Nematodos entomopatogenos paola b [modo de compatibilidad]

NEMATODOS COMO AGENTES DE
CONTROL BIOLÓGICO

EDNA PAOLA BECERRA E
Ing. Agronómica

Seminario elementos de
microbiología agrícola 2008-II

CONTENIDO
Introducción
Familias
Plagas que controlan
Ubicación taxonómica de los nematodos
entomopatógenos
Ciclo de vida
Relación simbiótica (Bacterias)
Modo de acción
Formulación y comercialización
Estudio de caso

CONTENIDO
Introducción
Principales familias
Ubicación taxonómica de los nematodos
entomopatógenos
Ciclo de vida
Relación simbiótica (Bacterias)
Modo de acción
Formulación y comercialización
Estudio de caso

INTRODUCCIÓN
Los nematodos son organismos invertebrados,
multicelulares de forma alargada y cilíndrica
asemejándose a un gusano
(Nematoda, del griego nema, "hilo", eidés u oidos, "con
aspecto de").
Estos presentan cuerpo no segmentado y simetría
bilateral.


NEMATODOS
ENTOMOPATÓGENOS
Agentes de Control Biológico
Organismos que parasitan larvas de
insectos causando su muerte.

Fácil producción, adaptabilidad en
campo, buena capacidad de búsqueda
(Parada, 2001).


Familias
Tetradonematidae
Allantonematidae
Sphaeruliidae
Phaenopsitylenchidae Heterorhabditis megidis
Mermithidae

Heterorhabditidae

Steinernematidae Steinernema feltiae


Coleópteros
Chizas

Phyllophaga spp. (Coleoptera: Ancognatha scarabaeioides
Melolonthidae) (Coleoptera: Scarabaeidae)

creatures.ifas.ufl.edu/field/white_grub4.htm

Otros coleópteros de importancia económica

Premnotrypes vorax
(Coleoptera: Curculionidae)
Hypothenemus hampei
(Coleoptera: Curculionidae)


Plagas que controlan Lepidópteros

Phthorimaea operculella
(Lepidoptera: Gelechiidae)

Tecia solanivora
(Lepidoptera: Gelechiidae), Galleria mellonella
(Lepidoptera: Pyrallidae)


Otras

Cyrtomenus bergi
(Hemíptero: Cydnidae)
Chinche de la yuca


Ubicación taxonómica
Reino: Animalia
Phylum: Aschelmyntes (Nematoda)
Clase: Secernentea
Orden: Rhabditida
Familia: Heterorhabditidae y Steinernematidae
Genero :Heterorhabditis y Steinernema
Especie: spp.


Especies

Steinernema feltiae
S. scarabaei
S. carpocapsae
S. carpocapsae

Heterorhabditis
Bacteriophora
H. megidis H. bacteriophora

Ciclo de vida Ciclo de Nematodos
Huevo JI
Primera muda J2
Segunda muda
J3 (infectivo)
Tercera muda J4
Cuarta muda
adulto


JI liberan toxinas
Y fase I del El hospedante
bacterio muere y se
produce torna crema
antibióticos
Y toxinas 1 Generacion
Ingresan por
de adultos
la cutícula
hermafroditas

Juveniles infectivos Eficiente reproducción
Localizan el Y desarrollo de huevos
hospedante J1, J2, J3 y J4

2da Generación
Juveniles infectivos J3 emergen De adultos
Del cadaver del hospedante Tamaño 50% menor
Eficiente Que la 1G
Fase I del
producción
bacterio
Y desarrollo
Coloniza
de
nematodos
Seminario elementos de Huevos J1, J2, J3

RELACIÓN SIMBIÓTICA
BACTERIAS
• Photorhabdus
Heterorhabditis
luminiscens

• Xenorhabdus
bovienii Steinernema


Bacteria simbionte

Familia Enterobacteriaceae
Bacilos Gram negativos
Móviles por medio de flagelos o cilios
No se encuentran en estado libre en la naturaleza
Photorhabdus spp son bioluminiscentes y producen pigmentos
amarillos o rojos (no es común en Enterobacteriaceae)

Fijan el cadáver del hospedante en color rojo purpúreo,
anaranjado, amarillo, castaño.

Produce antibióticos
Xenorhabdus spp presenta fase I y fase II ( estacionaria). es
catalasa negativa y no reduce nitrato (no es usual en
Enterobacteriaceae)
Se encuentra en el intestino posterior de los J3.


Diferencias (Forst y Nealson, 1996)


Relacion simbiotica Fuente:
www.cost850.ch/welcome.html

BACTERIA NEMATODO
Es incapaz de vivir en el La bacteria mata al hospedante
suelo y se debe alojar en el rápidamente y crea un ambiente
intestino del juvenil conveniente para el desarrollo del
Depende del juvenil nematodo, produciendo antibióticos
infectivo para llegar al que suprimen competencia de
hemocele (cavidad microorganismos.
sanguínea) del hospedante La bacteria transforma los tejidos
Recibe protección del del hospedante en una fuente de
nematodo, el cual inhibe comida para el nematodo.
las defensas La bacteria sirve como fuente de
antibacterianas del comida para el nematodo ( Parada
hospedante. et al 2002).
La reproducción es optima cuando
esta en simbiosis con la bacteria.

Heterorhabditis bacteriophora infected waxmoth larvae. 36
hours post-infection, these larvae glow due to the symbiotic bacteria,
P. luminescens.

http://www.oardc.ohio- (a) Larva sana (crema);
state.edu/nematodes/using_insect_parasitic_n
ematodes.htm
(b) Steinernema feltiae - cafe
(c) Steinernema carpocapsae - infected
Cranberry rootworm larvae and (marron claro)
pupa (middle) infected with (d) Heterorhabditis bacteriophora -
H. bacteriophora infectado (rojo) larvae of Galleria
mellonella.

Características
de las
bacterias
simbiontes

(Forst y Nealson, 1996) Seminario elementos de

Características de las bacterias
simbiontes (Forst y Nealson, 1996)

Antibióticos: Xenorhabdinas, xenocumacinas,
Hydroxistilbenes, Indoles derivados de antibióticos.
Pigmentos: derivados de Antraquinona
Menor actividad en la fase II Seminario elementos de

Especies de bacteria y hospederos

(Forst y Nealson, 1996)


A dissected Japanese beetle larva showing later stages
of the Heterorhabditis bacteriophora nematode.
http://www.pueblo.gsa.gov/cic_text/housing/japanese-beetle/jbeetle.html

Fuente: microbiología agrícola 2008-II
http://el-atracio.blogspot.com/search/label/Cusco

Modo y mecanismo de acción
Búsqueda de su hospedero,
Producción de secreciones enzimáticas para
entrar al cuerpo a través de la boca, ano y
espiráculos del insecto hasta llegar a la
hemocele.
El nematodo obtiene el alimento de la hemolinfa
El nematodo regurgita la bacteria
El hospedero muere 48 horas posterior a la
inoculación
Los infectivos salen del cadáver a los 12-14 días
después de la infección. de
Seminario elementos

Requerimientos medioambientales

Objetivo: mantener la movilidad y viabilidad
del nematodo
Temperatura: 12-18ºC
Luz: Aplicación en la tarde para que la
radiación UV no afecte los nematodos y
aplicar con protectantes
Humedad del suelo: capacidad de campo
Textura del suelo: no compactada

Formulación Descripción Almacenamiento
Gel alginato Contenedor de 0,5 litros, 10 5 meses a temperatura
millones de nemátodos ambiente, 12 meses con
atrapados en matriz. refrigeración.
Contenedor de 4 litros, 250 3 meses a temperatura
millones de nemátodos ambiente, 6 meses con
atrapados en matriz. refrigeración.

Gel poliacrilamida 3 billones de nemátodos por 5 días a temperatura
caja (25 x 40 x 60 cm), 109 ambiente, 3 meses con
nemátodos atrapados en 2 refrigeración.
kg.

Arcilla 50 millones de nemátodos 3 meses con refrigeración.
dispersos en 80 g de arcilla.

Gel soluble 250 millones de nemátodos 3 meses a temperatura
suspendidos en matriz ambiente, 6 meses con
encerrada en bolsa plástica refrigeración.
(40 x 50 cm).


Comercialización
NemaSeek - Beneficial Nematodes - H. bacteriophora
10 milliones de nematodos

NEMOPAKH
heterorhabditis bacteriophora
nematodos entomopatógenos de larvas de coleópteros.
50 millones de larvas infectivas de nematodos

B-Green
Dependiendo del envase, contiene 50 ó 500 millones de
nemátodos juveniles. Los envases de 50 y 500 millones de
nemátodos permiten respectivamente el tratamiento de una
superficie de 100 m² y 1.000 m².

PROBIONE

Guardian T - Heterorhabitis bacteriorphora
Prod. ID: 2210BT Seminario elementos de

Estudio de caso

Aislamiento de Xenorhabdus bovienii,
simbionte de Steinernema feltiae
(Rhabditida: Steinernematidae), cepa
colombiana (Triviño et al., 2006).


Aislamiento de Xenorhabdus bovienii, simbionte de
Steinernema feltiae (Rhabditida: Steinernematidae), cepa
colombiana

Objetivo
Aislamiento de X. bovienii,
simbionte de S. feltiae, cepa
colombiana como etapa
inicial para determinar la
cinética de población en
medios de cultivo.


Introducción
La bacteria presenta dos fases:
La fase I es de gran importancia en el
proceso patogénico, provee mas
nutrientes al nematodo.
La fase II se observa cuando los
nematodos abandonan el cadáver, en esta
fase pierde algunas funciones metabólicas
aun no es claro los mecanismos de
variación de fase.

Introducción
FI forman colonias redondas pequeñas,
adsorbe rojo neutral en McConkey y en NBTA
adsorbe Azul de Bromotimol y degradan
cloruro de trifeniltetrazolio
FII Las colonias son mas grandes y no
adsorben colorantes pero se tiñes de rojo al
degradarse el CTT
Es un proceso reversible identificado como
fase de variación inversa

Materiales y métodos
AISLAMIENTO:
Aislamiento a partir de hemolinfa de larvas de G. mellonella de
ultimo instar.

CARACTERIZACIÓN
Medio NBTA (agar + 0,0025% azul de bromotimol + 0,004% de
cloruro de trifeniltetrazolio)
Agar McConkey para evidenciar las dos formas de la bacteria
Criterio de selección de la bacteria asimilación de azul de
bromotinol a las 42 horas después de incubación.
Descripción de las colonias y pruebas bioquímicas


El cultivo base se inicio transfiriendo una de las colonias aisladas
a un medio liquido YS, incubando a 25ºC durante dos días, en
agitación a 200rpm.
Las bacterias Fase I y fase II fueron almacenadas en medio con
glicerol al 15%, en Eppendorf a -80 ºC.
ACTIVIDAD ANTIBIOTICA:
Se evaluó en fase I sobre Bacillus cereus, inoculando una placa
de esta con 24 horas de crecimiento en medio nutritivo
distribuyéndolo en el agar.
Se pusieron discos de papel filtro impregnados con X. bovienii de
24 horas de crecimiento en medio nutritivo.
Registro del tamaño de las zonas de inhibición a las 24 horas.


Patogenicidad:
Soluciones (10ml) buffer fosfato (50nM)
90.000.000 - 900.000 - 90.000 - 9.000 - 900 - 9
células/ml. ( 25 larvas por dosis)
Fueron inyectadas vía oral con jeringa, en el hemocele de
las larvas de últimos instares de G. mellonella.
Las larvas se dispusieron en cajas de petri y se incubaron a
21ºC en oscuridad.
Se registro la mortalidad y cambio de coloración de la
cutícula durante 24 – 72 horas.
Control: solución salina

Resultados y discusión
Aislamiento y caracterización de X. bovienii

Fase I Fase II
Descripción de la circulares convexas, Planas, traslucidas,
colonia granuladas, opacas, con margen regular y
con borde irregular mayor diámetro
Agar McConkey Coloración rojo y Blancas o amarillas
rosado
Agar NBTA Color azul-verde con Rojas- marrón sin
zona clara alrededor zona clara alrededor


No Bioquímicas Aislamiento Literatura
1 Arabinosa + -
2 Manosa + +
3 Sacarosa - - Bioquímicas complementarias
4 Melibiosa - -
1 lactosa - -
5 Ramnosa - -
6 Sorbitol - - 2 sacarosa -
7 Manitol - - 3 glucosa - +
8 Adonitol - -
4 producción de gas - -
9 Galactosa - -
10 Inositol - - 5 rojo de metilo + -
11 p-n-p-fosfato + + 6 voges Proskauer - -
12 p-n-p-a- glucosido + +
13 p-n-p-galactosido + +
7 sulfuros - -
14 Prolina nitroanilida - - 8 indol D +
15 p-n-p-bis fosfato + + 9 movilidad - +
16 p-n-p-xilosido + +
17 p-n-p-a-arabinosido + +
10 nitratos + -
18 p-n-p-fosforilcolina + + 11 gelatina -
19 p-n-p-a- glucoronido - - 12 catalasa - -
20 p-n-p-N- acetil glucosamida + + 13 oxidasa + -
21 L-glutamil p-nitroanilida + + 14 patogenicidad en larvas + +
22 Esculina + +
23 p-nitro-DL-fenilalanina - - adsorcion de azul de
24 urea + - 15 bromotinol + +
25 glicina + + colonia en Agar
26 citrato - -
27 acido malonico - -
16 McConkey Roja Marrón
28 cloruro de trifenil tetrazolio D D
29 arginina + - Seminario elementos de
30 lisina - +

Actividad antibiótica
Se presentaron zonas de inhibición de crecimiento con
áreas promedio de 0,43 cm2 de Bacillus cereus por
actividad antibiótica de X. bovienii.
El control no presento crecimiento de B. cereus .
La actividad antibiótica permite un ambiente adecuado
para el nematodo ya que infecta invasores
secundarios.


Patogenicidad
Transcurridas 24 horas se
registro un 70% de mortalidad
de larvas de G.mellonella.
Se obtuvieron cultivos puros de
X. bovienii y se observo la
rápida patogenicidad sobre el
hospedante comparadas con
otras sepas evaluadas por
otros autores.


Conclusiones Generales
Los nematodos son Agentes de Control Biológico que
pueden ser usados en MIP.
Las principales especies son Heterorabditis
bacteriophora y Steinernema spp.
El Nematodo es efectivo gracias a las bacterias
simbiontes de los géneros Xenorhabdus y
Photorhabdus.
Se ha comprobado su acción en plagas de importancia
económica.
Es eficaz gracias a que el nematodo busca a su
hospedero y la bacteria permite la entrada y muerte del
mismo.

GRACIAS


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