6 oct la plata oct2012

“Inactivación microbiana por
nuevas tecnologías”
Stella Maris Alzamora
UBA - CONICET

V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y
AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES
La Plata, Pcia. de Buenos Aires, 9-11de octubre de 2012
Carrera de Microbiología Clínica e Industrial
Facultad de Ciencias Veterinarias
UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA


Nuevos agentes o factores de conservación de alimentos
Fuerzas impulsoras

Inocuidad
(en países desarrollados, 1/4 ó 1/3 de la población es afectada por
ETA’s cada año) (Scalla et al., Em. Inf. Dis. 17, 17, 2011; Gkogka et al., Em. Inf. Dis.
17, 1581, 2011).

(el costo económico asociado a ETA’s en USA es mayor a 50
billones de dólares/año, involucrando a más de 48 millones de
personas) (Scharf, J. Food Prot. 75, 123, 2012)

Calidad sensorial, nutricional o funcional de productos de
consumo directo o de materias primas y productos intermedios
antes de su industrialización


Algunos factores emergentes “no térmicos” de
preservación
Factor Aplicaciones potenciales para
conservar alimentos/productos
en el mercado
Efecto volumétrico
• altas presiones hidrostáticas
Aplicación de 100-800 Mpa debajo de Dulces, jaleas, jugos y purés de frutas,
0ºC hasta 100ºC, desde seg. hasta 20’, yogur, salsas, guacamole, carnes cocidas y
instantánea y uniformemente a través curadas, ostras, comidas preparadas, etc.
de todo el alimento (1990 - ). Pasteurización y esterilización
asistidos por alta presión.
• ultrasonido
Energía generada por ondas de sonido Sugerido para pasteurización de
de baja frecuencia (20-100 kHz) y alta jugos, leche, etc.
intensidad (10-1000 W/cm2)
• pulsos eléctricos
Aplicación de pulsos de alta intensidad Sugerido para pasteurización de
de campo eléctrico (10-80 kv/cm) de leche, yogurt, jugos, huevo líquido,
duración de micro a milisegundos sopas, aderezos y otras bebidas


Efecto superficial

• luz UV-C
Pasteurización de alimentos líquidos
Aplicación de radiación de la región del
(2000 - ). Descontaminación de
espectro electromagnético entre 200 –
superficies de alimentos
280 nm

• pulsos de luz
Aplicación de pulsos intensos y de corta Sugerido para la descontaminación de
duración (1 µs á 0,1 s; 1-20 flashes superficies de alimentos y de
/seg) de luz blanca de amplio espectro, alimentos líquidos
desde el UV al IR (≅ 200 – 1100 nm)

• sanitizantes Descontaminación de superficies en
general, granos, algunas carnes,
(O3, H2O2)
productos marinos, etc.


Factores de inactivación “emergentes”

Mecanismos de acción no totalmente elucidados.
Efectivos contra células vegetativas pero esporas de bacterias y
hongos y algunas enzimas son refractarias.
A altas dosis, deterioro en la calidad y/o limitaciones técnicas
equipos/tecnologías

El concepto de preservación multifactorial
(“hurdle effect”) constituye la base del
procesamiento de alimentos mediante las
nuevas tecnologías.
Los microorganismos que no son inactivados durante el proceso o que son
inhibidos en su crecimiento consumen energía para oponerse al medio hostil, sufren
agotamiento metabólico y posteriormente mueren.
La eficiencia de la inactivación puede ser incrementada por el uso de factores
coadyuvantes.


Factores de inactivación emergentes

¿Adopción industrial?
Mayor conocimiento en:
Eficiencia en la inactivación de microorganismos
Mecanismos de acción de los factores de inactivación, sólos y en
combinación, y la respuesta microbiana
Cinética de inactivación microbiana en función de la dosis y cuantificación
de la conducta microbiana
Evolución de los microorganismos tratados durante el almacenamiento
Posibilidades de combinación

Impacto de la dosis en la calidad, estructura y funcionalidad del
alimento

Uniformidad de los procesos

Educación y comunicación
(Heldman et al., 2008)


Agenda

Cinética de inactivación microbiana por algunos factores
emergentes

Modo de acción de los factores de inactivación en función
de la dosis y el tipo de microorganismo

Conducta microbiana durante el almacenamiento de
alimentos tratados


Cinética de inactivación microbiana por algunos
factores emergentes

Patrones de inactivación

Influenciados por:

 Tipo de microorganismo y estado fisiológico

 Agente de inactivación y niveles de aplicación; factores críticos
del proceso

 Distribución y estado del microorganismo en el alimento (biofilm o
cultivo planctónico)

 Dominio ambiental (composición del medio ambiente, aw, pH,
medio líquido o sólido, temperatura, etc.)

 Presencia de coadyuvantes de la inactivación.


factores emergentes

Tipo de microorganismo
0

-1

-2

Log(N/No)
-3

-4

-5

-6
0 5 10 15 20
Time (min)

Patrones de inactivación durante la aplicación Patrones de inactivación durante la
de altas presiones: aplicación de UV-C en jugo de naranja:
-- 375 MPa, L. monocytogenes en leche -о- S. cerevisiae KE 162
-+- 600 MPa, S. aureus en pollo -●- cocktail of yeasts
-- 600 MPa, S. aureus en leche -∆- E. coli ATCC 35218
-- 600 MPa, E. coli en solución de fosfato -▲- cocktail of E. coli

(Patterson et al., 1995) (Char et al., 2009)


factores emergentes

Tipo de agente/combinaciones
0

-1 Curvas de supervivencia de E. coli
ATCC35218 sujeto a US o a UV-C:
-2
Log (N/No)

- o - agua peptona
-3 -▲- jugo de manzana
-4 -■- jugo de naranja
US
-5

-6
0 5 10 15 20
Time (min)

0

-1

-2 Excepto en el caso de jugo de naranja,
Log (N/No)

-3
UV-C el efecto letal de la luz UV-C fue 3-4
-4
veces mayor que el del US.
-5

-6
0 5 10 15 20
Time (min)

Char et al., 2009


factores emergentes
Tipo de matriz

S. aureus
E. coli

E. coli
S. aureus

300 MPa, agua peptona
300 MPa, jugo de zanahoria
El jugo tuvo un efecto protector en S. aureus y un
efecto ligeramente sensibilizante en E coli :
modificación de las resistencias relativas. (Pilavtepe-Celik et al., 2009)


factores emergentes

Tipo de matriz
Interacción de la radiación con el medio
de propagación y la muestra

Absorción
(decaimiento exponencial
de la intensidad con la
distancia, ley de Lambert-
Beer)

Reflexión

agua peptona pH 3,1 Dispersión

Esporas de Alyciclobacillus acidoterrestris
Refracción
Pulsos de luz, 10 cm de la lámpara,
3 pulsos/s, fluencia a 60 s: 95,5 J/cm2

(Ferrario et al., resultados no publicados, 2012)


Cinética de inactivación microbiana por algunos factores
emergentes

Cultivos planctónicos vs biofilms
Curvas de supervivencia de E. coli ATCC 35218 en biofilm y en solución
buffer tratada con distintas concentraciones de peróxido de hidrógeno
(%p/v) (25ºC; pH 3,3)
tiempo (min) tiempo(min)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 5 10 15 20 25
0

-0,5 control
-1
-1,5

-2
pH 3,3
)

-2,5

Log (N/No)
-3
-3,5
N
g
o
(
/
l

1,00% -4
0,50%
-4,5 1,00%
-5
-5,5 1,00%
2,50%
0,75%
1,50% -6 0,75%
-6,5
2,00% 1,50% 0,50%
1,50%
2,00% 1,50%
-7
1,00%
Biofilm maduro en acero inoxidable Desarrollo planctónico

(Raffellini et al.,2008)

Los biofilms representan sistemas biológicos con un alto nivel de
organización, donde los microorganismos forman comunidades
funcionales, estructuradas y coordinadas.
Células en el biofilm  protegidas de situaciones ambientales adversas
(estrés osmótico, calor, ácidos, radiaciones, biocidas, antibióticos, u otros
agentes biológicos).
Mayor resistencia comparadas con cultivos planctónicos.

Mecanismos múltiples de resistencia:
 Resistencia física a la penetración de los agentes biocidas por la matriz extracelular.
 Activación de la respuesta al estrés de la fase estacionaria por la alta densidad
celular.
 Subpoblación de fenotipos altamente protegidos para crecer en superficies.
 Producción de enzimas que degradan los antimicrobianos.
 Menor velocidad de crecimiento, menor metabolismo y por tanto más difíciles de
inactivar.

Consecuencias:
 Serios problemas higiénicos (contaminación microbiana del
producto, persistencia de patógenos en superficies, pérdidas
económicas por deterioro).
Diseño subdimensionado de procesos si estos se basan en
cinéticas en medios planctónicos.


factores emergentes
Modelado matemático de las curvas de supervivencia

Enfoque mecanístico vs enfoque vitalístico
Una subpoblación altamente
La intensidad del factor
resistente permanece viable
debe exceder un valor
durante un tiempo largo de
umbral antes de que L L
tratamiento y/o se adapta al estrés
ocurra inactivación o o (heterogeneidad en la respuesta
(heterogeneidad en la g g
con “hombro de la población al factor de
respuesta de la
estrés)
población al factor de N N con “cola”
estrés)

tiempo tiempo
Cada miembro de la
población tiene la
misma sensibilidad al
L
factor, pero sólo una L
o
fracción se afecta por o
el tratamiento letal a un g
g sigmoidea
dado tiempo
(homogeneidad en la N lineal
N
respuesta de la
población al factor de
estrés) tiempo tiempo


factores emergentes
Modelado matemático de las curvas de supervivencia
Modelo de distribución de resistencias tipo Weibull

loge N(t)/No = -btn b: parámetro de escala o de veloc. no lineal
n: parámetro de forma
tiempo(min) tiempo(min)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
pH 3,3 0

-1

pH 7,2
-1

-2 -2
Log (N/No)

-3 -3

0,50% log (N/No)
-4
2,50% 1,00% 0,75% -4

-5 1,50% -5

-6 -6

-7 -7

Efecto de la concentración de peróxido de hidrógeno (%p/v) y el pH en la inactivación de E. coli
ATCC 35218 (25ºC; soluciones buffer de ácido cítrico – Na2HPO4)


- Frecuencia de distribución de resistencias de E. coli a peróxido de
hidrógeno

La magnitud de los parámetros
b, n, moda, promedio, varianza y
1
coeficiente de asimetría de la
0,75 % H2O2
distribución varían con el medio y
0,8
con la dosis del agente letal.
Frecuencia (1/min)

0,6

Conforme se incrementa la dosis
Reducción de pH
0,4
del agente letal o los parámetros
0,2
del medio se hacen más
desfavorables, la distribución se
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
corre a tiempos menores, y
Tiempo (min) disminuye la varianza, indicando
una población más homogénea
en su respuesta.
diferentes pHs (25ºC)
 3,3 -  4,4 -  5,8 -  7,2

(Raffellini et al. 2004)


Modo de acción de los factores de inactivación en
función de la dosis y el tipo de microorganismo

Células Aquellas células capaces de realizar todas las
viables funciones celulares necesarias para la
supervivencia en circunstancias determinadas

Criterio y método usual para evaluar viabilidad
 Habilidad de las células para reproducirse.
(Recuento en placa).

No se cuentan microorganismos que no forman colonias:
 muertos
 dañados subletalmente
 viables pero no cultivables
(Breeuwer & Abee, 2000)


Citometría de flujo

Detectores de  Luz desviada a ángulos
Detector luz roja y altos y bajos: tamaño y
de luz naranja
granularidad (complejidad
reflejada
a 90º Detector de interna) de las células.
luz verde  Emisión de
fluorescencia: estado
fisiológico de las células a
Detector
nivel individual.
de luz  500-5000 cél./seg
incidente Espejos reflectores  Digitalización de la
de luz de
determinadas
información y presentación
longitudes de onda de resultados como
histogramas o gráficos de
puntos.
Fuente de luz
láser


1 2

Gráfico de densidad de fluorescencia (IP vs FDA)
3
4

Cuadrante Propiedades de Explicación posible de los mecanismos
fluorescencia de las celulares involucrados
células de cada cuadrante
1 F– PI+ Actividad de esterasa negativa,
membranas comprometidas

2 F+ PI+ Esterasa activa, membranas
mínimamente dañadas

3 F– PI- Actividad de esterasa no detectable (o
expulsión de F de las células),
membranas intactas
4 F+ PI- Esterasa activa, membranas intactas

S. cerevisiae
0 min 1 min 2 min
Gráficos de densidad de fluorescencia de células 1 2 1 2 1 2

teñidas con FDA y PI y sometidas a diferentes
tiempos de exposición a UV-C (0-5 kJ/m2)

2
3 4
Recuento
3 4 3 4

0
de viables
-2 1 2 1 2
Log (N/No)

-4 L. innocua

-6 E. coli
-8 S. cerevisiae 4
3 4 3

-10
0 2 4 6 8 10 3 min 5 min 10 min
Time (min)
L. innocua
0 min 1 min 2 min
E. coli
0 min 1 min 2 min 1 2 1 2

1 2 1 2 1 2

3 4 3 4
3 4 3 4 3 4

1 2 1 2 1 2

3 4 3 4 3 4

3 min 5 min 7 min 3 min 5 min 8 min

0 min 5 min
Gráficos de densidad de fluorescencia de a b
1 2 1 2
células de S. cerevisiae teñidas con FDA y PI
y sometidas a diferentes tiempos de
exposición a ultrasonido (20 kHz, 600 W, 45ºC,
95,2 μm de amplitud de onda)
3 3
4 4

0,5
Log (N/No)

0 c 10 min d 15 min
1 2 1 2
-0,5

-1

-1,5

-2
0 5 10 15 20 25

Time (min)
3 4 3 4

Curva de supervivencia de S.
cerevisiae durante el tratamiento e
20 min
1 2
ultrasónico en caldo Sabouraud.

A los 20 min de tratamiento, el recuento de viables indicó más de 1 ciclo
log de reducción pero el estudio de citometría de flujo reveló sólo 37% de
células con daño en membrana (cuadrantes 1+ 2) la pérdida de
3 4
viabilidad de la levadura no ocurre sólo por daño a membranas

(Alzamora et al., 2010)


c
o
La acción disruptiva del ultrasonido se
n
refleja en varios blancos en la célula de
tr
la levadura: pared celular, membrana
ol
C C citoplasmática, estructura interna.

Pérdida de material interno
s Restos de pared celular y membrana
o plasmática
n Disrupción contenido interno
i S S Hinchamiento de pared celular con
C
c B encogimiento material interno y
a A
completa disrupción de organelas.
d
a
s
S S

Imágenes de TEM de células de
S. cerevisiae sonicadas 20 min.


Conducta microbiana durante el almacenamiento de
alimentos tratados
Estudios focalizados en
 microorganismos patógenos más que en microorganismos deteriorantes,
 el efecto del tratamiento per se más que en la conducta durante el almacenamiento.

Muchas de estas tecnologías combinadas pueden:
extender la vida útil
incrementar la inocuidad
aumentar la vida útil y la inocuidad

Problemas potenciales?
 La prolongación de la vida útil por reducción de la microflora incrementa la probabilidad
de crecimiento de los patógenos resistentes a la inactivación durante el almacenamiento,
agravado por la destrucción de la flora competitiva.
 Si el daño a la estructura del alimento por el tratamiento de inactivación es alto se
puede incrementar el crecimiento de patógenos remanentes durante el almacenamiento
(pérdida de fluidos con nutrientes).

Estudio integrado de flora nativa y de patógenos después del
tratamiento y a lo largo del almacenamiento pretendido
Gómez-López et al., 2008; Alzamora et al., 2012


Ejemplo: Manzanas cortadas
Irradiadas con pulsos de luz a 10 cm o 5 cm de la lámpara.
Supervivencia de m.o. inoculados y evolución de la flora nativa a 5ºC

Tratamiento per se Almacenamiento
E. coli Flora nativa: bacterias totales
250

200  control
10 cm
 10 s, 10 cm

N (UFC/g)
150  60 s, 10 cm
100

50
5 cm
0
0 2 4 6 8
Storage time (day)

Flora nativa: hongos y levaduras
L. innocua
0 400
-0.5 350  control
-1
10 cm 300  10 s, 10 cm

N (UFC/g)
Log (N/N0 )

250  60 s, 10 cm
-1.5
200
-2 5 cm 150
-2.5 100
-3 50
0 20 40 60 80 100 120 0
Exposure time (s) 0 2 4 6 8
Storage time (day)

Almacenamiento:después de 10s
Incremento de inocuidad y vida útil ó 60s de radiación:
(Gómez et al., 2011)
aún a la menor dosis (10s- 10 cm) No existió crecimiento de E. coli
Reducción de L. innocua

Ejemplo: Jugo de naranja
Adicionado con antimicrobianos naturales, irradiado con luz UV-C 30 min y almacenado en refrigeración
UV-C UV-C/100 ppm citral/1000 ppm vanillina UV-C/50 ppm citral/1500 ppm vanillina

S. cerevisiae E. coli L. innocua
A C D
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
0
P 0 0
-1
R -1
O -1 -2
C -2
-3
E -2

N

N
-3

g
o
L

g
o
L
N

/
g
o
L

/
S
/

-4
-4
O -3
-5
-5
-4 -6
Time (min) -6 Time (min) Time (min)
A
L A
M -1 1 3 5 7 9 11 13 15
-1 1 3 5 7 9 11 13
C
-1 1 3 5 7 9 11
D

A 0
0
-0,5
C -0,5 -0,5
-1,5
E -1 -1
-1,5
N -1,5
-2
-2,5

A -2
-2,5
-3,5
N

N
M
N
g
o
L

-2,5 -4,5

g
o
L
g
o
L

-3
/

/
/

I -3 -3,5 -5,5
-4
E -3,5
-4,5
-6,5

N -4
-5 -7,5
Time (day) Time (day) Time (day)
T
O

Los antimicrobianos no mejoraron la inactivación por irradiación con luz UV-C pero en
determinadas concentraciones se minimizó el desarrollo de las levaduras que resistieron el
tratamiento con luz UV-C o que se recuperaron después del mismo UV-C como único
factor contribuiría a la inocuidad sin modificar la vida útil pero ésta se incrementaría por el
agregado de 100 ppm de citral y 1000 ppm de vainillina.
Ferrario et al., 2011


Conclusiones

Cinética de inactivación

Específica para un dado microorganismo, dominio ambiental y factor
de inactivación (en combinación o no con otros factores de estrés).

 Evaluación en microorganismos adheridos en biofilms.

 Cuantificación de la cinética de inactivación microbiana por modelos
de distribución de resistencias de acuerdo al enfoque vitalístico

Estudios simultáneos de la respuesta microbiana de la flora
nativa y de los microorganismos inoculados, tanto en el
tratamiento per se como durante el almacenamiento


Muchas gracias!

Grupo de investigación
Dra Sandra Guerrero
Dra Cielo Char
Dra Silvia Raffellini
Dra Marcela Schenk
Lic. Mariana Ferrario

smalzamora@gmail.com

Factors affecting inactivation and explaining the
great variance values of the mean inactivation time

The presence of colored compounds and pulp particles which
caused poor UV-C light transmission (UV-C light absorption by
dissolved solids; UV-C scattering and reflection, and a site
for the aggregation of bacteria to particles surfaces by solids
in suspension).

The complex flow pattern in the system and the great
distribution of residence times.

The difference in the response per se between the members
of E. coli population (different sensibility to the treatment).

Gráficos de densidad de fluorescencia de
Agua peptonada pH 5,6
células de S. cerevisiae teñidas con cFDA
y PI y sometidas a diferentes tiempos de
Jugo de manzana comercial exposición a pulsos de luz (0-71,6 J/cm2)

0s 1s 5s 10 s 20 s 60 s



Jugo de manzana comercial

6 oct la plata oct2012

Empfohlen

Empfohlen

Weitere ähnliche Inhalte

Ähnlich wie 6 oct la plata oct2012

Ähnlich wie 6 oct la plata oct2012 (20)

Mehr von microbiologia100

Mehr von microbiologia100 (17)

6 oct la plata oct2012

Hinweis der Redaktion