Informe de laboratorio que muestra el procedimiento y resultados al realizar tinciones diferenciadoras en bacterias.

1. Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Facultad de Ciencias Biológicas
Escuela Académico Profesional de Ciencias Biológicas
Laboratorio de Microbiología Géneral
Practica N° 5
Coloración Gram y Ziehl Neelsen
Alumno: Merino Loayza, Aarom Sebastian 16100075
Profesores: Dr. Enrique Mamani Zapana
Dra. Egma Mayta Huatuco
Mg. Chistrian Guillermo Florian Carrillo
Fecha de elaboración: Miércoles 6 de Setiembre del 2017
Fecha de entrega: Miércoles 27 de Setiembre del 2017
Lima – Perú
2017

2. Índice
Introducción:.......................................................................................................................3
Marco teórico:.....................................................................................................................3
Tinción Gram:...................................................................................................................3
Fundamento de la tinción Gram: .......................................................................................4
Tinción de Zhiel Neelsen .............................................................................................5
Fundamento de la tinción Zhiel Neelsen:............................................................................6
Parte experimental:..............................................................................................................6
Tinción Gram:...................................................................................................................6
Materiales:...................................................................................................................6
Procedimiento:.............................................................................................................6
Tinción Ziehl Neelsen:.......................................................................................................7
Materiales:...................................................................................................................7
Procedimiento:.............................................................................................................7
Resultados:..........................................................................................................................8
Tinción Gram:...................................................................................................................8
Tinción Ziehl Neelsen:.......................................................................................................9
Discusión:..........................................................................................................................10
Tinción Gram:.................................................................................................................10
Tinción Ziehl Neelsen:.....................................................................................................10
Cuestionario:......................................................................................................................10
Bibliografía:........................................................................................................................11

3. Introducción:
La identificaciónde muestrasesesencial paralaelaboraciónde estudiosparaellose
desarrollaronherramientasde granutilidadcomoel microscopio,el cual brinda lafacilidadde
entregarunaimagenaumentadadel objetoaestudiar,parapotenciardichobeneficiose
desarrollarontincioneslascuales permitanunaidentificaciónde lasmuestrasobservadas.
Las distintastincionespueden tenerorigen natural (extraídasde animalesoplantas) yde
origenquímico (mineralesadulteradosenlaboratorio),sinimportarel origende lastinciones,
su funciónprincipal eslade resaltarestructurasycaracterísticas del tejido,célulasy
microorganismos. Unosclarosejemplosde estoson lascoloraciones GramyZiehl
Neelsen(tincioneslascualesse ejecutaronenlapresente practica) lascualespermitenel
reconocimientode génerosespecíficossegún losresultados de lastincionessobre lasparedes
celularesde lasbacteriassometidas.
Para finalizarcadatinciónposee unfundamento,el cual se basaenetapas,etapasenlas cuales
se agregan reactivosocondicionesdiferentes,yendichasetapasque ocurre con la estructura
afectada.Las etapaso procesosmáscomunesenlas tincionesmicrobianasconstande:
Coloraciónprimaria,mordiente,decoloraciónycoloraciónsecundariaode contraste.
Marco teórico:
Los ejesconceptualessobre el cual nosapoyamosparala aplicaciónde lastincioneso
coloracionesGramy Ziehl Neelsen sonlossiguientes:
Tinción Gram:
SegúnEsaú,Hernández(2014):
Esta tinción es unprocedimiento de gran utilidad empleadoen los laboratorios donde se
manejan pruebasmicrobiológicas.Esdefinidacomounatincióndiferencial,yaque utilizados
colorantes yclasificaa las bacteriasendosgrandes grupos:bacteriasGramnegativasy
bacteriasGram positivas. Fue desarrolladaporel científicodanésHansChristianGramen
1884; hoyen día, sigue siendounade lastincionesmás utilizadasuniversalmentedebidoalo
económico,sencilloyeficazqueresulta. Enmicrobiologíaclínicaresultade granutilidad,yaque
a partir de muestrasclínicasdirectasprovenientesde sitiosestérilesse puede saberde manera
rápidalas característicasde lamuestray hacer una diferenciade lospotenciales
microorganismoscausantesde unainfección. Losprincipios de latinciónde Gramestán
basados enlascaracterísticas de laparedcelularde lasbacterias, lacual leconfiere propiedades
determinantes acadamicroorganismo. Laparedcelularde lasbacteriasGramnegativas está
constituidaporunacapafinade peptidoglicanoyunamembranacelularexterna,mientrasque
lasbacteriasGram positivasposeenunapared celulargruesaconstituidaporpeptidoglicano,
peronocuentan con membranacelularexterna;asípues,lacomposición químicayel contenido
de peptidoglicanoen laparedcelularde lasbacteriasGramnegativasyGrampositivas explicay
determinalascaracterísticastintoriales (Figura 1).

4. Fundamento de la tinción Gram:
La tinciónGramse basaen colocar comocolorante primariocristal violeta,el cual tiene
afinidadconel peptidoglicanode laparedbacteriana.Posteriormente,se colocalugol,el cual
sirve comomordiente e impidelasalidadel cristal violetaporlaformacióndeuncomplejo
cristal violeta-yodoque saturalosespaciosdel peptidoglicanode laparedbacteriana. En
seguida,se colocaunamezclade alcohol-acetona,lacual deshidratalaparedbacterianay
cierralos porosde la misma,tambiéndestruyelamembranaexternade lasbacterias Gram
negativasdebidoaque éstaessoluble alaacción de solventesorgánicos,comolamezclade
alcohol- acetona. LasbacteriasGrampositivas,al contenerunagrancantidadde peptidoglicano,
retienenconmayorfuerzaeste complejo,mientrasque lasGramnegativasnolopueden
retenerportenermenoscantidadde peptidoglicano.Porúltimo,se colocasafranina, lacual
funcionacomoun colorante secundarioode contratinciónysirve parateñirlasbacteriasque
no pudieronretenerelcomplejocristalvioleta-yodo. Haybacteriasdeunmismogéneroque
puedenobservarse enlamismamuestracomoGram positivasycomoGram negativas,aeste
eventose le llamatinciónGramvariable secundariaaalteraciónen nutrientes,temperatura,
pH o concentraciónde electrolitos. Losresultadosobtenidosenunacorrectatincióngramse
vencuandolas Gram(+) poseenunacoloraciónmoradao azul ylas Gram(-) poseencoloración
rosada o fucsia(Figura2). Sinembargo,estatinciónnoesaplicable entodaslasbacterias,
como laspertenecientesal género Mycobacterium lascualesposeencerasyácidosmicolicos.
Figura 2. Fotomicrografíadon-dese observan bac- teriasGramnegativas en cultivo di recto
(izquierda) y Gram positivas en hemo- cultivo (derecha) (au-mento 100x).Imagen en:
www.medigraphic. com/rid

5. Tinción de Zhiel Neelsen:
En palabrasde Aliaga(2007):
Latinción de Ziehl-Neelseneslatécnicacomúnmenteusadaenel diagnósticorutinariode
tuberculosis. Esunatécnicarápida,fácil yde bajocosto, loque permiteque se puedarealizar
encasi cualquierlabo-ratorioclínico.Estatinciónpermite diferenciaralas bacteriasendos
grupos:aquellosque soncapacesde resistirladecoloración conalcohol-ácidoyaquellosque no
loson. La sensibilidadde estatinción paraidentificarbacilosácido-alcohol resistentes esdel74%
y la especificidaddel 98%, teniendounlímite de detecciónde 5,000-10,000 bacilos/mLde
muestra. El agente etiológicode latuberculosis fuedescritoporHeinrichHermannRobert Koch,
quien,basándoseen lascaracterísticasde lasmicobacterias,desarrollóunade las primeras
tinciones utilizandoazulde meti- lenoseguidode latinciónde Bismarck.Sin embargo,fueron
lostrabajosde Paul Ehrlichlosque definieron laresistenciaaladecoloración poralcohol-ácido,y
lasúltimasmodificacionesalatinciónfueronrealizadasporloscientíficos alemanesFranzZiehl
y Karl Adolf Neelsen. El géneroMycobacteriumeselúnicomiem- broenlafamilia
Mycobacteriaceaeyestárelacionadoconotrosgénerosque contienenácidos micolicos
(Gordonia,Tsukamurella yRhodococcus), loscualestambiénpuedenserteñidoscon esta
tinción. Laparedcelulardelasmicobacteriasesextremadamente complejaencuantoasu
composiciónbioquímica;dichacaracterísticaeslaquese haaprovechadopararealizarlatinciónde
Ziehl-Neelsen. Laparedcelularestácom-puestaporácidomesodiaminopimélico, alanina,ácido
glutámico, glucosamida,ácido murámico, arabinosaygalactosa(Figura 3).Losácidosmicólicos
(70-90 númerodeátomosdecarbono)juntoconlípidoslibres(ej.trealosa-6,6´-dimicolato)
proveenalacéluladeunabarrerahidrofóbica.Otrosácidosgrasosimportantesson:ceras,
fosfolípidos, ácidosmicoséricos yphtienoico.
Figura 3. Representación esquemática de la composición de la pared celular de las
micobacterias.

6. Fundamento de la tinción Zhiel Neelsen:
Latinciónsebasaencolocarcarbol-fucsinaycalentarlapreparaciónligeramenteparasolubilizarlas
ceras, lípidosyotrosácidosgrasosde laparedcelularparaque permitael pasolibredel
colorante,el cual tiene una enormeafinidadporlos ácidosmicólicos presen- tesenlapared.Al
enfriarconagua, loscomponentesde laparedvuelvenasolidificar,resistiendolaacción
abrasivadel alcohol-ácido,yel azul de metilenose utilizacomocontratinción (Figura 4).Las
muestras clínicasútilesparasuusosonmúltiples,comoellíquidocefalorraquídeo, líquidopleural,
líquidosinovial, líquidopericárdico, biopsiasparacultivo,abscesos,aspirados,crecimientode
colonias aisladasenmediosde cultivo, expectoraciones,aspiradosendotraqueales ylavados
bronquioalveolares.Unatinción positivaesaquéllaen laqueseobservanbacilosácido-alcohol
resistentes, loscualessondecolorrojofucsia.
Figura 4. Fotomicrografíade una muestrade expectora- cióndonde se observanlos
bacilosde colorrojo fucsia(Mycobacterium spp)(aumento100x).
Fuente: Imagen en color en: www.medigraphic.com/rid
Parte experimental:
Tinción Gram:
Materiales:
 Placascon coloniasbacterianasde Staphylococcus,Enterococcus,bacillus,E.coli,
Proteus y Salmonella.
 Laminasportaobjetoslimpiasydesengrasadas.
 MecheroBunsen
 Microscopiocompuestoconlente de inmersión(100x)
 Aceite de inmersión
 Batería de coloración(Cristal violeta,lugol,alcohol-acetonaysafranina)
 Pisetaconagua destilada
 Papel lente yalcohol isopropílico
Procedimiento:
Para la realizaciónde estatinciónse siguieronlospasosoetapassustentadasenlateoríadel
fundamento.Primerose colocóunapequeñagotade agua enel centrode lalámina
portaobjeto,luegose flameoel asade siembraparatomar encondicionesasépticasuna
pequeñacantidadde cultivobacteriano(Staphylococcus,Enterococcus,bacillus,E.coli, Proteus
y Salmonella) yluegose dejósecarlas muestrasconayuda del mechero,tomandolas
precaucionesde que el calornosea enexceso.Laprimeraetapade lacoloraciónprimariase
utilizócristal violetaovioletade genciana,estecolorante se dejóencontactocon lasmuestras

7. enun tiempoaproximadode 90segundos,unavezterminadoel tiempode contactose lavó
lasmuestrascon abundante agua.En la segundaetapase agrególugol que actuó como
mordiente,el tiempoencontactoconlasmuestrasfue tambiénde aproximadamente90
segundos.Lasiguiente etapa realizadafue lade decoloración,enestaetapalasmuestras
fueronlavadasconabundante aguay luegose agregaronunas cuantasgotas de alcohol
acetonadurante un tiempoaproximadode 60segundos.Laúltimaetapade coloración
secundariase agregóFucsinao safranina(Figura 5).Finalmentese llevaronlasmuestrasal
microscopioycon el usode aceite de inmersiónyel lentede 100x se vieronlosresultados
obtenidos. Luegose procedióalimpiarel lente del microscopioconpapel lente humedecido
enalcohol isopropílico.
Figura5. Procedimiento de la tinción Gram
Fuente: https://www.wikipedia.com.es/tincion.gram
Tinción Ziehl Neelsen:
Materiales:
 Laminasdebidamenteteñidasproporcionadasporel docente
 Muestra de esputode unpaciente contuberculosis
 Asa de siembra
 Laminasportaobjetoslimpiasydesengrasadas
 MecheroBunsen
 Microscopiocon lente de inmersión(100x)
 Aceite de inmersión
 Batería de coloración
 Papel lente yalcohol isopropílico
Procedimiento:
Para la realizaciónde estatinciónse tomóconel asa de siembrapreviamente esterilizada,una
pequeñacantidadde muestrade esputodel pacientecontuberculosis,dichamuestrade
espacioen unrectángulo de 2x3 cm aproximadamente paraluegodejarlasecaryfijarlaal
calor.La segundaetapafue lade aplicacióndel colorante primarioque eneste casofue la
fucsina,luegose calentólaláminahastaque estase emitieravapores,se cuidóque lafucsina
no se seque ni hierva,dichoprocesode repitióvariasvecesdurante 5minutos.Luegose lavó
con abundante agua.La decoloraciónse realizóconlasoluciónalcohol acidohastaque no
quedócoloración roja,luegose lavóconagua. La coloraciónde contraste se realizóconazul de
metilenodurante 2minutos (figura 6).Parafinalmente lavarysecarla muestra,unavez

8. hecho,se llevólamuestraal microscopioycon ayudadel aceite de inmersiónse observóla
muestraa 100x.
Figura 6. Procedimiento de la tinción Zielh Neelsen
Fuente: http://www.medical-labs.net/ziehl-neelsen-acid-fast-staining-procedure-822/
Resultados:
Tinción Gram:
Los resultadosobtenidosenestatinciónfueroncorrectosencasi sutotalidad,estoesdichoya
que algunasmuestrasfueronafectadasenel procesode tinción.Losresultadosobtenidosen
la tinciónGrammuestranque de las 6 bacteriasexpuestasala tinción,3pertenecenalas
Gram (+) y lasrestantesa lasGram (-) comomuestrala tabla1:
Coloración Grupo
Staphylococcus Violeta Gram (+)
Enterococcus Violeta Gram (+)
Bacillus Violeta Gram (+)
E. coli Rosa Gram (-)
Proteus Rosa Gram (-)
Salmonella Rosa/violeta Gram (-)
Tabla 1. Resultados de la tinción Gram.
Comose ve enla tablaanteriorla mayoría de muestrasmostraronel resultadoesperado,sin
embargo,lamuestrade Salmonella mostro bacteriasrosasy violetas,dichoresultadose llevóa
discusión.

9. (a) (b) (c)
Figura 7. Muestras de coloración Gram (+): (a) Bacillus, (b) Staphylococcus, (c) Enterococcus
(a) (b) (c)
Figura 8. Muestras de coloración Gram (-): (a) Salmonella (b) Proteus (c) E. coli
Tinción Ziehl Neelsen:
Los resultadosmostradosporestatinciónfueronlosesperados,lamuestrade esputode un
paciente contuberculosis(Mycobacteriumtuberculosis) mostróalasbacteriasde la muestra
de un color grosellaofucsiacontrastadasconel fondode azul de metilo (Figura 9).Estohace
entenderque lascerasy losácidos micólicosestánpresentesenlasparedescelularesde las
bacteriasde la muestradandoa entenderque lasbacteriasde laespecie Mycobacterium
tuberculosis sonbacteriasácido-alcohol resistentes(BAAR).
Figura 9. Muestra de Mycobacterium tuberculosis en tinción Ziehl Neelsen.

10. Discusión:
Tinción Gram:
Si bienlosresultados obtenidosfueronsatisfactorios,losresultadosdejarondiferentespuntos
a discutircomo el procesode fijaciónal calor,este procesose debe tenercuidadoyaque la
exposiciónaunaaltatemperaturapodríaatrofiar lamuestrahaciendoque lamuestrapueda
desperdiciarse.Encuantolamuestrade salmonella sp. unade lascausas de que esta resultara
con bacteriasde coloraciónmoraday fucsiapodría sera la bateríade coloraciónempleada
para el desarrollode latinción,paraevitardichoinconveniente se recomiendautilizaren
mayor tiempolacoloraciónsecundaria unalcohol-acetonade mayorconcentración,todoesto
con el finde que se evitenestosproblemas,sinembargo,al descartarunaposible causadel
error a la batería de coloraciónpodríaver tambiénconla muestra,lacual podría estar alterada
enconcentraciónde electrolitos,pH,temperaturayotrascausas relacionadasensi ala
muestra.
Tinción Ziehl Neelsen:
Despuésde obtenerlosresultadosde lamuestraparauna cloraciónpositivaparabacterias
BAAR,no se realizóunamuestrapara contrastar resultadosconunamuestrano BAAR,sin
embargo, el únicoresultadodejounparde puntosa discutir,comoel cuidado que se debe
teneral trabajar con este tipode muestrasy esque por su altapatogenicidadse debentomar
lasmedidasde precauciónnecesarias. El otropuntoque discutiresque lacoloraciónempleada
fue utilizayaque ante estamuestrala coloraciónGram que obsoletaacausa de la naturaleza
bioquímicade laparedcelularde las bacteriasde este género.
Cuestionario:
I. ¿Qué factoresinfluyenenunacorrectatinciónGram?
Los factoresque determinanunacorrectatinciónGram vandesde la
concentraciónde nutrientes,el pH,latemperatura,concentraciónde electrolitosy
ademásdel estaenel que se encuentranlosreactivosotincionesempleadas.
II. ¿Qué funcionestieneel lugol yel alcohol de acetonaenlatinciónGram?
Fundamente.
Lugol:La funciónde este enlastincionesGrameslade mordiente ofijadordel
colorante primario,laacciónde este reactivoeslade impedirlasalidadel
colorante primarioformandoel complejocristal violeta-yodo,que saturalos
espaciosde peptidoglicanode laparedcelular.
Alcohol de acetona: La acción de estamezclaesque deshidratalapared
bacterianay cierralosporos de la misma,tambiéndestruye lamembranaexterna
de lasbacterias Gramnegativasdebidoaque éstaessoluble alaacción de
solventesorgánicos,como lamezclade alcohol- acetona. LasbacteriasGram
positivas, alcontenerunagrancantidadde peptidoglicano,retienenconmayor
fuerzaeste complejo,mientrasque lasGramnegativasnolopuedenretenerpor
tenermenoscantidadde peptidoglicano.

11. III. ¿Para que se utilizael aceite de inmersión?
El usodel aceite de inmersiónse basaenel aprovechamientode losentesde
aumento100x los cualesal estartan cerca de la muestranopermitenlaentrada
directade la luz,ante estose aplica sobre lamuestrauna gota de aceite de
inmersión,esteúltimoreflejarayesparciráloshacesde luzhaciendoque la
visualizaciónde muestraspequeñasseamasfácil.
Bibliografía:
 Anonimo,TinciónZiehl Neelsen.Receperadoel 22de septiembre de 2017 de
http://www.medical-labs.net/ziehl-neelsen-acid-fast-staining-procedure-822/
 Anonimo,TinciónGram.Recuperadoel 22de septiembrede 2017 de
https://www.wikipedia.com.es/tincion.gram
 Tincionesbacterianas.Recuperadoel 22de septiembre de 2017 de
http://www.medigraphic.com/rid
 Esaú,Hernandez(2014).Lastincionesbásicasen el laboratoriode microbiología.
Investigacionendiscapacidad,3(4),11-18
 Aliaga(2007).Morfologiaytincionesbacterianas.Manual de prácticasdel Laboratorio
de Microbiologíageneral de UNAM,5(9), 22-37