Microdialyse et quantification des neurotransmetteurs
1. MICRODIALYSE ET QUANTIFICATION DES
NEUROTRANSMETTEURS DANS LE CERVEAU
Réalisé par:
o Omari Zineb
o Lguensat Asmae
o Boudjafad Zineb
Encadré par:
Pr. Bennis M.
2. INTRODUCTION
Initialement utilisée dans l’épilepsie, la microdialyse est
rapidement devenue un outil d’exploration clinique en
réanimation neurologique.
Quittant le strict domaine de la recherche, elle connaît un
développement important pour devenir une technique
intégrée au monitorage multimodal des patients.
3. DÉFINITION
La technique de microdialyse permet le dosage simple
des substrats présents dans le liquide extracellulaire de
nombreux organes (tissu sous cutané, muscle, poumon,
myocarde, …) sans recours à une extraction tissulaire.
Micro: se réfère aux très petites échelles.
Dialyse: se réfère aux mouvements des substances chimiques à
travers une membrane perméable
4. HISTORIQUE
La microdialyse cérébrale a largement été utilisée dans le
domaine de la recherche depuis le début des années 70.
5. TECHNIQUES D’UTILISATION
Trois grandes stratégies peuvent être employées:
Dosage simple des
substrats présents
dans le liquide
extra-cellulaire;
Perfusion de
médicaments ou
de composés
évoquant une
réponse
biochimique
(libération de
neuromédiateurs)
et dosages des
substrats du liquide
extra-cellulaire;
Perfusion de
médicaments et
étude de sa
captation par le
compartiment
cérébral.
10. La sonde est par la suite
perfusée par un liquide (Ringer
par exemple)
11. Molécules du perfusat
pompées vers la structure
cible.
Molécules du dialysat
acheminées par un capillaire
au centre de la sonde vers
un micro tube.
12. La membrane semi-perméable permet le
passage des molécules de petite taille.
Les molécules présentes dans le fluide
extracellulaire diffusent à travers la
membrane de dialyse suivant un gradient
de concentration et sont collectées à la
sortie de la sonde
Membrane semi-
perméable
13.
14.
15. FACTEURS INFLUENÇANT LE RENDEMENT DE
LA MICRODIALYSE
Température
Surface de la membrane de dialyse.
Ampleur du gradient de concentration.
Débit à travers la sonde.
Type de membrane de dialyse. Les membranes ont
différentes tailles de pores.
La taille des molécules diffusant à travers la
membrane.
16. APPLICATIONS
Chez l’animal (rat)
En plus des tissus cérébraux, les
organes tels que les reins, le foie et
le cœur sont perfusés pour
comprendre le comportement de
certaines molécules ou observer
les effets d’un agent
pharmacologique.
Chez l’Homme
Utilisée cliniquement au niveau
sanguin, musculaire et aussi au
niveau cérébral pour des soins
intensifs:
détection d’une ischémie dans des
circonstances pathologiques variées
: hémorragie sous-
arachnoïdienne,traumatisme crânien
grave,…
21. Infarctus sylvien
malin
Libération
massive du
glutamate et
du glucose.
Élévation du
rapport
lactate/pyruv
ate.
Hémorragie
sous
arachnoïdienne
Élévation des
taux
d’aspartate et
de glutamate
Variations de
lactate est
peu
interprétables
alors que
l’élévation du
rapport
lactate/pyruv
ate au-delà
de 25
Traumatisme
crânien grave
Glucose bas
(150μmol/l)
Elévation du
lactate et du
rapport
lactate/pyruv
ate
Elévation du
glutamate
(glutamate>2
0 μmol/l).
Ischémie
cérébrale
Augmentation
massive du
glutamate, de
l’aspartate, du
rapport
lactate/pyruvate
et du glycérol.
23. I-AVANTAGES
la membrane de dialyse
permet de diffuser les
molécules de bas poids
moléculaire.
Les neurotransmetteurs
présents dans l’échantillon
peuvent être identifiés et
dosés
les risques de
contamination des
échantillons sont
négligeables.
des agents
pharmacologiques
peuvent être administres
de manière constante vers
les cellules
cette technique couplée a
des appareils d’analyse
permet d’étudier le
comportement des
neurotransmetteurs vis-a-
vis de ces molecules
exogenes
24. II- LIMITES
Possibilité
d’hémorragie
intracérébrale.
C’est un outil de
surveillance très local
Le cathéter et la sonde
de microdialyse sont
fragiles
les composés ayant
une masse moléculaire
importante diffusent
plus lentement a travers
la membrane de dialyse
Possibilité d’influencer
le métabolisme et de
légèrement modifier les
concentrations des
molécules
25. CONCLUSION
La techniques de microdialyse a été développée afin de
:
limiter les problèmes d’extraction
analyser les molécules issues de la fente synaptique lors de la
neurotransmission.
administrer des agents pharmacologiques pour étudier leurs effets
dynamiques ou cinétiques sur la concentration des NT
À l’opposé, la microdialyse, de part sa sélectivité
membranaire sera préférée pour l’analyse de
neurotransmetteurs dans des tissus cérébraux riches
en molécules.
l’introduction dans le cerveau d’une sonde contenant à son extremité une membrane semi-perméable à l’eau et aux petites molécules (Ce de 6000 à 100 000 daltons).
La membrane semi-perméable est de longueur connue (entre 1 et 3 mm) constituant la chambre de dialyse.
La zone étudiée par la microdialyse (ou résolution spatiale) est de l’ordre de quelques millimètre cubes.
La membrane est habituellement perfusée avec un milieu aqueux proche du liquide céphalorachidien afin d’éviter les mouvements excessifs de molécules autour de la membrane en rapport avec un gradient osmotique fort. La solution de Ringer est également utilisable.
La vitesse de perfusion de la solution est très faible et peut varier de 0,1 à 0,2 microlitre par minute.
La concentration du dialysat ne peut représenter l’exacte concentration du milieu extracellulaire, mais plutôt une fraction de celle-ci dépendant principalement du rendement de la membrane. Ce rendement est estimé par le rapport entre les concentrations dans le dialysat et les concentrations dans le milieu extracellulaire (rendement relatif). Il dépend principalement de la longueur de la membrane, des pores de la membrane, du débit de perfusion de la sonde, de la composition du perfusat et de la diffusion des molécules. Ainsi, plus le débit de perfusion de la membrane est élevé, plus le temps de contact du perfusat avec la membrane sera court et plus le rendement sera faible. Au contraire, le rendement de la membrane sera amélioré par des débits de perfusion faibles.
La microdialyse est constituée d’une sonde avec, à son extrémité, une membrane de dialyse semiperméable. A l’intérieur de la sonde, s’écoule du liquide
physiologique par le biais d’une pompe, un équilibre est alors créé avec les tissus interstitiels autour de la sonde. Les molécules présentes dans le fluide extracellulaire diffusent à travers la membrane de dialyse suivant un gradient de concentration et sont collectées à la sortie de la sonde
Le glucose extracellulaire reflète la balance entre les apports et l’utilisation du glucose par les cellules. Des études chez le rat ont permis de démontrer que le glucose cérébral mesuré en microdialyse est un bon marqueur d’ischémie sévère, et qu’il pourrait aider à différencier entre ischémie partielle et complète.
Le glutamate est un neurotransmetteur physiologique ; il est donc habituellement détectable dans les liquides extra-cellulaires où sa concentration varie de 2 à 10 μmol/l. En situation d’ischémie, il est libéré massivement, les concentrations pouvant alors atteindre 600 μmol/l.
Le rapport lactate—pyruvate extracellulaire reflète l’état d’oxydoréduction intracellulaire qui est en relation étroite avec le fonctionnement mitochondrial. L’utilisation de ce rapport permet de s’affranchir des variations interindividuelles de rendement des membranes de microdialyse observées lors de la mesure d’un seul paramètre. Ce rapport est un marqueur plus sensible pour la détection de l’ischémie que le lactate seul. Sa valeur normale serait inférieure à 20.
Des études animales ont permis de montrer que le glycérol est un bon marqueur de l’étendue des lésions ischémiques cérébrales. Le glycérol serait un meilleur marqueur que le glutamate pour l’ischémie cérébrale expérimentale. Chez l’homme, on retrouve cette augmentation après ischémie focale ou traumatisme crânien grave.
(Ce de 6000 à 100 000 daltons).
Cette selectivite empechant la diffusion des enzymes, les substances recoltees dans le microdialysat sont moins sujettes aux possibles degradations enzymatiques et sont donc plus stables pour l’analyse.
dosés avec des techniques separatives telle que la chromatographie liquide
La microdialyse presente l’avantage d’eviter le prelevement de liquide cerebral et le contact direct du liquide avec les tissus
(quelques millimètre cubes de parenchyme cérébral au maximum
et le risque de rupture de la fibre n’est pas négligeable chez les patients agités
L’ordre de grandeur des sondes d’analyses (1-4mm) peut limiter les regions implantables et notamment chez les petits animaux comme les rats.
