1. Métodos para la siembra y
mantenimiento de virus en
laboratorio.
A diferencia de lo que sucede con la mayoría de las bacterias, hongos y protozoos, sólo
pueden multiplicarse en el interior de las células vivas, no pudiendo hacerlo en un
medio nutritivo carente de células.
Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el laboratorio son:
Animales de experimentación
Embriones animales
Cultivos celulares artificiales
Animales de experimentación:
La inoculación en animales de experimentación de muestras clínicas o de virus para su
aislamiento o propagación, es una técnica poco empleada debido a diversas dificultades
como el entrenamiento de los animales, la laboriosidad de la inoculación y el peligro de
difusión del virus con las excretas de las animales.
Se emplea únicamente cuando se trata de propagar virus cuya replicación en los otros
sistemas - embriones cultivos celulares - no es posible. Los animales más utilizados:
monos, los cobayos y los ratones lactantes.
Embriones animales
Los más utilizados son los embriones de pollo, los huevos fecundados se incuban hasta
el momento de su inoculación que suele oscilar entre 5 y 14 días. Las inoculaciones, que
pueden realizarse en diversas zonas del embrión (cavidad amniótica, saco vitelino o
cavidad alantoidea).
Se requiere de experiencia para su realización debido al tipo de inoculación y
extracción. La inoculación en la cavidad amniótica es la más utilizada para el
aislamiento del virus a partir de muestras clínicas.
Los virus sólo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión; por
consiguiente, se deben inyectar en la región apropiada, ej. Losmixovirus crecen bien en
la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la parotiditis prefiere la cavidad
alantoidea. La infección puede producir una lesión tisular local conocida como pústula,
cuyo aspecto, a menudo, es característico del virus.

2. El método exacto de inoculación y la edad del embrión
Que se emplea, dependen del virus problema. ej. Para aislar en forma primaria el virus
de la influenza a partir de material recogido de la garganta, suele inocularse este en la
cavidad amniótica de embriones de 7 a 8 días; pero el virus se duplica fácilmente en la
membrana alantoidea de embriones de 12 a 13 días, después de varias resiembras
(“adaptación”) en el amnios. Los focos más utilizados para la inoculación, a parte de las
cavidades amniótica y alantoidea, son la membrana corioalantoidea y el saco vitelino.
Algunas veces, puede inyectarse directamente el virus en el embrión en desarrollo,
recurriendo a la inoculación intravenosa, intraperitoneal o intracerebral. Una vez que se
duplicó el virus dentro de las células de las membranas o del embrión, puede liberarse a
los líquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una buena fuente de virus. P. ej. el
virus de la influenza, que se duplica en el sistema respiratorio del embrión y en las
células de la membrana amniótica, pasa al líquido amniótico, que luego puede recogerse
con una jeringa y aguja. En cambio, otros virus, como p.ej. los de la viruela y el herpes,
que se duplican en la membrana corioalantoidea, siguen unidos a las células en las
lesiones o “pústulas” que se forman sobre dicha membrana. Al moler y deshacer en una
solución salina isotónica las membranas, logran liberarse estos virus.
En consecuencia el crecimiento de un virus en un embrión de pollo puede provocar la
muerte del embrión (p.ej. virus de la encefalitis), producir pústulas o placas sobre la
membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, vacuna), desarrollar hemaglutininas
en los líquidos o tejidos embrionarios (p.ej. influenza) o desarrollar virus infectante
(p.ej. poliovirus tipo 2).
En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se pueden cuantificar por la técnica de
inoculación de huevos embrionados al correlacionar el número de pústulas contadas con
la dilución viral inoculada.
Actualmente el método preferido para cultivar virus de influenza aviar es la inoculación
en huevos embrionados libres de patógenos específicos (SPF) o huevos negativos a
anticuerpos específicos (SAN). El sobrenadante de los centrifugados de las muestras se
inocula en el saco alantoideo de al menos 5 huevos de 9-11 días de incubación y se
incuba a 35-37ºC durante 4-7 días. Luego los huevos con embriones muertos, cuando
esto ocurra, o los que queden al final del periodo de incubación se refrigeran a 4 ºC y el
líquido alantoideo se chequea con la prueba de hemaglutinación. Si se detecta actividad
de hemoaglutinatión hay una probabilidad alta de la presencia de virus A de influenza o
de un paramixovirus aviar. Los fluidos que den reacción negativa deben inocularse al
menos en otro lote de huevos.

3. Entre los lugares deinoculación tenemos:
Membrana Corioalantoidea: Se emplean embriones de 10 – 12 días y
La cantidad de inóculo es de 0.1 – 0.5 ml. Apropiada especialmente para el aislamiento
y cultivo de virus variolicos; virus de laringotraqueitis aviar y de la enfermedad de
Beyer(Pseudorrabia); que provocan focos o pústulas fácilmente visibles.
Cavidad Alantoidea: Se emplean embriones de 9 – 12 días y la
Cantidad de inoculo es de 0.1 – 0.2 ml. Entre los virus que desarrollan en el endodermo
alantoideo tenemos: peste, New Castle, virus de la bronquitis infecciosa, encefalitis
equina occidental y oriental Venezuela, parotiditis. Ventaja: simplicidad de la
inoculación y toma de muestra
Cavidad Amniótica
Se emplean embriones de 7 – 15 días y la cantidad de inóculo es de 0.1 – 0.2 ml. la edad
de los mismos depende fundamentalmente del tipo de virus o del estudio que se realiza.

4. Saco Vitelino
Se emplean embriones de 5 – 8 días de incubación y la cantidad de inóculo es de 0.2 – 1
ml. Vía es sumamente adecuada para el aislamiento y cultivo de los virus de
enfermedades venéreas, neumonía y rickettsias. El vitelo es empleado para la
preparación de vacunas y como antígeno para reacciones serológicas de los virus ya
mencionados.
Vía Intravenosa
La membrana corialantoidea está irrigada por vasos sanguíneos, es susceptible de
inoculación para casos especiales, virus queocasionan cambios hematológicos; por
ejemplo, virus de la Leucemia. Son empleados embriones de 10 - 15 días y la cantidad
de inóculo es de 0.02 - 0.05 ml.

5. Vía Intracerebral (embrión)
Se emplea embriones de 8 – 14 días, específicamente para virus que producen
alteraciones cerebrales: la rabia, herpes, etc; 0.01 –0.02 ml.
EFECTO CITOPÀTICO (CPE),´
Los virus invaden las células causando normalmente algún tipo de cambio visible en el
crecimiento de las células .Ejemplo efecto citopàtico (CPE), es un deterioro delas
células del cultivo de tejidos causado por el virus.´
La CPE puede tener diferentes aparienciasdependiendo de un virus particular y del tipo
decélulas en el cultivo.
Cambios morfológicos visibles en célulasinfestadas con virus.
Incluye la paralización del ARN celular y de lasíntesis de proteínas, fusión celular,
liberaciónde enzimas lisosomales, cambios en lapermeabilidad de las membranas
celulares,cambios difusos de las estructurasintracelulares, presencia de cuerpos
deinclusión virales, y aberraciones cromosómicas
EFECTOS CITOPATOGÉNICOS´
Los efectos citopatogénicos virales aportan unvalioso método para la identificación
yclasificación de los virus que producen lainfección.
MATERIALES Y MÉTODOS

6. Material de Laboratorio:
• Ovoscopio.
• Tijera Quirúrgica.
• Agua Destilada.
• Azul de Metileno.
• Agujas Hipodérmicas.
• Placas Petri amplias.
Los virus pueden propagarse en las membranas extraembrionarias o en el propio
embrión. Anatómicamente el huevo embrionado de gallina presentan en su estructura
las siguientes partes:
1.- Embrión
2.- Cavidad amniótica
2a.- Membrana amniótica
3.- Saco vitelino
4.- Albúmina
5.- Cavidad alantoidea
6.- Membrana corioalantoidea
7.- Membrana externa del huevo
8.- Cáscara
9.- Cámara de aire
Cultivos celulares
Se trata de multiplicar y mantener células in vitro. La células se obtienen de un
fragmento de un órgano u embriones de pollo, por trituración y posterior disgregación
con tripsina (enzima), lo que permite obtener células aisladas que se introducen en
frascos con medos de cultivo líquidos adecuados (botellas o placas Petri).
Las células en los frascos pueden estar en suspensión, es decir, libres en el medio de
cultivo líquido o adosadas a la pared del frasco y bañadas por el medio (las células
producen un material glicoprotéico que permite su adhesión a las superficies). En el
primer caso se trata de células en suspensión y en segundo en monocapa.

7. El medio de cultivo utilizado para los cultivos celulares es bastante complejo, e incluye
aminoácidos, vitaminas, sales, glucosa y buffer de bicarbonato. Para un mejor
crecimiento, se da la adición de una pequeña cantidad de suero sanguíneo, y también
suele añadirse varios antibióticos para impedir la contaminación bacteriana. También se
añade un indicador de pH coloreados para evidenciar esta contaminación.
Algunos cultivos celulares pueden crecer indefinidamente y constituyen las llamadas
líneas celulares permanentes, estos cultivos son más convincentes para investigación
vírica. En otros casos no ocurre un crecimiento indefinido, pero permanece vivo por
unos días, estos son los llamados cultivos primarios, que aunque también sean útiles hay
que prepararlos en cada análisis.
Acción citopática: Lesión que causan algunos virus a las células in vitro. Pueden ser
intensas y precoces, produciendo en 24 o 48 horas la muerte celular, acompañada de
lisis fácilmente observable al inspeccionar los cultivos celulares con microscopio.
El efecto citopático es muy diferente debido al tipo de virus. En otras ocasiones las
alteraciones morfológicas que se producen en las células son mínimas o tardías y muy
difíciles de detectar. En las células infectadas por determinados virus pueden observarse
cuerpos de inclusión.
Los cuerpos de inclusión pueden visualizarse, después de la tinción de las células con
hematoxilina-eosina, como masas con morfología más o menos característica y
localización nuclear o citoplasmática típica, según los virus que los originan. Están
constituidos por acúmulos del material vírico sintetizado depositados en zonas celulares
alteradas.