O documento descreve um estudo sobre o diagnóstico da mastite bovina utilizando a técnica de PCR multiplex. O trabalho desenvolveu um método de extração de DNA bacteriano a partir de amostras de leite e validou primers para detecção de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, S. dysgalactiae, S. uberis e S. aureus resistente à meticilina através de PCR multiplex. O método mostrou-se sensível, específico e eficiente para diagnóstico etiológico da mastite.

1. Aline Lemes
Fernanda Aquino
Marília Gomes
Viviane Pessin

2.  Inflamação das glândulas mamárias
 Prejuízos econômicos:
1. Queda na produção
2. Queda na qualidade
3. Perda de teto
4. Descarte de animais
5. custos com drogas, veterinário e mão de obra
 Perda mundial 35 bilhões $/ano
 Atividade leiteira

3.  Multifatorial
1. Trauma
2. Irritação química
3. Infecção microbiana
 Predomínio de Staphilococcus e
Streptococcus
 Tipos: sub clínica ou clínica

4. Clínica Sub clínica

5. IRRITAÇÃO
PERSISTENTE
I
I
I
PERDA DO
EPITÉLIO
SECRETOR

6.  Patógenos contagiosos:
1. Contaminam os quartos – ordenha
2. S. agalacteae, S. aureus, Corynebacterium bovis
 Patógenos ambientais:
1. Fezes, cama, solo, represas...
2. E. coli, S. dysgalacteae, S. uberis
 S. aureus, S. agalacteae,
S. dysgalacteae, S. uberis
90 – 95% dos casos

7.  Etiológico é fundamental
1. Rápido
2. Barato
3. Eficiente
 Análise fenotípica:
Expressão de fatores biológicos celulares – produção de
enzima, utilização de nutrientes, metabolismo,
susceptibilidade aos agentes químicos
 Análise genotípica
Detectam variações no DNA, normalmente estáveis e
pouco afetadas pelas condições ambientais – identifica
espécie, virulência, transmissão e fonte de infecção

8.  Bacteriológico
1. Caro
2. Ineficiente
3. Baixa sensibilidade
4. Cultura bacteriológica lenta
5. Isolamento e identificação
6. Técnicas bioquímicas
 Vacas sub clinicamente infectadas podem
eliminar intermitentemente o patógeno
 Cultura negativa por resíduos de antibióticos

9.  ETIOLÓGICO
Bacteriológico
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus resistente à meticilina
Streptococcus
 MOLECULAR
 PCR Multiplex
 PCR Ribotipagem
 Detecção de microrganismos no leite

10.  Local: EV – DMP – UFMG
 Doações da Embrapa Gado de Leite,
Universidade Federal de Lavras e Hospital das
Clínicas da UFMG
As amostras foram mantidas
em caldo BHI (Brain Heart
Infusion Broth Acumedia
Manufacters) com 50% de
glicerol a -20ºC até o
momento do uso.

11.  Plano de execução do experimento

12.  PCR – Primer – amplifica segmentos específicos

13.  Extração de DNA
1. Preparação da amostra: retira cálcio, principal
inibidor da PCR no leite
2. Extração: retira o DNA
3. Purificação do DNA: retira proteínas e debris
celulares através do protocolo de Fenol-Clorofórmio

14. Extração de DNA a partir de amostras de
bactérias de referência em cultura pura
Extração de DNA a partir de amostras de
bactérias de referência em leite artificialmente
contaminadas
Extração de DNA a partir de amostras de leite de
tanque de expansão

15.  Padronização das PCRs
 Individual
 Multiplex
 Ambas com DNA obtido a partir de amostras de
bactérias de referência em cultura pura
 PCR Multiplex para detecção de microrganismos
a partir das amostras de leite de tanque de
expansão

16.  Avaliação da especificidade verificada:
 Utilizando Streptococcus bovis,
Staphylococcus intermedius e S. epidermidis,
comumente encontradas no leite

17.  Especificidade dos Primers
Bandas de DNA esperadas para cada
microorganismo
Exceto, S.aureus em que se observou 3 bandas
com predomínio de 900pb na maioria

18. Figura 1: Fragmentos de DNA amplificados por PCR a partir de culturas
puras de S. aureus e Streptococcus spp.

19.  Sensibilidade do PCR a partir de culturas
puras
PCR Individual  10pg de DNA
PCR multiplex  500pg de DNA
 S. uberis, S. agalactiae, S. dysgalactiae e S. aureus
MRSA  250pg de DNA

20.  Sensibilidade da PCR a partir de amostras do
leite
PCR individual  10²UFC/mL
PCR multiples  10³UFC/mL

21. Figura 2. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de
concentrações seriadas de S. agalactiae (270 pb), visualizados em gel
de agarose 2%.

22. Figura 3. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de
concentrações seriadas de S. dysgalactiae (264 pb), visualizados em gel
de agarose 2%.

23. Figura 4. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de
concentrações seriadas de S. uberis (330 pb), visualizados em gel de
agarose 2%.

24. Figura 5. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de
concentrações seriadas de S. aureus (900 pb, 420 pb, 200 pb),
visualizados em gel de agarose 2%.

25. Figura 6. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de
concentrações seriadas de MRSA (533 pb), visualizados em gel de
agarose 2%.

26.  Testes em amostras de leite de tanque de
expansão
Nas figuras e na tabela a seguir se encontram
os resultados obtidos das 30 amostras de
tanque de expansão.
Não foi observada interferência do azidiol
presente na amostra.

27. Figura 7. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de leite
de tanque de expansão, visualizados em gel de agarose 2%.

28. Figura 8. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de leite
de tanque de expansão, visualizados em gel de agarose 2%.

29. Figura 9. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de leite
de tanque de expansão, visualizados em gel de agarose 2%.

30. Tabela 1. Utilização da PCR multiplex para detecção de microrganismos
em leite bovino com diferentes contagens bacterianas totais e contagens
de células somáticas, diretamente do tanque de expansão.

32.  Teste diagnóstico
Controlar e erradicar doenças
OBJETIVO

33.  Para garantia de sucesso, temos como
característica impressindível a Sensibilidade
 Desenvolvimento de métodos rápidos e
sensíveis para a diferenciação de
microorganismos
 Com isso, metódos genotípicos substituem
métodos fenotípicos

34. Métodos fenotípicos Métodos genotípicos
Falso negativo Rápida e acurada
identificação
Valores ambientais
interferem
Não tem interferência do
meio (genoma)
Baixa reprodutibilidade Vantagem da
reprodutibilidade
Baseia em características
instáveis dos
microorganismos
Rapidez Sensibilidade Reprodutibilidade

37.  A caseína é um dos principais inibidores
presentes no leite, em associção com cálcio
forma micelos
 Adição de solução com alta concentração de
EDTA quelam (eliminam os metais tóxicos) o
cálcio dissolvendo os micelos de caseína
 No experimento usou-se o tampão NET (alta
[EDTA])

39.  No trabalho realizado utilizou-se bactérias
Gram-positivas
 parece celular mais resistenteparece celular mais resistente

40.  O método de extração para DNA dessas
bactérias na amostra apresentada mostrou-se:
Eficiente
Fácil realização
Reagentes econômicos
Equipamentos sofisticados não foram requeridos
Pouca manipulação da amostra
Tempo de análise de processo aproximadamente
8 horas

44.  Pré dipping e pós dipping
 Terapia da vaca seca
 Tratamento eficaz e eficiente
 Descarte de animais crônicos
 Manutenção regular da ordenhadeira
mecânica

45.  Marisa Araújo Silva. Utilização de PCR
multiplex para o diagnóstico etiológico da
mastite bovina. Dissertação de mestrado
UFMG. 2008.