2. INTRODUCCION
■ H2S exógeno tiene profundos efectos fisiológicos
■ mejor resultado después del infarto de miocardio en mamíferos (Elrod et al.,
2007; Simon et al., 2008)
■ mayor esperanza de vida en nematodos (Miller y Roth, 2007).
■ pequeñas cantidades de H2S reducen la tasa metabólica basal y el consumo de
oxígeno 10 veces menos y exhiben una reducción correspondiente en en
ratones (Blackstone et al., 2005)
■ H2S también mejora la supervivencia de los ratones en hipoxia (Blackstone y
Roth, 2007).
3. HIF-1
(Cerychova and Pavlinkova
2018)
(Shao et al. 2010)
• usaron C. elegans para
estudiar la influencia
de H2S en HIF-1
• hif-1 es necesario
cuando los nematodos
están expuestos a H2S.
• ↑HIF-1 --->
↑concentración
máxima tolerable de
H2S.
• H2S e hipoxia causan
aumento tanto de la
concentración y
localización nuclear
de HIF-1.
• H2S e hipoxia son
distintos, con
diferentes patrones de
actividad
transcripcional de HIF-
1
4. MATERIALES Y
METOD0S
Cepas
■ N2 Bristol
■ CB5602, vhl-1(ok161)
■ JT307, egl-9(sa307)
■ ZG31 hif01(ia04)
■ CB6088, egl-9(sa307), hif-1(ia04)
■ CB6090, vhl-1(ok161), hif-1(ia04)
■ ZG120 nhr-57::gfp(iaIs07)
■ Cámaras atmosféricas
– atmósfera de 5 ppm de H2S
atmósferas que contienen H2S
(5000 ppm de H2S con aire
ambiente)
– La cámara hipóxica tenía 5000
ppm de O2 con nitrógeno.
■ Prueba de viabilidad
– larvas L4 se trasladaron a la
cámara que contiene H2S
durante 24 h
■ Producción de anticuerpos
– generó el anticuerpo
monoclonal contra HIF-1 en
ratones
■ Inmunotinción
■ Análisis de Western Blot
■ Cuantificación de ARNm
■ Microscopía de fluorescencia de
5. RESULTADOS
■ Supervivencia de C. elegans en H2S
■ C. elegans expuestos a atmósferas que contienen H2S en el aire ambiente durante 24
h. La supervivencia dependía de la dosis, con gusanos de tipo salvaje que
sobrevivieron 50 ppm de H2S pero no 150 ppm de H2S.
6. Figura complementaria 1
La inmunotinción muestra que el
anticuerpo generado es específico para
HIF-1. egl-9 (sa307) y vhl-1 (ok161) tienen
niveles constitutivamente altos de HIF-1
por inmunotinción. hif-1 (ia04) demuestra
la tinción de fondo. Las imágenes son
apilados de todos los núcleos visibles con
tinción DAPI. Los animales se tiñeron con
anticuerpo anti-Ce-Hif-1 (a, d, g) y DAPI
(b, e, h) para visualizar los núcleos. Los
núcleos hipodérmicos (flechas sin cola) y
los núcleos intestinales (flechas con cola)
se observan claramente en las imágenes
fusionadas (c, f, i). El tiempo de
exposición es más corto que el que se
muestra en la Figura 3, para evitar la
sobreexposición. (A) Anterior del gusano.
(B) Posterior del gusano. Barras de escala,
50 µm.
mAb específico para C. elegans
HIF-1
7. Figura complementaria 2.
Este anticuerpo reconoce dos bandas
presentes en egl-9 (sa307), pero ausentes en
hif-1 (ia04). Las bandas migran con un peso
molecular aparente de 113 y 106 kilodaltons.
Figura 1. Los niveles de
proteína HIF-1 aumentan
cuando los gusanos están
expuestos al H2S.
(A) Un análisis representativo de Western blot
muestra que la proteína HIF-1 aumenta
cuando los gusanos se exponen a 50 ppm de
H2S o 0,5% de O2. Se recortaron las manchas
y reexaminaron con un anticuerpo anti-actina
para confirmar cantidades equivalentes de
proteína total. Los marcadores de tamaño se
muestran en kilodaltons. (B) Aumento
promedio de la señal en relación con el
control ± SD de tres experimentos
independientes. * p < 0.05 (prueba t de
Student) en comparación con animales
8. Figura 2. La exposición al H2S
causa la localización nuclear
de HIF-1.
Tanto el tratamiento con H2S como la
hipoxia (0.5% O2) inducen la
localización nuclear de HIF-1 en todo
el animal. Las imágenes son apilados
de todos los núcleos visibles con
tinción DAPI. Los animales se tiñeron
con anticuerpo anti-Ce-Hif-1 (a, d y g)
y DAPI (b, e y h) para visualizar los
núcleos. Los núcleos hipodérmicos
(flechas sin cola) y los núcleos
intestinales (flechas con cola) se
observan claramente en las imágenes
fusionadas (c, f e i). (A) Anterior del
gusano. (B) Posterior del gusano.
Barras, 50 µm.
9. Figura 3. La exposición a
H2S aumenta la expresión
de NHR-57::GFP.
Un plano medio focal de una
microfotografía confocal fluorescente y
una micrografía Nomarski. La
fluorescencia no es aparente en animales
transgénicos L4 nhr-57::gfp(iaIs07) no
tratados. Un animal nhr-57::gfp(iaIs07)
expuesto a hipoxia exhibe actividad HIF-1
en el intestino pero ausente en la
hipodermis. A las 1 h del tratamiento con
H2S, la fluorescencia es evidente en la
hipodermis en todo el animal, pero no se
puede detectar en el intestino. La
fluorescencia se vuelve más intensa hasta
las 3 h de exposición. nhr-57::gfp(iaIs07);
los animales hif-1 (ia04) no muestran
fluorescencia, independientemente del
tratamiento con H2S. Barra, 40 µm.
10. Figura 4. La exposición a
H2S aumenta los niveles
de ARNm de los genes
diana HIF-1.
La PCR de transcripción inversa en
tiempo real se utilizó para cuantificar
los niveles de ARNm de los genes diana
HIF-1 en gusanos de tipo salvaje o hif-1
(ia04) expuestos a H2S o hipoxia. El
ADNc de nhr-57 (A) o K10H10.2 (B) se
muestra como el aumento promedio ±
SD en relación con los niveles de ADNc
de sir-2.1, que no cambian durante la
exposición al H2S.
11. Figura 5. La actividad de
HIF-1 dependiente de H2S es
independiente de VHL-1.
El nhr-57::gfp (iaIs07); egl-9(sa307)
exhibe una fluorescencia intensa
evidente en todo el animal, incluso en la
hipodermis y el intestino. 100 animales
nhr-57::gfp(iaIs07);vhl-1(ok161) no
tratados, muestran expresión basal de
GFP en el intestino y el tratamiento con
H2S induce la expresión hipodérmica.
Estos resultados son representativos de
100 de 100 gusanos examinados para
cada panel. Barra, 40 µm.
12. DISCUSION
■ Las células tienen múltiples formas de activar
las respuestas HIF.
■ Tanto el sulfuro como el cianuro interrumpen la
respiración celular como inhibidores no
competitivos del citocromo oxidasa
■ Por lo tanto, HIF-1 ayude a superar la toxicidad
aliviando el estrés de la actividad impedida del
citocromo oxidasa. Quizás aumentando la
expresión de genes que codifican enzimas
glucolíticas (glucolisis anaerobia).
■ La expresión inducida por H2S de un informador
para la actividad de HIF-1 no requiere vhl-1
pero sí requiere egl-9.
■ H2S puede estar involucrado en dos pasos de
activación de HIF-1: estabilización de proteínas
y activación transcripcional.
■ Una posibilidad para las diferencias observadas
es que el intestino se hace más fácilmente
hipóxico y la hipodermis se expone más
fácilmente al H2S.
■ Además, la superposición casi perfecta de la
actividad HIF-1 en hipoxia y animales nulos vhl-
1 argumenta que las diferencias observadas
reflejan algo intrínseco al tejido, que tal vez
implique factores de transcripción adicionales.
■ HIF-1 puede estar involucrado en la
aclimatación a entornos que contienen H2S.
■ exposición al H2S aumenta la actividad de HIF-1
y aumenta la tolerancia a una mayor exposición
al H2S. preacondicionamiento de la hipoxia