Congreso Institucional

2. "Evaluación in vitro del secretoma de células troncales dentales
criopreservadas con potencial en Medicina Regenerativa. Fase I"
Juan Carlos Munévar Niño, Sergio Marino Viáfara,
Gloria Inés Lafaurie Villamil.
Unidad de Investigación Básica Oral
UIBO.
VICERRECTORIA DE INVESTIGACIONES
PCI 2015-8311

3. Fácil accesibilidad con un trauma
mínimo.
(Miura y col, 2003)
La presencia de inmunomodulación
quizás ocasionada por la frecuencia de
exposición al medio ambiente
inflamatorio en la cavidad oral
(Wada y col, 2009;. Ding y col, 2010a;. Yamaza
y col, 2010, 2011).
El orígenes de las MSC dental es la
cresta neural, debido a esto poseen un
potencial de multidiferenciación lo que
favorece la regeneración tisular
(Yamaza y col, 2011, Chung y col, 2009)
Altas tasas de proliferación
proporcionan células suficientes para
futuras aplicaciones regenerativas
(Gronthos y col, 2009; Miura y col, 2003)
RAZONES PARA SELECCIONAR MSC DENTALES
L. Wang, Y. Zhao, and S. Shi. Interplay between Mesenchymal stem cells and Lymphocytes: Implications for Immunotherapy and tissue regeneration.
Journal of Dental Research 2012.

4. 1. Estudios preclínicos
2. Fenotipos y números de células.
3. Métodos y costos.
4. Patógenos, componentes no celulares y riesgo de contaminación
cruzada.
5. Manipulaciones.
6. Seguimiento del paciente.
7. Normatividad & legislación
8. Entrenamiento & Acreditación.
9. Evidencia sobre la eficacia del producto celular para esta enfermedad
o lesión.
10. Seguridad del tratamiento.
Terapias basadas en células Stem
Criterios
Células Stem: Del laboratorio al paciente
International Society for Stem Cell Research. http://www.closerlookatstemcells.org/. On line Oct 10 2013.

5. A pesar de los estudios clínicos sobre los tratamientos
basados en células troncales, todavía existen serios desafíos
científicos, financieros, de legislación y bioéticos a superar.
Clinical grade adult stem cell banking. Thirumala S, Goebel WS, Woods EJ. Organogenesis. 2009 Jul;5(3):143-54.
NORMAS GUIAS CLINICASPROTOCOLOS
Procesamiento
ex vivo
Almacenamiento
ex vivo
1. Recolección
2. Procesamiento
3. Evaluación 4. Criopreservación
5. Embalaje
6. Distribución

6. En medicina regenerativa se plantea la hipótesis paracrina como
un enfoque alternativo a las células troncales.
El secretoma es el complejo de moléculas
secretadas por las células vivas o liberadas
desde la superficie celular que es codificado
por aproximadamente el 10% del genoma.
H. Skalnikova, J. Motlik, S.J. Gadher, H. Kovarova, Mapping of the secretome of primary isolates of mammalian cells, stem cells and derived cell lines, Proteomics 11 (2011) 691–708.

7. OBJETIVO GENERAL
Identificar in vitro las moléculas que
constituyen el secretoma de las
células troncales dentales humanas
postcriopreservación.

8. MATERIALES & METODOS
Estudio Experimental in vitro
Unidad muestral: Sobrenadantes obtenidos de los cultivos de MSC,
Fibroblastos, Osteoblastos y DPSCs / SCAP postcriopreservación
Analizados de manera aleatoria simple.
CRITERIOS DE INCLUSION
DPSCs criopreservadas
RESOLUCIÓN Nº008430 de 1993 del Ministerio de Salud. Investigación sin riesgo (artículo 11)
SCAP criopreservadas
5X105 Células/ T25
Consentimiento informado
Subcultivo DPSCs 1-5
Subcultivo SCAP 1-3

9. Human Cytokine 30Plex Panel. Invitrogen.
EGF, Eotaxina, FGF-básico, G-CSF, GM-CSF, HGF, IFN-α, IFN-γ, IL-1ra, IL-1β,
IL-2, IL-2r, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12(p40/p70), IL-13, IL-15, IL-
17, IP-10, MCP-1, MIG, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, TNF-α y VEGF.
1. Descongelación
2. Expansión
3. Inmunofenotipificación
citometría de flujo
4. Medios condicionados
SECRETOMA
5. Análisis LUMINEX
LX 200
6. Análisis estadístico
DPSCs /
SCAP

10. 3 5 9
6
6
Fibroblastos
C C
C C
C C
C C
C C
C C
C C
C C
Curvas calibración
Osteoblastos
1 3 7
1 4 8
2 4 8
2 5 9
DISEÑO EXPERIMENTAL
C C
7
1
3
1
7
2
1
1
1
1
5
1
8
1
0
1
4
1
8
1
1
1
5
1
9
1
2
1
6
2
0
1
2
1
6
2
0
1
3
1
7
2
1
1
0
1
4
1
9
32 DPSCs 30 SCAP
2
5
2
9
2
3
2
6
2
2
2
6
2
3
2
7
2
4
2
8
2
4
2
8
2
5
2
9
2
2
2
7
3
3
3
1
3
5
3
0
3
4
3
1
3
5
3
2
3
6
3
2
3
6
3
3
3
0
3
4
12 MSC
Por duplicado
DMEM/SFB 10%

11. PROTOCOLO LUMINEX
Equipo fluoroanalizador por principio de citometría de flujo
La tecnología xMAP® de Luminex® está basada en la combinación de tecnologías de
citometría de flujo, micro esferas, láser, procesamiento de señales digitales y química.
En primer lugar, minúsculas microesferas codificadas por colores, en 100 juegos
distintos. Cada conjunto de perlas puede recubrirse con un reactivo específico para un
bioensayo particular, permitiendo la captura y detección de analitos específicos de una
muestra. Dentro del analizador Luminex, los láseres excitan los colores internos que
identifican cada partícula de las microesferas, y también cualquier colorante reportero
capturado durante el ensayo. Se hacen muchas lecturas en cada conjunto, validando aún
más los resultados. De esta forma, la tecnología xMAP permite multiplexar hasta 100
ensayos únicos dentro de una única muestra, de forma rápida y precisa.
http://cdn.panomics.com/products/luninex-assays/technical-overview/overview
https://www.rndsystems.com/resources/technical/luminex-assay-principle

12. ANALISIS ESTADISTICO
Estadística descriptiva mediante prueba de
Kruskal-Wallis y prueba de U Mann Whitney
Se realizó comparación entre grupos.
P≤ 0.05
Se midio cuantitativamente la concentración de
cada una de las proteínas del kit Human
Cytokine 30-Plex Panel (Invitrogen):
EGF, Eotaxina, FGF-básico, G-CSF, GM-CSF, HGF, IFN-α, IFN-γ, IL-1ra, IL-1β,
IL-2, IL-2r, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12(p40/p70), IL-13, IL-15, IL-17,
IP-10, MCP-1, MIG, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, TNF-α y VEGF.

13. Unidad Formadora de Colonias
Fibroblast-like in vitro
Microscopia de Contraste de Fase
RESULTADOS

14. SCAP pasaje 1
PASAJE 1
% DE
EXPRESION
CD 105+ 96,1%
CD 90+ 99,0%
CD 73+ 100,0%
CD 45- 0%
CD 34- 0.5%
PASAJE 1
% DE
EXPRESION
CD 105+ 60,2%
CD 90+ 99,1%
CD 73+ 100,0%
CD 45- 1%
CD 34- 0.6%
DPSCs pasaje 1
INMUNOFENOTIPIFICACION
Citometría de Flujo

15. RESULTADOS
Respuesta
Inmune
Respuesta
Inmune
Proliferación Diferenciación Angiogénesis
Eotaxina RANTES EGF G-CSF VEGF
INF ⍺ IL2R FGF B GM-CSF
IL10 MIP-1β HGF
IL12 MIP-1⍺
IL13 MIG
IL15 MCP-1
IL17 IP-10
IL1β IL7
IL2 IL8
IL4 INF-Y
IL5 TNF-α
IL6

16. Comparación de secretoma entre pasajes
Dental Pulp Stem Cells
DPSCs
Stem Cells from Apical Papilla
SCAP

17. RESULTADOS
Comparación de secretoma entre SCAP y DPSCs
*
*
Los niveles de IL6 y MCP1 fueron significativos en DPSC’s p≤0,05
Los niveles de IL8 fueron significativos en SCAP p≤0,05
*
*
*
*
IL6IL6

18. Comparación de secretoma entre células troncales
dentales, fibroblastos y osteoblastos

19. Factores inmunomoduladores
*
*
IL8IL6
IL10MCP-1

20. Factores de crecimiento y diferenciación
* *
*
*
HGFVEGF
IL13
*
*
FGF-b

21. DISCUSION
P. Sarkar, S.M. Randall, D.C. Muddiman, B.M. Rao, Targeted proteomics of the secretory pathway reveals the secretome of mouse embryonic fibroblasts and human embryonic stem cells, Mol. Cell.
Proteomics 11 (2012) 1829–1839.
Se han utilizado diversas metodologías para analizar el
secretoma de las células troncales:
o Proteómica: Orgánelos involucrados en las vías secretoras de células embrionarias
(Sarkar P et al, 2012)
o Espectrometría de Masa de Exclusión: 10 a 12 veces más proteínas extracelulares
(Bendall SC, 2009)
o GeLC-MS/MS, SDS PAGE combined with Liquid Chromatography Tandem Mass
Spectrometry: Secretoma de las hBMSC en medios osteogénicos (Choi Y.A. et al 2010)
o LC-MS/MS Espectrometría de Masas y cromatografía líquida: compararon el secretoma
de hBMSCs y osteoblastos. (Kim J.M. et al 2013)
S.C. Bendall, C. Hughes, J.L. Campbell, M.H. Stewart, P. Pittock, S. Liu, E. Bonneil, P. Thibault, M. Bhatia, G.A. Lajoie, An enhanced mass spectrometry approach reveals human embryonic stem cell growth
factors in culture, Mol. Cell. Proteomics 8 (2009) 421–432.
Kim J.M, Kim J, Kim YH, Kim KT, Ryu SH, Lee TG, Suh PG, Comparative secretome analysis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells during osteogenesis, J. Cell. Physiol. 228 (2013) 216–24.
Y.A. Choi, J. Lim, K.M. Kim, B. Acharya, J.Y. Cho, Y.C. Bae, H.I. Shin, S.Y. Kim, E.K. Park, Secretome analysis of human BMSCs and identification of SMOC1 as an important ECM protein in osteoblast
differentiation, J. Proteome Res. 9 (2010). 2946–2956.
Luminex LX200™ y el kit Human Cytokine 30-Plex Panel (Invitrogen): Factores solubles
del secretoma de DSCs postcriopreservación

22. Comparación en proteínas detectadas en diferentes
estudios (Choi, Bendall, Kim, Sarkar)
Célula
Troncal
Método Resultados Autor/Año
hBMSCs GeLC-MS/MS SMOC1 regulador diferenciación
osteoblastos
Choi y col (2010)
hBMSCs LC-MS/MS
Baja regulación de proteínas implicadas
en proliferación de células troncales
durante la diferenciación hacia
osteoblastos
Kim y col (2013)
hASCs 2DE-MS
Detección de serpinas: fisiología y
patología del tejido adiposo
Zvonic y col (2007)
hASCs LC-MS/MS
IL6, IL8 y MCP1 involucradas en la
migración de monocitos
Lee y col (2010)
hMADS GeLC-MS/MS PAI-1 marcador de osteoporosis Chiellini y col (2008)
hMSCs Immunoarray
Quimiocinas aumentan la
supervivencia en un modelo de falla
hepática fulminante
Parekkadan y col
(2007)
hAMSCs ELISA
IL6, IL8 involucradas en la regeneración
tisular estimulada con TNF α
Heo et al. (2011)
S.C. Heo, E.S. Jeon, I.H. Lee, H.S. Kim, M.B. Kim, J.H. Kim, Tumor necrosis factor-alpha-activated human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells accelerate cutaneous
wound healing through paracrine mechanisms, J. Invest. Dermatol. 131 (2011) 1559–1567.

23. DISCUSION
En nuestro estudio detectamos la presencia de VEGF y de HGF en
concentraciones de pg/mL en los medios condicionados de DPSCs y SCAP
postcriopreservación.
Katagiri W, Osugi M, Kawai T, Hibi H. First-in-human study and clinical case reports of the alveolar bone regeneration with the secretome from human mesenchymal stem
cells. Head Face Med. 2016 Jan 15;12:5.
En el primer estudio clínico y reportes de caso de regeneración ósea alveolar con
secretoma de BMSCs-CM humanas se demostró VEGF, HGF, IGF1, TGFß1 en bajas
concentraciones que promovían la regeneración ósea. (Katagiri y col. 2016)
(Migración, angiogénesis y osteogénesis in vitro / in vivo)
No se informaron complicaciones sistémicas o locales a lo largo del estudio.
La evaluación radiográfica reveló la formación ósea temprana en todos los casos.
La evaluación histológica apoyó los hallazgos radiográficos.
Además, la infiltración de células inflamatorias fue escasa en todas las muestras.
Observamos un aumento en las concentraciones in vitro de citocinas IL10 e
IL13: efecto anti inflamatorio, inhiben la producción de citocinas
proinflamatorias y regulan la síntesis de interferón ϒ.

24. DISCUSION
Shi Yu y col en el 2016 mediante Marcaje de Masas en Tandem y cromatografía líquida
de alta resolución (TMT and HPLC-MS/MS analysis) detectaron quimiocinas, factores
angiogénicos, inmunomoduladores, antiapoptóticos y neuroprotectores así como
proteínas de la matriz extracelular.
Shi Yu, Yuming Zhao, Yushi Ma, Lihong Ge. Profiling the Secretome of Human Stem Cells from Dental Apical Papilla. Stem Cells and Development. 2016. Mar 15;25(6):499-508.
Nuestros resultados demuestran una mayor secreción de proteínas involucradas en la
respuesta inmune, proliferación, diferenciación y angiogénesis en los secretomas
evaluados de DPSCs y las SCAP
Del mismo modo, revelaron que las SCAP exhiben un incremento en la secreción de
quimiocinas, neurotrofinas así como de proteínas involucradas en procesos metabólicos,
de transcripción y niveles bajos de proteínas asociadas con adhesión, procesos de
desarrollo y función inmune en contraste con las BMSCs.
En contraste, las BMSCs secretan concentraciones mayores de proteínas de la matriz
extracelular y factores proangiogénicos

25. PCI 2015-8311
Diferenciación REGENERACION
TISULAR
Proliferación
AngiogénesisSECRETOMA
DPSCs/SCAP
Migración
Comunicación
Proinflamatorio
Antiinflamatorio
Respuesta
inmune
Antitumoral
⍺
IL2R
IP10
RANTES
TNF⍺
EOTAXIN
IL17
¿IL1RA?
REGENERACION
APICAL
REGENERACION
PERIODONTAL
REGENERACION
DENTINOPULPAR

26. PERSPECTIVAS DE INVESTIGACION
Fase II: Evaluar el contenido de las vesículas secretadas in vitro
(micro vesículas, exosomas, ectosomas) por las células troncales
dentales humanas de los mismos pacientes.
Fase III: Desarrollar fabricas basadas en células troncales
dentales in vitro de medios condicionados con moléculas de
interés para sintetizar secretomas en regeneración tisular
específica.
Fase IV: Diseñar y ejecutar proyectos de investigación en
regeneración tisular periodontal y/o dentinopulpar que analicen
el potencial terapéutico en modelos animales del secretoma de
las células troncales dentales

27. @munevarjuan
https://stemuelbosqueblog.wordpress.com/
#StemcellsUElBosque
@UElBosque

30. String Version 10.5 https://string-db.org/cgi/network.pl?taskId=tulgpldE0QLA

31. Factor soluble DPSCs pg/mL SCAP pg/mL
IL8 91591 275
IL6 4491 122
MCP1/CCL2 2576 941
HGF 218 307
VEGF 51 19
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
VEGF HGF IL8 IL6 MCP1/CCL2
Factores solubles en DPSCs y en SCAP
DPSCs pg/mL SCAP pg/mL
PRINCIPALES FACTORES SOLUBLES DEL SECRETOMA
DE LAS CELULAS TRONCALES DENTALES

32. 0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
IL8 IL6 MCP1/CCL2 HGF VEGF
DPSCs pg/mL
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
MCP1/CCL2 HGF IL8 IL6 VEGF
SCAP pg/mL
COMPARACION DE FACTORES SOLUBLES DEL SECRETOMA
DE LAS CELULAS TRONCALES DENTALES

33. David Bioinformatics database. https://david.ncifcrf.gov/kegg.jsp?path=xtr04510$Focal%20adhesion&termId=550072008&source=kegg

34. David Bioinformatics https://david.ncifcrf.gov/kegg.jsp?path=ssc04060$Cytokine-cytokine%20receptor%20interaction&termId=550062631&source=kegg

35. Odontogénesis
Esmalte
Periodonto
Cemento
Radicular
Hueso
Alveolar
Complejo
Dentinopulpar
Gene Expression in Tooth: http://bite-it.helsinki.fi/
Epitelio
Papila
Dental
Folículo
Dental
Receptores
Citocinas
Factores de
Transcripción
Integrina Alfa 4
Notch1
TGFBR2
Patched1
FGFR4
C-ErbB2
IL6
IL8
TNF ALFA
IL4
IL1
IL17INF ϒ
Dlx1
C-Myb
Pitx2
β Catenina
Egr1Lef1
Sox9Osr2
Factores de
crecimiento
BMP2
FGF4HGF
GDNF
PLEIOTHROPIN
SHH
NGF WNT
TGFB

36. PCI 2015-8311
Diferenciación
REGENERACION
TISULAR
Proliferación
Angiogénesis
SECRETOMA
in vitro
DPSCs
Migración
Comunicación
Proinflamatorio
Antiinflamatorio
Inmunomodulación
RESPUESTA
INMUNE
Antitumoral

37. p= 0,0217
p= 0,003 (grupos 2-7)
Se puede observa una
diferencia significativa entre
el grupo 2 (DPSCs pasaje 2) y
grupo 7 (SCAP), es decir las
DPSCs en el pasaje 2 tienen
mayor expresión de IFN-a
que las SCAP
p= 0,006
p= 0,02 (grupos 2-7)
Se puede observa una
diferencia significativa entre el
grupo 2 (DPSCs pasaje 2) y
grupo 3 (SCAP) hubo mayor
expresión de IFN-a en el grupo
3

38. DISEÑO EXPERIMENTAL