Son ejercicios que la dra. Gloria Gordillo presenta a sus alumnos para su docencia.

1. TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: PROBLEMAS DE CINÉTICA ENZIMÁTICA
Los alumnos deben repasar todos los conceptos de cinética enzimática, tanto de las
clases teóricas como de los prácticos de enzimología 1, 2 e isoenzimas. Asimismo,
deben practicar la resolución de problemas. Los que se incluyen en esta guía son
algunos ejemplos resueltos que se discutirán en clase práctica, pero se sugiere la
resolución de los otros problemas propuestos en la guía y la interpretación de los
gráficos resultantes de los prácticos anteriores.
Traer calculadora, papel milimetrado y otros elementos necesarios la resolución de
problemas.
Problema 1:
1- Un sustrato S se transforma por una enzima, y la velocidad de desaparición se mide
cada 30 seg. durante 3 min. Se preparó en tubos de ensayo una serie de seis tubos con
1.5 µg de enzima (peso mol 30,000) añadiéndose un mismo volumen de disolución de
sustrato a distintas concentraciones. Los resultados están resumidos en la tabla.
¿Cuáles son las velocidades iniciales para cada tubo con distinta concentración de
sustrato?
Tiempo (min) Sustrato transformado (µmol)
0
S 1
S 2
S 3
S 4
S 5
S
0.5 0.0 0.49 0.71 1.10 1.36 1.45
1 0.1 1.05 1.52 2.24 2.74 3.00
1.5 0.2 1.66 2.36 3.48 - -
2.0 0.3 2.23 3.18 - - -
2.5 0.4 2.81 4.00 - - -
3 0.5 3.40 - - - -
Conc. Inicial
(µmoles ml-1
)
0.0 2.32 4.55 12.66 38.50 200.00
Solución: Paso 1. Corregir cada lectura sustrayendo el cambio aparente en la disolución
testigo (0
S) en el tiempo correspondiente.
1
S 2
S 3
S 4
S 5
S
0.4
9
0.7
1 1.1
1.3
6 1.45
0.9
5
1.4
2
2.1
4
2.6
4 2.90
1.4
6
2.1
6
3.2
8 - -
1.9
3
2.8
8 - - -
2.4
1 3.6 - - -
2.9 - - - -
Paso 2. Representar µmoles de sustrato transformado para cada concentración frente al
tiempo (Figura). Trazar la mejor recta para cada serie de puntos.
1

2. De esta figura determinar la velocidad de sustrato transformado por minuto para cada
concentración de sustrato en el tramo lineal de cada curva. Estos valores serán las pendientes
de las porciones lineales y serán también las velocidades iniciales.
[1
S] 2.32 x 10-3
M 1
V= 0.95 µmol min-1
[2
S] 4.55 x 10-3
M 2
V= 1.44 µmol min-1
[3
S] 12.66 x 10-3
M 3
V= 2.31 µmol min-1
[4
S] 38.50 x 10-3
M 4
V= 2.64 µmol min-1
[5
S] 200.00 x 10-3
M 5
V= 2.90 µmol min-1
Estos valores se representan unos frente a otros
2
Tiempo (minutos)
Sustratotransformado(µmol)
1
S
2
S
3
S
4
S
5
S
Conc. Sustrato (M x 103
)
Velocidadinicial(µmolmin-1
)

3. Problema 2:
v0 = Vmáx [S]
Km + [S]
Utilizando la ecuación de Micaelis-Menten, calcular el cambio en la [S] necesaria para
aumentar la velocidad de una reacción del 10 al 90 % de la velocidad máxima.
SOLUCIÓN
Poniendo v0 = 0,1 Vmáx
Entonces [S] = 0,1
Km + [S]
[S] = (Km + [S]) . 0,1
[S] = 0,1 Km + 0,1 [S]
[S] - 0,1 [S] = 0,1 Km
0,9 [S] = 0,1 Km
9 [S] = Km
Es decir, [S] = Km / 9
Poniendo v0 = 0,9 Vmax encontramos que [S] = 9 Km,
entonces [S]90% = 9 Km = 81
[S]10% Km/9
Es decir, se debe aumentar la [S] 81 veces.
Problema 3:
Las velocidades iniciales a varias concentraciones de sustrato para una reacción catalizada
por una enzima hipotética son:
[S] (moles/l) V (µmoles/min)
5x10-2
0.25
5x10-3
0.25
5x10-4
0.25
5x10-5
0.20
5x10-6
0.071
5x10-7
0.0096
a) ¿Cuál es la velocidad máxima para esta reacción?
b) ¿Por qué la velocidad inicial permanece constante a una [S] mayor de 5x10-4
M
c) ¿Cuál es la concentración de enzima libre para una [S] de 5x10-4
M?
d) ¿Cuál es la Km de la enzima?
e) Calcular la velocidad inicial para [S]=1x10-6
3

4. 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04
0.00
0.06
0.12
0.18
0.24
0.30
1/Vinicial
(mgminmmoles
-1
)
1/[urea] (dm
3
mmoles
-1
)
y [S]=1x10-1
f) Calcular la concentración de producto formado en los cinco primeros minutos de reacción
utilizando 10 ml de una disolución de sustrato 2x10-3
M.
SOLUCIÓN
a) Vmax = 0.25 µmol/min, ya que por encima de [S] de 5x10-4
no aumenta.
b) Porque todos los enzimas está ocupados transformando un sustrato.
c) Cero, todos los enzimas ocupados, a esa [S] se da la Vmax.
d) Empleando la ecuación de Michaelis, utilizando la velocidad 0.20, 0.070 ó 0.0096 y sus
correspondientes [S], como sabemos la Vmax, obtenemos una Km 0 1,25 x 10-5
moles/l.
e) Sabiendo la Km y Vmax, aplicamos Michaelis utilizando esas [S], y
obtenemos: V = 0,018 µmol/min y V = 0,25 µmol/min.
f) A [2x10-3
] la V = Vmax = 0,25 µmol/min. En 5 min 0,25 x 5 = 1,25 µmol. Tenemos 10 ml
de sustrato, luego 1,25 µmol / 10-2
l = 1,25 x 102
µmol/l
Problema 4:
Se estudió la actividad de la enzima ureasa, que cataliza la reacción:
CO(NH2)2+H2O <=> CO2+2NH2
en función de la concentración de urea, con los resultados siguientes:
Concentración de urea (mmoles dm-3
) 30 60 100 150 250 400
V inicial (mmoles urea consumidos min-1
mg enzima-1
) 3,37 5,53 7,42 8,94 10,70 12,04
¿Cuáles son los valores de Km y Vmáx para esta reacción?
SOLUCIÓN
Los datos se ordenan en la forma adecuada para una gráfica lineal (por ejemplo, 1/Vinicial
frente a 1/[S], aunque existen otras formas de linealizar que no son motivo de nuestro
estudio). La gráfica de la doble inversa se indica en la Figura. De la gráfica se puede calcular
que Km es 105 mmoles dm-3
y la Vmáx es 15,2 mmoles urea consumidos mg-1
min-1
. Observar
la distribución de los puntos y tener presente cuando se eligen los valores adecuados para la
concentración de sustrato al planificar un experimento.
Ejemplo resuelto de acuerdo con el método de doble inversa o de Lineweaver-Burk.
Problema 5:
4

5. 0
1
2
3
4
5
6
7
8
-15 -10 -5 0 5 10 15 20 25
1/[S] 0 [(mmol L
-1
)
-1
]
1/ν0(µmolL
-1
min
-1
)
[I ] 0 (mmol L-1)
[I ] 0,5 (mmol L-1)
[I ] 1,0 (mmol L-1)
Se investigó el efecto de un inhibidor I sobre la velocidad de una reacción catalizada
enzimáticamente sobre un solo sustrato, obteniéndose los siguientes resultados
Concentración de sustrato
(mmol L -1
)
Concentración del inhibidor
(mmol L -1
)
0 0.5 1.0
Velocidad de reacción ν0 (µmol L -1
min-1
)
0.05
0.10
0.20
0.40
0.50
0.33 0.20 0.14
0.50 0.33 0.25
0.67 0.50 0.40
0.80 0.67 0.57
0.83 0.71 0.63
A) ¿De que manera actúa el inhibidor? B) Obténgase los valores para Vmáx, y Km.
SOLUCIÓN
A) La manera más sencilla de deducir cómo actúa un inhibidor es graficar 1/ν0 en función de
1/[S]0 para cada concentración del inhibidor.
Gráfica de Lineweaver-Burk del efecto de un inhibidor
A partir de la gráfica se puede observar que la pendiente de las curvas se modifica con los
cambios en la concentración del inhibidor pero no la intersección en el eje 1/ν0 (1/Vmax). Por
ello los datos anteriores indican que el inhibidor I está actuando como un inhibidor
competitivo.
B) De la intersección en el eje 1/ν0 se puede estimar Vmax= 1(µmol L -1
min-1
) y de la
intersección con el eje 1/[S]0 los valores de Km=0,1 (mmol L -1
) sin ihnhibidor, Km=0,2(mmol
L -1
) con 0.5(mmol L -1
) de inhibidor y Km=0,3 (mmol L -1
) con 1(mmol L-1
)
5
1
0
0.5
-1/Km
1/Vmáx

6. Problema 6:
A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática, determinar de que manera está
actuando el inhibidor. Determinar la Km y la velocidad máxima.
[S] mM µg producto/h µg producto/h
(sin inhibidor) (6 mM inhibidor)
2 139 88
3 179 121
4 213 149
10 313 257
15 370 313
SOLUCIÓN
Se calculan los inversos de [S] y de v, producto sin inhibidor y producto con inhibidor y se
representa. Sin inhibidor: Vmax = 0,5x103
µg/h y Km = 5 mM. Con inhibidor: Vmax es la
misma y Km=9 mM.
6

7. Problema 6:
A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática, determinar de que manera está
actuando el inhibidor. Determinar la Km y la velocidad máxima.
[S] mM µg producto/h µg producto/h
(sin inhibidor) (6 mM inhibidor)
2 139 88
3 179 121
4 213 149
10 313 257
15 370 313
SOLUCIÓN
Se calculan los inversos de [S] y de v, producto sin inhibidor y producto con inhibidor y se
representa. Sin inhibidor: Vmax = 0,5x103
µg/h y Km = 5 mM. Con inhibidor: Vmax es la
misma y Km=9 mM.
6