1.  Vai trò của protein cho cơ thể
 Phân tích định lượng protein
 Nhóm các phương pháp xác định Protein thô
 Nhóm các phương pháp xác định protein hòa tan
 Nhóm các phương pháp xác định phi Protein
CHƯƠNG 5:PHÂN TÍCH PROTEIN TRONG
THỰC PHẨM
CHƯƠNG 5:PHÂN TÍCH PROTEIN TRONG
THỰC PHẨM

2. TẦM QUANG TRỌNG CỦA PROTEINTẦM QUANG TRỌNG CỦA PROTEIN
 Vai trò sinh học của Protein
 Vai trò dinh dưỡng của Protein

3. VAI TRÒ SINH HỌC CỦA PROTEINVAI TRÒ SINH HỌC CỦA PROTEIN
Protein là thành phần không thể thiếu được của tất cả các cơ
thể sống. Protein là nền tản về cơ thể và chức năng của cơ
thể sinh vật. Dưới đây là một số chức năng quan trọng của
protein:
+ Xúc tác
+ Vận tải
+ Chuyển động
+ Bảo vệ
+ Truyền xung thần kinh
+ Điều hòa
+ Kiến tạo chống đỡ cơ học
+ Dự trữ dinh dưỡng

4. VAI TRÒ VÀ GIÁ TRỊ CỦA PROTID
TRONG DINH DƯỠNG
VAI TRÒ VÀ GIÁ TRỊ CỦA PROTID
TRONG DINH DƯỠNG
+ Protein là hợp phần chủ yếu quyết định toàn bộ các đặc
trưng của khẩu phần thức ăn. Khi thiếu protein trong chế độ
ăn hàng ngày sẽ dẫn đến nhiều biểu hiện xấu:
- Sức khỏe bị suy dinh dưỡng, sút cân mau, chậm lớn đối
với trẻ em
- Giảm khả năng miễn dịch, khả năng chống đở của cơ thể
đối với một số bệnh

5. - Gây ảnh hưởng xấu đến hoạt động bình thường của
nhiều cơ quan chức năng như gan, tuyến nội tiết và hệ
thần kinh
- Làm thay đổi thành phần hóa học và cấu tạo hình thái
của xương (lượng calci giảm, lượng magie tăng cao).
- Do đó mức protein cao chất lượng tốt (protein chứa
đủ các acid amin không thay thế) là cần thiết trong
khẩu phần ăn cho mọi lứa tuổi.
Protein là thành phần nguyên sinh chất của tế bào
Protein tham gia cân bằng năng lượng của cơ thể
Protein là chất kích thích ngon miệng
VAI TRÒ VÀ GIÁ TRỊ CỦA PROTID
TRONG DINH DƯỠNG
VAI TRÒ VÀ GIÁ TRỊ CỦA PROTID
TRONG DINH DƯỠNG

6. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN THÔĐỊNH LƯỢNG PROTEIN THÔ
 Phương pháp KjelDahl
 Phương pháp Dumas

7. • Nhà hóa học người Đan mạch; X Johan G.C.T. Kjeldahl
(1883).
• Mục đích: Xác định hàm lượng nitơ tổng
PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL (1883)PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL (1883)

8. Phân hủy Chưng cất Chuẩn độ
8
Quy Trình
PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL (1883)PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL (1883)

9. Các yếu tố:
+ Điều kiện vô cơ hóa mẫu
+ Thứ tự cho mẫu và hóa chất vào bình Kjeldalh
+ Thiết lập nồng độ cho NaOH
+ Thử quá trình chưng cất là hoàn toàn
+ Làm mẫu trắng để loại bỏ ảnh hưởng của môi
trường
PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL (1883)PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL (1883)

10. PHƯƠNG PHÁP DUMAS CẢI TIẾNPHƯƠNG PHÁP DUMAS CẢI TIẾN
A sample of known mass
Combustion (900 o
C)
CO2, H2O and N2
Nitrogen
Thermal conductivity detector
The nitrogen content is then measured
10

11. PHƯƠNG PHÁP DUMAS CẢI TIẾNPHƯƠNG PHÁP DUMAS CẢI TIẾN

12. + Đầu dò TCD chứa một dây
tóc được đốt ở một nhiệt độ
nhất định.
+ Trong điều kiện bình thường
có một dòng nhiệt ổn định từ
dây tóc đến detector. Tạo ra
thế ổn định.
+ Khi có một chất được rữa
giãi từ cột, thì lập tức độ dẫn
nhiệt của cột bị giảm, dây tóc
nóng lên làm điện trở thay đổi.
Detector TCD
+ Sự thay đổi điện trở này thường được cảm nhận bởi một mạch cầu
Wheatstone mà từ đó sinh ra một sự thay đổi điện áp.
+ Để xác định hàm lượng khí Nito của mẫu người ta so sánh mức độ
thay đổi điện áp của nó với sự thay đổi điện áp của mẫu thực phẩm có
chứa hàm lượng nito xác định (chất chuẩn). Từ đó tính ra hàm lượng
PHƯƠNG PHÁP DUMAS CẢI TIẾNPHƯƠNG PHÁP DUMAS CẢI TIẾN

13. 13
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
PROTEIN HÒA TAN
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
PROTEIN HÒA TAN
 Phương pháp Lowry
 Phương pháp BCA
 Phương pháp Braford
 Phương pháp phổ UV

14. Nồng độ protein được xác định, trong đó có chứa các gốc
phenol như tyrosine bằng cách cho phản ứng với hợp chất
màu phenol Folin-Ciocalteu, phản ứng kép tạo phức
đồng. Phản ứng gồm hai bước:
Cu2+
tạo phức với các liên kết peptide trong protein ở
pH kiềm.
Phức hợp protein-Cu2+
sẽ xúc tác cho phản ứng oxy
hóa các nhóm phenol có trong tyrosine hay trytophan
bằng thuốc thử Folin-phenol: (Na2MoO4 + Na2WO4 +
H3PO4 trong phenol) tạo phức hợp có màu xanh dương
Nguyên Tắc:
PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)

15. PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)

16. + Các acid mạnh và muối ammonium sulphat ảnh hưởng
lên phản ứng.
+ Phản ứng nhạy với các tạp chất màu khác
+ Thành phần acid amin ảnh hưởng đến sự phát triển màu
trong phản ứng LOWRY (để dựng đường chuẩn nên dùng
các protein có cấu trúc tương tự để có kết quả chính xác.)
+ Những biến đổi của hóa chất, nhiệt độ, và thời gian đòi
hỏi phải dựng đường chuẩn mỗi lần khi tiến hành.
+ Độ nhạy cao: cho phép xác định từ 10 - 200 µg of
protein, bước sóng hấp thụ trong khoảng : 500 - 750 nm
PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)

17. + Sự hiện hiện của 5 acid amin có tính khử (tyrosine,
tryptophan, cysteine, histidine, and asparagine) trong
chuổi peptide hay trong mạch protein sẽ làm tăng
cường độ màu của sản phẩm khử, làm cho cần bằng
chuyển dịch về phía phải.
PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)

18. Thuốc thử Lowry A
21,2 g natri cacbonat (2% w / v)
40 ml 1 N NaOH (hoặc 4,0 g NaOH; dung dịch 0,1N)
Thêm nước cất hoặc nước khử i-on vào 1 lít. Pha ngay khi dung
Thuốc thử Lowry B
0,5 g CuSO4.5H2O (0,5% V)
1 g Natritartrate (1% V)
Pha định mức 100ml
Lowry thuốc thử C (1 N Folin thuốc thử phenol)
Pha loãng 2 N Folin phenol (Sigma, Fisher, hoặc VWR) với một lượng nước tương
đương.
Chuẩn bị ngay trước khi sử dụng.
Lowry thuốc thử D (thuốc thử A và B kết hợp)
Trộn 1 thể tích thuốc thử B và 50 thể tích thuốc thử A . Chuẩn bị ngay trước khi sử
dụng.
Thuốc thử Lowry D’
Thêm 2 ml dung dịch 10% sodium dodecyl sulfate vào nước khử ion định mức 100ml.
Chuẩn bị ngay khi dùng
PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)

19. 0 1 2 3 4 M1 M2
DD chuẩn 0,1
mg/ml
0 0,5 1 1.5 2
Maul 0,5 0,5
DD thuốc thử D 1 1 1 1 1 1 1
Lắc kỹ - để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng
DD thuốc thử C 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Lắc kỹ - để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng
Nước cất khử ion 3.5 3 2.5 2 1.5 3 3
C mg/ml 0 0.01 0.02 0.03 0,04 ? ?
PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)

20. * BCA = 2,2'-Bicinchoninic Acid or 4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline.
Cu2+
bị khử bởi các liên kết peptide cho ra Cu+
. Hai phân tử
BCA sẽ tạo phức Bicinchoninic acid với Cu+
, phức màu tím,
hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 562nm
* Nguyên Tắc:
PHƯƠNG PHÁP BCA (1985)PHƯƠNG PHÁP BCA (1985)

21. + Phương pháp này có độ nhạy gấp 100 lần so với phương
pháp biure, ngưỡng phát hiện tương đối lớn từ 20- 2000
µg.
+ Các hợp chất như đường khử và amoniac có ảnh hưởng
đến quá trình
PHƯƠNG PHÁP BCA (1985)PHƯƠNG PHÁP BCA (1985)

22. PHƯƠNG PHÁP BCA (1985)PHƯƠNG PHÁP BCA (1985)

23. 0 1 2 3 4 M1 M2
DD chuẩn 0,1
mg/ml
0 0,5 1 1.5 2
Mẫu 0,5 0,5
DD thuốc thử BCA 2 2 2 2 2 2 2
Lắc Vortex
Nước cất khử ion 3 2.5 2 1.5 1 2.5 2.5
Để yên 30 phút ở nhiệt độ 370
C, làm lạnh ở nhiệt độ phòng
C mg/ml 0 0.01 0.02 0.03 0,04 ? ?
Đo độ hấp thụ ở bước sóng 562nm
PHƯƠNG PHÁP BCA (1985)PHƯƠNG PHÁP BCA (1985)

24. PHƯƠNG PHÁP BRADFORF (1976)PHƯƠNG PHÁP BRADFORF (1976)
Nguyên tắc:
Trong môi trường H+ Protein kết hợp với Coomassie
(Coomassie Brilliant Blue G - 250) tạo ra phức màu
xanh, có khả năng hấp thu bức xạ ở bước sóng 595nm.
Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch.
Từ phương trình đường chuẩn ta tính được hàm lượng
protein.

25. Chuẩn protein 2mg/ml BSA (Bovine serum albumin)
Mẫu protein
Vật liệu và cách tiến hành
Thuốc nhuộm Coomassie
+ 100mg Coomassie Brilliant blue G-250
+ 50ml etanol 95%
+ 100ml acid phosphoiric 85%
Thuốc thử được hòa tan bằng etanol sau đó
pha loãng bằng nước khử ion
PHƯƠNG PHÁP BRADFORF (1976)PHƯƠNG PHÁP BRADFORF (1976)

26. 0 1 2 3 4 5 M1 M2
DD chuẩn
1000µg/ml
0 1 2 3 4 5
Mẫu 2 2
DD
Coomassie
5 5 5 5 5 5 5 5
Nước 5 4 3 2 1 0 3 3
Thời gian lên màu là 10 phút và đo ở λ = 595nm
PHƯƠNG PHÁP BRADFORF (1976)PHƯƠNG PHÁP BRADFORF (1976)

27. • Đo phổ hấp thụ (A) cực đại ở
bước sóng 275 - 280 nm. (nhân
thơm)
• Nguyên tắc: Một số các acid amin hấp thụ ánh sáng tia cực tím
(UV): Tryptophan, tyrosine và phenylalanine .
• Nồng độ protein tối đa có thể xác
định 20-3000µg/ml.
• Không nhạy bằng các phương pháp
đo phổ hấp thụ của các hợp chất màu.
PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV
(Đo ở bước sóng 280nm)
PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV
(Đo ở bước sóng 280nm)

28. + Dung dịch 3 mg / ml dung dịch protein tiêu chuẩn BSA và protein mẫu
+ Quang phổ với đèn UV
1. Sử dụng 3 mg/ml dung dịch protein tiêu chuẩn để chuẩn bị
dãy chuẩn gồm các nồng độ 20 , 50, 100, 250 , 500 , 1000, 2000 , và
3000 µg / ml trong cùng dung môi. Mẫu Blank chỉ chứa dung môi .
2. Bật đèn tia cực tím của quang phổ kế và thiết lập ở bước sóng 280 nm.
Nên khởi động 30 phút trước khi đo .
3 . Setting mẫu blank có A = 0
4 . Đo độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn và dung dịch protein mẫu cần
đo. Nếu A, , của protein mẫu là > 2.0, pha loãng mẫu hơn nữa trong cùng
dung môi và đo lường A, , , một lần nữa .
5. Tạo một đường cong chuẩn bằng các dự liệu từ nồng độ và độ hấp thu
A của dãy chuẩn. Từ phương trình đường chuẩn tình hàm lượng protein
trong mẫu
Vật liệu và cách tiến hành

29. Nguyên tắc: dựa trên khả năng hấp thu của liên kết peptide
ở bước sóng 205nm. Phương pháp có thể xác định nồng
độ protein trong khoảng từ 10- 100µg
PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV
(Đo ở bước sóng 205nm)
PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV
(Đo ở bước sóng 205nm)
+ Dung dịch brij 35 0,01% (Sigma):
Dung dịch dùng để hòa tan hay pha loãng dịch protein.
C12H25(OCH2CH2)46OH - M: 1225

31. Bao gồm các chỉ tiêu
•Hàm lượng TVB (Total vapor base)
•Hàm lượng TMA (Trimetylamin)
•Hàm lượng tổng axid amin
PHÂN TÍCH PHI PROTEINPHÂN TÍCH PHI PROTEIN

32. Ý nghĩa: TVB là tổng hàm lượng base dể bay hơi bao gồm:
chủ yếu TMA, DMA, NH3 và một số amin mạch ngắn khác.
TVB là một trong những chỉ số dùng để xác định độ tươi
của thủy hải sản.
Nguyên tắc: Các nitơ bazơ bay hơi có trong mẫu được chiết
bằng dung dịch axit percloric. Sau khi được kiềm hóa, dịch
chiết được chưng cất bằng hơi nước và các thành phần nitơ
bazơ bay hơi được hấp thụ trong bình chứa axit. Chuẩn độ
các nitơ bazơ đã hấp thụ bằng dung dịch axit clohydric
chuẩn.
Phương pháp này áp dụng cho các mẫu có tổng hàm lượng
nitơ bazơ bay hơi từ: 5 mg/100g đến 100 mg/100 g
HÀM LƯỢNG TVB
(TCVN 9215 : 2012)
HÀM LƯỢNG TVB
(TCVN 9215 : 2012)

33. HÀM LƯỢNG TVB (TCVN 9215 : 2012)HÀM LƯỢNG TVB (TCVN 9215 : 2012)

34. Trong đó:
V1 là số ml HCl chuẩn ở mẫu thử
V0 là số ml HCl chuẩn ở mẫu trắng
a là số mg N ứng với 1ml chuẩn axit clohydric:
- Với HCl 0,01 mol/l, a = 0,14 mg/ml;
- Với HCl 0,05 mol/l, a = 0,70 mg/ml;
m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam
Vđm là thể tích sau khi định mức
tính bằng mililit (ml)
Vxđ là thể tích dịch lọc được lấy để chưng cất
Công thực tính: 100
)( 01
××
×−
=
xđ
đm
V
V
m
aVV
X
HÀM LƯỢNG TVB (TCVN 9215 : 2012)HÀM LƯỢNG TVB (TCVN 9215 : 2012)

35. HÀM LƯỢNG TMAHÀM LƯỢNG TMA
+ Sự phân cắt TMAO tạo ra TMA, trimetylamin là một
amin dễ bay hơi có mùi khó chịu, đặc trưng cho mùi thuỷ
sản ươn hỏng.
+ Nhiều công trình nghiên cứu đã quan tâm đến chỉ số
TMA và TVB trong đánh giá độ tươi của thủy sản.
+ TMA được xem là một chỉ số đánh giá độ tươi của thủy
sản. Giới hạn cho phép là nhỏ hơn 15mg/100g
Ý nghĩa

36. HÀM LƯỢNG TMAHÀM LƯỢNG TMA
Quy trình phân tích:

37. 0 1 2 3 4 M1 M­2
TMA 0,01 mg/ml 0 1 2 3 4
D ch xác đ nhị ị 3 3
H2O 4 3 2 1 0 1 1
HCHO 1 1 1 1 1 1 1
Toluen 10 10 10 10 10 10 10
K2CO3 ( 1g/1ml) 3 3 3 3 3 3 3
L c – hút 8­9 ml l p trên cho vào ng nghi m có ch a ắ ớ ố ệ ứ
0,1 gam Na2SO4
L c đ u, hút 5 ml cho vào ng nghi mắ ề ố ệ
Acid Picric 5 5 5 5 5 5 5
L c đ u đo b c song λ = 410nmắ ề ở ướ
HÀM LƯỢNG TMAHÀM LƯỢNG TMA

38. Nguyên tắc: Các axit amin tự do được chiết với dung dịch
axit clohydric loãng. Các chất đồng chiết xuất có phân tử
lượng lớn chứa nitơ được kết tủa với axit sulfosalicylic và
được loại bằng cách lọc. Dịch lọc được điều chỉnh pH tới
2,20. Axit amin được tách bằng sắc ký trao đổi ion và xác
định bằng phản ứng với ninhydrin sử sụng detector quang
đo ở bước sóng 570 nm.
HÀM LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO
TCVN 8764:2012
HÀM LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO
TCVN 8764:2012

39. HÀM LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO
TCVN 8764:2012
HÀM LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO
TCVN 8764:2012
Phản ứng xãy ra

40. Sắc ký đồ của mẫu
Sắc ký đồ chuẩn axit
amin (570 nm)
HÀM LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO
TCVN 8764:2012
HÀM LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO
TCVN 8764:2012