Biotecnología para hacer frente al cambio climático: la búsqueda de variedades tolerantes a sequía, frío y salinidad By José Miguel Mulet

1. Biotecnología para hacer frente
al cambio climático: la búsqueda
de variedades tolerantes a
sequía, frío y salinidad,
Barcelona 16-11-2011
José Miguel Mulet

2. ¿Que es el estrés para una planta?
• Es difícil de definir a nivel general, puesto
que lo que puede resultar estrés para una
planta para otra puede que no lo sea.
• Una definición para salir del paso de
estrés biológico sería: “factor o condición
adversa que inhibe el funcionamiento
normal de un sistema biológico (planta)”

3. ¿Por que nos estresa que las
¿Por qué nos estresa que
las plantas se estresen?
plantas se estresen?
• La población mundial es de 7.000 millones y creciendo.
• El estrés abiótico es el mayor factor limitante para la
productividad agrícola.
• El estrés abiótico produce pérdidas de cientos de
millones de euros cada año debido a bajadas de
producción o pérdida de cosechas.
• El crecimiento de la población ha acentuado los factores
de estrés existentes (básicamente metales pesados y
salinidad… quizás cambio climático).

4. Históricamente la sequía ha sido más definitivo
para el fin de una civilización que las guerras o las
epidemias
Existen más casos documentados como la civilización Maya, los indios pueblo,la
mesopotamia primitiva o la antigua camboya.

5. La sequía y la salinidad son problemas actuales tanto en países desarrollados
como en países en desarrollo
Imágenes tomadas en Tempe (Arizona, USA), que muestran el
efecto de vaias décadas de irrigación (Gentileza del Dr. Roberto
Gaxiola)

6. La Mejora Clásica se ha demostrado muy buena para el aumento de la productividad,
pero limitada en tolerancia a condiciones ambientales adversas
Trigo tradicional:
Bajo radio grano/paja
Trigo de la revolución verde:
Alto radio grano/paja
Norman Borlaug (2009)
Premio Nobel de la Paz

7. La cuestión es: ¿Qué gen elegir
para hacer plantas tolerantes?
O dicho de otra manera: ¿Por
qué no hay todavía plantas
tolerantes a estrés abiótico en el
mercado?

8. Para aplicar ingeniería genética es preciso
conocer el efecto a nivel celular… y elegir
un gen

9. Estrategias basadas en
conocimiento previo
• Genetica reversa:
– Partiendo de datos obtenidos del genoma clonar genes con una
función determinada y/o construir lineas modificando la
expresión del gen que nos interesa.
• Genómica funcional:
– Estudiar que genes se expresan o se reprimen en determinadas
condiciones de estrés y a partir de estos datos modificar la
expresión de genes de relevancia.
• Ingeniería Genética:
– Transformar una planta con un gen de otro organismo de
probada funcionalidad en determinado estrés.

10. Así es como representamos una
ruta de respuesta

11. Pero realmente se parece a esto
Pérdida de Función
Factores
negativos
Tolerancia a estrés
Cuello de botella Factores
positivos
redundancia
Unico gen que dará tolerancia por sobrexpresión

12. Un ejemplo: Optimizar la síntesis de
osmolitos para tolerancia a sequía
• La síntesis de osmolitos es una estrategia
generalizada para retener el potencial osmótico
dentro de la célula.
• El problema es que no es una respuesta
conservada, y cada organismo parece que ha
encontrado su solución particular… lo que
dificulta el diseño de estrategias…
• Las diferentes estrategias han fracasado
(incluso después de haber funcionado bien en el
laboratorio).

13. El Yield Penalty, un indeseado efecto secundario
Theor Appl Genet. 2007 Jun;115(1):35-46. Epub 2007 Apr 11.
Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions.
Xiao B, Huang Y, Tang N, Xiong L.

14. Un gen puede dar tolerancia por
sobreexpresión por:
• Mejorar la respuesta a estrés
(señalización).
• Mejorar la respuesta a estrés (defensa).
• Ser una diana molecular del estrés.
• Regular negativamente un factor negativo.
• Ser un factor negativo (la mutación daría
tolerancia).

15. ¿Por qué no cambiamos la
estrategia?
• El truco es cambiar la afirmación: “este
gen que conozco funcionará” por : ”voy a
buscar genes que funcionen, aunque no
los conozca”, ergo: hacer un screening.
• El problema es: ¿Cómo?

16. La levadura como instrumento para buscar genes
Yeast genomic fragments
+
Yeast multicopy plasmid
Overexpression libraries
Saccharomyces cerevisiae
NaCl or
LiCl Selection for salt tolerance
medium

17. Este sistema nos permitió descifrar la
homeostasis de iones en levadura
setting energization
+++ Li+, Na+
H+ Polyaminesn+
---
Aminoglycosidesn+
ADP K+
?
ATP + Pi
Trk1 ?
Acid stress Pma1 ? Plasma membrane
Hal4,5 Hal1
CN
YCK1,2
Ptk2
Osmotic stress
Ppz1.Hal3
Glucose K+ starvation
Na+ stress
metabolism
Alkaline
stress

18. Y también alguna aplicación en plantas
THE YEAST HAL1
35S::HAL1 control GENE IMPROVES
SALT TOLERANCE IN
TOMATO
(cultivar P73; Gisbert et al.,
Plant Physiol. 123 (2000) 393-
402; collaboration with the
group
of Vicente Moreno)
… and in water melon
(Ellul et al., 2003,
10 days with Theor. Appl. Genet.
150 mM NaCl 107: 462-469)
20 days with
150 mM NaCl

19. Ya que la levadura funciona muy
bien para encontrar genes de
levadura…
• …Por que no buscar genes de plantas?
• Ventajas:
• Es un proceso rápido y barato.
• En poco tiempo se puede hacer un escrutinio exhaustivo.
• Inconvenientes:
• No todos los cDNA se expresan bien en los sistemas
heterólogos (problemas con el codon usage).
• Muchas rutas no están conservadas.
• Suele salir un sesgo hacia moleculas efectoras, pocas
señalizadoras, y poquísimas proteínas de membrana.

20. La levadura como instrumento para buscar genes
Plant cDNAs
+
Yeast multicopy plasmid
with strong promoter
Overexpression libraries
Saccharomyces cerevisiae
NaCl or
LiCl Selection for salt tolerance
medium

21. Genes de halotolerancia de la planta modelo Arabidopsis thaliana encontrados por sobreexpresión en levadura
(Forment et al., 2002, Plant J. 30:511-519; collaboration with the group of Oscar Vicente )
TECHNICAL DATA
Yeast strain G19 (ena1-4::HIS3)
Library of F. Lacroute (Plant J. 1992, 2: 417-422): Arabidopsis seedlings grown in vitro
Minimal medium with 25 mM LiCl and 0.4 mM methionine
750.000 transformants tested
Name Times isolated Mechanism of action
RCY1 3 K/T-type cyclin fused to an RS-domain
typical of splicing proteins
SRL1 3 RS-domain typical of splicing proteins
AtU1A 1 U1A protein of the spliceosomal U1-snRNP

22. OVEREXPRESSION OF SRL1 CONFERS
SALT TOLERANCE TO TRANSGENIC
ARABIDOPSIS PLANTS
In vitro germination
3-weeks old plants
treated for 20 d with
200 mM NaCl
aborted siliques
normal siliques

23. Escrutinio de genes de remolacha capaces de dar tolerancia a salinidad. (Col.
Con Roc Ros, U. de Valencia)
mRNA AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
cDNA
Beta vulgaris cv. DITA
Eco RI
Xho I
Eco RI
Xho I
Eco RI
Xho I
cDNA
Yeast/E. coli plasmid
pYPGE15
S. cerevisiae
(ena1-4 nha1)

24. Genes de remolacha obtenidos en el escrutinio de tolerancia
a salinidad
Clone Number of Predicted function Motifs
times isolated
BvSATO1 6 RNA binding protein RGG and RE/D
BvSATO2 1 Homologous to BvSATO1
BvSATO3 1 RNA binding protein P-rich and Zn-finger
BvSATO4 1 RNA binding protein RBD
BvSATO5 1 RNA binding protein
BvSATO6 1 RNA binding protein RBD
BvU2AFsnRNP 3 RNA binding protein RBD and Zn-finger
BvSATO7 1 No homologies
BvCK2a 1 Protein kinase CK2
BvURA4 2 Dihydroorotase (uracil biosynthesis)
BveIF-1A 3 Translation initiation factor

25. 35S::BvSATO1 control
35 days growth with
without stress
35 days growth with
50 mM NaCl

26. PATENT TITLE: Protection against environmental toxicity through manipulation of the
processing of messenger RNA precursors
Inventors : O. Vicente-Meana, M. Roldan-Medina, R. Serrano-Salom, J. J. Forment,
M. A. Naranjo-Olivero, R. Ros Palau, R. Khanonou
Priority date: 19 April 2000
Filing date : 19 April 2001
PCT publication date: 01 November 2001
(transferred to Crop Design, now part of BASF)
AN EXAMPLE OF A PATENT TOO SPECIFIC
Because 8 years later an RNA binding protein provided drought tolerance in corn:
News release, Monsanto (St. Louis, USA) and BASF (Ludwigshafen, Germany), June 9, 2009
Monsanto, BASF scientists disclose discovery of gene conferring drought
tolerance in corn plants: bacterial cspB gene encoding an RNA binding protein
Gene provides yield stabilty
Control plants during periods of inadequate
water supply

27. Escrutinio de genes de remolacha capaces de dar tolerancia a sequía.
mRNA AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
cDNA
Beta vulgaris cv. DITA
Eco RI
Xho I
Eco RI
Xho I
Eco RI
Xho I
cDNA
Yeast/E. coli plasmid
pYPGE15
S. cerevisiae
(gpd1)

28. Resultados del escrutinio en
sequía
cDNAs identificados en 1.7 M de Sorbitol
YPD XERO1 Serine O-Acetyltransferase
XERO2 Type II Plant Haemoglobin
SD XERO3 Ascorbate Peroxidase 3
No incluidos en la patente
Incluidos en la patente

29. ¿Por que da tolerancia un gen que no está
conservado?
Homoserine Serine
Serine
Homoserine
Acetil-CoA
Acetil-CoA
[MET2] XERO1
CoA
CoA
O-acetylserine
O-acetylserine
O-acetylhomoserine
O-acetylhomoserine
S2- [MET15] S2-
Homocysteine Cysteine
Cysteine
Homocysteine
[STR4] Serine
Recientemente se ha demostrado que este gen
puede ser clave para el desarrollo de estrategias de
cystathionine
cystathionine fitorremediación
(Freeman et al… Plant Cell, 2004; BMC 2007)
[STR1/CYS3]
Cysteine
Cysteine

30. Actualmente tenemos arroz que
sobreexpresa este gen
Y hemos empezado una colaboración con
Carmina Gisbert (COMAV, Valencia) para
sobreexpresar XERO1-3 en tomate y
berengena

31. Escrutinio de genes de remolacha capaces de dar tolerancia a frío.
mRNA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
cDNA
Beta vulgaris cv. DITA Eco RI
Xho I
Eco RI
Xho I
Eco RI
Xho I
cDNA
Yeast/E. coli plasmid
pYPGE15
S. cerevisiae
(wt)

32. Resultados del escrutinio en frío
cDNAs identificados a 10 ºC
YPD CRIO1 (8) ScDID1 / AtSNF7 / CHMP4 / VPS32
CRIO2 (2) Homólogo de CRIO1
CRIO3 (4) ScDID2 / AtVPS46/CHMP1
CRIO4 (1) PDR16 / SEC14
SD CRIO5 (1) Proteína “Ring Finger”
CRIO6 (1) Proteína intrínseca de tonoplasto
SDCOLD1 (2) Cadena corta de la rubisco
SDCOLD5 (1) Proteína de unión a clorofila

33. CRIO1,2 localizan en el MVB en
células vegetales

34. Crecimiento de las plantas RD29A::CRIO2 a 10 ºC
hypocotyl length
10
7,5
5
2,5
0
wt L3 L8 L9
N. Of branches/plant
4
3
2
1
Line 9
0
wt L3 L8 L9
Line 8 Vegetative
Bolting N. Of Flowers/plant
Inflorescence
Line 3 Floral 6
4
wt 2
0
0% 25% 50% 75% 100%
wt L3 L8 L9

35. La levadura funciona bien
Pero no es una planta

36. Buscar genes de plantas en
plantas
• Ventajas:
• Trabajan “In situ”, por lo que evitas el sesgo de los
sistemas heterólogos contra las proteínas de
membrana o las proteínas reguladoras.
• Las variedades obtenidas pueden ser de utilidad
immediata.
• Desventajas:
• Sistema caro y lento. Requiere una infraestructura
complicada.

37. Primera aproximación: Colecciones de mutantes no marcadas (ganancia o
pérdida de función)
Sodium transporters
SOS1 (extrussion in roots)
HKT1 (phloem loading in shoots
and xylem retrieving in roots)
Regulators
SOS2-SOS3 (Ca-PK) Calcium signaling
SAL1 (PAP and inositol polyphosphatase) ABA signaling
ABA (ABA2, ABA3, ABI4)
Antioxidants H2O2 detoxification
Catalase
General metabolism Defects in fundamental processes
SOS4 (pyridoxal kinase) compromise adaptation to diffferent
SOS5 (arabinogalactan protein) stresses
Problemas: No identifica factores limitantes, Proyectos muy largos y caros

38. Las colecciones marcadas: Una especie de solución
para encontrar genes de tolerancia
• Activation tagging: Construcción con cuatro
copias en tandem del promotor del 35S. En
función del sitio de inserción puede ocasionar la
sobreexpresión de un gen.
• El problema es que a veces se consigue la
sobreexpresión de una copia truncada o la
sobrexpresión de un antisentido.
RB LB
T-DNA
Activador Transcripcional

39. Alejandro et al. (2007) EMBO J. 26: 3203-3215
(tesis doctoral de Santiago Alejandro; colaboración con los grupos de
Pedro L. Rodriguez y José A. Fernández)
A dominant mutation
conferring pleiotropic
tolerance to toxic cations

40. Y ahora que?
• Los genes SATO, CRIO1-5 y
XERO2 han sido introducidos
en maíz, colza, soja y algodón
y están actualmente en
evaluación en campo.
• …Quizás algún día tengamos
plantas tolerantes con genes
que encontramos en el
laboratorio de Valencia

41. ¡¡¡Gracias por la vuestra atención!!!
• Si teneis ganas de más: ( @jmmulet)
• www.losproductosnaturales.com