O documento descreve um estudo que avaliou a atividade antibacteriana do veneno da rã Rhinella jimi contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. O veneno foi extraído de quatro rãs e testado em diferentes concentrações, mas não apresentou atividade antibacteriana contra Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus ou Enterococcus faecalis. Isso sugere que o veneno pode ter um efeito protetor sobre a microbiota da pele da rã, auxiliando em sua imunidade contra patógenos.
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Artigo bioterra v15_n2_04
1. REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228
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Volume 15 - Número 2 - 2º Semestre 2015
ATIVIDADE DO VENENO DE Rhinella jimi (STEVAUX, 2002) (ANURA: BUFONIDAE)
SOBRE CEPAS MICROBIANAS
Jacqueline Ramos Machado Braga1*; Mariane Alves da Silva2; Norma Suely Evangelista-Barreto3;
Arielson dos Santos Protázio4
RESUMO
A pele dos anfíbios contém várias substâncias com uma larga variedade de propriedades
farmacológicas, que funcionam como defesa contra predadores e microrganismos patogênicos.
Estudos voltados para a avaliação do efeito de substâncias naturais, sobre o controle do crescimento
microbiano, são promissores na prospecção de novos fármacos. O presente estudo teve como objetivo
avaliar as propriedades antibacterianas do veneno de Rhinella jimi contra bactérias Gram-negativas
(Escherichia coli e Salmonella enterica) e Gram-positivas (Staphylococcus aureus e Enterococcus
faecalis). Foram extraídas amostras de veneno de quatro sapos, que foi liofilizado, diluído e estocado
a 4oC para utilização nos ensaios. A atividade antibacteriana foi avaliada através de ensaio em disco
em triplicata. Os resultados não mostraram inibição de crescimento bacteriano, tanto para bactérias
Gram-negativas, quanto para Gram-positivas, mesmo em elevadas concentrações do veneno de R.
jimi. Estes dados sugerem um provável efeito protetor do veneno de R. jimi sobre a microbiota da
epiderme do anfíbio, que remete a um possível papel destas comunidades bacterianas na imunidade
inata, podendo elas serem crucias na proteção contra patógenos, principalmente fungos. Isto sugere
uma possível nova função deste veneno para a sobrevivência desta espécie.
Palavras chave: Atividade antibacteriana, sapo cururu, toxina.
POISON ACTIVITY OF Rhinella jimi (STEVAUX, 2002) (ANURA: BUFONIDAE) ON
MICROBIAL STRAINS
ABSTRACT
The skin of amphibians contains substances with a wide variety of pharmacological properties that
act as defense against predators and pathogens. Studies aimed at evaluating the effect of natural
compounds on the control of microbial growth, are promising in the search for new drugs. The present
study aimed to evaluate the antibacterial properties of R. jimi poison against Gram-negative bacteria
(Escherichia coli and Salmonella enterica) and Gram-positive (Staphylococcus aureus and
Enterococcus faecalis). Were extracted poison samples of four frogs that were lyophilized, diluted
and stored at 4°C for use in the tests. The antibacterial activity was evaluated by disk test in duplicate.
The test results showed no activity of inhibiting bacterial growth for both, the Gram negative bacteria
and Gram positive, for even high concentrations of R. jimi poison. These data suggest a probable
protective effect of R. jimi poison on the micro biota of amphibian’s epidermis, and a possible role of
these bacterial communities in the innate immunity that may be important to protect against
pathogens, especially fungi. This suggests a possible new function of this poison to the survival of
this specie.
Keywords: Antimicrobial activity, cururu frog, toxin.
2. 28
INTRODUÇÃO
Os anfíbios são constituintes de uma
classe de animais vertebrados conhecidos por
possuírem glândulas cutâneas mucosas e
granulosas excretoras de substâncias químicas
produzidas em sua pele, que são utilizadas em
sua defesa em momentos de constante estresse ou
de perigo. Tais substâncias vêm, ao longo do
tempo, sendo estudadas com relação às suas
atividades biológicas, como o efeito anestésico,
alucinógeno e antimicrobiano (PINTO et al.,
2009).
Segundo Brand et al. (2006), a pele dos
anfíbios é um órgão de grande importância e
exerce funções fisiológicas relacionadas ao
equilíbrio de fluídos, transporte de íons,
respiração e defesa. É na pele dos anuros onde se
encontram glândulas secretoras de substâncias
químicas, em sua maioria de natureza protéica,
cuja expressão e acúmulo é uma característica
bem conservada no grupo. Existem dois tipos de
glândulas na pele dos anfíbios: as glândulas
mucosas, que secretam mucina e são
responsáveis pela manutenção da humidade
corporal e termorregulação; e as glândulas
granulosas que secretam peptídeos relacionados
à defesa do animal contra predadores e patógenos
(TOLEDO; JARED, 1995).
As substâncias extraídas da pele dos
anfíbios foram introduzidas na sociedade pelos
asiáticos, em práticas religiosas e medicinais. O
bufadienolídeo encontrado na secreção das
glândulas de sapos do gênero Bufo, também foi
isolado em plantas, e é uma das principais causas
de envenenamento e morte de gado na África. Os
bufadienolídeos como as bufogeninas e
bufotoxinas, encontradas em elevada
concentração na pele de sapos, são inibidoras da
bomba de Na+K+ATPase, o que por sua vez
explica os efeitos cardiotóxicos e arteriais
provocados em algumas espécies de mamíferos
(NOGUEIRA, 2000).
O sapo Rhinella jimi (Stevaux, 2002) está
inserido no grupo Rhinella marina (Linnaeus,
1758). O bufonídeo R. jimi popularmente
conhecido como “sapo cururu”, apresenta pele
espessa e coberta por glândulas distribuídas no
antebraço, pés, cloaca, e parte posterior da
cabeça. Esta espécie possui hábitos noturnos e
está geograficamente distribuída em toda a
região Nordeste do Brasil, tanto em lugares de
baixas altitudes, como de altitudes elevadas, não
havendo especializações entre as populações
(STEVAUX, 2002). Apesar de sua ampla
distribuição geográfica e de sua abundância na
Região Nordeste, ainda são reduzidos os estudos
realizados com substâncias biologicamente
ativas extraídas a partir da pele desses anfíbios.
Os sapos do gênero Rhinella utilizam
suas glândulas granulosas paratóides para se
defender contra predadores. Estas glândulas
secretam toxinas como a bufogenina, bufotenina,
bufotoxina e substâncias como epinefrina,
serotonina, ergosterol 5-hidroxitriptamna e o
colesterol (SONNER et al., 2008). A bufotenina
é atualmente classificada como droga. Acredita-se
que os efeitos da bufotenina são semelhantes
ao de um envenenamento leve, que inclui
alucinações brandas de curta duração. Entretanto,
a pele desses sapos contém outros compostos que
potencializam seu efeito trazendo um maior risco
para a saúde humana e animal (MARTINEZ-SILVESTRE,
2012).
Atualmente, vários estudos vêm
utilizando testes microbiológicos com o veneno
de sapo contra bactérias causadoras de certas
doenças em seres humanos, sendo estas bactérias
disponíveis no ambiente em que animais e
vetores de doenças habitam. Os estudos
realizados buscam a elaboração de drogas como
antibióticos e anticancerígenos. Entretanto,
apenas algumas espécies de anfíbios
demonstraram tal atividade antibacteriana. A
maioria dos venenos da pele de anfíbios
apresenta alguma atividade antimicrobiana
devido aos compostos presentes nos mesmos,
mas ainda são reduzidos os estudos referentes ao
veneno de R. jimi (PINTO et al., 2009).
No estudo de Tempone (2008), foram
isolados alguns bufodienolídeos do veneno de R.
jimi que mostraram atividades leishmanicida e
tripanossomatída, inibindo desidrogenases
mitocondriais parasitárias. Em estudo mais
recente, Ferreira (2013) descreveu diferenças
significativas na composição química do veneno
de R. marina e R. guttatus e demonstrou que
alguns componentes específicos apresentaram
efeitos citotóxicos contra células neoplásicas
inibindo sua proliferação, quando expostas a
estes compostos.
A bufotenina e as aminas biogênicas,
encontradas nos venenos de sapos do gênero
Rhinella e outros anfíbios, atuam tanto sobre
3. 29
bactérias Gram-positivas, quanto Gram-negativas
(FREITAS, 2003). O controle
bacteriano e a rápida resistência desenvolvida
aos fármacos existentes constituem-se numa
preocupante realidade (ROSSI; ANDREAZZI,
2005). O desenvolvimento de novos
medicamentos e a busca por novas substâncias
antibacterianas, a partir de fontes naturais, tem
sido um dos grandes interesses da indústria
farmacêutica. Por esta razão, estudos voltados
para a avaliação do efeito de substâncias naturais
sobre o controle do crescimento microbiano
tornam-se promissores. O presente estudo
buscou avaliar as propriedades antibacterianas do
veneno de R. jimi contra bactérias Gram-negativas
(Escherichia coli e Salmonella
enterica) e Gram-positivas (Staphylococcus
aureus e Enterococcus faecalis).
MATERIAL E MÉTODOS
Extração do veneno de Rhinella jimi
Quatro exemplares de sapos da espécie R.
jimi foram coletados e identificados (STEVAUX,
2002) na cidade de Cruz das Almas, Bahia. A
extração do veneno foi realizada em meio
silvestre, com posterior liberação do animal em
seu habitat natural, logo após o término da coleta.
Todo o procedimento obedeceu às regras de
experimentação e bem estar do animal. Para a
extração por compressão da região glandular, o
animal foi colocado dentro de um saco com uma
abertura, onde as glândulas paratóides foram
inseridas na perfuração e o veneno recolhido em
vidro de relógio (PINTO et al., 2009). O veneno
bruto foi mantido sob refrigeração (4ºC) até sua
utilização no intervalo de 24 horas. Para a
elaboração do extrato bruto, uma alíquota de 0,5g
de veneno foi diluído em 50ml de salina (PBS
0,9%) (FREITAS, 2003).
Ensaio de atividade antibacteriana
Foram colhidas colônias de E. coli
(ATCC 25922) e S. enterica (Gram-negativas), S.
aureus (ATCC 6538) e E. faecalis (ATCC 29212)
(Gram-positivas), suspensas em 5ml de solução
salina (0,9%) e homogeneizadas. A turbidez do
inóculo foi ajustada a 0,5 da escala de
MacFarland (1,5 x 108 UFC/ ml). Com o auxílio
de swab estéril, foi feita a inoculação dos
microrganismos em placas de petri contendo
meio Ágar Mueller-Hinton.
Foram aplicados nas placas os discos
contendo o veneno de R. jimi em duas diferentes
concentrações: solução estoque (100 g/L) e na
diluição de 1:10, os discos brancos (PBS 9%), e
discos contendo antimicrobianos comerciais
(Quadro 1). As placas inoculadas foram
incubadas a 37oC por 24 h e todos os ensaios
foram realizados em triplicata.
Quadro 1. Microrganismos utilizados no ensaio e seus
respectivos controles.
Microorganismos Controle
Negativo
(resistente)
Controle
Positivo (sensível)
Escherichia coli Tetraciclina Ampicilina
Salmonella enterica Tetraciclina Gentamicina
Staphylococus aureus Gentamicina Vancomicina
Enterococus faecalis Tetraciclina Gentamicina
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados dos testes microbiológicos
demonstraram que o veneno de R. jimi não
apresentou atividade antibacteriana sobre
colônias de S. aureus, E. coli, E. faecalis e S.
enterica. Este resultado foi confirmado através
da observação direta em placa, onde foi possível
observar a formação de halos de inibição apenas
nos controles usados com os antibióticos
comerciais (Figura 1) (Tabela 1).
4. Figura 1. Ausência de formação de halos de inibição com o veneno de Rhinella jimi (V) e no controle (PBS), e presença
de halo de inibição nos controles com antibióticos comerciais (setas). (A) Escherichia coli, (B) Salmonella enterica, (C)
Enterococus faecalis e (D) Staphylococus aureus.
Tabela 1. Tamanho (mm) dos halos de inibição de crescimento bacteriano e desvio padrão, nos testes com veneno de
30
Rhinella jimi e seus controles.
Microorganismo Veneno PBS Controle
negativo
(resistente)
Escherichia coli S/I S/I 9,7 ±1,3 (T) 18,5± 2,3 (A)
Salmonella enterica S/I S/I 26,7± 0,9 (T) 23,1±0,7 (G)
Staphylococus aureus S/I S/I 18,6±2,1(V) 19,5±1,5 (G)
Enterococus faecalis S/I S/I 9,4±1,4 (T) 21,6±2,6 (G)
*S/I:Sem Inibição
Controle positivo
(sensível)
* Antibióticos: (T) Tetracliclina, (V) Vancomicina, (A) Ampicilina e (G) Gentamicina
É crescente a atenção dada atualmente
aos agentes terapêuticos em potencial,
principalmente àqueles que são compostos de
amplo espectro de atividade antimicrobiana
sintetizados pelas glândulas granulosas e serosas
presentes na pele de anuros (FREITAS, 2003).
No entanto, nossos resultados demonstraram que
o veneno de R. jimi não apresenta tal atividade
para as cepas bacterianas testadas. Ao testar a
atividade antibacteriana do veneno de R. icterica,
Pinto (2009) encontrou apenas uma leve
atividade sobre duas das colônias testadas no
presente estudo, S. aureus e E. coli.
Nossos achados corroboram o estudo de
Brito (2009), onde avaliando a atividade
antibacteriana de estratos e frações de pele de R.
jimi para E.coli e S. aureus, concluiu que esta
espécie não produz compostos com atividade
antibacteriana para estas bactérias. De acordo
com Lauer et al. (2007), embora não sejam muito
estudadas, as comunidades bacterianas da pele
dos anfíbios possuem uma importante função
biológica, podendo estar relacionadas à proteção
da pele contra a invasão de outros
microrganismos potencialmente patogênicos.
5. 31
A produção de peptídeos antimicrobianos
provenientes das secreções de anfíbios é
considerada parte da resposta imune inata
primitiva contra microrganismos patogênicos, e
está amplamente difundida no grupo (REDDY et
al., 2004). Apesar disso, é possível que anfíbios
e a flora bacteriana que reside em sua pele
tenham desenvolvido uma relação evolutiva
altamente complexa, em que bactérias se
tornaram uma extensão do sistema imune desses
animais (WOODHAMS et al., 2007). Brito
(2009), avaliando a atividade antibacteriana de
estratos e frações de pele de R. jimi para as
bactérias E.coli e S. aureus, concluiu que esta
espécie não produz compostos com atividade
antibacteriana. Este mesmo resultado foi
encontrado em nosso estudo, onde a ineficiência
de ação antibacteriana foi estendida para as
bactérias S. entérica e E. faecalis.
Embora exista carência de estudos, é
possível que as comunidades bacterianas da pele
dos anfíbios possuam uma importante função
biológica relacionadas à proteção da pele contra
a invasão de outros microrganismos
potencialmente patogênicos (LAUER et al.,
2007). Segundo Woodhams et al. (2007), a
microbiota mutualista é uma extensão do sistema
imune dos anfíbios, neste sentido, podemos
inferir que anfíbios resistentes a determinadas
doenças podem apresentar grande diversidade de
simbiontes que diminuem as chances de
colonização da pele por patógenos.
Segundo Brito (2009), é incomum que
compostos presentes na pele de um anfíbio
possam apresentar atividade protetora contra
linhagens bacterianas, como foi observado no
presente estudo com o veneno de R. jimi, visto
que a pele desses animais tem como uma de suas
principais funções a defesa contra organismos
patogênicos, dentre eles, as bactérias. Por esta
razão, nossos resultados sugerem a existência de
um mecanismo em R. jimi onde os compostos de
sua pele atuariam na proteção da flora bacteriana
associada que, em contrapartida, protegeria o
anuro da colonização por outros microrganismos
patogênicos. Esta suposição pode ser suportada
pela análise biológica da pele dos anfíbios, que
em razão de ser úmida e sem queratina, poderia
se caracterizar como um ambiente propício à
proliferação de vários micro-organismos,
principalmente fungos. O estudo de Becker e
Harris (2010), realizado com a salamandra
Plethodon cinereus, sugere que a comunidade
bacteriana cutânea é um componente importante
da defesa inata da pele de P. cinereus para a
quitridiomicose.
Ao avaliar a atividade antifúngica de
extratos de pele de R. jimi, Santos (2010)
verificou que a presença de alcalóides, na
resposta do animal contra estes patógenos, tem
um papel muito importante na imunidade inata
deste anfíbio. O estudo indicou também, que a
pele de R. jimi possui vários compostos ativos.
Entretanto, o extrato bruto do veneno de suas
glândulas não apresentou atividade antifúngica, o
que caracteriza o veneno desta espécie como uma
mistura complexa de substâncias que juntas não
apresentam atividade antimicrobiana.
Os resultados obtidos por Sá (2005), ao
avaliar as atividades imunomoduladoras de
extratos de peles e glândulas paratóides de
anuros, mostraram que apesar dos anuros serem
uma potencial fonte de moléculas com atividade
imunomoduladora, não foi verificada modulação
da atividade de macrófagos expostos ao veneno
de R. jimi. Por outro lado, os testes realizados por
Freitas et al. (2003) demonstraram que alguns
compostos isolados do veneno de R. schnneideri
exerceram alta atividade antibacteriana para E.
coli, B. subtilis, P. aerogenosa, S.aureus, E.
aerogenes, K. pneumonae. Isso nos revela que
apesar do veneno de R. jimi não ter demonstrado
atividade antibacteriana, o mesmo não ocorre
com outras espécies do mesmo gênero.
Em nossos resultados, a falta de atividade
antibacteriana do extrato bruto do veneno de R.
jimi sugere que a microbiota da epiderme deste
anfíbio pode possuir um papel na resposta imune
inata, pois a manutenção dessas comunidades
bacterianas pode ser importante na proteção
contra ataques de patógenos, principalmente
fungos. Compostos isolados das glândulas
paratóides e da pele de anfíbios podem apresentar
atividades contra vários microrganismos,
podendo ser utilizados como agentes terapêuticos
e farmacológicos. O presente estudo pode servir
de base para investigações futuras de
bioprospecção de compostos isolados com
propriedades farmacologicamente ativas
extraídas do veneno de sapos do gênero Rhinella.
6. 32
CONCLUSÃO
O presente estudo forneceu evidências de
que o veneno do sapo Rhinella jimi não
apresentou atividade antibacteriana sobre
colônias de bactérias Gram-positivas (S. aureus e
E. faecalis) e Gram-negativas (E. coli e S.
enterica). Partindo-se do pressuposto que a
microbiota da epiderme de R. jimi possa estar
relacionada à imunidade inata deste animal, é
possível que a manutenção destas comunidades
bacterianas protejam estes anuros do ataque de
patógenos, o que aponta para estudos futuros
desta microbiota e dos componentes do veneno
com evidentes propriedades protetoras para o
animal.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos à MSc Irana Paim (UFRB)
pelo auxílio no desenvolvimento dos ensaios
microbiológicos e ao Dr. Alexandre Moraes
Pinheiro (UFRB) pela contribuição no
processamento das amostras de veneno.
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