1. Građa protutijela
Prof. dr. Milan Taradi
Katedra za fiziologiju
Medicinskog fakulteta Zagreb
Biosinteza protutijela
PROTUTIJELA
2. M.
Građa i svojstva imunoglobulina (pregled)
Građa protutijela
– temeljna četverolančana jedinica (monomer)
– trodimenzijska struktura
– višejedninične molekule (polimeri)
Heterogenost protutijela
– izolacija homogenih protutijela
– antigenske determinante protutijela
– primarna struktura
Biološka svojstva imunoglobulina
– IgG
– IgA, lokani imunološki sustav
– IgM
– IgD
– IgE
3. M.
Otkriće “antitoksina”
Behring i Kitasato pronalaze prije sto godina da se otpornost na toksin
može prenijeti u normalnu jedinku infuzijom seruma iz imunizirane
jedinke. U serumu dakle tijekom imunizacije nastaju specifični
“antitoksini” tj. protutijela.
toksin tetanusa
smrtonosna doza
(LD tetanusa)
toksin tetanusa
subletalna doza
toksin difterije
smrtonosna doza
(LD difterije)
LD tetanusa
LD tetanusa
LD difterije
SERUM
4. M.
ELEKTROFOREZA SERUMA
Bjelančevine seruma se razdvajaju na albumine i α, β i γ
globuline. Protutijela su pretežno u γ -frakciji.
Katoda
Odvajanje na temelju naboja
+
Anoda
--
Serum
+
Anoda
Katoda
Albumini Globulini
β γ+ -α1 α2
5. M.
Protutijela su gamaglobulini
Nakon precipitacije imunokompleksa (ovoalbumina i protutijela
protiv njega) u elektroforetskom profilu značajno nedostaje γ frakcija
globulina. Protutijela jesu gamaglobulini, ali svi gamaglobulini nisu
protutijela, niti su sva protutijela gamaglobulini. Bolje ih je zvati
imunoglobulini.
Albumini
α1 α2 β
γ
+ -
Koncentracijabjelančevina
Globulini
precipitat
ovoalbumin protutijela
6. M.
Elferogrami različitih seruma
Frakcija γ globulina u
normalnom serumu je relativno
široka (heterogeničnost) i niska
(mala koncentracija).
Frakcija γ globulina u
hiperimunom serumu je
relativno široka
(heterogeničnost) i visoka (velika
koncentracija).
Frakcija γ globulina u serumu
bolesmika s multiplim
mijelomom pokazuje izrazito
uski vrhunac koji odgovara
homogenoj mijelomskoj
bjelančevini (M).
Normalni serum
Hiperimuni serum
Multipli mijelom
7. M.
Redukcija međulančanih disulfidnih veza
Temeljna jedinica protutijela se sastoji
od dva teška (H) i dva laka (L) lanca.
ispiranje
separacija gel-
filtracijom na
sefadeksu
na temelju
molekulske mase
2H 2L
Opća formula
(H2L2 )n
redukcija i
zakiseljenj
e
H : L= 1 : 1
Mol. masa Pt = 160 000
Mol. masa H = 50 000
Mol. masa L = 23 000
-s-s-
8. M.
Fragmentacija proteolitičkim enzimima
Papain cijepa protutijelo na dva fragmenta Fab i jedan Fc.
Pepsin cijepa protutijelo na veliki F(ab),
2, koji se dalje može pocijepati na
dva fragmenta slična Fab.
ispiranje
separacija
na temelju
naboja
2Fab Fc
Opća formula
(Fab2Fc)n
papain
Fab : Fc= 2 : 1
Mol. masa Pt = 160 000
Mol. masa Fab = 45 000
Mol. masa Fc = 50 000
++
+
+
+
+
+
9. M.
Odnos lanaca i fragemenata
Cijeli je laki lanac sadržan u Fab, a dijelovi teških
lanaca se nalaze i u Fab i u Fc.
Antiserum Precipitacija s
lancima H
Precipitacija s
lancima L
anti Fab + +
anti Fc + -
Ag Pt
10. M.
Snimanje elektronskim mikroskopom
Vide se likovi nalik na trokute,
četverokute, peterokute, itd. s
izdancima na kutevima.
*Mali dvovaljani
hapten uzrokuje da
se vezna mjesta
antihaptenskih
protutijela
orijentiraju jedno
nasuprot drugom.
*Fosfovolframova
kiselina daje
kontrast.
14. M.
Shematski prikaz β nabiranja lanca
Poredak i orijentacija nabora karakteristični su za svaku domenu.
Domena V se sastoji od dva β nabora više koji stvaraju dodatnu petlju.
domena Vdomena C
dodatni β nabori
15. M.
Trodimenzijski model protutijela
Shematski prikaz
imunoglobulinskih domena i
interakcija između njih.
Vide se pojedinačne
aminokiseline, kao kuglice.
Tamne kuglice prikazuju
pobočne ugljikohidratne
lance.
Prostorni razmještaj
imunoglobulinskih domena
17. M.
Oblikovanje veznog mjesta
Po tri hipervarijabilne
regije (HV ili CDR) lakog
i teškog lanca oblikuju
žlijeb u koji pristaje
nekovalentno,
reverzibilno antigen, kao
ključ u ključanicu.
Vezno je mjesto
(paratop) dugačko oko 2
nm, a široko i duboko
oko 1 nm.
18. M.
Regije CDR lakog i teškog lanca
određuju konfiguraciju veznog mjesta
Princip komplementarnosti pri građi veznog mjesta.
21. M.
Imunoglobulin IgM
pentamer
makroglobulin, 900 KD, 19 S
prvi nastaje u primarnoj reakciji
nema koljeno, ali ima dodatnu CH
jako aktivira komplement
SSS S
SS
S
S
SS
S S
SS
SS
SS
SS
SS
SS
S
S
S
S
S
S
J lanac
slobodan IgM u
serumu
IgM na površini
bakterije
Snimka elektronskim mikroskopom
23. M.
Primarna struktura lanca L
Varijabilni (V) i konstantni (C) dijelovi lanca
C kraj
214
aminokiselina
Različit slijed
N- kraj
Istovrsni slijed dva temeljna slijeda
k (kapa) i λ (lambda)
Varijabilna
domena(VL)
Konstantna
domena (CL)
ogroman broj
različitih idiotipova
SSS S
SS
Fab Fab
N-kraj
C kraj
Fc
24. M.
Hipervarijabilne (CDR) regije lanaca H i L
Relativna varijabilnost
aminokiselina na položajima
uzduž varijabilnih domena
lakog i teškog lanca.
Porazbacani dosječci s
manjom varijabilnošću (FR)
grade osnovni kostur lanca.
Varijabilnost je posebno
izražena u tzv.
hipervarijabilnim
odsječcima lanaca tj.
regijama koje određuju
komplementarnost (CDR).
CDR regije su odgovorne za
oblikovanje paratopa.
25. M.
Položaj regija CDR
Tri regije CDR lakog
lanca sudjeluju u
određivanju
komplementarnosti.
Teški lanac ima također
tri regfije CDR.
Oba lanca određuju
karakteristike veznog
mjesta (paratopa).
CDR1
CDR2
CDR3LANAC L
C kraj
N kraj
VL
26. M.
Biosinteza protutijela (pregled)
Molekulska razina
– organizacija imunoglobulinskih gena; više gena - jedan polipeptid
– izvor različnosti protutijela
– specijalizacija klona limfocita B
– transkripcija, translacija, sastavljanje i izlučivanje molekula
– primjena u kliničkoj imunologiji
Stanična razina
– aferentna faza; prepoznavanje antigena
– centralna faza; suradnja limfocita T i B
– eferentna (efektorna) faza;jedna plazma-stanica - jedan imunoglobulin;
prekapčanja IgM-IgG
Tkivna razina
– ulazak antigena i reakcija limfatičkih organa; promet limfocita
Razina organizma
– kinetika stvaranja protutijela; primarna i sekundarna reakcija
– raspodjela po organizmu
– razgradnja (katabolizam) protutijela
27. M.
Načelna organizacija gena
5’ // L ekson 1 ekson2 ekson 3 ekson4 // 3’
geni
DNA
introni
transkripcija
Općenito od
gena do
polipeptidnog
lanca
udruživanje lanaca i sastavljanje molekule
primarni
transkript
RNA
5’ // L ekson 1 ekson2 ekson 3 ekson 4 // 3’
prerada
polipeptidni
lanac
NH2
prijenos i prekrajanje lanaca
COOH
L ekson 1 ekson 2 ekson 3 ekson 4 mRNA
translacija
NT PANT
28. M.
Mehanizam
preslaganja gena
Vidi se pravilo 12/23 pri
preslaganju gena za stvaranje
određene kombinacije
(primjerice gena V i J), uz
ireverzibilnu deleciju dijela
kromosoma između odabranih
gena.
29. M.
Signalni niz RSS
Dva evolucijski očuvana slijeda u genima za lake i teške lence
funkcioniraju kao rekombinacijske signalne sekvence (RSS).
Oba se signalna slijeda sastoje od dva očuvana niza, od 7
(heptamer), odnosno 9 (nonamer) nukleotida i umetnute
srednje, dosta različite, razmaknice od 12 ili 23 parova baza.
30. M.
Smještaj RSS u embrijskoj DNA
Raspored signalnih segmenata RSS oko gena V, D i J, dok su
oni u konfiguraciji zametne loze, jest takav da osigura
pravilan slijed preslagivanja.
dvozavojni RSS jednozavojni RSS
31. M.
Smještaj i organizacija ljudskih imunoglobulinskih gena
5’ 3’Cκ
V1-40 E E
2. geni za lance κ
J1-5
2. kromosom
Geni za lanac H su smješteni u čovjeka na 14., geni za
lanac κ 2., a geni za λ na 22. kromosomu.
J1-65’ 3’
14. kromosom
C1-10D1-30
V1-50 S EE
1. geni za lance H
µ δ γ3 γ1 εφ α1 γ2 γ4 ε α2
J1-45’ 3’C1-9
V1-30 E E
22. kromosom3. geni za lance λ
S
λ1 λ2 λ3 λ4 λ5 λ6
32. M.
Preslaganje gena za lake lanace
Od zametne loze do
polipeptidnog lanca
J1 - 5
transkripcija
5’ 3’
preslaganje
DNA u
limfocitu B
preslaganje
Ck
x4V2V1 Cy
EE
5’ 3’
primarni
RNA
transkript
prerada
CxJV
P L
15’ 3’
Vk
zametna loza
Ck
C1
x2V2 Vn
V1 E Cy
E
P L
polipeptidni
lanac
NH2 COOHCV J
zrela mRNA
translacija
JV1
C2
NT
5’
NT PA
3’
prvotni
polipepti
-dni
lanac
NH2
COOHCV J
prerada lanca
33. M.
Organizacija gena za lanac κ
Tandem gena na 2. kromosomu u čovjeka za lanac κ.
prekrajanje
5’ 3’
preslaganje DNA
u limfocitu B
preslaganje
Ck
54V2V1
15’ 3’
Vk
J1 - 5
zametna loza
Ck
Ck
3 4 52V2 V40V1
zrela mRNA
translacija
4V2
polipeptidni lanacNH2 COOHCkV2 4
5’ 3’
transkripcija
Ck
54V2
primarni RNA
transkript
36. M.
Receptori tokom sazrijevanja limfocita
Antigenski receptori nezrelih i zrelih limfocita B i limfocita T.
Receptori su prikazani bez pridruženih jedinica koje porenose signal.
Pre-B limfociti imaju receptore
građene od definitivnih teških
lanaca i surogatnih lakih
lanaca λ 5
Pre-T limfociti imaju receptore
građene od β lanaca
istovjetnih onima u zrelim T
stanicama, i pre-Tα lanca koji
ima samo konstantni dio.
38. M.
Stanice koje proizvode protutijela
Protutijela stvaraju zrele plazma-
stanice nastale kroz desetak dioba
tijekom diferencijacije potaknutih
limfocita B.
limfociti
plazma-stanice
Limfociti B ne
stvaraju rozete s
ovčjim eritrocitima.
Limfociti T
stvaraju rozete s
ovčjim eritrocitima.
39. M.
Suranja limfocita T i B
Elektronsko mikroskopska snimka suradnje limfocita T i B.
limfocit B
limfocit T
limfocit B
limfocit T
početni dodir konjugat T-B
40. M.
Mehanizam suradnje
limfocita T i B
premoštenje mIg antigenom izaziva
prvi signal što pojačava izražavanje
MHC II i B7
T prepoznaje antigen - MHC II na
membrani limfocita B (prvi signal)
limfocit B izražava CD40
interakcija CD40 - CD40L pribavlja
drugi signal
interakcija B7 - CD 28 stvara
kostimulacijski signal
limfocit B počinje izražavati receptore
za brojne citokine
citokini iz limfocita TH dovode do
progresije limfocita B
41. M.
Primarna i sekundarna reakcija
Razlika između primarne i sekundarne reakcije je temeljni
dokaz da je neki proces u svojoj prirodi imunološki.
Primarna reakcija se
odvija na prvi dodir s
antigenom.
Sekundarna reakcija se
odvija na drugi i svaki
naredni dodir s
antigenom.
FAZE REAKCIJE:
I. induktivna faza
II. eksponencijalna faza
III. faza platoa
IV. faza smanjenja titra
I
II
III IV
I
II
III
IV
42. M.
Antigenske determinante (epitopi)
Protutijela i limfociti ne prepoznaju cijelu molekulu antigena, već samo
jedan njezin dio -antigesnku determinantu (epitop).
Složeni antigeni imaju mnogo desetaka epitopa.
Imunološka reakcija teče na svaku pojedinu determinantu.
Vrste epitopa prema građi
– sekvencijski
– konformacijski kontinuirani
– konformacijski diskontinuirani
43. M.
Varijacije ljudskih imunoglobulina
Navedene su izotipske, alotipske i idiotipske varijacije imunoglobulina.
Skupni
naziv
variajcije
Pojavni oblik Član
skupine
Smještaj u
lancu
Rasprostra-
njenost
Način
otkrivanj
a
IZOTIP razred
podrazred
vrsta
podvrsta
skupina
podskupina
teških
lanaca
lakih
lanaca
varijabilne
regije
γ,α,µ,δ,ε,
γ1−4,α1,2
κ, λ
λ1−4
VH,Vκ,Vλ
CH
CH
CL
CL
VH, VL
VH, VL
u serumu svakog
čovjeka
ksenogeničan
antiserum
ALOTIP biljezi Gm
biljezi Am
Biljeg Mn
biljezi Km (InV)
biljeg Hv
Gm 1-25
Am 1,2
Mm 1
Km 1-3
Hv 1
Ch u γ1-3
Ch u α2
Ch u µ
Cl u κ
VH
u nekih ljudi
(alternativni
oblici)
alogeničan
antiserum
(aglutinator)
IDIOTIP vezno mjesto
s antigenom
10 6
do 1011
različitih
specifičnosti
veznih mjesta
3 hipervarijabilne
regije VL
3 hipervarijabilne
regije VH
u određenoj
molekuli,
odgovorne za
specifičnost
geničan
antiserum
istog alotipa
(antiidiotipsk
a protutijela)
44. M.
Pregled građe protutijela (sažetak)
Protutijela su enormno heterogeni glikoproteini koji spadaju pretežno u serumsku frakciju
imunoglobulina, a koji posreduju humoralnu imunost.
Proizvode ih završni diferencijacijski oblici limfocita B, tj plazma stanice.
Postoje 5 osnovnih razreda ili klasa imunoglobulina: IgG, IgA, IgM, IgD i IgE.
Osnovna četverolančana jedinica (monomer) protutijela ima izgled slova “Y” i sastoji se od 2 teška
(H) i 2 laka (L) lanca. Papain cijelpa molekulu na 2 Fab i 1 Fc fragment.
Dvije do pet osnovnih jedinica se udružuju tvoreći polimere (IgA, IgM). Oni sadrže dodatni lanac J,
a kad su u sekretima i sekrecijsku komponentu.
Molekula je funkcionalno i topološki dvojna : Fab obavlja prepoznavanje antigena, a Fc funkcije
neovisne o specifičnosti.
Krakovi molekule vezuju antigen (Fab), a “rep” Fc određuje sekundarna biološka svojstva.
Lanci su višestruko antiparalelno nabrani u kuglasto klupko od 110 aminokiselina koje se zove
imunoglobulinska domena. Laki lanac ima 2, a teški 3 ili 4 domene.
Lanci se, prema slijedu aminokiselina, sastoje od varijabilnih (V) i konstantnih (C) dijelova.
Varijabilne se regije sastoje od više porazbacanih odsječaka osnovnog kostura (FR) i tri
hipervarijabilne regije (HV ili CDR).
Specifičnost veznog mjesta određuje slijed aminokiselina (CDR) u varijabilnom dijelu teškog i
lakog lanca. Vezno mjesto (paratop) je žlijeb u koji pristaje antigenska determinnata (epitop).
Na temelju konstantnog dijela laki se lanci dijele na vrste: κ i λ, a teški na razrede: γ, α, µ, ε, i δ i
dalje na podrazrede: γ1,2,3,4 i α1,2.
Izotipske determinate su zajedničke za sve pripadnike iste vrste (specijesa) (primjerice razredi,
podrazredi teških lanaca). Otkrivaju se ksenogeničnim antiserumom.
Alotipske determinante su male razlike imunoglobulina istog izotipa, ali dviju različitih skupina
unutar jednog specijesa (genski biljezi Gm, Am, Km, Mm i Hv). Otkrivaju se aloserumom.
Idiotipske determinante su jedinstvene individualne razlike specifične za određeno protutijelo
proizvedeno protiv određenog antigena od jednog klona limfocita, a nalaze se u paratopu.
45. M.
Bolesnica Petra M.
Pedesetgodišnja službenica Petra M.
primjećivala je mjesecima da se osjeća slabo i
da se lako umora. Tijekom jedne posjete svom
obiteljskom liječniku zbog recepata za svog
supruga, usputno je spomenula da se u zadnje
vrijeme vrlo lako umara. Fizikalnim
pregledom liječnik nije pronašao ništa
patološko. Ipak je uputio gđu. Petru M. da
napravi uobičajene krvne pretrage.
Pronađena je blaga anemija, uz nešto smanjen
broj leukocita i povišenu sedimentaciju.
46. M.
Što može uzrokovati povišenu sedimentaciju i
koje je pretraga dalje indicirana?
Sedimentacija je brzina taloženja eritrocita u krvi u
kojoj je spriječeno zgrušavanje. Ona ovisi o polumjeru i
gustoći eritrocita, kao i gustoći i viskoznosti plazme.
Dakle najvažniji je čimbenik sastav proteina plazme,
odnosno povećanje globulina ili fibrinogena ubrzava
sedimantaciju. Stoga je indicirano mjerenje serumskih
imunoglobulina imunoelektroforezom. Ustanovljena je
trostruko veća koncentracija IgG (normala je 6 do 15
g/L) samo desetina normalne koncentracija IgA
(normala je 0,2 – 2,5 g/L) i polovica koncentracije IgM
(normala 0,8 do 1,5 g/L) Imunoelektroforeza je otkrila
monoklonski protein IgG (M-protein) s lakim lancom κ.
47. M.
Na koju bolest se sumnja i što je dalje
indicirano?
Postavljena je sumnja na plazmacitom (multipli
mijelom). Radi se o malignom tumoru plazma
stanica. Jedna jedina plazma stanica koja
proizvodi protutijela jednog izo- alo- i idio-tipa
doživi malignu transformaciju i neobuzdano se
dijeli, pa zasije koštanu srž svojim stanicama-
kćeri. Treba dakle radiografski snimiti kostur
gdje nakupine tumorskih stanica razaraju kost,
pa je slika prošarana svijetlim mrljama. U
bolesnice nisu nađena oštećenja kostura.
Također je zatražen nalaz Bence Jonesovog
proteina u mokraći.
48. M.
Što je Bence Jonesov protein i koje je njegovo
dijagnostičko značenje?
Bence Jonesov protein je monoklonska bjelančevina
veličine oko 20 kDa koja se nalazi u krvi i u mokraći
bolesnika. Radi se o dimerima imunoglobulinskih lakih
lanaca, češće κ nego λ, koji su proizvod malignih
plazma stanica. Ne reagiraju s uobičajenim reagensima
pri pregledu urina, pa se trebaju posebno otkrivati.
Talože se ako se urin zagrije na 50 do 60 °C i ponovo
otope kad se dosegne 90-100 °C.
Nalaz Bence Jonesovog proteina ima patognomonično
značenje za postavljanje dijagnoze multiplog mijeloma.
U bolesnice nije nađen.
49. M.
Kakav je daljnji postupak?
Postavljena je jaka sumnja na plazmocitom, ali
u nekih ljudi takovo benigno stanje može trajati
doživotno, bez pojave simptoma bolesti. Čak oko
10% starijih osoba ima benignu monoklonski
gamapatiju. Bence Jonesov protein nije prisutan
u 1/3 bolesnika koji boluju od plazmocitoma.
Terapija bolesnici nije potrebna, ali joj je
preporučena vrlo redovita kontrola.
50. M.
Daljnji tijek bolesti
U redovnim kontrolnim pregledima gđa. Petra
M. je imala svaki puta sve veću koncentraciju
IgG, sve manji broj eritrocita i leukocita
(zašto?).
Nakon dvije godine pri sagibanju pri
uobičajenim kućnim poslovima osjetila je vrlo
jaku bol u „križima“, pa ju je suprug odvezao
liječniku.
51. M.
Koji bi mogao biti uzrok križobolje i kako to
potvrditi?
Rast malignih plazma stanica razara kosti, pa bi
uzrok mogao biti destrukcija tijela kralješka i
pritisak na leđnu moždinu. Potreban je
radiološki pregled kralješnice. Doista
ustanovljena je patološka destrukcija lumbalnog
kralješka. Također je nađena jaka anemija i
gotovo deseterostruko povećanje IgG u serumu.
Bence Jonesov protein postao je pozitiva.
Definitivno je potvrđena dijagnoza
plazmocitoma.
53. M.
Deregulated expression of both Myc and Bcl-XL are
consistent features of human plasma cell neoplasms.
Novel targeted deregulation of c-Myc cooperates with Bcl-XL to cause plasma cell neoplasms in mice
J. Clin. Invest. 113:12:2004 doi:10.1172/JCI20369
54. M.
Koja je daljnja terapija?
Primjenjeni su kortikosteroidi, a uveden je i
citostatik (melphalan) i lokalno zračenje
tumora.
Dana je i transfuzija krvi i bolesnica se
oporavila.
55. M.
Daljnji tijek bolesti
Na redovnim kontrolama praćeno je
napredovanje bolesti (radiološki, IgG,
anemija) i povremeno je uz kortikosteroide
uveden i novi citostatik (adriamycin,
vincristin). Više puta je bolesnica imala teške
upale pluća (zašto?), pa je hospitalizirana u
više navrata i liječena antibioticima. Primila je
i više transfuzija (zašto?), kao i povremene
lijekove protiv bolova u kostima.
Predlagana joj je transplantacija koštane srži.
56. M.
Koja je prognoza bolesti?
Radi se o malignoj bolesti koja ima lošu
prognozu.
