DNR replikacija

1. DNR REPLIKACIJADNR REPLIKACIJA

2. ĮVADAS
 DNR replikacija yra procesas, kurio metu
kopijuojama genetinė medžiaga
 Originalios DNR grandinės yra naudojamos
kaip matricos naujoms grandinėms sintetinti
 Replikacija vyksta labai greitai, labai tiksliai
ir tik tam tikru ląstelės gyvenimo metu
4-2

3.  DNR replikacija remiasi DNR grandinių
komplementarumu
 AT/GC arba Chargaffo taisyklė
 Procesas gali būti apibendrintas taip:
 Dvi DNR grandinės išsiskiria
 Kiekviena tarnauja kaip šablonas naujos grandinės
sintezei
 Dvi naujai susintetintos grandinės = dukterinės
grandinės
 Dvi pradinės grandinės = tėvinės grandinės
4.1 DNR REPLIKACIJOS
APŽVALGA
4-3

4. 4-4
Identiškos bazių
sekos
DNR replikacijos mechanizmas Replikacijos produktas

5. 4-5

6. 4-6

7. 4-7

8.  DNR sintezės prasideda vietoje, vadinamoje
replikacijos pradžia (origin of replication)

Kiekviena bakterinė chromosoma turi tik vieną
replikacijos pradžią
 DNR sintezė yra dvikryptė, t.y. vyksta į
priešingas nuo replikacijos pradžios
chromosomos puses
 Replikacijos šakutė pasiekia bakterinės
chromosomos priešingą pusę

Tuo replikacija baigiasi
4.2 BAKTERINĖS DNR
REPLIKACIJA
4-8

9. 4-9
Bakterinės chromosomos
replikacija

10.  E. coli replikacijos pradžia yra vadinama oriC
 origin of Chromosomal replication
 Trijų tipų sekos yra svarbios oriC funkcionavimui
 AT poromis turtingas regionas
 DnaA dėžutės (boxes)
 GATC metilinimo vietos
Replikacijos iniciacija
4-10

11. 4-11

12. 4-12
 DNR replikaciją inicijuoja DnaA baltymo
prisijungimas prie DnaA dėžutės sekų
 Šis prisijungimas stimuliuoja papildomų 20-
40 DnaA baltymo molekulių prisijungimą,
susiformuojant dideliam kompleksui
 Taip pat prisijungia ir kiti baltymai,
tokie kaip HU ir IHF.
 Tai priverčia regioną
apsivynioti apie DnaA baltymą
ir išsiskirti komplementarias
grandines
DnaB baltymas (helikazė) jungiasi prie oriC
(DnaC baltymas padeda šiam procesui,
tačiau vėliau yra pašalinamas)

13. 4-13
Sudaryta iš šešių subvienetų
Juda pagal DNR
5’ → 3’ kryptimi
Naudoja ATP energiją
Dvikryptė replikacija

14.  DNR helikazė atskiria dvi DNR grandines,
suardydama vandenilines jungtis
 Tai sukuria teigiamą superspiralizaciją prieš
kiekvieną replikacijos šakutę
 DNR girazė keliauja prieš helikazę ir atpalaiduoja šias
superspirales
 SSB (single-strand binding) baltymas jungiasi prie
atskirtų DNR grandinių ir laiko jas išsiskyrusias
 Tada DNR praimazė sintetina trumpus (10 - 12
nukleotidų) RNR pradmenis
 Šios trumpos RNR grandinės pradeda DNR sintezę

Vėliau jos yra pašalinamos ir pakeičiamos DNR
4-14

15. 4-15
Suardo vandenilines
jungtis tarp grandinių
Atpalaiduoja
superspirales
Laiko tėvines grandines
išsiskyrusias
Sintetina RNR
pradmenis

16.  DNR polimerazės yra fermentai, kurie katalizuoja
naujos DNR susidarymą prisijungiant nukleotidams
 E. coli turi penkis fermentus, pasižyminčius
polimeraziniu aktyvumu
 DNR pol I, II, III, IV ir V
 DNR pol I ir III

Normali replikacija
 DNR pol II, IV ir V

DNR reparacija ir pažeistos DNR replikacija
DNR polimerazės
4-16

17.  DNA pol I
 Sudaryta iš vieno polipetido
 Pašalina RNR pradmenis ir pakeičia juos DNR
 DNA pol III
 Sudaryta iš 10 skirtingų subvienetų

α subvienetas sintetina DNR

Kiti 9 atlieka kitas funkcijas
 Visų 10 subvienetų kompleksas yra vadinamas DNR pol
III holoenzimu
4-17
DNR polimerazės

18. E.coli holoenzimo polIII subvienetų sudėtis
Subvienetas Funkcija
α Sintetina DNR
ε Taiso klaidas 3’-5’ kryptimi
θ Papildomas baltymas, stimuliuojantis klaidų taisymą
τ Skatina dviejų polIII baltymų polimerazicaiją
replikacijos šakutėje; stimuliuoja DNR helikazę
β Pritvirtinantis baltymas, kuris užtikrina, kad polIII
nenuslystų nuo DNR
γ Pritvirtinančio baltymo pakrovėjas; padeda
pritvirtinančiam baltymui prisijungti prie DNR
σ Pagalbinis baltymas, kuris jungiasi prie β
σ’ Pagalbinis baltymas, stimuliuojantis γ
ψ Pagalbinis baltymas, stimuliuojantis γ
χ Pagalbinis baltymas, prisijungiantis prie SSB baltymų
4-18

19.  Bakterinės DNR polimerazės gali skirtis pagal savo
subvienetų sudėtį
 Tačiau jų katalitinis subvienetas visada yra tokio pat tipo
4-19
Struktūra primena
dešiniąją žmogaus ranką
DNR šabloninė grandinė
skverbiasi per delną
Nykštys ir pirštai yra
apglėbę DNR
DNR polimerazės schematinis vaizdas

20. 4-20
Problema sprendžiama
praimazei sintetinant RNR
pradmenis
DNR polimerazė negali
pradėti DNR sintezės
DNR polimerazė gali
prijungti nukleotidus tik
kryptimi nuo 5’ į 3’
Problema sprendžiama 3’
→ 5’ grandinę sintetinant
trumpais fragmentais
Neįprastos DNR polimerazės funkcijų ypatybės

21.  Dvi naujos dukterinės grandinės yra sintetinamos
skirtingais būdais
 Pirmaujančioji grandinė

Pradžioje prijungiamas vienas RNR pradmuo

DNR pol III prijungia nukleotidus 5’-3’ kryptimi,
judėdama link replikacijos šakutės pradžios
 Vėluojančioji grandinė

Sintezė taip pat vyksta 5’-3’ kryptimi
 Tačiau ji nukreipta nuo replikacijos šakutės

Reikia daug RNR pradmenų

DNR pol III naudoja RNR pradmenis smulkiems (1000
- 2000 nukleotidų) DNR fragmentams sintetinti
 Šie fragmentai yra vadinami Okazaki(ų) fragmentais pagal
atradėjų pavardę
4-21

22.  DNR pol I pašalina RNR pradmenis ir užpildo
susidariusią skylę DNR
 Ji naudoja 5’-3’ egzonukleazinį aktyvumą skaidyti RNR
ir 5’-3’ polimerazinį aktyvumą jos pakeitimui DNR
 Kai skylė užpildoma, vis dar trūksta kovalentinių
jungčių sandūrose
 DNR ligazė katalizuoja fosfodiesterinės jungties
susidarymą
 Tuo būdu yra sujungiami DNR fragmentai
4-22

23. 4-23
Sintetina dukterines
DNR grandines
III
Kovalentiškai sujungia
DNR fragmentus
Palaiko
grandines
išsiskyrusiasSuardo vandenilines
jungtis tarp DNR
grandinių
Atpalaiduoja
superspiralę
Sintetina RNR
pradmenį

24.  DNR polimerazė katalizuoja fosfodiesterinės
jungties susidarymą tarp
 prijungiamo dezoksinukleozidtrifosfato vidinio fosfato

IR
 anksteniojo dezoksinukleotido pentozės 3’-OH grupės
 Vykstant šiam procesui, du paskutinieji prijungiamo
nukleotido fosfatai yra atpalaiduojami
 pirofosfato (PPi) forma
4-24
DNR polimerazės reakcija

25. 4-25
Vidinis fosfatas

26.  DNR polimerazė III lieka prisitvirtinusi prie šabloninės
DNR grandinės visą laiką, kol yra sintetinama dukterinė
grandinė
 Ši procesinė ypatybė atsiranda dėl keletos skirtingų DNR
pol III holoenzimo struktūrinių subvienetų veiklos
 β subvienetas yra žiedo formos

Jis yra vadinamas pritvirtinančiu baltymu
 γ subvieneto reikia β subvienetui prisikabinti prie DNR

Jis vadinamas pritvirtinančio baltymo pakrovėju
 δ, δ’ ir ψ subvienetų reikia optimaliai α ir β subvienetų funkcijai
palaikyti
4-26
DNR polimerazė III yra procesinis
baltymas

27.  Šis procesinis efektas yra gana ryškus
 Jei trūksta β subvieneto

DNR pol III nukrenta nuo DNR šabloninės grandinės
po to, kai polimerizuojama keliasdešimt nukleotidų

Polimerizacijos greitis ~ 20 nukleotidų per sekundę
 Jei β subvienetas yra

DN pol III išsilaiko ant DNR šabloninės grandinės tol,
kol yra polimerizuojama iki 50,000 nukleotidų

Reakcijos greitis yra ~ 750 nukleotidų per sekundę
4-27
DNR polimerazė III yra procesinis
baltymas

28.  Priešingos pagal savo funkciją oriC sekai yra pora
terminacijos sekų, vadinamų ter sekomis
 Jos žymimos T1 ir T2
 Baltymas tus (termination utilization substance)
jungiasi prie šių sekų
 Jis gali sustabdyti replikacijos šakučių judėjimą
Replikacijos pabaiga (terminacija)
4-28

29. 4-29
Netrukdo prieš laikrodžio rodyklę judančiai replikacijos šakutei
Blokuoja pagal laikrodžio rodyklę judančią šakutę
Netrukdo pagal laikrodžio rodyklę judančiai replikacijos šakutei
Blokuoja prieš laikrodžio rodyklę judančią šakutę

30.  DNR replikacija baigiasi, kai susitinka priešingomis
kryptimis judėjusios replikacijos šakutės
(dažniausiai prie T1 ar T2)
 DNR ligazė kovalentiškai sujungia visas keturias
DNR grandines
 DNR replikacijai pasibaigus dažnai susidaro dvi
susipynusios molekulės
 Susipynusios žiedinės molekulės vadinamos katenanais
 Jie yra atskiriami veikiant topoizomerazėms
Replikacijos pabaiga (terminacija)
4-30

31. 4-31
Katenanai
Katalizuojama DNR
topoizomerazės

32. E.coli baltymai, dalyvaujantys replikacijoje
Pavadinimas Funkcija
DnaA Prisijungia prie DnaA dėžučių, esančių replikacijos pradžios
sekoje, ir inicijuoja replikaciją
DNR helikazė (DnaB) Išskiria DNR grandines
DnaC Padeda DnaA pritraukti helikazę į replikacijos pradžią
Topoizomerazė Pašalina superspirales, susidarančios prieš replikacijos šakutę
DNR praimazė Sintetina trumpus RNR pradmenis
DNR polimerazė III Sintetina DNR pirmaujančioje ir vėluojančioje grandinėse
DNR polimerazė I Pašalina RNR pradmenis, užpildo susidariusius tarpus
DNR ligazė Kovalentiškai suriša gretimus Okazakių fragmentus
Tus Jungiasi prie ter sekos ir blokuoja replikacinės šakutės
judėjimą
4-32

33.  DNR helikazė ir praimazė yra fiziškai prisitvirtinusios
viena prie kitos ir sudaro kompleksą, vadinamą
praimosoma
 Šis kompleksas praskina kelią replikacijos šakutėje kitiems
fermentams
 Praimosoma yra fiziškai asocijuota su DNR
polimerazės holoenzimu ir taip suformuoja replisomą
DNR replikacijos kompleksai
4-33

34. 4-34

35.  Du DNR pol III baltymai veikia suderintai,
replikuodami tiek pirmaujančiąją, tiek ir
vėluojančiąją grandines
 Du baltymai suformuoja dimerinę DNR polimerazę, kuri
kaip vientisas vienetas juda replikacijos šakutės link
 DNR polimerazės gali sintetinti DNR tik 5’-3’
kryptimi
 Todėl pirmaujančiosios grandinės sintezė yra
nenutrūkstama
 Vėluojančiosios grandinės sintezė netolydi
DNR replikacijos kompleksai
4-35

36.  Vėluojančiosios grandinės sintezė vyksta taip:
 Vėluojančioji grandinė sudaro kilpą

Tai leidžia prisijungusiai DNR polimerazei sintetinti Okazakių
fragmentą “normalia” 5’-3’ kryptimi
 Pabaigęs sintetinti Okazakių fragmentą, fermentas
paleidžia vėluojančiąją grandinę

Po to formuojama nauja kilpa
 Šis procesas kartojamas daug kartų, kol visa
vėluojančioji grandinė yra susintetinama
DNR replikacijos kompleksai
4-36

37. 4-37

38.  DNR replikacijai būdingas didelis tikslumo laipsnis
 Vykstant šiam procesui klaidos daromos ypač retai

DNR pol III daro tik vieną klaidą 108
nukleotidų
 Yra keletas tokio didelio tikslumo priežasčių:
 1. Neteisingai suporuotų (mismatched) nukleotidų
nestabilumas
 2. DNR polimerazės aktyvaus centro konfigūracija
 3. DNR polimerazės “korektūros skaitymo”
(proofreading) funkcija
Korekcijos mechanizmai
4-38

39.  1. Neteisingai suporuotų nukleotidų nestabilumas
 Komplementarių bazių poros yra žymiai stabilesnės nei
nekomplementarių bazių poros
 Tačiau ši savybė nulemia tik dalį replikacijos tikslumo

Jei tai būtų vienintelis tikslumo užtikrinimo mechanizmas, tada
klaidų dažnis būtų 1/1 000 nukleotidų
 2. DNR polimerazės aktyviojo centro konfigūracija
 DNR polimerazė nekatalizuoja jungčių susidarymo tarp
neteisingų porų
 Tai sumažina klaidų dažnį iki 1/100 000 – 1 000 000
nukleotidų
Korekcijos mechanizmai
4-39

40.  3. DNR polimerazės “korektūros skaitymo” funkcija
 DNR polimerazė gali nustatyti neteisingai suporuotus
nukleotidus ir pašalinti juos iš dukterinės grandinės
 Fermentas naudoja 3’-5’ egzonukleazinį aktyvumą
neteisingam nukleotidui pašalinti
 Tada jis pakeičia veikimo kryptį ir pratęsia DNR sintezę
5’-3’ kryptimi
Korekcijos mechanizmai
4-40

41. 4-41
“Korektūros skaitymo” schema
Vieta, kurioje
kerpamas
DNR karkasas

42.  Bakterinės ląstelės gali dalintis ypač greitai
 E. coli  kas 20-30 minučių
 Todėl yra labai svarbu, kad DNR replikacija vyktų prieš
pat ląstelės pasidalijimą
 Bakterinė ląstelė reguliuoja DNR replikaciją
kontroliuodama iniciaciją oriC sekos vietoje
 E. coli tai daro dviem skirtingais būdais
Bakterinės DNR replikacija ir
ląstelės dalijimasis yra suderinti
4-42

43. 4-43
DnaA baltymo kiekis reguliuoja DNR replikaciją
Kai kurie degradavę; kiti prisitvirtinę prie ląstelės membranos
Dvigubai daugiau
DnaA dėžučių Nepakankamas DnaA
baltymo kiekis

44. 4-44
GATC sekų metilinimas oriC
DNA adenine
methyltransferase
Atpažįsta 5’ –
GATC – 3’ seką
ir prijungia
metilo grupę
prie adenino

45. 4-45
GATC sekų metilinimas oriC
Prieš replikaciją GATC seka yra
metilinta abiejose grandinėse
Šis pilnas metilinimas leidžia
inicijuoti DNR replikaciją
Po replikacijos GATC sekos
nėra metilintos dukterinėje
grandinėje
Šis dalinis metilinimas
neužtikrina replikacijos
efektyvios iniciacijos
Reikia keleto minučių kol Dam
metilazė metilins GATC sekas
dukterinėje grandinėje Vaizdas iš karto po DNR replikacijos

46.  Eukariotų DNR replikacija nėra taip gerai
ištyrinėta, kaip bakterijų
 Abudu procesai turi daug panašumų

Visi bakteriniai fermentai, išvardyti anksčiau, taip pat randami ir
eukariotų ląstelėse
 Tačiau eukariotų DNR replikacija yra sudėtingesnė dėl
šių priežasčių:

Ilgos linijiškos chromosomos

Standus DNR susipakavimas chromatine

Sudėtingesnė ląstelės ciklo reguliacija
4.3 EUKARIOTŲ DNR
REPLIKACIJA
4-46

47.  Eukariotams būdingos ilgos linijiškos chromosomos
 Todėl joms reikia daug replikacijos pradžių

Tai užtikrina, kad DNR bus replikuota per pakankamai trumpą laiką
Daugybinės replikacijos pradžios
4-47
DNR replikacija vyksta abiem kryptimis nuo daugelio
replikacijos pradžių

48. 4-48
Dvikryptė DNR
sintezė
Replikacijos
šakutės
susijungia
DNR replikacija, prasidedanti daugelyje replikacijos pradžių

49.  Replikacijos pradžios, randamos eukariotuose, turi
panašumų su bakterinėmis replikacijos pradžiomis
 Mielių Saccharomyces cerevisiae replikacijos pradžios
yra vadinamos ARS elementais (Autonomously
Replicating Sequence)

Jų ilgis 100-150 bp

Jie turi daug A ir T

Jie turi tris-keturias specifinių sekų kopijas
 Šios sekos panašios į bakterines DnaA dėžutes
Daugybinės replikacijos pradžios
4-49

50.  Pradžios atpažinimo kompleksas ORC (Origin
recognition complex)
 Šešių subvienetų kompleksas, veikiantis kaip
eukariotinės DNR replikacijos iniciatorius

Jis būdingas visiems eukariotams
 Jam reikia ATP, kad galėtų prisijungti prie ARS elementų
 Viengrandininė DNR stimuliuoja ATP hidrolizę, vykdomą
ORC
Daugybinės replikacijos pradžios
4-50

51.  Žinduolių ląstelėse yra daugiau nei 10 skirtingų
DNR polimerazių
 Keturios jų - alfa (α), delta (δ), epsilon (ε) ir gama
(γ) – pasižymi pirmine DNR replikacijos funkcija
 α, δ ir ε  Replikuoja branduolinę DNR
 γ  Replikuoja mitochondrinę DNR
Eukariotams būdingos kelios
skirtingos DNR polimerazės
4-51

52. Eukariotų (žinduolių) DNR polimerazės
Polimerazės tipas Funkcija
α, δ, ε Replikuoja nepažeistą DNR ląstelės branduolyje S
fazės metu
γ Replikuoja mitochondrijų DNR
η, κ, ι, ζ Replikuoja pažeistą DNR
α, β, δ, ε, σ, λ, µ,
θ, ϕ
DNR reparacija ir kitos funkcijos
4-52

53.  DNR pol α yra vienintelė polimerazė, asocijavusi su
praimaze
 DNR pol α/praimazės kompleksas sintetina trumpą
RNR-DNR hibridą

Paskui 10 RNR nukleotidų seka nuo 20 iki 30 DNR nukleotidų
 Šis hibridą naudoja DNR pol δ arba ε procesinei
pirmaujančiosios ir vėluojančiosios DNR grandinių
elongacijai

Didesnė yra DNR pol δ reikšmė
 DNR pol α pakeitimas pol δ arba ε yra vadinamas
polimerazės perjungimu (switch)
 Jis vyksta tik po to, kai yra susintetinamas RNR-DNR
hibridas
4-53

54. δ replikuoja
pirmaujančiąją grandinę
α/praimazė sintetina
RNR pradmenį ir
trumpą DNR fragmentą
α/praimazė
pašalinama
δ prisijungia ir sintetina
vėluojančiąją grandinę
4-54

55.  DNR polimerazė taip pat svarbi DNR
reparacijai
 DNR pol β nedalyvauja DNR replikacijoje
 Ji yra svarbi bazių ekscizijos reparacijai (BER)

Šis reparacijos tipas pašalina klaidingas bazes iš
pažeistos DNR
 Dabar nustatyta dar daugiau DNR
polimerazių
 Pažeistas vietas replikuojančios polimerazės

Dalyvauja pažeistos DNR replikacijoje

Gali susintetinti komplementarią grandinę esant
nenormaliai DNR sričiai
4-55

56.  Replikacija padvigubina DNR kiekį
 Todėl ląstelės turi sintetinti daugiau histonų, kad
patenkintų išaugusius poreikius
 Histonų sintezė vyksta S fazės metu
 Histonai susirenka į oktamerines struktūras

Jie asocijuoja su DNR prie pat replikacijos šakutės
 Todėl po DNR replikcijos kiekviena dukterinė
grandinė turi ir senų, ir naujų histonų
Nukleosomos ir DNR replikacija
4-56

57. 4-57

58.  Linijiškų eukariotų chromosomų abiejuose galuose
yra telomeros
Telomeros ir DNR replikacija
4-58
Terminas telomera atspindi telomerinės DNR sekos
ir su ja susijusių baltymų komplekso sudėtingumą.
Telomeros yra chromosomų struktūrinės dalys

59.  Telomerines sekas sudaro
 Vidutiniškai pasikartojančios tandeminės sekos
 3’ nuosvyra yra 12-16 nukleotidų ilgio
4-59
 Tipišką telomerinę seką sudaro
 Keletas guanino nukleotidų
 Dažniausiai daug timino nukleotidų

60. Kai kurių organizmų telomerinės sekos
Grupė Pavyzdys Telomerinė kartotinė seka
Žinduoliai Žmonės TTAGGG
Gleivūnai Physarum, Didymium,
Dictyostelium
TTAGGG
AT(1-8)
Grybai Neurospora TTAGGG
Mielės Saccharomyces
cerevisiae
TG(1-3)
Žiuželiniai Tetrahymena
Paramecium
Euplotes
TTGGGG
TTGGG(T/G)
TTTTGGGG
Aukštesnieji
augalai
Arabidopsis TTTAGGG
4-60

61.  DNR polimerazės pasižymi dviem svarbiomis
ypatybėmis
 1. Jos sintetina DNR tik 5’-3’ kryptimi
 2. Jos negali inicijuoti DNR sintezės
 Šios dvi ypatybės sukuria tam tikrų problemų
linijiškos chromosomos 3’ gale
4-61

62.  Ši problema nėra sprendžiama replikacijos metu
 Todėl linijiška chromosoma tampa vis trumpesnė po
kiekvienos replikacijos
 Tačiau ši problema ląstelėje sprendžiama pridedant
DNR sekas prie telomerų galų
 Šią reakciją katalizuoja fermentas telomerazė
 Telomerazę sudaro baltymas ir RNR
 RNR yra komplemetari telomerinei kartotinei DNR sekai

Dėl to telomerazė gali prisikabinti prie 3’ nuosvyros
4-62

63. 4-63
Žingsnis 3 =
Translokacija
Prisijungimo –
polimerizacijos –
translokacijos ciklas
gali kartotis daug kartų
Tai žymiai pailgina
vieną grandinę
Komplementarią grandinę
sintetina praimazė, DNR
polimerazė ir ligazė
RNR pradmuo
Žingsnis 2 =
Polimerizacija
Žingsnis 1 =
Prisijungimas