10. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Están constituidos por unidades elementales denominadas
NUCLEÓTIDOS
Composición de los nucleótidos
Azúcar
Grupo Fosfato
Base Nitrogenada
11. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Nucleótidos
CH2P OO
OH
OH
O
OHOH
Ácido Fosfórico + Azúcar + Base Nitrogenada
12. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Azúcar
O
CHHC
CH2
CHHC
OHOH
OH
HO
1’
2’3’
4’
5’
O
CHHC
CH2
CHHC
HOH
OH
HO
1’
2’3’
4’
5’
Ribosa (ARN) Desoxirribosa (ADN)
13. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Grupo Fosfato
CH3 O
OH
CH2P OO
O
O-
O
OHO
(H3PO4)
P OHO
OH
OH
1’
2’3’
4’
5’
1’
2’3’
4’
5’
14. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Bases Nitrogenadas
Pirimidínicas
Citosina C
Uracilo (ARN) U
Timina T
Púricas
Adenina
Guanina
A
G
15. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Púricas Pirimidínicas
CitosinaC
Uracilo (ARN)U
Timina (ADN)T
Adenina A
Guanina G
Puentes de Hidrógeno
Unión entre bases Nitrogenadas
16. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Sentido cadenas: 5´ 3´
CH3 O
OH
CH2P OO
O
O-
O
OHO
1’
1’
3’
5’
5’
3’
17. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Cadenas antiparalelas
3’
5’ CH2P OO
O
O-
O
H
CH2P OO
O
O-
O
HO
CH2 PO O
O
O-
O
H
CH2 PO O
O
O-
O
H O
3’
5’
TT
AA
CC
GG
18. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Secuencia de Nucleótidos
CCGG
TT
AA
AA GG
CCTT
AA
CCTT
AA
GGAA
TT
CCGG
TT
3’5’
5’ TAAgTCgCA 3’
5’3’
19. I. Concepto
II. Ácidos Nucleicos
III. Sondas
IV. Hibridación in situ
V. Sistemas de Detección
VI. HIS en Diagnóstico
21. Sondas
Sondas antisentido y sentido
• SONDA ANTISENTIDO (Antisense): Secuencia de nucleótidos
complementaria de la secuencia diana
• SONDA SENTIDO (Sense, control negativo): Secuencia de nucleótidos
idéntica a la secuencia diana, por lo que no puede hibridarse con ella
Secuencia diana
Sonda antisentido T A A g gT C C A3’ 5’
A T T C CA g g T5’ 3’
A C g C AT g A T5’ 3’
A T T C CA g g T5’ 3’Sonda sentido
22. Sondas
Tipos de Sondas
• Sondas bicatenarias (ADN)
• Sondas monocatenarias
Número de hebras
• Sondas de ARN (Ribosondas)
• Sondas de ADN
Naturaleza
• ARN
• Oligonucleótidos
27. Sondas
Marcadores
Marcadores antigénicos
• Incorporan moléculas antigénicas acopladas a la base nitrogenada
• Los más usadas son: Biotina, Digoxigenina y Fluoresceína (FITC)
CH2 O
OHOH
P OO
OH
OH
PO
OH
OH
PO
OH
OH
MM
29. I. Concepto
II. Ácidos Nucleicos
III. Sondas
IV. Hibridación in situ
V. Sistemas de Detección
VI. HIS en Diagnóstico
30. Hibridación in situ
Procesamiento de las muestras
Fijación
Permite preservar los ácidos nucleicos y la morfología tisular
DNasas ¡RNasas!
Degradación de ácidos
nucleicos diana
FIJACIÓNFIJACIÓN
31. Hibridación in situ
Procesamiento de las muestras
Fijador
FORMOL TAMPONADO 10%, pH 7.4, durante 24 horas
Procesado rutinario de inclusión en parafina
Evitar mezclas fijadoras que contengan Hg o ácidos
Bouin
Zenker
B5
!
32. Hibridación in situ
Procesamiento de las muestras
Secciones
Secciones de 5 µm en portaobjetos tratados
• Limpieza con alcohol (microtomo, baño, ...)
• Esterilización en autoclave (pinzas, ...)
Precauciones con las RNasas exógenas (condiciones de esterilidad):
• Uso de agua destilada en el baño para recoger las secciones
• Portaobjetos de caja recién abierta
!
33. Hibridación in situ
Procesamiento de las muestras
Secado de las secciones durante
1 Noche a 50-55 ºC
Almacenamiento de las secciones desecadas a –20ºC
Si no se realiza la HIS en
los días siguientes
Precauciones con las RNasas!
34. Hibridación in situ
Etapas
• Pretratamiento
• Desparafinado e hidratación
• Deshidratación
• Desnaturalización
• Hibridación
35. Hibridación in situ
Desparafinado e Hidratación
Se realizará de igual manera que la IHQ
Llevar la hidratación hasta Agua Destilada Estéril
Precauciones con las RNasas!
38. Hibridación in situ
Deshidratación y secado
Precauciones con las RNasas!
Evita la dilución de la sonda
La deshidratación se realiza con alcoholes de graduación creciente
OH 70º OH 96º OH 100º
El secado lo podemos realizar
Al aire / campana
En placa térmica a 45-50ºC
39. Hibridación in situ
Desnaturalización
Permite la separación de las dos hebras de ADN para que
pueda ser detectada la secuencia a estudio
Sólo es necesaria cuando se pretenda detectar ADN y/o
cuando la sonda sea bicatenaria
44. Hibridación in situ
Lavados de rigor (astringency)
Permiten aumentar la especificidad de la reacción
eliminando las uniones inespecíficas de la sonda
con secuencias parcialmente homólogas
SSC 2X SSC 1X SSC 0,5X
SSC: Tampón citrato salino
Se realizan los lavados a 72ºC, 65ºC, 42ºC, 37ºC
45. I. Concepto
II. Ácidos Nucleicos
III. Sondas
IV. Hibridación in situ
V. Sistemas de Detección
VI. HIS en Diagnóstico
47. Sistemas de Detección
Sondas biotinadas
BB
1. Detección mediante Estreptavidina unida a la enzima
(Fosfatasa alcalina o Peroxidasa)
EZ
EZ
E
Diana
2. Revelado con el cromógeno de la enzima
(NBT/BCIP o DAB)
50. Sistemas de Detección
Amplificación con tiramidas
BB
E
P
P
TT
BB
TT
BB
2. Tiramida-biotina oxidada por la peroxidasa se une a residuos
tirosina de proteínas próximas
TT
BB
TT
BB
51. Sistemas de Detección
Amplificación con tiramidas
BB
E
P
P
TT
BB
E
P
P
TT
BB
E
P
P
TT
BB
E
P
P
TT
BB
E
P
P
3. Detección de la biotina de las tiramidas con más Estreptavidina-
peroxidasa
4. Revelado con DAB
55. Sistemas de Detección
Sondas antigénicas
AA
E
1. Detección mediante un anticuerpo unido a una enzima
(Fosfatasa Alcalina o Peroxidasa)
2. Revelado con el cromógeno
(NBT/BCIP o DAB)
Antígeno
• Digoxigenina
• FITC
Detección por Inmunohistoquímica
57. Sistemas de Detección
Sondas marcadas con fluorocromos
FITCFITC
Iluminación con luz de
alta frecuencia (Ultravioleta)
Emisión de
fluorescencia de
frecuencia inferior
Visualización directa de la fluorescencia (FISH)
58. Sistemas de Detección
Sondas Marcadas con Fluorocromos
HER-2/neu
Centrómero
Gen HER2
FISH
(Fluorescence In Situ Hybridization)
59. I. Concepto
II. Ácidos Nucleicos
III. Sondas
IV. Hibridación in situ
V. Sistemas de Detección
VI. Aplicaciones
62. HIS en Diagnóstico
HPV
• Virus ADN
• Técnica más sensible que la IHQ
• Permite el tipaje:
HPV 6,11
HPV 31,33
HPV 16,18 (factor de riesgo) Cáncer de cérvix
67. HIS en Diagnóstico / HPV
HIS-HR
(16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68)
68. HIS en Diagnóstico
EBV
• Detección de su ARNm (elevado número de copias):
EBER: Epstein Barr Earlier RNA
¡Atención RNasas!
• Asociado a
Mononucleosis infecciosa
Linfomas
Carcinoma nasofaríngeo
88. FISH / HER-2 - Polisomía
Centrómero del
cromosoma 17
Gen Her-2
Amplificación del gen
Múltiples copias
del gen debido a
polisomía del
cromosoma 17
CEN 17 / Núcleo ≥3
89. FISH / HER-2 - Polisomía
• No tiene influencia en la expresión de HER-2
Downs-Kelly E et al., Am J Surg Pathol 29:1221-1227, 2005
• No tiene efecto sobre el contenido de la proteína ni del ARNm
Dal Lago L et al., Mol Cancer Ther 5:2572-9, 2006
• En ausencia de amplificación no se asocia con sobreexpresión
Van den Bempt I et al., Curr Opin Oncol 19:552-7, 2007
90. FISH / HER-2 - Polisomía
• Factor principal en la sobreexpresión de casos 3+ no amplificados
Varshney D et al., Am J Clin Pathol 121:70-77, 2004
• Principal causa de respuesta a trastuzumab en casos 3+ FISH-
Hofmann M et al., J Clin Pathol 61:89-94, 2008
92. FISH / HER-2 – Monosomía
• Define un grupo de pacientes con menor respuesta a trastuzumab
Risio et al., Oncol Rep 13:305-309, 2005
• En algunos casos con monosomía 17, la relación ≥ 2 es causada
por 2 copias de HER2 y una copia simple del cromosoma 17
por lo que no deben ser interpretados como amplificados
Persons DL et al, Arch Pathol Lab Med 130:325-331, 2006
95. Duo-CISH / HER-2
Cinco Laboratorios europeos:
Reino Unido
• School of Molecular Medical Sciences. University of Nottingham
• Medical School. Birmingham University
Alemania
• Johannes Gutenberg Universitätsklinikum
Suecia
• Universitetssjukhuset Lund
España
• Universidad de Santiago de Compostela
VALIDACIÓN
103. Duo-CISH / HER-2
Duo-CISH combina las ventajas de
FISH y CISH
• Evaluación objetiva ( IHC)
• Contaje simultáneo de las señales de HER2 y
CEN-17 ( CISH)
• Campo claro ( FISH)
• Las señales en células normales y tumorales
representan un control interno positivo
ubicuo que falta en IHC
VENTAJAS
104. Duo-CISH / HER-2
Campo claro
• El componente invasivo puede
ser fácilmente identificado,
reduciendo el riesgo de analizar
células no tumorales o no
invasivas
VENTAJAS
105. Duo-CISH / HER-2
Campo claro
• El componente invasivo puede
ser fácilmente identificado,
reduciendo el riesgo de analizar
células no tumorales o no
invasivas
• Facilira la discusión de casos y
la formación
VENTAJAS
106. Duo-CISH / HER-2
Campo claro
• El componente invasivo puede
ser fácilmente identificado,
reduciendo el riesgo de analizar
células no tumorales o no
invasivas
• Facilita la discusión de casos y
la formación
• Fácil evaluación del estado de
HER2 en TMA
VENTAJAS
107. Duo-CISH / HER-2
No se requiere un
microscopio especial de
fluorescencia
• Economía
• No ambiente oscuro
• No aceite de inmersión
(40x-60x)
FISH
dc-CISH
VENTAJAS
108. Duo-CISH / HER-2
Archivo
• Tiempo indefinido en el
archivo general
• Reevaluación de casos
• Estudios retrospectivos
VENTAJAS
<number>
Se emplea HIS: cuando no existen buenos Ac; cuando en IHQ se observa mucho fondo; cuando la proteína es segregada; cuando existen más ácidos nucleicos que proteínas en la célula (Leong, Atenas).
Las bases nitrogenadas son el elemento diferenciadro entre nucleótidos
<number>
Sales de Hg: hacen inaccesibles los ácidos nucleicos. Ácido pícrico reacciona con histonas fomando picratos que hacen inaccesibles los ácidos nucleicos.
<number>
Papovavirus que afecta SNC de pacientes inmunodeprimidos. Causa patología desmielinizante (leucoencefalopatía multifocal progresiva).
<number>
La tiramida es oxidada por la peroxidasa al reaccionar con H2O2. La tiramida activada (con radicales libres) se une covalentemente a residuos tirosina de las proteínas adyacentes a la peroxidasa. Ya que la vida media de los radicales libres de tiramida es muy corta, el depósito ocurre muy próximo a la enzima y por tanto al AN diana.
