technologie chowu i hodowli pstrąga tęczowego

1. TESTOWANIE TECHNOLOGII PRODUKCJI
PSTRĄGA STOSOWANYCH W POLSCE
W ŚWIETLE ROZPORZĄDZENIA KOMISJI (WE)
NR 710/2009 – ŚRODOWISKOWA
I PROZDROWOTNA OPTYMALIZACJA
PRODUKCJI
01. 03. 2014 r. – Darłowo

2. TECHNOLOGIE CHOWU I HODOWLI
PSTRĄGA TĘCZOWEGO
A KSZTAŁTOWANIE SIĘ
MECHANIZMÓW ODPORNOŚCI
Elżbieta Terech-Majewska
Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie

3. Czynniki biologiczne
 Wirusy, bakterie, grzyby, pasożyty
 Zagrożenie jest skorelowane:
głównie ze zmianami w środowisku,
brakiem kontroli,
brakiem higieny
 w warunkach hodowlanych
ułatwionym kontaktem ryb i możliwością
bezpośredniego przenoszenia tych czynników

4. Zakres badań
 Badania kliniczne i anatomopatologiczne
 bakteriologiczne i wirusologiczne
 immunologiczne i biochemiczne
 Każdorazowo zastosowano premedykację
przed rozpoczęciem badań
 zanurzenie w roztworze Propiscinu (IRS)
w stężeniu 1 ml preparatu/litr wody

5.  We wszystkich gospodarstwach o systemie OOH i RAS
izolowano głównie saprofityczną,
warunkowo chorobotwórczą florę bakteryjną,
 Aeromonas sp. i Pseudomonas sp., występującą w wodach
otwartych, na powłokach zewnętrznych ryb hodowlanych
i wolnożyjących.
 W gospodarstwie 3-OOH u ryb S i D oraz 2-RAS u ryb S
i D stwierdzono na wiosnę 2012 r. obecność bakterii
Aeromonas salmonicida, które są czynnikiem etiologicznym
furunkulozy u ryb łososiowatych.
 Ogółem izolowano 16 rodzajów czynników bakteryjnych
 częstotliwość izolowania była zróżnicowana w zależności
od rodzajów gospodarstw.
 W próbkach z gospodarstw w systemach RAS
nie stwierdzono Vibrio fluvialis, natomiast w OOH
nie stwierdzono Pasteurella pneumotropica.
WYNIKI

8.  W Polsce największe znaczenie w patologii ryb
hodowlanych mają mezolfilne, ruchliwe bakterie
Aeromonas sp. (grupa fenotypowa Aer. hydrophila complex,
Aer. sobria complex), psychrofilne Aer. salmonicida,
różne gatunki Pseudomonas sp. i Flavobacterium sp.,
Shewanella putrefaciens, Yersinia ruckeri
 W ostatnich latach notowane są przypadki zakażeń
Acinetobacter sp., Citrobacter freundi, Hafnia alvei,
Mycobacterium sp., Lactococcus sp., Pseudomonas
chlororaphis, Streptococcus sp.

10. Badania wirusologiczne
 Prowadzono w kierunku VHS, IHN, IPN i Herpes
SAlHV-2.
 Materiał do badań stanowiły wycinki
skrzeli, nerki, śledziony, wątroby oraz mózgu, które
pobierano jałowo do pojemników transportowych i
przetrzymywano
w stanie zamrożenia (-20 C).
 Izolację wirusów prowadzono metodami biologicznymi,
a identyfikację (materiału genetycznego) wirusów
wykonywano metodami molekularnymi PCR
i Nested-PCR wg procedur stosowanych w ZPiIR IRS
i zalecanych przez laboratoria referencyjne.

11.  Dla oceny sprawności układu immunologicznego
wybrano te wskaźniki, które umożliwiają
ocenę naturalnych procesów, istotnych
dla obrony przed szkodliwymi
czynnikami środowiska

12. Ocena poziomu
nieswoistej odporności humoralnej
 aktywność lizozymu w surowicy z użyciem bakterii
Micrococcus lysodeikticus
 poziom białka całkowitego w surowicy metodą
biuretową przy zastosowaniu zestawu Diagnostic
Kits – Protein Total Reagents (Sigma)
 poziom gamma-globulin z użyciem
metody biuretowej (zestaw Diagnostic Kits
– Protein Total Reagents - Sigma)
oraz glikolu polietylenowego 10000 (Sigma)
 poziom ceruloplazminy
 białek ostrej fazy
 kortyzolu
 laktoferyny

13. Oceny poziomu
nieswoistej odporności komórkowej
 RBA (Respiratory Burst Activity) – zdolność do
wewnątrzkomórkowego wybuchu tlenowego, izolowanych z krwi oraz
ze śledziony leukocytów, zawieszanych w gradiencie Gradisol G
(Polfa), oznaczono za pomocą metody spektrofotometrycznej po
stymulacji komórek PMA (Phorbol Myristate Acetate),
 PKA (Potential Killing Activity) – aktywność bójcza fagocytów krwi
oraz makrofagów izolowanych ze śledziony zawieszanych w
gradiencie Gradisol G (Polfa), oznaczano przy użyciu metody
spektrofotometrycznej, po stymulacji komórek bakteriami Aeromonas
hydrophila,
 LyP - odpowiedź proliferacyjna limfocytów T (LyTP)
stymulowanych konkanawaliną A (ConA, Sigma) oraz limfocytów B
(LyBP) stymulowanych lipopolisacharydem (LPS) przy użyciu metody
MTT, limfocyty krwi oraz ze śledziony izolowano po wirowaniu
komórek w gradiencie Gradisol L (Polfa).

14. Na odporność nieswoistą wpływa
 temperatura- wzrastająca wpływa na wzrost
poziomu lizozymu w surowicy, koncentrację
IgM, a także ekspresję molekuł i cytokin;
 długość dnia świetlnego i pora roku - wzrost
poziomu lizozymu i IgM w surowicy (wiosna);
 stres- czynniki stresogenne,
t.j. zanieczyszczenie środowiska,
stopień natlenienia wody,
nadmierne zagęszczenie ryb, transport,
a nawet obsługa.

15.  Najwyższy potencjał odporności komórkowej
 i humoralnej stwierdzono w gospodarstwie
 1-OOH we wszystkich okresach badawczych
zarówno w 2011 r. jak i 2012 r.

16. 0
10
20
30
40
50
60
70
11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.2012
Lizozymmg/l
Terminy pobrań
Aktywność lizozymu w różnych pobraniach u ryb z Gr S
i Gr D w gosp. OOH 1
Gr S Gr D
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.2012
Poziom
ceruloplazminy(IU)
Terminy pobrań
Aktywnosć ceruloplazminy w różnych pobraniach próbek
u ryb z Gr S i Gr D w gosp. OOH 1
Gr S Gr D

17. 3-OOH i 3-RAS
 Statystycznie istotne obniżenie aktywności
komórkowych mechanizmów obronnych
 u ryb D i S w dwóch gospodarstwach
 3-OOH i 3-RAS, gdzie stwierdzono w 2011 r.
w dwóch okresach badawczych obecność
wirusa IPN

19. IPN
 ma silne działanie obniżające aktywność
fagocytów krwi i makrofagów
oraz limfocytów T i B,
czego wynikiem jest
obserwowane obniżenie aktywności lizozymu.

20. 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.2012
Lizozymmg/l
Terminy pobrań
Aktywność lizozymu w różnych pobraniach od
ryb w Gr S i Gr D z gosp. OOH 3
Gr S
Gr D
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.2012
Lizozymmg/l
Terminy pobrań
Aktywność lizozymu w róznych pobraniach od
ryb z Gr S i Gr D w gosp. RAS 3
GR S
GR D

21. 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.2012
POziom
ceruloplazminy(IU)
Terminy pobrań
Aktywność ceruloplazminy w róznych pobraniach od ryb
z Gr S i Gr D w gosp. OOH 3
Gr S Gr D
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.2012
Ceruloplazmina(IU)
Terminy pobrań
Aktywnośc ceruloplazminy w różnych pobraniach od ryb
z Gr S i Gr D w gosp. RAS 3
Gr S Gr D

22.  W okresie wiosennym 2011 roku statystycznie
istotny wzrost aktywności
ceruloplazminy, białka ostrej fazy, co
jednoznacznie wskazuje
 na aktywację hepatocytów związaną z infekcją
wirusową
 Poziom białka całkowitego oraz Ig był zbliżony
zarówno u ryb z gospodarstw OOH jak RAS
 Jedynie obserwowano statystycznie istotny
spadek białka całkowitego w okresie badań
jesiennych u ryb z gospodarstw 3-OOH i 3-
RAS, gdzie stwierdzono obecność wirusa IPN

23.  Na podstawie uzyskanych wyników badań
nie stwierdzono istotnych różnic w parametrach
nieswoistej odporności komórkowej i humoralnej
u pstrągów tęczowych pochodzących
ze zróżnicowanych systemów chowu OOH i RAS,
 Wysoki potencjał odporności przeciwzakaźnej
nie pozwalał na pojawienie się objawów
chorobowych u badanych ryb.
 Stwierdzenie obecności wirusa IPN pozwoliło
na obiektywną ocenę jego wpływu na komórkowe
i humoralne mechanizmy obronne
w gospodarstwach o odmiennych systemach chowu.

24. Birnaviridae
Aquabirnavirus,
wirus zakaźnej martwicy trzustki
Infectious pancreatis necrosis - IPN
 izolowany jest od 33 rodzin ryb, 11 gatunków
mięczaków, 4 rodzin skorupiaków;
 powszechne jest nosicielstwo;
 pierwsza izolacja w 1960 r. w USA (1941 r.);
 Chorobę stwierdza się w USA, Kanadzie, w krajach Płn.
i Płd. Europy
(Norwegia, Szkocja, Hiszpania, Grecja, Turcja, także
Polska), w krajach Płd. Ameryki (Meksyk, Chile), a także
w Japonii.

25. Antychowicz 2008 -
badania prowadzone w PIWet-PIB w Puławach

26. Gatunki ryb wrażliwe na IPNV:
 pstrąg tęczowy
(Oncorhynchus mykiss);
 pstrąg źródlany
(Salmo fontinalis);
 pstrąg potokowy
(Salmo trutta morpha fario L.);
 łosoś bałtycki
(Salmo salar);
 troć wędrowna
(Salmo trutta m. trutta).
Inne gatunki to:
halibut, węgorz, danio * danio
pręgowane , a także małże i
skorupiaki.

27. Birnaviridae
Budowa wirionu
Birnavirusa:
 kwas nukleinowy
w formie dsRNA;
 kapsyd białkowy;
 nie posiadają
otoczki.
 Wirion ma kształt kulisty
i wykazuje symetrię
ikozaedralną, tzw. T13;
 Średnica cząsteczki wirusa
wynosi 60 nm.

29. Funkcje białek wirusowych
 Część A genomu (większa 3092 pz) - koduje 4 białka
VP2, VP3, VP4 (NS), VP5
 Część B genomu (mniejsza 2784 pz) koduje cząstkę
VP1
 VP1 jest największym białkiem
wirusa, polimeraza, nie jest związana z wirulencją.
 VP-2 jest białkiem głównego kapsydu białkowego,
to antygen grupowo swoisty. VP-2 i VP-3 są ze sobą
związane. Nie posiadają one epitopów wiążących
przeciwciała na IPNV.
 VP4 czyli NS (non structure) funkcjonuje
jako koenzym współgrający z enzymami komórki
gospodarza, co służy namnożeniu wirusa.
 VP 5 białko antyapoptotyczne.

30. Wirus jest bardzo trudny do sklasyfikowania
 genotyp nie równa się serotypowi,
 niepatogenne serotypy IPNV mogą być serologicznie
identyczne z formami patogennymi (w testach SN)
 Od 1988 r., uznaje się 3 serogrupy (A-C)
wraz ze swoimi serotypami,
 Grupa I (A) obejmuje wirusy patogenne dla ryb
(9 serotypów A1-A9)
Sp, Ab, He, Te, Can1, Can2, Can3, Jasper, VR-299, są
od siebie dość odległe serologicznie.
 Grupa II (B) tzw. TV- od Tellina virus, od mięczaka
Tellina tennis dotyczy mięczaków.
 Grupa III (C) to wszystkie wirusy IPN - podobne

31.  Udało się wydzielić 6 genogrup
i przyporządkować je pochodzeniu
geograficznemu oraz klasyfikacji serologicznej
 Stwierdza się duże zróżnicowanie i zmienność
w budowie antygenowej, zjadliwości oraz
patogenności badanych szczepów wirusa IPN
 Budowa molekularna zmienia się, genom ulega
mutacjom, co także determinuje cechy
patogenności

32. Źródła zakażenia wirusem IPN:
 Woda – główny wektor
 Ptaki wodne: wykazano, że wirus IPN może być
przenoszony na pazurach i dziobach ptaków
oraz za pośrednictwem upuszczonych przez
nie zakażonych ryb;
 Ssaki wodne, a także inne, które współprzebywają
w gospodarstwie;
 Kał ptaków (IPNV jest oporny na działanie
niskich pH);
 Zaschnięty śluz ryb, którym pokryty jest sprzęt
rybacki.

34. Źródła zakażenia wirusem IPN
 Produkty płciowe
IPNV może się znajdować na zewnątrz
lub wewnątrz komórek płciowych ,
u pstrąga tęczowego i źródlanego jest
potwierdzony mechanizm (u pstrąga tęczowego
także w nasieniu),
 Wydzieliny wyrostków pylorycznych, trzustki oraz nerki
(wydalany do środowiska),
 Wirus IPN jest uwalniany do środowiska po rozkładzie
zwłok śniętych ryb,
 IPNV przeżywa w leukocytach krwi i w nerce (ochrona
przed niszczeniem przez UI gospodarza.

35. IPNV jest stabilny i bardzo oporny na warunki
środowiskowe:
 W temp. 20 ºC może przetrwać w wodzie
maksymalnie 3 miesiące
 W temp. 10 ºC do 231 dni, (słonej także)
 Oporny na wysuszenie:
w temp. między 4 ºC a 20 ºC wysuszone i
przetrzymywane w laboratorium próbki wirusa
wykazywały właściwości zakaźne ponad 20 dni
 Szczególnie długo przeżywa w rybach,
np. w martwym pstrągu w temp. -20 ºC
zachowuje właściwości infekcyjne ponad dwa lata

36. Objawy IPN:
 korkociągowe ruchy w czasie pływania
 wytrzeszcz gałek ocznych
 obrzęk jamy brzusznej
 bladość skrzeli
 wybroczyny w trzustce
 obrzęk okolicy odbytu
 nitkowaty galaretowaty kal
 nieprawidłowe stężenie chlorków we krwi
 zmiany martwicze trzustki i jelita
 martwica wątroby (narybek słodkowodny)

38. Patogeneza
 Wirus wnika do organizmu przez układ pokarmowy,
- „lubi” kwaśne pH (pierwotne miejsce
namnażania wirusa,
 stany zapalne, od nieżytu
do krwotocznego zapalenia jelit
i martwicy.
 Wybroczyny lub rozległe przekrwienia w okolicy
odźwiernika i wyrostków pylorycznych.
 Wirus wędruje z krwią do nerki, trzustki oraz mięśni.
 Apoptoza, z wyjątkiem trzustki,
 hamując apoptozę w trzustce, wirus zyskuje czas na
namnożenie się, po namnożeniu wirusa rozwija się
wywołana apoptozą martwica narządu.

39.  Wirus może przebywać w komórkach
leukocytarnych, a szczególnie w makrofagach różnych
narządów (śledziony, nerki), które chronią go
przed mechanizmami obronnymi gospodarza.
 Często wirus IPN replikuje się w leukocytach
krążących. Jest to wtedy infekcja przetrwała.
 Taki wirus często też ma odmienne właściwości
antygenowe niż typowy IPNV. Dzieje się tak,
ponieważ tylko pewna subpopulacja leukocytów
jest zakażona wirusem i tylko tam wirus się namnaża.
 Daje to nietypowe objawy u ryb 3-4 letnich.
 Aktualnie obserwuje się tendencje do bezobjawowych
infekcji IPNV.

40.  Aktualnie wirus IPN jest diagnozowany
na zlecenie hodowcy lub lekarza
prowadzącego, nie podlega obowiązkowi
monitorowania,
a zatem urzędowego diagnozowania
realizowanych w ramach programów nadzoru.

41. Rezultat amplifikacji fragmentu genu VP2 (cDNA):
RT PCR
M − marker GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus firmy Fermentas; składa się on z 14
oczyszczonych chromatograficznie fragmentów DNA o następujących długościach (w
parach zasad): 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100;
P − kontrola pozytywna;
N − kontrola negatywna;
23-28 − numery kolejnych prób;
(1×) − stężenie cDNA użyte w przypadku pierwszej amplifikacji;
(2×) − stężenie cDNA dwukrotnie większe niż w przypadku pierwszej amplifikacji.
M P N (1 ) (2 )M P N 23 24 25 26 27 28
Produkt
długości 206
par zasad

42. U ryb wędrujących IPNV stanowi duże zagrożenie
 IPN dodatnie smolty wykazują
5x większą śmiertelność niż IPN
- ujemne smolty, po zasiedleniu
środowiska morskiego,
sną krótko po zmianie

43. Istnieje możliwość szczepień!
 US Patent 6274147 - Method for generating
nonpathogenic infectious pancreatic necrosis virus
(IPNV) from synthetic RNA transcripts
 US Patent Issued on August 14, 2001
Estimated Patent Expiration Date: March 31, 2019

44. Zwalczanie
 Usuwanie wirusa z powierzchni gamet
poprzez stosowanie środków
biobójczych, daje możliwość stosowania
profilaktyki
i bioasekuracji
 Przenoszenie wirusa wewnątrz gamet
wymusza konieczność kontroli ryb
w kierunku nosicielstwa (u tarlaków)
 Aktualnie obserwuje się tendencje
do bezobjawowych infekcji IPNV,
wirusa należy diagnozować
najefektywniejszymi metodami
 Ryby mogą być nosicielami przez całe życie

45.  Duże straty bezpośrednie, od kilku procent
do około 100% (u narybku)
 Wielkość śnięć jest uzależniona od gatunku
i wieku ryby, warunków higienicznych,
od stopnia zjadliwości patogennego szczepu
wirusa.
 Równie istotne dla efektów hodowli
jest immunosupresyjne działanie wirusa
na funkcje układu odpornościowego,
co sprzyja wtórnym infekcjom bakteryjnym.

46. Dziękuję za uwagę!