1. Virus de l'hépatite A et E
Virus et marqueurs diagnostiques
Vincent THIBAULT
Laboratoire de Virologie
Hôpitaux Universitaires
Pitié-Salpêtrière – Charles Foix
Paris - France
V.Thibault_janv.-13 1

2. Hépatites virales
mode de transmission préférentiel
parentéral féco-oral
B non A, non B A
1965 D 1972
Vaccin
1977
C E Vaccin
1990 1991
(Vaccin)
F, G, TTV, autres…
V.Thibault_janv.-13 2

3. V.Thibault_janv.-13 3

4. Historique VHA
 Avant J.C.: “La Jaunisse” (Ikterus / kirrhos)
 1745 : Cockayne, hépatites épidémiques
 1908 : McDonald, "notion de virus…"
 Reproduction de la maladie 1942 :
 Volontaires (Voegt, Havens), Paul 1943 ingestion feces/serum
 Entité clinique :
1995 : Vaccin
 17-18ème siècle - 1923 Blumer - 1947 McCallum (VHA "infectious"-VHB recommandations
1996 : "serum")
Transmission nosocomiale (préparation vaccinale : variole, fièvre jaune…)
 Visualisation : 1973 (Feinstone)
1999 : recommandations
 Développement de la sérologie : épidémiologie
 1979 : culture (Provost et Hilleman)
 1981... : Clonage, Séquences nucléotidiques
 1991… : Vaccination
 2006 : Déclaration obligatoire
V.Thibault_janv.-13 4

5. Virus de l'hépatite A
V.Thibault_janv.-13 5

6. Virus de l’Hépatite A
• Famille : Picornaviridae
Capside (entérovirus type 72)
• Genre : hépatovirus
• Taille 27-32 nm
27-32nm
• Non enveloppé
ARN (+)
• Structure icosaèdrique
• ARN simple brin,
Vpg • polarité positive
• lié de façon covalente à
une protéine Vpg
V.Thibault_janv.-13 6

7. P1 prot. Capside P2 P3
0 Structurales Non structurales
7478
1B 1C 1D 2A 2B 2C 3
A-B 3C (PRO) 3D (POL) AAA
Vpg 1A
2.5kDa IRES
3
Traduction 2A A-B
(eIF-4G) poly-
VP2 VP3 VP1 2B 2C 3C (PRO) 3D (POL)
protéine
VP4 2 227 AA








? Vpg
Protéase
Liaison NTP
Hélicase ARN
VP0 Polymérase
VP2 VP3 VP1 Réplication
VP4 2A
VP2 VP3 VP1 X5 – X12
VP4 Protéines de surface 2A Maturation finale
immunogénicité
V.Thibault_janv.-13 7

8. Cycle de multiplication du VHA en culture de cellules
Attachement
Libération Réplication
du génome
Espace +
de Disse -
Traduction
Synthèse +
de la polyprotéine
-
P3
Maturation
P2 Réticulum
endoplasmique
P1
Empaquetage
Canalicule
Relargage biliaire
V.Thibault_janv.-13 8

9. VHA : physiopathologie
Absence d'effet cytopathique direct :
cytolyse résultant du processus immun de
défense de l'hôte,
médiation cellulaire
médiation humorale
V.Thibault_janv.-13 12

10. Propriétés Physiques du VHA
Agents Stabilité
Chaleur
Autoclavage (121°C, 20') Inactivation
100°C Inactivation
60°C Stable 1 heure
température ambiante Stable 1 mois (selles, eaux, sols)
Plusieurs jours sur surface sèche
4 h. Sur les mains
4°C Stable plusieurs mois
Congelé Stable des mois ou années
Acide-base pH 1 : stable 5 h.
PH 3-11 : stable au moins 30'
U.V. Inactivation
Chimiques
Chlore, ozone, Inactivation
glutaraldéhyde, iode
Alcool 70° 3' : inactivation partielle
V.Thibault_janv.-13 13

11. VHA et agents physiques ou chimiques
http://www.invs.sante.fr/publications/2009/guide_hepatite_a
V.Thibault_janv.-13 14

12. Variabilité génétique
P1 prot. Capside P2 P3
0 Structurales Non structurales
7478
1B 1C 1D 2A 2B 2C 3 3C (PRO) 3D (POL) AAA
A-B
Vpg 1A
2.5kDa
 Comparaison nucléotidique
 6 Génotypes : IA,B ; II; IIIA,B ; IV-VI
Homme : génotype I (90%), (III, II)
Singes : IV, V, VI
 Sérotype unique
Nombre limité d'épitopes antigéniques VP1, VP3
Tests immunologiques
Vaccination (HM175, CR326)
 virus inactivé cultivé sur MRC-5
V.Thibault_janv.-13 15

13. Répartition mondiale des génotypes
Génotypes infectant l'homme en noir , les singes en rouge.
Souche PA21 (génotype IIIA), isolée d'un singe Panamanian Owl en vert.
Cristina J, Costa-Mattioli M. Virus Res. 2007 Aug;127(2):151-7.
V.Thibault_janv.-13 16

14. Epidemiology and Genetic
Characterization of Hepatitis
A Virus Genotype IIA
IA
IB
Diffusion du génotype IIA en IIB
France à partir d'une origine
Autochtones
Africaine
IIA
West Africa
VP1 sequences (900 nt.)
IIIB
Desbois et al. J CLIN MICROBIOLOGY, IIIA
2010, 48, 9:3306–3315
V.Thibault_janv.-13 19

15. Génotypes et sévérité de l'hépatite
Globalement, pas de consensus pour un lien direct entre le
génotype et la sévérité de l'atteinte hépatique –
Données en faveur de facteurs liés à l'hôte (TIM-HAVCR).
Hepatitis A Virus Genotype and Its Correlation With the Clinical
Outcome of Acute Hepatitis A in Korea: 2006–2008
Yun et al. J. Med. Virol. 83:2073–2081 (2011)
•n=556 (497 ARN positifs) Sept. 2006 à Août 2008
•Génotype IIIA induit des symptômes plus sévères
Comparative Analysis of Disease Severity Between Genotypes IA
and IIIA of Hepatitis A Virus
Yoon et al. J. Med. Virol. 83:1308–1314 (2011)
•n=111, comparaison de deux périodes 1998 et 1999 (IA) (n = 45) et 2009
(IIIA) (n = 66)
•IIIA plus sévère (ALAT et durée hospitalisation)
V.Thibault_janv.-13 20

16. VHA : Paramètres Biologiques
Ac anti-VHA = hépatite A ancienne ou vaccination
IgM anti-VHA = hépatite aiguë A (clinique)
protection contre réinfection
Ag foie IgG
Symptomes
Ictère
VHA Selles
IgM
VHA Sang
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24
Semaines 23
V.Thibault_janv.-13

17. IgM HAV uniquement à bon escient !
1%
11 %
82 %
Faux positifs
Roque Afonso et al. CID 2006:42 -887
 Alaska : test "réflexe" si Ig-VHA totales +  Ig M HAV
32 % de faux + (Castrodale CID 2005:41;e86)
 Vaccination : 8 à 20 % d'IgM VHA + dans les 2 à 3 semaines suivant
l'injection…
 NE RECHERCHER L'IgM anti-VHA QU'EN CAS D'HEPATITE AIGUË
V.Thibault_janv.-13 24

18.  Marqueurs biochimiques
Diagnostic  Transaminases (ALAT, ASAT)
 Bilirubine
 Phosphatase alcaline
 Facteurs de coagulation
 Sérologie +++
 IgM anti VHA : infection récente
 IgG anti VHA : infection passée ou vaccination
 IgM et IgG anti VHA
 Diagnostic direct (-) [uniquement dans le cadre d'études]
 Virémie : techniques sensibles (105 v./mL)
 Recherche de virus dans les selles, prolongée, importante
(109v./mL), épidémiologie
Salive :
IgG (ELISA)
V.Thibault_janv.-13
Génome viral (RT-PCR)
25

19. Durée de la virémie: conséquences cliniques et biologiques
6-7 5-6 2-5 Log particules/mL
Suivi de 13 patients : durée moyenne 95 jours Suivi de 27 patients
dont 2 avec rechute (1-2 mois)
High and Persistent Excretion of Hepatitis A
Duration of viremia in hepatitis A virus
Virus in Immunocompetent Patients
infection
Tjon et al.
Bower et al. Journal of Infectious Diseases
Journal of Medical Virology 78:1398–1405 (2006)
2000;182:12–7
V.Thibault_janv.-13 26

20. Quantification de la virémie ?
Limite de
quantification
Hépatite fulminante Evolution bénigne Fujiwara K et al.
50 Hépatites A dont 19 fulminantes (10 OLT) J. Med Virol. 2011 Feb;83(2):201-7.
Hépatite fulminante : Hepatitis A viral load in relation to
-virémie (p=0.03) * severity of the infection.
-bilirubine -(p=0.04) * 11 patients with fulminant hepatitis
-age (p=0.09) 10 with severe acute hepatitis
-génotype non IA (p=0.09) 70 with self-limited acute hepatitis
Rezende et al., Hepatology 38:613-618 (2003)
V.Thibault_janv.-13 27

21. Hépatite A : le vaccin
virus inactivé
 AVAXIM 160U suspension injectable seringue préremplie
 Virus de l'hépatite A souche GBM cultivée sur cellules diploïdes humaines MRC-
5 , inactivé
 HAVRIX 1 440 U Elisa/ml susp inj IM Ad en seringue
 HAVRIX 720 U Elisa/0,5 ml susp inj IM Enf/Nour en seringue
 Souche HM 175 du virus de l'hépatite A cultivée sur cellules humaines
diploïdes MRC5
 Le schéma vaccinal habituel comprend 1 dose suivie d'un rappel (1 dose) 6 à
12 mois plus tard.
 La persistance des anticorps anti-VHA après vaccination n'est
actuellement pas connue . Les données disponibles suggèrent la persistance
des anticorps anti-VHA à un niveau protecteur au moins jusqu'à 20 ans
après primo-immunisation.
Hepatitis A Vaccine versus Immune Globulin for Post-exposure Prophylaxis
Victor et al. 2007 N Engl J Med 357;17
V.Thibault_janv.-13 29

22. SRAS ?
Hépatite E ? Grippe
V.Thibault_janv.-13 31

23. Historique VHE
 Découverte dépendante de la connaissance des virus des hépatites
1955 : Inde, hépatite chez des personnes immunisées contre le
VHA, épidémie particulière. "NANBH"
 Entité clinique 1980 - similitude avec l’hépatite A :
 Inde : prévalence de l’hépatite A importante
 Epidémie : autre virus des hépatites, contamination par l’eau
 1983 : reproduction de l’hépatite non A-non B chez un volontaire
immunisé contre VHA (Balayan)
 Hépatite à J36
 J28-45, visualisation de particules virales > VHA (27-30nm)
 Reproduction de l’infection chez le singe (cynomolgus)
 Hépatite "non A - non B" à transmission entérique (ENANB)
 1990 : Reyes et al. clonage et séquençage  "VHE"
 1991 : Tam et al. VHE
 2000 : Panda et al. cDNA infectieux
V.Thibault_janv.-13 32

24. Coloured transmission electron micrograph of hepatitis E virus particles (purple)
Holmberg, Lancet Vol 376 September 11, 2010
V.Thibault_janv.-13 33

25. VHE Virus non enveloppé
Sphérique (SRV)
Famille : Hepeviridae Surface irrégulière
Genre : Hepevirus Capside 27-34 nm
Symétrie icosaédrique
ARN simple brin
hélice droite
polarité +
7,5kb
poly-A extrémité 3’
Stabilité
Au laboratoire : instable(-70 à +8°C)
Décongélation/congélation
Tractus GI : stable (pH)
V.Thibault_janv.-13 34

26. Organisation génomique
Non structurales Structurales
7 200 nt ARN polarité +
3’NC
5’ NC 28 5109 7124
Poly-A
5109
ORF3 114 AA
MeT Y Pro P X Hel RdRp 5123
ORF2 660 AA
Génotypes 1-4
Protéines
DIAGNOSTIC
immunogènes
Vaccin
Hétérogénéité génétique
 Au moins 4 groupes majeurs (<20% hétérogénéité ORF2) subdivisés
en 24 sous groupes dont homologues animaux
 Epitopes majeurs : parties C-ter de l’ORF3 et ORF2
 Protection croisée entre différentes souches : un seul sérotype
 Développement de tests sérologiques (performances équivalentes entre
les différents types ?)
 Vaccin : ORF 2 recombinante
V.Thibault_janv.-13 35

27. Similarités des souches humaines et animales
Bilic et al. Journal of General Virology
(2009), 90, 863–873
Sporadique
Epidémique
humaines aviaires
Unrooted phylogenetic tree of four avian HEV
and nine mammalian HEV isolates, based on
the complete genome region
V.Thibault_janv.-13 37

28. Evolution VHE
Anthropotropic
enzootic
536 to 1344 years ago
Purdy MA, Khudyakov YE. Evolutionary history and population
V.Thibault_janv.-13 dynamics of hepatitis e virus. PLoS One. 2010 Dec 17;5(12):e14376.38

29. Répartition des différents génotypes
Aggarwal Hepatology 2011
V.Thibault_janv.-13 39

30. Etudes des souches de l'homme et du porc en France
Bouquet et al. Emerging Infectious Diseases Vol. 17, No. 11, November 2011
V.Thibault_janv.-13 44

31. Homologie des souches de
l'homme et du porc
Bouquet et al. Emerging Infectious Diseases Vol. 17, No. 11, November 2011
V.Thibault_janv.-13 45

32. De l'homme au
lapin…
Izopet et al. Emerging Infectious Diseases Vol. 18, No. 8, August 2012
V.Thibault_janv.-13 48

33. I. Ahmad et al. / Virus Research 161 (2011) 47– 58
V.Thibault_janv.-13 50

34. Culture et Modèles animaux
• Culture
 Difficile
 Culture primaire d’hépatocytes de macaques (cynomolgus)
 Cellules PLC/PRF/5 hépatocarcinome et "A549" cellules cancer
poumon (Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007; Takahashi et al. Arch. Virol. 2012)
 Cellule embryonnaire
• Modèles animaux
 Primates : reproduction de la pathologie humaine
 Volontaires...
 VHE du porc, du poulet
 Présence d’Ac chez poulet, porc, rat, souris, mouton...
Lapin… Ma H et al. Experimental infection of rabbits with rabbit and genotypes 1
and 4 hepatitis E viruses. PLoS One. 2010 Feb 11;5(2):e9160
V.Thibault_janv.-13 51

35. Résistance thermique du VHE…
VHE dans des suspensions fécales :
Inactivation : 70°C 10' ou 95°C 1 min;
56 °C 30 min maintien de l'infectiosité
Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007
Barnaud et al. August 2012 Volume 78 Number 15 Applied and Environmental Microbiology p. 5153–5159
Colson et al. JID 2010:202
V.Thibault_janv.-13 52

36. VHE : Paramètres Biologiques
Khuroo MS, Khuroo MS.
Seroepidemiology of a second epidemic of hepatitis
E in a population that had recorded first epidemic
Titre peu élevé
30 years before and has been under surveillance
protection contre réinfection ?
since then.
Hepatol Int. 2010 Feb 3;4(2):494-9 IgG
Symptomes
Ictère
VHE Selles
IgM
VHE Sang
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 200
Jours 54
V.Thibault_janv.-13

37. Virémie et excrétion fécale
Virémie Selles
Détection du RNA-VHE chez 20 patients ayant une hépatite E aiguë
Aggarwal et al. THE LANCET • Vol 356 • September 23, 2000, p1081-1082
Chandra NS et al. Dynamics of HEV viremia, fecal shedding
and its relationship with transaminases and antibody
response in patients with sporadic acute hepatitis E.
V.Thibault_janv.-13 Virol J. 2010 Sep 6;7:213 55

38. HEV – virémie- selle
transmission
serum
salive
Concentré de plaquettes à J0
Transfusé à un homme de 64
ans traité pour Lymphome
non-Hodgkinien par GM IgG
autologue
IgM
Matsubayashi K, et al. Transfusion.
2008 Jul;48(7):1368-75.
V.Thibault_janv.-13 56

39. Immunodépression, hépatite chronique et
stratégie diagnostique
Dans le cadre d'une investigation chez un patient immuno déprimé,
La détection du génome viral (RT-PCR) sera privilégiée !
(ceci s'applique pour de nombreux diagnostics viraux - PCR)
Kamar et al. American Journal of Transplantation 2008; 8: 1744–1748
V.Thibault_janv.-13 57

40. Stratégie Diagnostique Pratique
 Hépatite aigue sans immunosuppression
1. IgM anti-VHE
 Délai d'obtention du résultat rapide
2. Recherche du génome du VHE (Sang et Selles)
 Fiabilité des tests ?
 Hépatite dans un contexte d'immunosuppression
1. Recherche du génome du VHE (Sang et Selles)
hépatite chronique, fibrose
2. Eventuellement quantification ARN-VHE avant traitement
3. Marqueurs sérologiques sans intérêt clinique
 Recherche d'anticorps (IgG) anti-VHE
 Intérêt ?
 Fiabilité des tests ?
V.Thibault_janv.-13 58

41. Influence des tests...
Séroprévalence VHE
500 don. Sang (UK)
Test Genelabs
GL : 3.6%
Test Wantai
Wantai: 16.2%
0.25 2.5
Bendall et al. 2010 J. Med. Virol. 82:799-805
Marseille : 64 transplantés (reins, foie) Rossi-Tamisier et al. 2013 J. Clin. Virol. 56:62-64
•Test Adaltis : 10.9% positifs (86% immunoblots +)
•Test Wantai : 31.3% positifs (80% immunoblots +)
Toulouse : 88 greffe de moelle Abravanel et al. 2012 J. Clin. Virol. 54:152-155
•Test Adaltis : 12.5% positifs
•Test Wantai : 36.4% positifs
Corée : 147 bilans de santé Park et al. 2012 BMC Inf. Dis. 12:142
•Test Genelabs: 14.3% positifs
•Test Wantai : 23.1% positifs
V.Thibault_janv.-13 60

42. Des données à affiner...
% d'enfants ou de donneurs de sang positifs pour les IgG anti-VHE (test Wantai)
Séroprévalence de 16.6% rapportée antérieurement...
Séroprévalence par tranche d'âge
80
52.5% (512 Don. Sg)
70
70
62.1 Facteurs de risque :
60 56
âge
50 résidence rurale
42.5
40 chasse
%
32.8
contact avec les
30
chats
20
44% (n=18) de
10 saucisses ARN-VHE +
3.7
0
2-4 18-27 28-37 38-47 48-57 58-65
n=188 n=64 n=106 n=184 n=116 n=40
Mansuy et al. 2011 Em. Inf. Dis 17;12,2309 61
V.Thibault_janv.-13

43. Performance des tests : détection du
génome viral (RT-PCR)
Panel de 24 échantillons envoyés à
% de détection positive différents laboratoire
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
titre (log) 6.2 /5.2/4.2/3.2/2.2/1.2 6.4 /5.4/4.4/3.4/2.4/1.4 5.1 /4.1/3.1/2.1/1.1 5 /4 /3 /2 /1
HRC-HE104 (3a) JRC-HE3 (3b) RKI (3f) HRC-HE15 (4c)
Baylis et al. J. Clin. Microbiol. 2011, 49(4):1234.
V.Thibault_janv.-13 62

44. En Pratique
(à adapter en fonction du lieu géographique ?)
 Hépatite aiguë
 IgM VHA et VHE
 IgM HBc – AgHBs
 Hépatite C
 Notions sérologiques pour d’autres virus (EBV, CMV, herpès)
 Immunodépression et cytolyse persistante
 RT-PCR VHE (sang et selles)
 Hépatite B – Hépatite C
 Autres causes
V.Thibault_janv.-13 63

45. Stratégie Diagnostique
Se donner les moyens de faire le diagnostic
Diagnostic Indirect Diagnostic Direct
Recherche de l'immunité antivirale Recherche du génome sur
IgM anti VHE prélèvements sang et selles
IgG anti VHE
Diagnostic IgG IgM RT-PCR
Certain +/- ++ +
Probable +/- - +
Douteux +++ - -
Immunité
+ - -
ancienne
Huang S et al. 2010 Profile of Acute Infectious Markers
in Sporadic Hepatitis E. PLoS ONE 5(10): e13560
V.Thibault_janv.-13 64

46. VHE et traitement
 Efficacité du PEG-IFN
 Efficacité de la ribavirine chez les patients
Pas de mécanisme virologique précis décrit
Haagsma EB et al Liver Transpl. 2010 Apr;16(4):474-7
Mallet V et al. Ann Intern Med. 2010 Jul 20;153(2):85-9.
Kamar N et al. Nephrol Dial Transplant. 2010 Aug;25(8):2792-5.
Kamar N et al. Gastroenterology. 2010 Nov;139(5):1612-8.
V.Thibault_janv.-13 65

47. Protéines et vaccins
Baculovirus
GlaxoSmithKline
E. coli
Hecolin;
Xiamen Innovax Biotech
S. Kamili / Virus Research 161 (2011) 93– 100
V.Thibault_janv.-13 66

48. VHE et vaccination
20 μg d'antigène rHEV (capside exprimée
dans baculovirus) dans 0.5 ml de PBS sur
0.5 mg d'hydroxyde d'aluminium.
3 injections
Moyenne géométrique du taux
d'anticorps anti-VHE
Incidence :
•Placebo : 66/896=7.37%
•Vaccin : 3/898=0.33%
Efficacité : 95,5% après 3 doses
Risque cumulé d'un premier épisode
d'hépatite E
Shrestha,et al 2007 N Engl J Med 356;9
V.Thibault_janv.-13 67

49. HEV 239 (Hecolin; Xiamen Innovax Biotech,
Xiamen, China), produced in bacterial cells :
VHE et vaccination safe and efficacious against infection with
hepatitis E virus in seronegative participants in
Incidence : a phase 2 trial
•Placebo : 15/48 663=0.031%
•Vaccin : 0/48 693
Zhu et al Lancet. 2010 Sep 11;376(9744):895-902
V.Thibault_janv.-13 68

50. Difficultés diagnostiques
http://www.invs.sante.fr/Espace-professionnels/Centres-nationaux-de-reference/Liste-et-coordonnees-des-CNR
V.Thibault_janv.-13 69