kendini eşleme yeteneği olan bir başka
DNA parçası içine vektör yerleştirilmesi ve bu
bileşimin vektörün çoğaltılması işlemlerini içerir. Bu
teknik, biyoloji biliminin neredeyse her alanında çok
önemli kullanım alanına sahiptir.
57. Klonlamada;virus ve bakteriler, bakteriofajlar,
plazmitler, nadiren de kozmid ve mayalar vektör
olarak kullanılmaktadır.
Plazmitler, bakteri ve diğer organizmalarda bulunan,
konak hücre kromozomundan bağımsız olarak
çoğalan küçük, yuvarlak yapılı kromozom dışı
DNA’lardır.
58. Gen klonlaması çalışmalarında plazmitler
kullanıldığında, klasik olarak genler genomik
DNA veya mRNA’dan izole edilerek Polimeraz
Zincir Reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılmakta, gen
ve genin yerleştirileceği plazmit bir veya daha
fazla enzimle kesilerek in vitro şartlarda genin
plazmite yerleştirilmesi sağlanmaktadır.
59. Araştırıcılara bir çok avantaj sağlayan plazmit ve
klonlama kitleri firmalar tarafından üretilmektedirler.
Bunlar yardımıyla çok kısa sürede ve çok etkin bir
şekilde gen klonlaması yapılabilmektedir.
60. Araştırıcıların biyoteknolojik gelişimi takip ederek
gen klonlaması ve sonrasındaki çalışmalar için
kullanacakları en uygun plazmiti; plazmitin kullanım
özellikleri, maliyet ve zamangibi faktörlerin yanı
sıra kendi laboratuvar olanaklarını da göz önünde
bulundurarak seçmeleri gerekmektedir.
62. Genlerin güvenlik altına alınarak onların yapı ve
fonksiyonları üzerinde araştırmalar yapılması,
Klonlanan genlerin üzerinde mutasyonlar
yapılarak fonksiyonel bölgelerin belirlenmesi,
DNA dizi analizlerinin kolaylaştırılması,
DNA aşılarının oluşturulması ve rekombinant
63. Proteinlerin açıklatılması
gibi amaçlarla yapılmaktadır . Bir genin vektöre
yerleştirilmesi ve bu vektörün bakteri hücrelerine
transformasyonu sonucunda hücrelerin bölünmesi
sırasında vektörün de içerdiği genin birçok kopyasını
oluşturması işlemine “gen klonlaması” adı
verilmektedir
64. Gen klonlamasının temel ilkeleri.
Konakçıdan elde edilen DNA ve plazmit aynı
restriksiyon enzimleriyle kesilerek, DNA’nın
plazmite yerleştirilmesi sağlandıktan sonra
oluşan rekombinant DNA,E.coli hücrelerine
transforme edilmektedir.