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Bioreactores xi 2009
- 1. Aplicaciones de la propagación masiva de plantas. Molecular Farming Dra. María Alejandra Alvarez malvarez@centromilstein.org.ar Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein CONICET- Fundación Pablo Cassará Jornada de Actualización en Propagación Masiva de Plantas y sus Aplicaciones Buenos Aires 2 de noviembre 2009
- 2. Molecular Farming • Se define como una estrategia alternativa de producir moléculas (proteínas, ácidos grasos) de aplicación terapéutica o industrial en organismos transgénicos (animales, vegetales) • Los motores primarios de este desarrollo son economía, eficiencia y seguridad. • La demanda de USA de proteínas recombinantes se expande en un 13% por año. • Mercado actual: 50 mil millones de U$. • Mercado estimado en 2010: 10 mil millones de U$.
- 3. Ventajas • Bioseguridad • Maquinara de síntesis proteica eucarionte • Producción en condiciones controladas (sistemas confinados)
- 4. Aspectos críticos • Glicosilación: no siempre debe ser idéntica, hay estrategias para resolverlo (humanización de glicoproteínas). • Tiempo: optimización del esquema de producción • DSP: igual que para cualquier otra plataforma, se resuelve si el producto no requiere purificación, usando fusión a oleosinas o con cultivos in vitro (secreción al medio). • Rendimiento: Al menos 1% de proteína total soluble para ser competitivo con otros sistemas. Optimización a distintos niveles: ingeniería genética, actividad proteolítica, etc.
- 5. Sistemas de producción • Planta a campo • Sistemas confinados (cultivos in vitro, invernáculos, piletas, hidroponia, etc.)
- 6. Cultivos in vitro • Callos • Cultivos de órganos (raíces, tallos) – Frascos agitados – Bioreactores • Suspensiones celulares – Frascos agitados – Bioreactores
- 7. Raíces transformadas •Rápido crecimiento •Estado de organización •Estabilidad de producción
- 8. Biorreactores para el cultivo de raíces Bioreactor de lecho de goteo Bioreactor de lecho de niebla con malla para inmovilizar a las raíces (nutrient mist reactor) Inóculo Salida de aire Malla de inmovilización Adición de nutrientes peristáltica Rotámetro Filtro de aire Bomba Bomba de aire Generador de niebla Aire Aire Reservorio Intensidad Condensador On Off de niebla Cámara Controlador Bomba de cultivo Tomado de:Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
- 9. Suspensiones celulares • Frascos agitados – Pequeños volúmenes – Conocimiento del sistema – Estudios para escalado
- 10. Bioreactores • Volumen 1 -3000 litros • Producción en gran escala • Modelo acorde al sistema y escala de producción
- 11. Tipos de bioreactores usados en cultivos vegetales
- 12. Consideraciones para el diseño • Crecimiento y demanda de oxígeno • Estado de agregación y propiedades reológicas • Sensibilidad a las fuerzas de corte • Formación de espuma/ pared celular
- 13. Crecimiento y demanda de oxígeno • Tiempos de duplicación altos ( 20-100hs) – BY-2: 12 hs – NT-1, Xanthi: 18-24 hs • Tasa de captación de oxígeno (OUR): 5-10 mmol- O2/l h (microorganismos: 10-90, células animales: 0.02-0.1 x 10-9) • A alta densidad celular, productividad volumétrica limitada por la transferencia de oxígeno. • Concentración de oxígeno disuelto crítica: 1.3 – 1.6 g m3, 20% saturación. • KLa en bioreactor: 10 – 50 hs -1 (microorganismos: 100-1000; células animales: 0.25-10), rango restringido. • Aireación: 0.5 – 1 vvm (neumáticos), 0.05-0.1 vvm (tanques agitados), altos niveles tóxicos.
- 14. Agregados-reología • Distribución de tamaños según la especie, inóculo, medio de cultivo, tipo de bioreactor, condiciones de cultivo, etc. • Gradiente de nutrientes y oxígeno en el interior de los agregados • Reología: varía a lo largo de la curva de crecimiento (redondeadas- elongadas).
- 15. Sensibilidad a las fuerzas de corte • Tamaño celular (largo: 100- 500 µm , diámetro: 20-50 µm) mayor a bacterias (diámetro < 1 µm), hongos (largo <100 µm, diámetro: 5- 10 µm), células animales ( diámetro: 10-100 µm) • Alto volumen de vacuolas (90% volumen total) • Pared celular rígida, no- flexible. • Alta sensibilidad durante la fase tardía de crecimiento exponencial y estacionaria temprana (elevado tamaño celular, elevado tamaño vacuolar) • Influye sobre: viabilidad, liberación al medio de compuestos intracelulares, cambios metabólicos, cambios morfológicos, patrones de agregación. • Valores de productividad menores a los de cultivos en frascos agitados
- 16. Espuma/pared celular • En la fase de crecimiento exponencial • Exacerbada durante la fase estacionaria • Las células entrampadas en la espuma tienen deficiencia de nutrientes y oxígeno: caída de la productividad • Crecimiento en pared, impeler, sensores. • Taponamiento de filtros de aire. • Estrategias posibles: menor velocidad de agitación y aireación, agregado de anti-espumas (0.01 % del V), por aeración de superficie o sin burbujeo, uso de disrruptor mecánico de espuma.
- 17. Estrategias para productos intracelulares • Aumento de la tasa de crecimiento • Aumento de la concentración de biomasa • Fase exponencial más extensa • Batch-/batch alimentado a alta densidad celular • Cultivo semi-continuo o continuo para evitar grandes agregados celulares y adhesión a superficies
- 18. Estrategias para productos extracelulares • Mayor tasa de crecimiento • Mayor concentración de biomasa • Fase exponencial más extensa • Batch, batch alimentado, perfusión en cultivos de alta densidad celular • Recuperación de producto in situ • Mayor estabilidad de proteínas por agregado de aditivos estabilizantes o inhibidores de proteasas.
- 19. Tanques agitados Agitador de paletas planas o Rushton • Pros – Flexibilidad – Altos coeficientes de transferencia de masa – Homogéneos – Aplicable a cultivos de alta densidad Agitador de paletas inclinadas – Permite trabajar en GMP • Cons – Sistema de mezclado (shear stress) – Costos – Generación de calor – Riesgos de contaminación en válvulas
- 20. Neumáticos: burbujeo • Pros – Fácil de escalar – Bajos costos – Bajos riesgos de contaminación – Sin generación decalor – Bajo shear stress • Cons – Transferencia de oxígeno pobre – Mezclado ineficiente en cultivos de alta viscosidad – Formación de espuma a alta aireación
- 21. Neumáticos: airlift • Pros – Direccionamiento del burbujeo – Buena transferencia de oxígeno – Menor shear stress, sin generación de calor – Menores tiempos de mezclado – Menores costos, sencillez de escalado, eficiente circulación de fluidos • Cons – Mezclado ineficiente en cultivos de alta viscosidad – Formación de espuma a alta aireación
- 22. Wave® • Pros – Shear stress – Transferencia de oxigeno – Costos operacionales • Cons – Escalado – Transferencia de calor – Estrategias operacionales avanzadas
- 23. De membrana • Pros – Remoción de productos extracelulares – Bajo shear stress – Bajos costos operacionales • Cons – Escalado – Oxigenación – Baja transferencia de calor – Monitoreo on- line
- 24. Algunos ejemplos comerciales Producto Sistema Compañía Vacunas aviares Suspensiones celulares de Dow AgroSciences tabaco (4-40 mg l-1) glucocerebrosidasa Suspensiones celulares de Protalix Biotherapeutics zanahoria (Fase III) paclitaxel Suspensiones celulares de Phyton Biotech Taxus IPLEX™ (macasermin Suspensiones celulares (2 Phyton Biotech+ Insmed rinfabato ) g l-1)
- 27. Eco-Pod Reactor temporario para algas. Producción de biocombustibles.
- 29. Muchas gracias por su atención malvarez@centromilstein.org.ar
Hinweis der Redaktion
- The main problem in cultivation of hairy roots in these bioreactors is limitation of oxygen mass transfer, which often results in reduced growth and metabolite production. Conventional bioreactors, which are generally used for cell suspension cultures cannot be used for hairy roots as they form root clumps which resist the percolation of oxygen
- In this regard, various modifications were attempted such as a stirred tank bioreactor in which the impellers were separated by a mesh from roots to reduce the shear; and a segmented bubble column bioreactor with multiple spargers for better aeration. In all the bioreactors studied, the conductivity decreased gradually with culture time (Fig. 5). From an initial level of 5.4 mS, the decrease was gradual and reached levels of 3.6, 3.6, 3.9, and 4mS in acoustic mist, nutrient sprinkle, bubble column, and shake flask, respectively. This decrease can be attributed to the intake of nutrients by growing hairy roots leading to a decrease in number of ions, which in turn decreases the conductivity. The conductivity decrease was correlated with an increase in biomass.
- Esta unidad de cultivo desechable fue diseñada para superar estas limitaciones dividiendo el biorreactor en dos cámaras, una cámara del medio y una cámara de células. Gracias a eso, pueden garantizarse condiciones de cultivo óptimas también como sistema estático. Una membrana semipermeable (10 kDa MWCO – peso molecular de corte) entre las cámaras permite la difusión de moléculas pequeñas de una cámara a la otra. Así se garantiza, por una parte, un suministro constante de substancias nutritivas en la cámara de células y, por otra parte, una eliminación simultánea de los metabolitos tóxicos. Las moléculas de alto peso molecular secretadas por las células proliferantes se retienen y concentran en la cámara de células. Como ambas cámaras tiene acceso separadamente, los pasos de trabajo generales como el suministro del medio y la cosecha celular pueden realizarse según las necesidades individuales. Además, por debajo de la cámara de células se encuentra una membrana permeable a gases, la que garantiza un suministro de oxígeno óptimo y un intercambio de dióxido de carbono del cultivo celular. El diseño de este bioreactor de membrana desechable permite la conservación óptima de las células bajo condiciones de cultivo similares a las “in vivo”. Con la tecnología de dos cámaras de CELLine, las limitaciones de substancias nutritivas y de oxígeno son problemas del pasado. En este biorreactor pueden alcanzarse densidades celulares dentro de la cámara de células 100 veces superiores a las que se logran con otras técnicas de cultivo estáticas convencionales.